UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONMA DE NICARAGUA, MANAGUA RECINTO UNIVERSITARIO RUBN DARO FACULTAD DE CIENCIAS E INGENIERAS

DEPARTAMENTO DE QUMICA ASIGNATURA: ANLISIS INSTRUMENTAL

PRCTICA DE LABORATORIO #1

Calibracin del Espectrofotmetro Ultravioleta/Visible Perkin Elmer Lambda EZ201

I. Introduccin

La espectrofotometra ultravioleta/visible (UV/Vis) es una de las tcnicas ms comnmente utilizadas de anlisis instrumental. Por ejemplo, la espectrofotometra es empleada en qumica clnica, en la industria farmacutica, en anlisis industrial, en aplicaciones ambientales, en investigacin y muy a menudo en el aseguramiento de la calidad. Las regulaciones para el control de calidad como las normas ISO 9000, Buenas Prcticas de Laboratorio (BPL), Buenas Prcticas de Manufactura (BPM) o procedimientos operativos estandarizados (POE) en la industria farmacutica requeridos por las ms importantes farmacopeas (EP, DAB, USP), exigen una regular comprobacin del rendimiento de los espectrofotmetros utilizados. Estos chequeos incluyen la verificacin de la resolucin, la exactitud de la longitud de onda as como tambin la examinacin de luz difusa1 y exactitud fotomtrica (Hellma, 2008). En adicin a lo anterior, segn la Norma ISO/IEC 17025:2005, para asegurar las trazabilidad de las mediciones todos los equipos utilizados para los ensayos que tengan un efecto significativo en la exactitud o en la validez del resultado del ensayo deben ser calibrados antes de ser puestos en servicio. El laboratorio debe establecer un procedimiento para la calibracin2 de sus equipos.

II. Objetivos Verificar la exactitud fotomtrica en las regiones ultravioleta y visible del

Espectrofotmetro UV/Vis Perkin Elmer Lambda EZ201 utilizando como referencia la Gua Tcnica: Procedimientos de Calibracin para Espectrofotmetros UV/Vis publicada por el Laboratorio Internacional de Acreditacin de Nueva Zelanda (IANZ).

1 La luz difusa se define como la luz detectada de cualquier longitud de onda que se encuentra fuera del ancho de banda de la longitud de onda seleccionada para el anlisis (Owen, 2000). 2 La calibracin es un conjunto de operaciones que establecen, bajo condiciones especficas, la relacin entre los valores de cantidades indicadas por un instrumento de medida o sistema de medida, o valores representados por un material de medida y los correspondientes valores emitidos por estndares. La forma usual para realizar la calibracin es someter cantidades conocidas del mesurando (por ejemplo usando un estndar de medida o material de referencia) al proceso de medida y monitorear la respuesta de medida (CITAC/EURACHEM, 2002).

III. Materiales y Reactivos

N Cristalera, Materiales y Equipo Reactivos Cristalera Clase A Frmula Grado

1 Matraz volumtrico Pyrex 1000 mL CuSO45H2O ACS, ISO; para anlisis

2 Matraces volumtricos Pyrex 500 mL K2Cr2O7 ACS; para anlisis; estndar primario 1 Matraz volumtrico Pyrex 250 mL H2SO4 ACS, para anlisis de metales trazas 3 Matraces volumtricos Pyrex 100 mL HCl ACS; para anlisis 6 Matraces volumtricos Pyrex 50 mL H2O dest. ASTM tipo III (6 pisetas 1 L) 4 Buretas 50 mL 2 Buretas 25 mL 2 Buretas 10 mL

10 Pipetas Pasteur 1 Beakers 600 mL Pyrex

10 Beakers 50 mL Pyrex 6 Agitadores de vidrio 1 Plato Petri

Materiales de Laboratorio Cada equipo de trabajo debe traer:

6 Soportes universal 1 Rollo de papel toalla 6 Pinzas para buretas 1 Marcador Sharpie punta fina 1 Pipeta de asistencia magntica 1 Caja de papel Kleenex 4 Esptulas Equipos de Laboratorio

2 Balanzas analticas 0.1 mg precisin 1 Campana de gases 1 Espectrofotmetro UV/Vis 1 Par de celdas de cuarzo 10 mm longitud

IV. Procedimiento Experimental

4.1. Lavado de la cristalera y el material de porcelana y plstico para el anlisis 1. Se selecciona la cristalera (clase A) y el material a utilizarse en el anlisis. 2. Se enjuaga el material con suficiente agua del grifo y se lava con detergente neutro y

libre de fosfatos Extran MA-02. 3. Se endulza cada pieza con agua destilada. 4. Se introduce la cristalera y los materiales en la tina de plstico, la cual debe contener

5 L de una solucin 1 M de HCl (Cuntos mL hay qu medir de HCl conc., = 1.184 g/mL, 37%?) por 24 horas.

5. Se retira cada pieza de la tina de plstico utilizando la respectiva proteccin de seguridad y se enjuaga bien cada pieza tres veces con agua destilada.

6. Se lleva nicamente la cristalera y el material de porcelana al horno a una temperatura de 60C para su respectivo secado. El material de plstico se coloca en posicin invetida y se deja secar por escurrimiento a temperatura ambiente.

7. Se deja enfriar el horno de secado para retirar cada pieza de material y ubicarla en el estante respectivo, con su tapa o envuelta con papel aluminio; los vasos de precipitados se colocan en posicin invertida. Los crisoles de porcelana (si hubiesen) deben ser trasladados a un desecador hasta alcanzar la temperatura del laboratorio.

4.2. Preparacin de soluciones3

a) Solucin de H2SO4 5 x 10-2 M. Prepare 500 mL de cido sulfrico 5 x 10-2 M aforando

con agua destilada. Cuntos mL hay qu medir de H2SO4 conc. ( = 1.84 g/mL, 96.7%)?

b) Solucin de H2SO4 5 x 10-3 M. Prepare 500 mL de cido sulfrico 5 x 10-3 M utilizando

la solucin a) y diluya con agua destilada hasta el enrase. Cuntos mL hay qu medir de Solucin de H2SO4 5 x 10

-2 M? c) Solucin 1 de K2Cr2O7 al 0.005%. Prepare 100 mL de dicromato de potasio

4 estndar primario al 0.005% (m/v) diluyendo los miligramos pesados de la sal con la solucin b) hasta el aforo. Cuntos gramos hay que pesar de K2Cr2O7 estndar primario?

d) Solucin 2 de K2Cr2O7 al 0.01%. Prepare 100 mL de dicromato de potasio estndar primario al 0.01% (m/v) diluyendo los miligramos pesados de la sal con la solucin b) hasta el aforo. Cuntos gramos hay que pesar de K2Cr2O7 estndar primario?

e) Solucin de H2SO4 al 1%. Prepare 1 L de cido sulfrico al 1% (v/v) aforando con agua destilada. Cuntos mL hay qu medir de H2SO4 conc. ( = 1.84 g/mL, 96.7%)?

f) Solucin de CuSO45H2O (patrn primario) al 2%. Prepare 100 mL de solucin de

CuSO45H2O al 2% (m/v) diluyendo los gramos pesados de la sal con la solucin e)

hasta el aforo. Cuntos gramos hay que pesar de CuSO45H2O?

g) Solucin stock de CuSO45H2O (patrn primario) 0.1 M. Prepare 250 mL de solucin

stock (de reserva) de CuSO45H2O 0.1 M diluyendo los gramos pesados de la sal con la

solucin e) hasta el aforo. Cuntos gramos hay que pesar de CuSO45H2O?

h) Set de Estndares de CuSO45H2O (0.00, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 y 0.10) M. Prepare seis

estndares de CuSO45H2O, midiendo alcuotas de la solucin g) y afore a 50 mL utilizando la solucin e) (blanco).

Tabla 4.1. Set de Estndares de CuSO4.5H2O

N Volumen del Stock

Volumen del Blanco

Concentracin del Estndar

1 ? mL ? mL 0.00 M 2 ? mL ? mL 0.02 M

3 Si es necesario calcular el peso molecular de una sustancia para preparar una determinada solucin,

utilcese la Tabla Peridica NIST (Anexo) para el clculo del peso molecular de dicha sustancia (incluya todas las cifras significativas). 4 Anticipadamente el dicromato de potasio deber ser secado por un tiempo de 30 60 minutos a una

temperatura de 140 150C.

3 ? mL ? mL 0.04 M 4 ? mL ? mL 0.06 M 5 ? mL ? mL 0.08 M 6 ? mL ? mL 0.10 M

4.3. Exactitud de la escala fotomtrica (absorbancia) en la regin espectral UV 1. Utilizando como referencia la solucin b), ajuste la lnea base del espectrofotmetro.

Endulce las celdas de cuarzo (referencia y muestra) con la solucin b) y ajuste a cero la lnea base del equipo.

2. Con ayuda del Docente configure el instrumento para realizar un barrido en la regin UV del espectro electromagntico de 400 a 200 nm.

3. Para verificar el rango de absorbancia de 0.2 0.7 utilice la Solucin 1 de K2Cr2O7. Tome la celda de la muestra, vaciando su contenido en el beaker de residuos. Endulce la celda con agua destilada al menos tres veces, proceda de igual forma con la Solucin 1 de K2Cr2O7, la cuarta vez llene cuidadosamente la celda (de modo que no queden burbujas de aire en el seno de la solucin). Limpie las paredes exteriores de la celda utilizando papel Kleenex y coloque la celda en el portacelda de la muestra. Cierre el paso de luz hacia las celdas.

4. Utilizando el espectro obtenido por el espectrofotmetro, evale la precisin de la escala de absorbancia de 0.2 0.7. (Tabla 5.1)

5. Con ayuda del Docente configure el instrumento para realizar un barrido en la regin UV del espectro electromagntico de 400 a 200 nm.

6. Para verificar el rango de absorbancia de 0.4 1.4 utilice la Solucin 2 de K2Cr2O7. Proceda de la misma forma descrita en el enunciado 2. de este acpite.

7. Utilizando el espectro obtenido por el espectrofotmetro, evale la exactitud de la escala de absorbancia de 0.4 1.4. (Tabla 5.1)

8. Segn la Gua Tcnica las diferencias porcentuales (error relativo porcentual) deben ser menores del 2% para considerar como aceptables los resultados obtenidos.

4.4. Exactitud de la escala fotomtrica en la regin espectral Visible 1. Utilizando como referencia la solucin e), ajuste la lnea base del espectrofotmetro.

Endulce las celdas de cuarzo (referencia y muestra) con la solucin e) y ajuste a cero la lnea base del equipo.

2. Para verificar la exactitud de la escala fotomtrica utilice la Solucin de CuSO45H2O al 2%. Tome la celda de la muestra, vaciando su contenido en el beaker de residuos. Endulce la celda con agua destilada al menos tres veces, proceda de la misma forma descrita en el enunciado 2. del acpite anterior.

3. Con ayuda del Docente configure el instrumento para realizar un barrido en la regin Vis del espectro electromagntico de 800 a 500 nm.

4. Utilizando el espectro obtenido por el espectrofotmetro, evale la precisin de la escala de absorbancia en la regin visible. (Tabla 5.2)

5. Segn la Gua Tcnica las diferencias porcentuales (error relativo porcentual) deben ser menores del 2% para considerar como aceptables los resultados obtenidos.

4.5. Prueba de Linealidad en la regin espectral Visible Soluciones de sulfato de cobre de diferentes concentraciones pueden utilizarse para comprobar la linealidad de la escala de absorbancia. El uso de las absorbancias a 600 nm y 650 nm es particularmente til para examinar el borde inferior de la escala de absorbancia (IANZ, 2005). 1. Utilizando como referencia la solucin e), ajuste la lnea base del espectrofotmetro.

Endulce las celdas de cuarzo (referencia y muestra) con la solucin e) y ajuste a cero la lnea base del equipo.

2. Con ayuda del Docente configure el instrumento para realizar la lectura fotomtrica

del Set de Estndares de CuSO45H2O (0.00, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 y 0.10) M a longitud de onda variable (multiwavelength). Establezca como primera longitud de onda 1 = 600 nm y como segunda longitud de onda 2 = 650 nm. Asegrese de configurar el instrumento para que lea cinco veces cada estndar.

3. El espectrofotmetro estimar e imprimir una curva de calibracin promedio a estas longitudes de onda, sin embargo se deber comprobar el ajuste lineal de dicha curva ingresando los datos en una hoja de clculo (Excel, Gnumeric, Minitab, etc).

4. Construya la curva de calibracin promedio graficando en el eje la concentracin de

los estndares de CuSO45H2O versus el eje expresando las absorbancias a 2 1 (Tabla 5.3).

5. Calcule el coeficiente de correlacin y pruebe estadsticamente si existe una bondad

de ajuste lineal significativa de los estndares de CuSO45H2O con el borde inferior de la escala de absorbancia (Tabla 5.4).

V. Resultados

Tabla 5.1. Valores de referencia de absorbancias para K2Cr2O7 en 5 x 10

-3 M H2SO4. Longitud de onda

(nm)

Absorbancia/ Solucin 1

(Gua Tcnica)

Absorbancia/ Solucin 2

(Gua Tcnica)

Absorbancia Experimental/

Solucin 1

Absorbancia Experimental/

Solucin 2

Error relativo % Solucin 1

Error relativo % Solucin 2

235 (min) 0.626 1.251

257 (max) 0.727 1.454

313 (min) 0.244 0.488

350 (max) 0.536 1.071 Fuente: IANZ, 2005, pg. 5.

El error relativo porcentual puede obtenerse a partir:

Figura 5.1. Espectro tpico de una solucin 0.006% de K2Cr2O7 en HClO4. Soluciones de dicromato de potasio en cido sulfrico o perclrico pueden utilizarse para verificar la escala fotomtrica de la regin UV. El K2Cr2O7 muestra un espectro con mximos picos caractersticos a 257 nm y 350 nm; y mnimos a 235 nm y 313 nm. Los valores de referencia de las absorbancias a estas longitudes de onda estn dados en la Tabla 5.1.

Fuente: Hellma, 2008, pg. 10.

Tabla 5.2. Valores de referencia de absorbancias para CuSO4.5H2O (2%) en 1% H2SO4.

Longitud de onda (nm)

Absorbancia (Gua Tcnica)

Absorbancia Experimental

Error relativo %

600 0.068

650 0.224

700 0.527

750 0.817 Fuente: IANZ, 2005, pg. 5.

Tabla 5.3. Absorbancias del Set de Estndares de CuSO4.5H2O.

N Concentracin del Estndar

Absorbancias 1 = 600 nm

Absorbancias 2 = 650 nm

Absorbancias a 2 1

1 0.00 M

2 0.02 M

3 0.04 M

4 0.06 M

5 0.08 M

6 0.10 M Las absorbancias de cada estndar son el promedio de las cinco lecturas realizadas por el espectrofotmetro a cada .

Tabla 5.4. Parmetros de la curva de calibracin promedio del borde inferior en la regin espectral visible 650 600 nm.

Coeficiente de regresin o correlacin ( )=

Pendiente ( )=

Intercepto al origen u ordenada( )=

Ecuacin de Regresin=

Existe correlacin significativa?

Bibliografa Hellma. (2008). Calibration standards for spectrophotometers. Mllheim: Hellma GmbH & Co. KG.

IANZ. (Mayo de 2005). Technical Guide: UV/Vis Spectrophotometer Calibration Procedures.

Auckland, New Zealand.

Owen, T. (2000). Fundamentals of UV-visisible spectroscopy. Germany: Agilent Technologies.