Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y … · 2016-05-03 · (Chile)...

Publicada por | Published by: Cooperación Latinoamericana y Caribeña en Plantas Medicinales y Aromáticas Indexada por | Indexed by: SCOPUS, Science Citation Index Expanded (SCISEARCH), Journal Citation Reports/Science Edition, Biological Abstracts y BIOThomson Reuters Master Journal List , Chemical Abstracts (CAS), NAPRALERT, CAB International (CAB Abstracts), GlobalHEALTH, Index Copernicus, IMBIOMED, LATINDEX, QUALIS, REDALYC, Biblioteca Virtual da Saude (BVS).

Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ISSN 0717 7917

Portulaca oleracea Volumen 9, Número 3, Mayo de 2010 Editorial - Silveira et al. (Brazil – Venezuela – Chile). Revisión | Review - Bermello Crespo. (Cuba) Los recursos genéticos y el conocimiento etnofarmacológico cubanos. Su protección mediante patentes. Artículos originales | Original articles - Cuassolo et al. (Argentina) Aspectos de la comercialización y control de calidad de las plantas medicinales más vendidas en una comunidad urbana del NO de la Patagonia

Argentina. - Hilgert et al. (Argentina) La medicina herbolaria en el contexto urbano. Estudio de Caso en un Barrio de la ciudad de Tandil, Argentina. - Thounaojam et al. (India) Antioxidant and free radical scavenging activity of Sida rhomboidea. Roxb methanolic extract using different in vitro models. - Prabhakaran et al. (India) Evaluation of the hepatoprotective activity of Portulaca oleracea L. on D-galactosmaine-induced hepatic injury in rats. - Oliveira et al. (Brazil) Chemical and Biological Investigations of Pilocarpus spicatus essential oils - Becerra et al. (Chile) Actividad de aceites esenciales de Canelo, Queule, Bailahuén y Culén frente a hongos fitopatógenos. - López Hernández et al. (Cuba) Estudio de secado por aspersión de extractos de Plecthranthus amboinicus, Ocimun tenuiflorum, Passiflora incarnata, Matricaria recutita y

Melissa officinalis. Comunicaciones | Communications - Perrotta and Arambarri (Argentina) Celtis ehrenbergiana (Celtidaceae): meristematic tissue in the thorns. - Ferreira et al. (Brazil) Effects of gamma radiation on the chemistry and antibacterial activity of artichoke leaves. - Carvalho et al. (Brazil) New Brazilian rules for herbal medicines.

© 2010 The Authors © 2010 Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 9 (3), i

BLACPMA ISSN 0717 7917 Comité Editorial | Editorial Board

BLACPMA es una publicación de la Cooperación Latinoamericana y Caribeña de Plantas Medicinales y Aromáticas

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EDITOR JEFE | EDITOR IN CHIEF

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http://www.blacpma.org/cooperacion/clacpma.htm�

http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/�

http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.es�

© 2010 The Authors

© 2010 Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 9 (3), ii BLACPMA ISSN 0717 7917

Nota Editorial / Editorial Note

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol.9 (3) 2010 | ii

BLACPMA, 2002 – 2010.

José Luis MARTÍNEZ

Universidad Santo Tomás, Talca, Chile.

On May 10, 2002 BLACPMA was presented for

the first time at the San Martin Events Center of Buenos Aires, Argentina on the occasion of the Latin American Phytochemistry Congress. Today, I want to share with you some memories on this new BLACPMA birthday. Firstly, we must mention Jorge Rodríguez Chanfreau (CIDEM, La Habana, Cuba), who originally accompanied me with the BLACPMA idea, as well as some other old friends who are still collaborating, Arnaldo Bandoni (Argentina), Francisco Moron (Cuba), Patrick Moyna (Uruguay) and Lionel Germossen Robineau (Guadalupe), all co-founders of BLACPMA. I would like to give thanks to other friends who were important in the life of BLACPMA, Patricia Arenas (Argentina), Gabino Garrido (Cuba), Elsa Anselmi (España).

A special mention goes to Dr. José María Prieto (Inglaterra), the former Scientific Editor, who worked

with us for almost five years. I feel very sad for his departure, because such an important friend will be hard to replace.

I want to thank those who continue to support BLACPMA: Guillermo Padrón (Cuba), Aurelio San Martin (Chile), Claudio Laurido (Chile) and Alvaro Portilla, a friend at the Ministry of Agriculture of Colombia.

Over time, others will make their contribution, making BLACPMA one of the most important journals in the field of medicinal plants.

Finally, I want to give thanks to all the colleagues who are sending manuscripts. This will contribute to the growth and prestige of BLACPMA thus guaranteeing a successful future.

© 2010 The Authors © 2010 Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 9 (3), 151-152

BLACPMA ISSN 0717 7917

Editorial

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol.9 (3) 2010 | 151

Regulating herbal medicine. [Regulación de la medicina herbal]

Dâmaris SILVEIRA1, Peter TAYLOR2, José Luis MARTÍNEZ3

1Universidad de Brasilia, Brasil. 2Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Venezuela. 3Universidad Santo Tomás, Talca, Chile.

Enviado / Sent 08/05/2010.

Over the last decades, phytotherapy has attained

new status in the world public health scenario. The increasing use of herbal medicines, due at least in part to the growth of the elderly population and their associated chronic diseases (Grünwald and Buettel, 1996), has made this market attractive to investors. In fact, the global market for herbal medicines stands at over USD$ 60 billion annually (Sharma et al., 2008). The World Health Organization currently recommends and encourages the inclusion of traditional herbal medicines in health care programs, as these drugs are available at low cost (WHO, 2002, 2003, 2008). Indeed, following this recommendation, and considering the worldwide trend towards such treatment, several Latin American countries have included medicinal plants and herbal medicines as major topics in their health policy agenda. On the other hand, the growth of this practice has also been cause for concern to authorities monitoring its impact on public health. Ever since the first issue, BLACPMA has played an important role in this context, publishing advances in medicinal plant research in Latin America and further afield. The special issues dedicated to the regulation of herbal medicines [BLACPMA 6(4) in 2007 and 8(10) in 2009], as well as herb-drug interactions [BLACPMA 7(2) and 7(6) in 2008] are examples of how this journal is contributing to evidence-based herbal medicine use.

In this vein, the present issue of BLACPMA contains several interesting papers covering ethnomedicine, phytotherapy and herbal medicine in Latin America. One paper addresses the lack of regulation in a medicinal plant market, where several problems such as lack of quality, incorrect labeling and misidentified species were identified.

Another recurrent situation in Latin America is the increasing use of foreign plant species by local communities, rather than native ones. The introduction of heavily advertised, and more expensive, transnational herbal preparations, has led to a decline in the use of local traditional remedies.

However, advances in herbal drug research at a national level are combating this decline. Government financing agencies have helped to stimulate studies into the efficacy of native plant species and there is an effort by several research groups to scale up the production of local medicinal plants stimulating domesticated crop production and developing new techniques to improve the quality control and manufacturing processes for the production of herbal medicines derived from local species.

Latin American regulatory agencies have been discussing the possibility of harmonizing the regulation of herbal medicine, within the framework of the Pan American Network of Drug Regulatory Harmonization (PANDRH). Mercosur has been promoting international seminars on herbal medicines (MERCOFITO). In the last 2 months, the Brazilian health minister has published several normative documents on herbal drugs and medicines in order to improve the quality, efficacy and safety of the products available in the Brazilian market. Nevertheless, there is still plenty of work to be done in the medicinal plant field. The editorial board of BLACPMA invites Latin American and medicinal plants researchers throughout the world to contribute to the development of effective, safe and accessible phytotherapy.

http://www.blacpma.org/�

Silveira et al. Regulating herbal medicine


Gruenwald J, Buettel K. 1996. The European Phytotherapeutics Market/Figures, Trends Analyses. Drugs made in Germany 39(1): 6-11.

Sharma A, Shanker C, Tyagi LK, Singh M, Rao CV. 2008. Herbal Medicine for Market Potential in India: An Overview. Acad J Plant Sci 1(1): 26-36.

WHO. 2002. Estrategia de la OMS sobre medicina tradicional 2002-2005. World Health Organization, Geneva.

WHO. 2003. Tradicional medicine. <http://www.who.int/en/>. (Retrieved 02/09/2003.

WHO. 2008. Informe sobre la salud en el mundo 2008: La atención primaria de salud, más necesaria que nunca. World Health Organization, Geneva.


http://www.who.int/en/%3e�



Revisión | Review


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Recursos Genéticos y Conocimiento Etnofarmacológico Cubanos. Su protección mediante patentes

[Cuban genetic resources and ethnopharmacological knowledge. Their protection by patents]

Addiss BERMELLO CRESPO

CIDEM, La Habana, Cuba

——————————————————————————————————————————————————— Abstract

Within traditional human knowledge Ethnopharmacology is prominent. In Cuba, around 1170 botanical species have been documented with proven or attributed medicinal properties. In order to determine the patent protection of pharmaceutical products based on Cuban genetic resources, the databases of patents in the Cuban Office of the Industrial Property (OCPI) web site and PATENSCOPE in the World Organization of the Intellectual Property web site were consulted. The genetic resources present in the 45 recovered Cuban patents were identified; of these only 2 are autochthonous. The immense majority of the terrestrial phytogenetic resources are attributable to ethnopharmacological knowledge. Only 7 of the patents have requested foreign registration. The management of patents based on Cuban genetic resources and ethnopharmacological knowledge is poor, in spite of our great genetic wealth, biodiversity and preservation of the cultural traditions in this area. Keywords: ethnopharmacology; genetic resources; Cuban patents; medicinal plants.

Resumen

Dentro del conocimiento tradicional se destaca la Etnofarmacología. En Cuba se han documentado alrededor de 1170 especies botánicas con

propiedades medicinales comprobadas o atribuidas por la población. A fin de conocer la protección mediante patentes de productos farmacéuticos a base de recursos genéticos cubanos, se consultaron las Bases de Datos de patentes en el sitio Web de la Oficina Cubana de la Propiedad Industrial (OCPI) y PATENSCOPE en el sitio Web de la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual. Se identifican los recursos genéticos presentes en las 45 patentes cubanas recuperadas, de los que sólo 2 son autóctonos. La inmensa mayoría de los recursos fitogenéticos terrestres pertenecen al conocimiento etnofarmacológico. Sólo 7 de las patentes han demandado su registro en el extranjero. La gestión de patentes con base a los recursos genéticos y conocimiento etnofarmacológicos es pobre, a pesar de nuestra gran riqueza genética, biodiversidad y preservación de las tradiciones culturales en esta temática.

Palabras Clave: etnofarmacología; recursos genéticos; patentes cubanas; plantas medicinales ——————————————————————————————————————————————————— Lista de abreviaciones: CIDEM – Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos; OCPI - Oficina Cubana de la Propiedad Industrial; OMPI – Organización Mundial de la Propiedad Intelectual. ——————————————————————————————————————————————————— Recibido | Received: January 18, 2010 Aceptado en versión corregida | Accepted in revised form: April 24, 2010 Publicado en línea | Published online: May 25, 2010 Declaración de intereses | Declaration of interests: The author has no competing interests. Financiación | Funding: none declared. This article must be cited as: Addiss Bermello Crespo. 2010. Recursos Genéticos y Conocimiento Etnofarmacológico Cubanos. Su protección mediante patentes. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 9(3): 153-165. [EPub May 25, 2010} *Contactos | Contacts: E-mail: [email protected]





mailto:[email protected]�

Bermello Crespo Recursos genéticos, el conocimiento etnofarmacológico y las patentes cubanas


INTRODUCCIÓN

En el mundo actual se impone el desarrollo económico basado en el conocimiento, la innovación y la creatividad. En este contexto la Propiedad Intelectual ha asumido gran importancia, e impacta nuestras vidas con repercusiones socio-económicas, tecnológicas y culturales.

No existe una definición completamente reconocida para el concepto “conocimiento tradicional”. La Organización Mundial de la Propiedad Intelectual (OMPI) utiliza este término (Blakeney, 1999) para referirse a las innovaciones y creaciones basadas en la tradición y que resultan de la actividad en la industria, la tecnología, la literatura y el arte. Es un conocimiento inherentemente dinámico y sujeto a un desarrollo continuo de comprobación, adaptación y creación, especialmente influenciado por la globalización y los procesos migratorios actuales. Este conocimiento, con frecuencia, está fuertemente vinculado con los recursos genéticos (WIPO, 2006). Los recursos genéticos como tal no son creaciones del intelecto, pero sí lo son los conocimientos asociados a ellos, que se pueden proteger mediante las diferentes formas de la Propiedad Intelectual, fundamentalmente las patentes.

Dentro del conocimiento tradicional y vinculado a los recursos genéticos se destaca la Etnofarmacología, que consiste en la observación, identificación, descripción e investigación experimental de los efectos de las drogas utilizadas en la medicina tradicional.

Los recursos genéticos son todos aquellos materiales de origen vegetal o animal con unidades funcionales de la herencia y con un valor actual o potencial.

La diversidad biológica constituye la variabilidad entre los organismos vivientes de todas las fuentes, es decir, los organismos terrestres y acuáticos, así como los complejos ecológicos de los que forman parte; esto incluye diversidad dentro de las especies, entre especies y de ecosistemas (Colectivo de autores, 2003). Actualmente los trópicos son cuna y museo de la biodiversidad (Jablonski et. al., 2006). En comparación con otras áreas geográficas, en ellos se han originado el doble de las especies biológicas y se han extinguido en menor cuantía. La mayor biodiversidad del planeta se encuentra en los países tropicales en vías de desarrollo. La creciente demanda de los recursos genéticos para su uso en la biotecnología, los fármacos, los cosméticos, la agricultura, etc. han incrementado su valor económico, científico y comercial. La utilización de plantas y

animales potencialmente útiles es una opción viable para el desarrollo sustentable, reducir la pobreza y generar riqueza en estos países.

Sin embargo, actualmente algunas especies han estado desapareciendo de manera desproporcionada: entre 50 y 100 veces por encima del ritmo natural. A ese ritmo, en mil años no quedará ninguna, incluido el Homo sapiens. Como el ritmo de desaparición de especies es superior al de los descubrimientos de nuevas sustancias procedentes de los recursos naturales (Vilches et. al., 2008), cada vez que desaparece una estamos perdiendo una alternativa para el futuro. Sin embargo, la amenaza más grave a la diversidad biológica es la degradación y la pérdida directa de los ecosistemas (bosques, humedales, arrecifes de coral, etc.) (Fuentes, 2004).

El Estudio Nacional sobre la Diversidad Biológica de la República de Cuba (Vales et. al., 1998), define al archipiélago cubano como el de mayor diversidad biológica de las Antillas, con el más alto índice de endemismo de la región, donde se destaca la flora por la riqueza total de especies y su endemismo. La flora cubana cuenta con cerca de 8 000 especies de plantas terrestres de las cuales entre 45 y 50% son endémicas (Serrano y Fernández, 2005; Fuentes, 2004).

En el conocimiento de las plantas medicinales cubanas existe una amplia información, desde los trabajos clásicos de Juan T. Roig (Roig, 1988, 1974), pasando por la sistemática labor de la Revista Cubana de Plantas Medicinales (ISSN 1028-4796), publicada desde 1996 por la Comisión Nacional Asesora en Investigaciones de Plantas Medicinales del MINSAP.

A fin de conocer la presencia de los recursos genéticos y el conocimiento etnofarmacológico en las patentes cubanas, se consultó la Base de Datos de patentes concedidas en Cuba en el sitio Web de la Oficina Cubana de la Propiedad Industrial (OCPI). En la estrategia de búsqueda se solicitaron las patentes cuyos titulares fueran de Cuba y con la clasificación internacional A61K, es decir, productos farmacéuticos. La Clasificación Internacional de Patentes (WIPO, 2009) es un sistema jerárquico de símbolos de lenguaje para la clasificación de las patentes y los modelos de utilidad según las diferentes áreas de la tecnología a que pertenecen.

Para saber a cuales patentes de las recuperadas se les había solicitado su registro en el extranjero, se consultó la Base de Datos PATENSCOPE en el sitio Web de la OMPI, que contiene las solicitudes internacionales de patentes por la vía del Tratado de Cooperación en Materia de Patentes o PCT (Patent




Cooperation Treaty). En la estrategia de búsqueda se solicitaron las patentes cuyo país de origen fuera Cuba y que contuvieran la clasificación internacional A61K.

RESULTADOS

En el sitio Web de la OCPI, se recuperaron 182 registros que, al analizarlos en detalle, resultaron en 45 patentes relacionadas con los recursos genéticos

nacionales cuyos pormenores se describen en el Anexo 1. El texto completo de las patentes se puede obtener en el sitio Web de la OCPI.

La Tabla 1 brinda información acerca de los recursos genéticos presentes en las patentes recuperadas, que abarcan mayoritariamente plantas, algunos animales (principalmente insectos) y pocos recursos minerales.

Tabla 1. Recursos genéticos en las patentes cubanas. Nr Recurso Genético (a) Nombre vulgar Conocimiento

Etnofarmacológico (b) Cant. de Patentes

1 Allophylus cominia (L) Sw Palo de Caja 1 2 Aloe vera (L.) N.L. Burm

Aloe barbadensis Mill Sábila SI 2

3 Carapa guianensis Aubl. Najesí SI 1 4 Catharanthus roseus (L.) G. Don Vicaria SI 2 5 Centella erecta (L.f.) Fern Oreja de Ratón SI 1 6 Chamomilla recutita (L.) Rauschert (Matricaria

recutita L.) Manzanilla SI 1

7 Clusia rosea Jacq Copey SI 1 8 Hibiscus elatus Sw Majagua SI 1 9 Hippeastrum equestre (Aiton) Herb Amapola 1 10 Justicia pectoralis Jacq;, Tilo SI 1 11 Mangifera indica L Mango SI 1 12 Morinda royoc L. Curamaguey, Paja de ratón,

Garañón, Piñi piñi SI 1

13 Mussa paradisiaca L. Plátano SI 2 14 Orthosiphon grandiflorus Terracciano 1 15 Passiflora incarnata L. Pasiflora, Pasionaria SI 1 16 Petiveria alliacea L. Anamú SI 2 17 Pinus caribaea Morelet Pino Macho SI 1 18 Piper aduncum L. s.l. Platanillo de Cuba SI 1 19 Plantago major L., Llantén, Llantén mayor SI 1 20 Rhizophora mangle L. Mangle Rojo SI 1 21 Roystonea regia (Kunth) O.F. Cook Palma real SI 1 22 Saccharum officinarum L. Caña de Azúcar SI 4 23 Sapium jamaicense Sw. 1 24 Solanum nigrum (Solanum nigrum var.

americanum Mill). Yerba Mora SI 1

25 Zingiber officinale Roscoe Jengibre SI 1 26 Thalassia testudinum Banks & Sol. Hierba de tortuga o Seiba. 1 27 Chlorella vulgaris Microalga 2 28 Arthrospira sp Microalga (Spirullina) 1 29 Apis mellifera L. (Propóleo) Propóleo SI 2 30 Apis mellifera L. (Cera) Cera 2 31 Crustáceos Crustáceos 2 32 Blomia tropicalis Ácaro doméstico 1 33 Dermatophagoides pteronyssinus Ácaro doméstico 1 34 Dermatophagoides siboney Ácaro doméstico 1 35 Rhopalurus Junceus Alacrán 1 36 Spirobolus marginatus Cocosí (ciempiés) 1 37 Sabellastarte magnifica Anélido marino 1 38 Condylactis gigantea Anémona marina 1 39 Stoichactis helianthus Anémona marina 2 40 Dolomitas Carbonatos 1 41 Peloides Fangos minero-medicinales SI 1

a) Tropicos.org. Missouri Botanical Garden. <http://www.tropicos.org/>.(Fecha de consulta: 10 Agosto 2009) b) Fuentes VR, Expósito A. 1995.




En la Tabla 2 se exponen los solicitantes de las patentes.

La Figura 1 muestra el comportamiento en el tiempo de las solicitudes cubanas. La OCPI sólo publica las patentes otorgadas, que en este caso abarcan desde 1984 hasta 2005.

Tabla 2. Solicitantes de las patentes cubanas Nr. Solicitudes Solicitante 1 5 Centro Nacional de Investigaciones

Científicas 2 4 Laboratorios Dalmer S.A 3 4 Universidad de la Habana 4 3 Instituto de Farmacia y Alimentos 5 2 Bordier, Misael; Martínez, Milagros Ma.;

Salgado, Héctor; Bory, Guillermo 6 2 Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria 7 2 Instituto Superior de Medicina Militar "Dr.

Luis Díaz Soto" 8 2 Ministerio de Salud Pública 9 1 Centro de Bioactivos Marinos 10 1 Centro de Investigación y Desarrollo de

Medicamentos 11 1 Centro de Investigaciones de Energía Solar 12 1 Centro de Investigaciones Pesqueras 13 1 Centro de Química Farmacéutica 14 1 Centro Internacional de Salud "La Pradera" 15 1 Centro Nacional de Biopreparados 16 1 Centro Nacional de Termalismo “Víctor

Santamarina” 17 1 Córdova Siveiro, Eleuterio Eugenio 18 1 Empresa Laboratorio Farmacéutico "8 de

marzo" 19 1 Empresa Laboratorio Farmacéutico "Mario

Muñoz" 20 1 Facultad de Agronomía de Sabaneta 21 1 Facultad de Biología, Universidad de La

Habana 22 1 Grupo Empresarial de Producciones

Biofarmacéuticas y Químicas 23 1 Instituto Politécnico "Villena - Revolución" 24 1 Instituto Superior de Ciencias Médicas de la

Habana 25 1 Instituto Superior Politécnico "José Antonio

Echeverria " 26 1 López, Ovadys 27 1 López, Ovadys; Mesa, Ángel 28 1 Ministerio de las Fuerzas Armadas

Revolucionarias 29 1 Unión Geológica Minera

Atendiendo a la Clasificación Internacional de

Patentes, en las Tablas 3 y 4 se muestra detalladamente la distribución de las patentes

cubanas por subgrupos y subclases de la Clasificación Internacional y en las Figuras 2 y 3 sus representaciones gráficas.

Tabla 3. Frecuencia por subgrupos de la clasificación internacional Subgrupo Frecuencia Subgrupo Frecuencia A61K 35/78 22 A61K 7/50 1 A23L 1/48 3 A61K 9/00 1 A61K 35/64 3 A61K 9/02 1 A61K 31/20 2 A61K 9/06 1 A61K 31/45 2 A61K 9/20 1 A61K 31/722 2 A61L 2/00 1 A61K 35/56 2 A61P 1/04 1 A61K 35/80 2 A61P 1/06 1 A61K 37/54 2 A61P 15/02 1 A23J 1 A61P 17/02 1 A23L 1 A61P 17/06 1 A23L 1/29 1 A61P 19/02 1 A23L 1/59 1 A61P 35/00 1 A23P 1/02 1 A61P 39/06 1 A61J 3/08 1 B01D 9/02 1 A61K 25/00 1 C01F 1/00 1 A61K 31/19 1 C07C 51/41 1 A61K 31/40 1 C07C 59/245 1 A61K 31/45 1 C07D 491/147 1 A61K 33/06 1 C07K 1/14 1 A61K 37/02 1 C07K 14/81 1 A61K 38/57 1 C08B 37/08 1 A61K 39/00 1 C12N 9/20 1 A61K 39/35 1 C12N 9/64 1 A61K 7/48 1

De la base de datos PATENSCOPE se

recuperaron 111 solicitudes, de las cuales sólo 6 aparecen entre las 45 patentes cubanas anteriormente referidas. En el Anexo 2 se brindan los detalles de estas patentes junto a una solicitud, aún no otorgada en Cuba, por lo que no se encuentra en el Anexo 1.

En la Tabla 5 se muestra la distribución de las patentes cubanas solicitadas en el extranjero por subgrupos de la Clasificación Internacional. Esta clasificación ha variado en el tiempo haciéndose más detallada, por lo que la misma no coincide con la de las patentes tramitadas hace algunos años.




Tabla 4. Frecuencia por subclases de la clasificación internacional

Subclase Frecuencia Subclase Frecuencia A61K 52 A23P 1 A61P 8 A61J 1 A23L 6 A61L 1 C07C 2 B01D 1 C07K 2 C01F 1 C12N 2 C07D 1 A23J 1 C08B 1

Tabla 5. Patentes cubanas solicitadas al extranjero. Solicitudes por subgrupos de la clasificación internacional Nr. Subclase Solicitu

des Nr. Subclase Solicitude

s 1 A23L 1/30 1 14 A61K 36/9068 1 2 A61K 8/11 1 15 A61K 39/106 1 3 A61K 8/97 1 16 A61K 45/06 1 4 A61K 9/28 1 17 A61P 3/10 1 5 A61K 31/20 1 18 A61P 5/28 1 6 A61K 31/45 1 19 A61P 13/08 2 7 A61K 31/60 1 20 A61P 25/06 1 8 A61K 36/185 1 21 A61P 29/00 1 9 A61K 36/19 1 22 A61Q 19/00 1 10 A61K 36/28 1 23 C07C 29/76 1 11 A61K 36/42 1 24 C07C 29/88 1 12 A61K 36/53 1 25 C07C 31/02 1 13 A61K 36/68 1 26 C07C 31/125 1

En el Anexo 3 se brinda la descripción de las

claves de la Clasificación Internacional en las patentes recuperadas.

Figura 1. Patentes cubanas de recursos genéticos. Solicitudes por años de presentación.

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5

6

7

8

9

1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004

SOLI

CIT

UD

ES

AÑOS




Figura 2. Patentes cubanas de recursos genéticos. Solicitudes por subgrupos de la clasificación internacional.

Figura 3. Patentes cubanas de recursos genéticos. Subclases de la clasificación internacional en las patentes.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 NÚMERO DE LA PATENTE

F R

C12N C08B C07K C07D C07C C01F B01D A61P A61L A61K A61J A23P A23L A23J

A23L 1/48, 3 A61K 35/64, 3

A61K 31/20, 2 A61K 31/45, 2

A61K 31/722, 2 A61K 35/56, 2

A61K 35/80, 2 A61K 37/54, 2

OTROS, 40

A61K 35/78, 22

A61K 35/78 A23L 1/48 A61K 35/64 A61K 31/20 A61K 31/45 A61K 31/722 A61K 35/56 A61K 35/80 A61K 37/54 OTROS




DISCUSIÓN

El carácter multiétnico de la identidad nacional cubana, tributaria fundamentalmente de dos grandes troncos, el hispano y el africano, unido al respeto de nuestro pueblo por las tradiciones de otras etnias (chinos, caribeños, etc.) insertadas posteriormente en nuestra nación, ha facilitado la preservación de tradiciones culturales patrimoniales a la que no escapa la etnofarmacología (Beyra et. al., 2004; Hernández y Volpato, 2004; Volpato y Godinez, 2004; Volpato et. al., 2009).

En la etnofarmacología cubana el campo más estudiado ha sido la etnobotánica, donde las encuestas realizadas han evidenciado no sólo la rica tradición popular sobre el conocimiento de las plantas medicinales, sino también el amplio uso que de ellas hace nuestra población. En estos trabajos se han documentado alrededor de 1170 especies con propiedades botánicas medicinales comprobadas o atribuidas por la población (Fuentes y Expósito, 1995; Scull et. al., 1998; Hernández y Volpato, 2004; Godinez y Volpato, 2008; Volpato y Godinez, 2004; Volpato et. al., 2009). Algunas plantas endémicas de Cuba se citan en el conocimiento etnobotánico (Fuentes y Expósito, 1995; Hernández y Volpato, 2004).

En Cuba el interés por las plantas medicinales abarca, junto al beneficio antropológico y farmacológico, la necesidad de disponer de recursos propios en diferentes circunstancias relacionadas con el bloqueo de los Estados Unidos contra Cuba (Gardfield y Santana, 1997; Kirkpatrick, 1997; AAWH, 1997). A partir de 1991 se introdujo el saber tradicional en la atención primaria de la salud (MINSAP 1992a, 1992b, 1993). Esta estrategia se fortaleció en 1999 con un programa nacional para introducir y generalizar la medicina natural y tradicional (MINSAP, 1999; Fuentes, 1996; Soler y Porto, 1997; Acosta, 2001) que se mantiene en nuestros días. El interés por la utilización de las propiedades bioactivas de las plantas ha trascendido también a otros campos como el de los plaguicidas (Pino et. al., 2008).

El recurso que aparece en el mayor número de las patentes cubanas recuperadas, con 4, es la caña de azúcar (Tabla 1), seguidos por la sábila, la vicaria, el plátano, el anamú, una microalga, productos apícolas, los crustáceos y cierta anémona marina, con 2 patentes cada uno. Cómo recursos autóctonos se

identificaron sólo dos, una especie de pino, Pinus caribaea Morelet, y un ácaro doméstico, Dermatophagoides siboney.

La inmensa mayoría de los recursos fitogenéticos terrestres presentes en estas patentes pertenecen al conocimiento etnofarmacológico. Aunque no siempre las patentes se refieren a su uso tradicional, en ocasiones, el conocimiento objeto de la patente se deriva del tradicional, pero éste no se declara en el estado del arte o la referencia es muy general.

Del comportamiento en el tiempo de las solicitudes cubanas (Figura 1) podemos apreciar las pocas patentes solicitadas cada año, con un máximo de 8 en 1998.

Las 45 patentes recuperadas fueron solicitadas por 29 entidades cubanas (Tabla 2). Se destacan el Centro Nacional de Investigaciones Científicas, con 5 solicitudes, y Laboratorios Dalmer S.A. y la Universidad de La Habana, con 4 cada una.

De acuerdo a la Clasificación Internacional de Patentes, las patentes recuperadas abarcan 49 subgrupos (Tabla 3, Figura 2), siendo el A61K 35/78 (Preparaciones medicinales de constitución indeterminada que contiene el material de algas, líquenes, hongos o plantas, o sus derivados, por ejemplo las medicinas herbarias tradicionales) el más recurrente, pues está presente en el 49 % de las patentes. El subgrupo A61K 35/78 se denomina actualmente como A61K 36/00.

La distribución en las patentes de las subclases de la Clasificación Internacional (Tabla 4) permite conocer con detalle el objeto de las patentes (ver Anexo 3). A continuación de la mayoritaria subclase A61K, le sigue la A61P, con 8 patentes con “actividad terapéutica de compuestos químicos o preparaciones medicinales” y la A23L con 6 en las que se protege también la preservación de comidas o comestibles en general. El gráfico de la Figura 3 facilita el análisis de las semejanzas y diferencias entre las solicitudes. Se observa que muchas patentes sólo poseen la subclase A61K. La solicitud Nr. 31 (ver Anexo 1) es la que abarca más subclases con 5. Se puede también apreciar la semejanza en las patentes de la distribución por subclases, por ejemplo, las solicitudes 28, 32, 38 y 39 se catalogan sólo con las subclases A61K y A61P.

Sólo 7 de las patentes cubanas han demandado su registro en el extranjero (Anexo 2). Estas solicitudes abarcan desde 1994 hasta el 2009 y




únicamente en el 2004 se realizó más de una solicitud; en algunos años no se realizaron solicitudes.

Las instituciones cubanas solicitantes en el extranjero son 5, siendo los Laboratorios Dalmer S.A. la de mayor cantidad de solicitudes con 3. Las otras 4 instituciones han presentado respectivamente una solicitud.

En la distribución de las patentes cubanas solicitadas en el extranjero por subgrupos de la Clasificación Internacional (Tabla 5), se observa que las patentes recuperadas abarcan 26 subgrupos, siendo el A61P 13/08, (Fármacos para desórdenes del sistema unitario: de la próstata), el único presente en 2 patentes.

CONCLUSIONES La gestión de patentes con base a los recursos

genéticos y etnofarmacológicos es pobre en comparación con nuestra gran riqueza genética, biodiversidad, conocimiento y preservación de las tradiciones culturales en esta temática.

La presencia de un alto endemismo en nuestros recursos, particularmente en la flora, potencia la importancia de esta situación.

La falta de atención a la utilización y protección de nuestros valiosos recursos nos puede llevar a la pérdida de muy probables y valiosas alternativas farmacológicas para el presente y futuro.

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Anexo 1. Patentes cubanas relacionadas con el conocimiento etnofarmacológico y/o los recursos genéticos nacionales

Nr. Título Fecha de Publicación

Clasificación Internacional

Nr. de Solicitud

Solicitante

1 Procedimiento para la obtención de Catharanthina y Vindolina a partir de Catharanthus roseus G. Don

1984.09.06 A61K 35/78 36153 Empresa Laboratorio Farmacéutico "8 de marzo"

2 Procedimiento para la obtención de Ajmalicina a partir del Catharanthus roseus G. Don

1986.12.17 A61K 35/78 C07D 491/147

217/86 Empresa Laboratorio Farmacéutico "Mario Muñoz"

3 Ungüento de Quitina 1988.03.03 A61K 9/06 C08B 37/08

23/88 Universidad de la Habana

4 Forma farmacéutica estable con efectos antiasmáticos. Su procedimiento de obtención

1988.03.16 A61K 35/78 29/88 Centro Nacional de Investigaciones Científicas

5 Método de obtención de Propóleo 1988.07.08 A61K 35/64 113/88 Ministerio de Salud Pública 6 Método de purificación de inhibidores de

proteasas de la anémona marina Stoichactis helianthus y el producto así obtenido

1988.12.12 A61K 37/54 200/88 Universidad de la Habana

7 Procedimiento para la obtención de Fosfolipasa A2 de la anémona Stoichactis helianthus y el producto así obtenido

1989.01.26 C12N 9/20 A61K 37/54


8 Procedimiento para la purificación de un polipéptido con actividad anticolinérgica de la anémona marina Condylactis gigantea

1989.02.08 C07K 1/14 A61K 37/02


9 Extracto inyectable de Aloe barbadensis antiviral e inmunoactivador. Procedimiento de obtención*

1989.12.04 A61K 35/78 236/89

Instituto Superior de Medicina Militar

10 Jarabe Vegetal Antiasmático* 1989.02.13 A61K 35/78 34/89 Ministerio de Salud Pública 11 Composición farmacéutica que contiene mezcla

de alcoholes alifáticos primarios superiores para el tratamiento de hipercolesterolemia y la hiperlipoproteinemia tipo II así como estimulante de la conducta sexual en animales y humanos.


12 Forma farmacéutica estable con efecto sobre sistema inmunológico. su procedimiento de obtención


13 Base Universal* 1991.03.04 A61K 35/78 27/91 Ministerio de las Fuerzas


http://www.oei.es/decada/accion18.htm�

http://www.ethnobiomed.com/content/5/1/16�

http://www.wipo.int/%20classifications/%20ipc/%20ipc8/%20?lang=en�

http://www.wipo.int/%20classifications/%20ipc/%20ipc8/%20?lang=en�



Armadas Revolucionarias

14 Policonasol, una mezcla de alcoholes alifáticos primarios superiores para el tratamiento de complicaciones atereoescleróticas tales como la hiperagregabilidad plaquetaria, los accidentes isquémicos, trombosis e incluso su efectividad contra úlceras gástricas químicamente inducidas y su proceso de obtención de la caña

1992.09.29 A61K 31/045 107/92 Laboratorios Dalmer S.A

15 Procedimiento de obtención y validación de un extracto hidroalcoholico de cuproclorofilinas a partir de microalgas y producto así obtenido

1992.11.05 A61K 31/40 A61K 35/80 A61L 2/00

121/92 Centro de Investigaciones de Energía Solar

16 Pomada de usos múltiples en la Medicina Veterinaria

1993.10.07 A61K 35/78 88/93 Facultad de Agronomía de Sabaneta

17 Productos con actividad hipoglicemiante, método para su obtención

1993.10.22 A61K 35/78 A61K 31/19

95/93 Instituto Superior de Ciencias Médicas de la Habana

18 Una mezcla natural compuesta por alcoholes alifáticos primarios superiores obtenidos de la cera de abejas para el tratamiento de las úlceras gástricas y duodenales que presenta también actividad antiinflamatoria.

1993.11.09 A61K 31/45 A61K 35/64

101/93 Laboratorios Dalmer S.A

19 Composición Antitumoral 1994.01.11 A61K 35/56 1994/4 Grupo Empresarial de Producciones Biofarmacéuticas y Químicas

20 Composición Fungicida 1994.01.11 A61K 35/56 7/94 Bordier, Misael; Martínez, Milagros Ma.; Salgado, Héctor Bory, Guillermo

21 Composición Insecticida 1994.01.11 A61K 35/78 8/94 Bordier, Misael; Martínez, Milagros Ma.; Salgado, Héctor Bory, Guillermo

22 Procedimiento para la obtención de formulaciones de Rhizophora mangle l.

1994.10.07 A61K 35/78 1994/115 Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria

23 Obtención de jabón de baño utilizando fangos minero medicinales o peloides

1995.02.10 A61K 7/50 11/95 Unión Geológica Minera

24 Medicamento contra parásitos y bacterias en animales y humanos

1995.11.10 A61K 35/78 1995/112 López, Ovadys; Mesa, Ángel

25 Preparación medicinal efectiva contra escaras y ulceras externas

1995.11.10 A61K 35/78 1995/113 López, Ovadys

26 Suplemento alimenticio de origen natural y su procedimiento de obtención

1997.01.14 A61K 35/78 A61K 25/00 A23L 1/48

1997/009 Instituto Politécnico "Villena - Revolución"

27 Mezcla de ácidos grasos primarios de alto peso molecular obtenidos de la cera de caña de azúcar y sus usos farmacéuticos

1997.04.02 A61K 31/20 1997/035 Laboratorios Dalmer S.A

28 Composición farmacéutica para el tratamiento de los procesos inflamatorios

1997.05.30 A61K 35/80 A61P 19/02 A61P 1/06

1997/057 Centro Nacional de Investigaciones Científicas

29 Supositorios de Quitina 1998.01.07 A61J 3/08 A61K 31/722 A61K 9/02 A61P 17/02

1998/1 Instituto de Farmacia y Alimentos




30 Composición Vegetal Antisolar 1998.01.14 A61K 35/78 1998/2 Instituto Superior de Medicina Militar “Dr. Luis Díaz Soto”

31 Proceso de obtención de citrato de calcio y magnesio a partir de dolomitas. Composiciones que lo contienen y uso como suplemento nutricional.*

1998.06.19 C01F 1/00 A61K 33/06 A61K 9/00 C07C 51/41 C07C 59/245 A23L 1/48 A23L 1/059 A23P 1/02

1998/082 Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

32 Tabletas de Quitina para el tratamiento de la ulcera péptica

1998.09.15 A61K 31/722 A61P 1/04 A61K 9/20

1998/129 Instituto de Farmacia y Alimentos

33 Procedimiento de obtención del polvo de pseudo tallo de plátano

1998.11.17 A61K 35/78 1998/0176 Instituto Superior Politécnico “José Antonio Echeverria “

34 Formulación cosmética con propiedades terapéuticas

1998.12.10 A61K 7/48 1998/0192 Centro Nacional de Termalismo “Víctor Santamarina”

35 Procedimiento de obtención de vino reconstituyente a partir de productos de la colmena y el producto obtenido

1998.12.24 A23L A23J A61K 35/64

1998/200 Córdova Siveiro, Eleuterio Eugenio

36 Composiciones farmacéuticas y nutricionales a partir de extractos de Mangifera indica L.

1998.12.29 A61K 35/78 A23L 1/29 A23L 1/48 A61P 35/00 A61P 39/06

1998/203 Centro de Química Farmacéutica

37 Medio y método de cultivo de ácaros del polvo doméstico, para la fabricación de vacunas de alérgenos y productos obtenidos mediante los mismos

1999.11.05 A61K 39/35 A61K 39/00

1999/0186 Centro Nacional de Biopreparados

38 Procedimiento de obtención de cuproclorofila, formulaciones de productos a partir del principio activo y método de tratamiento

2000.05.08 A61K 35/78 A61P 15/02

2000- 0099 Centro de Investigaciones Pesqueras

39 Composición farmacéutica a partir de una mezcla de ácidos grasos obtenida del aceite de la cera de la caña de azúcar

2000.06.07 A61K 31/20 A61P 17/06

2000-0134 Centro Nacional de Investigaciones Científicas

40 Extracto de la planta marina Thalassia testudinum con actividad antienvejecimiento, antiinflamatoria y analgésica, su obtención y formulaciones que lo contienen

2000.11.07 A61K 35/78 2000- 0246 Centro de Bioactivos Marinos

41 Extracto de origen natural con actividad hipoglicemiante y procedimiento para su obtención

2001.04.13 A61K 35/78 2001- 0091 Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria

42 Procedimiento de aislamiento y purificación de un inhibidor de carboxipeptidasa a partir del anélido marino Sabellastarte magnifica

2002.02.28 C12N 9/64 A61K 38/57 C07K 14/81

2002- 0046 Facultad de Biología, Universidad de La Habana

43 Extracto obtenido a partir de frutos de Roystonea regia utilizado contra la hiperplasia prostática y la prostatitis

2003.03.20 A61K 35/78 2003- 0062 Laboratorios Dalmer S.A

44 Procedimiento para la obtención de Nemorosona a partir de la especie Clusia rósea

2004.03.10 B01D 9/02 2004- 0046 Instituto de Farmacia y Alimentos

45 Composición farmacéutica a base de extractos de plantas para el tratamiento y prevención de la migraña

2005.10.25 A61K 35/78 2005- 0205 Centro Internacional de Salud "La Pradera"




Anexo 2. Patentes cubanas solicitadas vía PCT relacionadas con el conocimiento etnofarmacológico y/o los recursos genéticos nacionales

Nr. Título Fecha de Publicación

Nr. de Solicitud Nr. OCPI Solicitante

1 (WO 1994/007830) A mixture of higher primary aliphatic alcohols, its obtention from sugar cane wax and its pharmaceutical uses

14.04.1994 PCT/EP1993/000007

107/92 Laboratorios Dalmer S.A.

2 (WO 1998/043631) Mixture of primary fatty acids obtained from sugar cane wax

08.10.1998 PCT/IB1998/000870

1997/035 Laboratorios Dalmer S.A.

3 (WO 2000/038699) Composiciones obtenidas a partir de Mangifera indica L.)

06.07.2000 PCT/CU1999/000007

1998/203 Centro de Química Farmacéutica

4 (WO 2004/110467) Extracto de origen natural con actividad hipoglicemiante y procedimiento para su obtención

23.12.2004 PCT/CU2003/000008

2001- 0091 Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria

5 (WO 2004/082696) Composición farmacéutica y procedimiento para el tratamiento y prevención de la hiperplasia prostática y la prostatitis a partir de los frutos de Roystones regia (palma real)

30.09.2004 PCT/CU2004/000004

2003- 0062 Laboratorios Dalmer S.A.

6 (WO 2007/048356) Composición farmacéutica a base de extractos de plantas para el tratamiento y/o prevención de la migraña

03.05.2007 PCT/CU2006/000010

2005- 0205 Centro Internacional de Salud 'La Pradera'

7 (WO 2009/071033) Procedimiento para mejorar la estabilidad y la biodisponibilidad de extracto lipídico de semillas de Cucurbita pepo L. y composición resultante.

11.06.2009 PCT/CU2008/000010

No publicada Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

Anexo 3. Clasificación internacional de patentes SECCIÓN A --- NECESIDADES HUMANAS A23 COMIDAS O COMESTIBLES; SU TRATAMIENTO, NO CUBIERTO POR OTRAS CLASES. A23L Comidas, comestibles o bebidas no alcohólicas, no cubiertas por las subclases A21D o A23B a A23J. Su preparación o tratamiento, por ejemplo cocción, la modificación de calidades nutritivas, el tratamiento físico. Preservación de comidas o comestibles en general, A23J Composiciones de proteína para comestibles. Procesamiento de proteínas para comestibles. Composiciones de Fosfátidos para comestibles. A23P Procesamiento de comestibles, no totalmente cubiertos por otras subclases A61 CIENCIA MÉDICA O VETERINARIA; HIGIENE A61K Preparaciones para propósitos médico, dental, o de higiene (dispositivos o métodos adaptados especialmente para brindar productos farmacéuticos en una forma física particular o de administración). A61L Métodos o aparatos para esterilización de materiales u objetos en general; Desinfección, esterilización o desodorización del aire; Aspectos químicos de vendas, vendajes, almohadillas absorbentes o artículos quirúrgicos; Materiales para las vendas, vendajes, almohadillas absorbentes o artículos quirúrgicos. A61P Actividad terapéutica de compuestos químicos o preparaciones medicinales A61Q Uso de cosméticos o preparaciones similares de aseo.

SECCIÓN B--- REALIZACIÓN DE OPERACIONES; TRANSPORTACIÓN B01 PROCESOS FÍSICOS O QUÍMICOS O APARATOS EN GENERAL B01D Separación SECCIÓN C--- QUÍMICA; METALURGIA C01 QUÍMICA INORGÁNICA C01F Compuestos de los metales Berilio, Magnesio, Aluminio, Calcio, Estroncio, Bario, Radio, Torio o de metales de tierras raras. C07 QUÍMICA ORGÁNICA C07C Compuestos acíclicos o carbocíclicos C07D Compuestos heterocíclicos


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C07K Péptidos C08 COMPUESTOS ORGÁNICOS MACROMOLECULARES; SU PREPARACIÓN O PROCESAMIENTO QUÍMICO; COMPOSICIONES BASADAS EN SIMILARES C08B Polisacáridos. Sus derivados. C12 BIOQUÍMICA; CERVEZA; BEBIDAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGÍA; ENZIMOLOGÍA; MUTACIÓN O INGENIERÍA GENÉTICA C12N Microorganismos o enzimas. Sus composiciones. Propagación, conservación o mantenimiento de los microorganismos; Mutación o Ingeniería Genética; Medios de cultivo.




Artículo Original



Aspectos de la comercialización y control de calidad de las plantas medicinales más vendidas en una comunidad urbana del NO de la

Patagonia Argentina

[Aspects of marketing and quality control of medicinal plants most sold in an urban community of NW Patagonia, Argentina]

Florencia CUASSOLO1,2, Ana LADIO1,2, Cecilia EZCURRA1,2

1. Universidad Nacional del Comahue, Centro Regional Universitario Bariloche, Argentina, 2. CONICET-INIBIOMA, Bariloche, Argentina

Abstract

In the last decades there has been an increase in the consumption of medicinal plants worldwide. In Argentina, this increase coincides with an inefficient action of the control organisms. Semi-structured interviews were conducted to medicinal plants sellers at 13 sites in Bariloche in order to investigate general aspects of marketing. In total, 64 samples were obtained for the most traded species in the city; these were analyzed by morphological and micrographic methods, determining the degree of adulteration. The monoherbs are marketed mainly by their common name, packed in transparent cellophane bags, and the materials are mostly fragmented. About 30% of the samples showed adulteration, the main adulterant being grasses. We conclude that in Bariloche, the quality control agencies are inefficient, which can lead to health problems for people and discredit to phytomedicine.

Keywords: urban ethnobotany, medicinal plants; quality control; adulteration; Patagonia

Resumen

En las últimas décadas se ha detectado un incremento en el consumo de plantas medicinales a nivel mundial. En Argentina, este incremento convive con un ineficiente accionar de los organismos de control. Se realizaron entrevistas semiestructuradas a expendedores de plantas medicinales en 13 sitios de venta de Bariloche con el objeto de indagar aspectos generales de su comercialización. En total se obtuvieron 64 muestras correspondientes a las especies más comercializadas en la cuidad, las que fueron analizadas con métodos morfológicos y micrográficos, determinándose su grado de pureza. Las monohierbas se comercializan principalmente por su nombre vulgar, envasadas en bolsa de celofán transparente, y el material se presenta principalmente fragmentado. Un 30% de las muestras resultó con adulteración, siendo el principal elemento adulterante las gramíneas. Se concluye que en Bariloche, los organismos de control de calidad son ineficientes, esto puede generar problemas de salud para la población y desprestigio hacia la fitomedicina.

Palabras Clave: etnobotánica urbana; plantas medicinales; control de calidad; adulteración; Patagonia

Recibido | Received: December 12, 2009. Aceptado en versión corregida | Accepted in revised form: March 3, 2010. Publicado en línea | Published online; May 25, 2010 Declaración de intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiación | Funding: This work was financed by FONCYT( PICT 2007-02289 directed by Ana Ladio) This article must be cited as: Florencia Cuassolo; Ana Ladio; Cecilia Ezcurra. 2010. Aspectos de la comercialización y control de calidad de las plantas medicinales más vendidas en una comunidad urbana del NO de la Patagonia Argentina. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 9(3):166-176. {EPub May 25, 2010}. *Contactos | Contacts: [email protected], [email protected]





mailto:[email protected],�


Cuassolo et al. Plantas medicinales en una comunidad urbana de la Patagonia Argentina


INTRODUCCION

Las plantas medicinales, de acuerdo a la Organización Mundial de la Salud (OMS), son todas aquellas que "en una o más partes contienen sustancias activas, que son utilizadas por el ser humano con fines terapéuticos, dado que las mismas poseen una actividad biológica alterando o modificando el funcionamiento de órganos y sistemas del cuerpo humano” (Hoffmann et al., 1992; OMS, 2003; Tres, 2006; Martínez, et al., 2009). El 80% de la población mundial depende del uso de plantas medicinales para atender sus necesidades de asistencia médica primaria (OMS, 1987). La medicina herbolaria se basa principalmente en el consumo directo de plantas, por consiguiente su estudio se volvió una prioridad para varias instituciones internacionales y fue declarada de interés mundial por la OMS (OMS, 1987).

A nivel mundial, numerosos estudios etno-botánicos han sido efectuados, principalmente en áreas rurales de raigambre aborigen, con el objeto de recuperar los conocimientos sobre plantas medicinales que tienen los pobladores. En cambio, en zonas urbanas, aunque sigue vigente el uso de la fitoterapéutica entre sus habitantes, las investigaciones son menores dada la mayor complejidad de su abordaje (Pochettino et al., 2008; Arenas, 2007; Batista de Lima et al., 2007). De este modo han prevalecido este tipo de estudios en zonas rurales de la Patagonia (Estomba et al., 2006; Ladio et al., 2007, Ochoa, 2007; Fariña, 2008) y un sólo trabajo, hasta el momento, ha sido llevado a cabo en zonas urbanas (Cuassolo, 2009).

En todos los casos se constató que las plantas medicinales constituyen recursos muy significativos en la terapéutica popular y son usadas para dolencias que se tratan en el ámbito doméstico. Estos estudios han revelado que los pobladores de zonas rurales y comunidades Mapuches de Patagonia utilizan más de 100 especies medicinales, tanto de origen nativo como exótico (Citarella, 1995; Funes, 1999; Ladio, 2002; Estomba et al., 2005; 2006; Ladio et al., 2007). La flora exótica ha sido incorporada en su herbolaria desde tiempos de la colonización, y estos conocimientos y prácticas se han ido hibridando con el tiempo, mezclándose los nuevos saberes con los conocimientos previos (Ladio y Lozada, 2008; Molares y Ladio, 2009).

En áreas urbanas, pese a una mejor distribución de los servicios médicos oficiales que en regiones rurales, la utilización de plantas medicinales también

es de uso corriente y se debe a diversos factores. Uno de ellos es la vigencia de la medicina tradicional en gran parte de la población de ascendencia indígena que ha migrado a la ciudad, pero también se debe a la existencia del comercio de productos naturales que en los últimos años ha ido aumentando cada vez más en todo el mundo (Bandoni, 1995; Balick et al., 2000). Las razones de este aumento en la venta de productos naturales se deben a diversas razones. En el presente se ha producido el resurgimiento y difusión de las medicinas naturistas o las llamadas “medicinas alternativas” por oposición a la medicina alopática. Esta tendencia se sustenta en la creencia popular que el consumo de productos naturales es inocuo y que posee cierta superioridad sobre las drogas sintéticas, (Arenas, 2007; Pochettino et al., 2008).

Por otra parte están quienes relacionan de manera directa “lo natural” con una mejor calidad de vida. Esto último podría verse unido a la insatisfacción que encuentra el consumidor en los medicamentos y tratamientos médicos convencionales, e inclusive en la atracción que siente hacia las filosofías que implican un “cuidado holístico” (Arenas, 2007; Pochettino et al., 2008; Martínez et al., 2009).

Se suma a esto que para el caso de los países en vías de desarrollo, por razones económicas, solo una parte de la población con poder adquisitivo puede aspirar a sanarse con remedios sintéticos, mientras que gran parte de la población se sigue volcando hacia la fitoterapia (Hoffmann et al., 1992; Da Silva et al., 2006; Martínez et al., 2009).

En Argentina, en consonancia con lo que ocurre en el ámbito mundial, se ha manifestado este proceso en la amplia gama de oferta comercial de plantas medicinales y de productos derivados de ellas. Las farmacias, herboristerías, dietéticas, almacenes naturistas y hasta supermercados los comercializan promoviendo su consumo, produciendo de esta forma una gran demanda en zonas urbanizadas (Arenas, 2007). Por otra parte, como consecuencia de la carencia de medios en los organismos de control, estos recursos son comercializados desprovistos de control de calidad, razón por la cual puede implicar serios peligros para la salud de la sociedad (Guaglio y Rampini, 1985; Arenas, 2007).

Por ejemplo, es frecuente que no exista una correlación entre los componentes declarados en la etiqueta y el contenido real de los productos (Arenas, 2007). Se han detectado adulteraciones y sustituciones por otras plantas de morfología o acción fisiológica similar, como también contaminaciones y presencia de




especies tóxicas (Cortella et al., 2001; Arenas, 2007). Debido a esto, ha habido antecedentes de casos de intoxicación (Akerele, 1990; Hoffmann et al., 1992; Arenas y Cortella, 1996; Arenas et al., 1997; OMS, 2003). Por ejemplo en el Partido de Bahía Blanca se encontró que el 25% de los compradores de hierbas medicinales ha tenido problemas por el uso incorrecto de las mismas (Cambi y Hermann, 2001).

El objetivo de este trabajo fue estudiar aspectos de la comercialización, estado sanitario y calidad de las plantas medicinales que son vendidas en la ciudad de S.C. de Bariloche.

MATERIALES Y METODOS

Sitio de estudio Este trabajo se desarrolló en la ciudad de San

Carlos de Bariloche, provincia de Río Negro, Argentina. Esta ciudad está situada sobre el margen SE del lago Nahuel Huapi. Cuenta con una población de 100.000 habitantes según el Censo Nacional de Población y Vivienda 2001 (INDEC, 2001). La actividad económica principal de esta ciudad es el turismo, el cual en ciertos momentos del año (meses de invierno y verano) podría aumentar el número de consumidores de distintos enclaves culturales de plantas medicinales. La población de Bariloche se caracteriza por una gran afinidad al uso de plantas medicinales, dado que parte de ella es de ascendencia rural-Mapuche que vive en la ciudad, como de los numerosos residentes que se manifiestan particularmente inclinados a la vida natural y sana (Cuassolo, 2009).

Metodología La información obtenida es parte de un estudio

etnobotánico realizado en 2007-2008 que incluyó un muestreo aleatorio en 30 centros de expendio de plantas medicinales (farmacias, herboristerías, almacenes naturistas y dietéticas). Para este estudio solo se tomaron las muestras de 13 sitios de expendio (30 % del total), incluyendo a los comercios más representativos de Bariloche y por ser los de mayores volúmenes de venta. En cada sitio se realizaron entrevistas semiestructuradas que indagaron sobre aspectos generales de la venta, envasado y formas de conservación del material vegetal (Alexíades, 1996; Albuquerque et al., 2008). En total, se obtuvieron 64 muestras de monohierbas de las especies más comercializadas según los entrevistados de los centros de expendio. Las muestras fueron determinadas

taxonómicamente utilizando métodos morfológicos y micrográficos (Barboza et al., 2006; Gurni, 2007); y bibliografía especializada (Correa, 1971, 1984, 1988, 1999; Boelcke, 1981; Dimitri, 1988; Bown, 1995; Wiersema y León, 1999; Simpson y Ogorzaly, 2001; Panizza, 2002; De la Peña y Pensiero, 2004; Ezcurra y Brion, 2005; Barboza et al., 2006). Sólo un 8 % de las muestras no pudieron ser identificadas taxonómicamente. Cabe aclarar que el material se encontraba principalmente molido o fragmentado, más que pulverizado, con lo cual no fue necesario el análisis químico para la determinación.

Análisis de calidad, adulteración y reglamentación Cada muestra fue revisada en su totalidad y

pesada con balanza analítica. Posteriormente se separó la materia extraña y se estimó el porcentaje de adulteración utilizando el criterio establecido por la OMS (1998) del 1 % como máximo de materia extraña. Como materia extraña se entiende a aquellas partes de la planta o de otras plantas, parte o producto de un organismo y partes minerales, como suelo o piedras, que no han sido especificadas en los rótulos del material vegetal concerniente (OMS, 1998).

Se realizó un análisis de la información presente en el envase de cada muestra (rótulos) y se comparó con la reglamentación vigente para drogas vegetales de la ANMAT (Especialidades Medicinales, Disposición 2673/99, inciso 10: Condiciones de Venta). Para este fin se utilizó una clasificación modificada de Pochettino et al. (2008) según las irregularidades halladas en los rótulos: SNC: sin nombre científico o mal escrito, SFE: sin fecha de envasado, SFV: sin fecha de vencimiento, SIU: sin indicaciones de uso, SP: sin posología. Adicionalmente, se registró la ausencia de fecha de recolección en el rótulo (SFR). Este criterio si bien no es exigido por la reglamentación vigente, fue considerado en este trabajo debido a la importancia de esta fecha en la durabilidad de las drogas vegetales (Costaguta, 2006). Las muestras fueron depositadas en el Herbario de la Universidad Nacional del Comahue, en el Centro Regional Universitario Bariloche (BCRU).

Análisis de datos Cada muestra fue categorizada en “adulterado” y

“no adulterado” utilizando el criterio de la OMS mencionado anteriormente.




Figura 1: Sitio de estudio, Ciudad de San Carlos de Bariloche, Rio Negro, Argentina.




Tabla 1. Plantas medicinales comercializadas en S. C. de Bariloche. Descripción y composición de las muestras analizadas

Muestra Especie declarada en rótulo

Especie hallada Partes halladas

Tipo de materia extraña

Materia extraña (%)

Resultado

MO8 manzanilla Matricaria recutita

Fl y T gran cantidad de hojas de gramíneas

92 adulterado

CR3 manzanilla Matricaria recutita

Fl y H hojas y flores de sp. indeterminada,

insectos (dípteros) barro, ácaros vivos

5 adulterado

BO2 Valeriana officinalis

Valeriana officinalis?

R piedras y tierra 5 adulterado

IB0 yerba de la piedra Usnea hieronymi talo fruticoso

tallos, corteza, parasitado con hongos,

trozos de sustrato, 2 spp. de líquenes

foliosos indeterminados

4 adulterado

DMO9 carqueja Baccharis crispa PA tallos, hojas de gramíneas, hojas sp.

Indeterminada, piedras

4 adulterado

MO9 cola de caballo Equisetum giganteum

T y Fl tallos, piedras, tierra 4 adulterado

BA7 Malva silvestris Malva sylvestris H, T y S hojas de gramíneas, flores sp.

indeterminada, insectos

4 adulterado

HNJ0 boldo Peumus boldus H y T piedras, tierra, insectos, pluma.

2 adulterado

BO2 pasionaria Passiflora caerulea

PA hojas sp. indeterminada, hongos

en las hojas

2 adulterado

FAR4 boldo Peumus boldus H y T troncos, tallos y semillas de spp. indeterminadas

2 adulterado

ON1 paico Chenopodium ambrosioides

H, T, Fl y Fr

piedras, pelos, tallos de sp. indetreminada

2 adulterado

LP1 Valeriana officinalis

Valeriana officinalis?

R piedras, barro, hojas de gramíneas, hojas sp.

indeterminada

2 adulterado

AR3 Fucus Fucus vesiculosus

talo fucoide restos de gasterópodos marinos, trozos de

balanus, rocas marinas

2 adulterado

AL2 sen Cassia angustifólia

H, Fl, Fr hojas sp. indeterminada, pelos,

piedras

2 adulterado




NJ0 yerba del pollo Alternanthera pungens

Fl, T, H piedras, hojas de gramíneas, alambre,

trozo de ladrillo

1 adulterado

AR4 ruda sp. Ruta chalepensis PA hojas de sp. Indeterminada, hongos

1 adulterado

NJ0 poleo Lippia turbinata H, T, Fl hojas de gramíneas, tallos sp.

indeterminada

1 adulterado

FAC1 Cecropia pachystachia

Cecropia pachystachya

H y T tallos y hojas sp. indeterminada

1 adulterado

FCR3 carqueja Baccharis aff. salicifolia

H, T y Fl hojas de gramíneas y de sp. indeterminada

1 adulterado

FDH1 Aloysia polystachya Aloysia polystachya

H, T y Fl piedras, tierra, fruto sp. indeterminada

0.8 no adulterado

LP1 Chamomille recutita

Matricaria recutita

Fl hojas sp. indeterminada

0.7 no adulterado

AL2 malva Malva parviflora H y T hojas de gramíneas 0.7 no adulterado

FDT1 Cecropia pachystachia

Cecropia pachystachya

H y T hojas de gramíneas y de sp. indeterminada, fragmento bolsa nylon

0.7 no adulterado

AC1 Buddleja globosa Buddleja globosa

H, T y Fl hojas de gramíneas, insectos, pelos

0.6 no adulterado

NJ0 manzanilla Matricaria recutita

Fl y T hojas de gramíneas, dípteros, hojas sp.

indeterminada

0.5 no adulterado

ON1 ruda Ruta chalepensis T, H, Fr, S tallos de sp. indeterminada, piedras

0.5 no adulterado

NJ0 tilo Tilia sp. Fl hojas sp. indeterminada

0.5 no adulterado

DH1 Dorstenia brasilensis

Trichocline aff. Reptans

H, Fl y R hojas de gramíneas y de sp. indeterminada

0.5 adulterado

AR3 yerba del pollo Alternanthera pungens

PA hojas de gramíneas 0.5 no adulterado

AL2 manzanilla Matricaria recutita

Fl y T hojas de gramíneas, insectos

0.5 no adulterado

BA7 Matricaria chamomilla

Matricaria recutita

Fl y T hojas de gramíneas 0.5 no adulterado

ON7 Usnea hieronymi Usnea hieronymi talo fruticoso

trozos de sustrato 0.4 no adulterado

BO2 palo pichi Fabiana imbricata?

C fragmentos de líquen 0.4 no adulterado

CR3 yerba del pollo Alternanthera pungens

PA insectos, piedras 0.4 no adulterado




HNJ0 carqueja Baccharis crispa T y Fl hojas y tallos de sp. indeterminada

0.3 no adulterado

DAL2 boldo Peumus boldus H y T hojas de gramíneas 0.3 no adulterado

DT6 Matricaria chamomilla

Matricaria recutita

Fl, T y H hojas y semillas spp. indeterminadas,

insectos

0.3 no adulterado

LP1 Alternanthera pungens

Alternanthera pungens

H, T, Fl, S hojas de gramíneas 0.3 no adulterado

NJ0 paico Chenopodium ambrosioides

H, T, Fl y S piedras, hojas de gramíneas

0.2 no adulterado

FBA7 Cecropia palmata Cecropia pachystachya y

C. palmata

H y T hojas sp. indeterminada

0.2 no adulterado

AC1 Malva parviflora Malva parviflora H y T hojas de gramíneas 0.2 no adulterado

BO2 matico Buddleja globosa

H, T, Fl y Fr

tallos, hojas de gramíneas, poliquetos

0.1 no adulterado

HNJ0 ambay Cecropia pachystachya

H y T tallos sp. indeterminada

0.1 no adulterado

FON1 carqueja Baccharis articulata

T y Fl hojas sp. indeterminada, tallos

0.1 no adulterado

AC1 Cassia angustifolia Cassia angustifolia

H, Fl, Fr hojas de gramíneas, plumas, pelos spp.

indeterminadas

0.1 no adulterado

NJ0 cedrón Aloysia citriodora

H y T hojas de gramíneas, insectos

0.1 no adulterado

FON0 ajenjo Artemisia annua?

PA insecto vivo, piedras 0.1 no adulterado

AR4 matico Artemisia douglasiana

H, T y Fl ácaros vivos, hojas de gramíneas

0.1 no adulterado

AR5 Eucaliptus Eucalyptus aff. camaldulensis

H, T y Fr fragmento de nylon 0.1 no adulterado

FLP1 Baccharis articulata

Baccharis articulata

H,T y Fl 0 0 no adulterado

FAC1 Baccharis articulata

Baccharis articulata

H, T y Fl 0 0 no adulterado

BA7 centella asiatica Centella asiatica PE 0 0 no adulterado

DT1 Quassia amara Quassia amara? C 0 0 no adulterado

NJ0 Eucaliptus Eucaliptus aff. camaldulensis

H, T y Fr 0 0 no adulterado

LP1 Buddleja globosa Buddleja globosa

H, T, Fl y Fr

0 0 no adulterado

NJ0 nalca Gunnera tinctoria?

R 0 0 no adulterado

NJ0 ñancolahuen Valeriana carnosa?

R 0 0 no adulterado




DT1 Chenopodium ambrosioides

Chenopodium ambrosiodes

H y T 0 0 no adulterado

BA7 palo pichi Fabiana imbricata?

C 0 0 no adulterado

MO9 palo pichi Fabiana imbricata?

C 0 0 no adulterado

NJ0 palo pichi Fabiana imbricata?

C 0 0 no adulterado

DT1 Fabiana imbricata Fabiana imbricata?

C 0 0 no adulterado

DH1 no declarado Quillaja saponaria?

C 0 0 no adulterado

AR4 tilo Tilia sp. Fl 0 0 no adulterado

(N=64, en orden decreciente del % de materia extraña). Abreviaturas usadas: Contenido hallado: H= hojas, T=tallos y pecíolos, Fl=flores o estróbilos, Fr=frutos, S=semillas, C=cortezas, leños, maderas, R= raíces o rizomas, PA= partes aéreas, PE= planta entera, ?= no se pudo determinar por caracteres anatómico-morfológicos. Materia extraña (%)= porcentaje de m.e. en relación al peso total en g. Adulteración: cuando la muestra posee más del 1% del peso en m.e.

RESULTADOS Y DISCUSION

Comercialización La mayoría (64%) de las plantas medicinales que

se comercializan en S.C. de Bariloche se expenden bajo el nombre vulgar y solo en un 36% de las muestras el nombre científico está presente en los rótulos. Esto ocasiona numerosos inconvenientes dado que un mismo nombre vulgar puede corresponder a especies totalmente diferentes (De la Peña y Pensiero, 2004) e inclusive que sus aplicaciones terapéuticas sean totalmente opuestas (Pochettino et al., 2008; Arenas, 2007). Coincidentemente, en este trabajo se encontró que varios nombres vulgares distintos fueron aplicados a una misma especie, o un mismo nombre vulgar fue aplicado a especies muy diferentes entre sí (Tabla 1). Por ejemplo, bajo el nombre vulgar “matico” podemos encontrar a dos especies: Artemisia douglasiana (Asteraceae) oriunda del centro de Argentina (Barboza et al., 2006); y a Buddleja globosa (Buddlejaceae) que crece en la zona de los bosques templados del sur de Argentina y Chile (Hoffman et al., 1992), ambas utilizadas para úlceras estomacales y en particular Buddleja globosa tiene usos hepático, cicatrizante, desinfectante, para quemaduras e infecciones en piel y para el dolor de muelas. En el otro caso, seis muestras con nombre vulgar “carqueja” correspondieron a tres especies del genero Baccharis diferentes, de las cuales dos tienen uso hepatoprotector y digestivo, mientras que la otra es antirreumática, antiinflamatoria y tiene actividad antibacterial (Tabla 1). Es decir que el consumidor de esta especie no se

encontrará con el efecto deseado a menos que dé con la especie que lo posee, según donde compre sus especies medicinales. Acordando con Costaguta (2006), esta situación irregular y hasta azarosa en Bariloche puede producir serios problemas de salud en la población, originando además, descreimiento y opiniones de menosprecio hacia las medicinas herbales. En este sentido, para minimizar este problema, es sabido que los médicos de la ciudad que practican la fitomedicina, recomiendan a sus pacientes barilochenses recolectar ellos mismos sus plantas o les aconsejan sitios seguros de expendio.

En el 100 % de las muestras, el material se presenta seco y con distinto grado de molido o fragmentado. Se venden en general paquetes de 50, 25 ó 10 gramos, y en algunos casos donde el material se expende suelto, las cantidades pueden variar a pedido. El envasado consiste en bolsas de celofán o nylon (66%) y en menor proporción en bolsas de papel madera (34%). En los casos donde la modalidad de venta fue “todo suelto” el almacenamiento en el comercio varió entre frascos de color caramelo (en un solo caso), tachos de pintura de 20 litros (4 casos), y bolsas de arpillera o bolsas de papel (9 casos).

Según Costaguta (2006), el envasado en bolsas transparentes permeables a la luz promueve la condensación de humedad al recibir calor o sol directo, esto se produce porque las plantas conservan un porcentaje de humedad aún después de realizarse correctamente su secado, lo cual afecta directamente la eficacia de una droga vegetal. En este sentido se observó que el 30% de los sitios de expendio poseían los exhibidores de plantas medicinales de cara al sol. De los sitios de muestreos analizados,




aproximadamente el 23% comercializaba plantas obtenidas por recolectores locales, mientras que la mayoría (76%) solo vendían productos provenientes de laboratorios de marcas reconocidas. En cuanto a los precios, éstos variaron desde 2,6 dólares a 76 dólares el kilogramo (aproximadamente) de planta deshidratada, sobre todo para el caso de las especies importadas.

Con respecto a la demanda, según los expendedores las especies más solicitadas son las especies exóticas: “manzanilla” (Matricaria recutita), “malva” (Malva parviflora y M. sylvestris), “eucalipto” (Eucalyptus sp.) y la “cuasia amarga” o “palo amargo” (Quassia amara= Picrasma excelsa), entre otras (mayores detalles en Cuassolo, 2009). Estos resultados evidencian la importancia de la farmacopea cosmopolita en las tendencias de consumo de los habitantes barilochenses.

Control de calidad El 30% del material analizado presentó evidencias

de adulteración con diferentes tipos de materia extraña, principalmente con hojas de gramíneas (Tabla 1 y Fig. 2). Estas muestras en su mayoría corresponden a siete marcas comerciales diferentes y en menor medida a plantas que provienen de recolectores locales. Del total del material adulterado, un 70 % correspondió a muestras provenientes de laboratorios medicinales.

En cuanto al estado de pureza se encontró como materia extraña a partes vegetales de otras especies de plantas, insectos y ácaros vivos y muertos, trozos de alambre, de nylon, tierra, piedras, hongos, etc. (Tabla 1). Estos hallazgos ponen de manifiesto no sólo que las muestras están adulteradas, sino que presentan contaminaciones de carácter muy peligroso para la salud.

El grado de adulteración en las muestras analizadas en este estudio es similar al encontrado en otros centros urbanos de la Argentina. Pochettino et al., (2008) observaron en un centro urbano de la Pcia. de Buenos Aires (Argentina), que en 11 muestras analizadas bajo el mismo nombre vulgar, encontraron 5 especies distintas que adulteraban o sustituían a otras de morfología o acción fisiológica similar. Estudios llevados a cabo por Betancour y Gutiérrez (1999) en México reconocen que es cada vez más frecuente la adulteración o sustitución de plantas enteras o de partes de éstas, especialmente de aquellas con alto valor comercial y escasez en el mercado. Varios autores (Betancour y Gutiérrez, 1999; Costaguta,

2006; Martínez, 2005; Pochettino et al., 2008) atribuyen la adulteración tanto a causas involuntarias como intencionales buscando lograr mayores beneficios económicos, siendo las principales razones mencionadas por estos autores: los precios altos para algunas especies, el aumento de la demanda y la escasez o disminución de las poblaciones silvestres, entre otras.

Los resultados expuestos pueden ser interpretados como una situación generalizada para toda la Argentina, principalmente porque se comparten distribuidores y marcas en todo el país. A partir de estos hallazgos se hace evidente la falta de controles de calidad, lo cual sugiere, en parte, que las intoxicaciones existentes en el país, no sólo se deben a un mal uso de estos fitoterapéuticos por parte de los usuarios, sino que los mismos están accediendo a recursos no seguros para su salud en los comercios habilitados (Akerele, 1990; Hoffmann et al., 1992; Arenas y Cortella, 1996; Arenas et al., 1997; OMS, 2003). Figura 2. Principales elementos adulterantes hallados en las muestras analizadas.

Irregularidades en rótulo En general, las muestras revelaron diferentes tipos

de irregularidades en los rótulos (Fig. 3), como falta de precisión en el nombre científico, la fecha de envasado, la fecha de vencimiento, las indicaciones de uso y la posología. Es decir que muchas de estas muestras no cumplen con la disposición 2673/99 de Especialidades Medicinales, propuesta por la ANMAT que es el organismo de Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica de Argentina. En la Figura 3, se muestra que SFR (sin fecha de recolección) contribuye con un 20 % del total. Siendo este carácter no exigido por el ANMAT, no puede aseverarse como irregularidad en este




aspecto, pero consideramos que el mismo debe ser tenido en cuenta por los profesionales encargados de la venta de plantas medicinales y por los mismos usuarios. El tiempo transcurrido entre la recolección y el envasado es crucial en la efectividad de las drogas vegetales, por lo que recomendamos su inclusión rotulada como elemento de control de calidad. Figura 3. Principales irregularidades halladas en rótulos

Irregularidades en rótulo según regulación ANMAT: SNC: sin nombre científico o mal escrito, SFR: sin fecha de recolección, SFE: sin fecha de envasado, SFV: sin fecha de vencimiento, SIU: sin indicaciones de uso, SP: sin posología.

CONCLUSIONES A partir de estos resultados se pone en evidencia

la ausencia de cumplimiento de la reglamentación vigente para la Argentina en relación a las plantas medicinales, particularmente porque los fitoterápicos deberían ser dispensados solo en farmacias y herboristerías, bajo la supervisión de un especialista farmacéutico. Las numerosas infracciones detectadas tanto en rótulos como en contenido pone en claro la necesidad de hacer cumplir dicha reglamentación.

Al igual que en todo el país, las plantas se comercializan principalmente por sus nombres vulgares. Esto propicia el mal uso o errores en el empleo de estos medicamentos y sus consecuentes peligros para la salud de la población. Garantizar la identidad de las plantas medicinales es el primer paso para contribuir con la calidad y seguridad de su uso racional, sobre todo considerando que son drogas vegetales de “venta libre”, es decir que no se necesita una receta médica para adquirirlas. La correcta identificación constituye una herramienta clave al momento de promover el consumo de estos productos en perfectas condiciones de calidad y por consiguiente, seguridad para la salud de la población.

Dado el valor otorgado a las medicinas de origen vegetal por la OMS en 1987 y siendo considerada una alternativa terapéutica en la atención primaria de la salud, consideramos que los centros de expendio de plantas medicinales son contextos de suma importancia en los ambientes urbanos. Estos sitios son lugares donde se genera un flujo de información que se transmite socialmente y forma redes de saberes que mantienen vigente conocimientos locales sobre las plantas medicinales. Es por ello que, ante la ausencia de controles por parte del Estado, necesitan de la labor responsable de sus expendedores en cuanto a una mayor verificación de los productos que comercializan y su estado sanitario.

Adicionalmente, creemos que los estudios etnobotánicos urbanos en relación a estos centros son una herramienta para registrar el conocimiento tradicional en continuo proceso de cambio y, por qué no, de fusión con las sociedades modernas.

AGRADECIMIENTOS

A los expendedores de plantas medicinales de la ciudad de Bariloche. A la UNComahue, en especial a las Dras. Cecilia Brion, Maria Damascos, Susana Calvelo, Laura Lorenzo y al Dr. Javier Puntieri por sus valiosos aportes en este trabajo.

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Artículo Original | Original Article



La medicina herbolaria en el contexto urbano. Estudio de caso en un barrio de la ciudad de Tandil, Argentina

[Herbal medicine in the urban context. Case study in a neighborhood of the city of Tandil, Argentina]

Norma Inés HILGERT1, Mariela de Lourdes HIGUERA2, María Julia KRISTENSEN2, 3

1Centro de Investigaciones del Bosque Atlántico (CeIBA), Instituto de Biología Subtropical , UNaM, CONICET, Yapeyú 94. CC 8, (3370) Puerto Iguazú, Misiones, Argentina.2Centro de Investigaciones y Estudios Ambientales (CINEA), Univ.Nac. del Ctro. de la Pcia. de Bs As,

Campus Universitario Aº Seco s/nº, (7000) Tandil, Buenos Aires, Argentina. 3Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de la Plata, Paseo del Bosque s/nº, (1900) La Plata, Buenos Aires, Argentina.

——————————————————————————————————————————————————— Abstract

Herbal medicine used by people in a suburban neighborhood from Tandil city (Bs. As.) was studied. The species used by the population and their

relative importance, the ailments treated, the places were herbal remedies were obtained and their relationship with Public Medicine were analyzed. Semi structured interviews in 40 domestic units and herbal medicine outlets interview were conducted. 83% of the interviewed used medicinal plants within a total of 46 species in 22 therapeutic applications for 11 body systems diseases. Species are collected in orchards and gardens (47,5%); bought /obtained in shops (25%), gathered from hills (15%) and vacant lots (12,5%). Orchards and vacant lots provide exclusive species and complement each other as places for the obtention of species with greater relative importance; the other species come mainly from shops. It was found that the folk medicine and the formal one are complementary.

Keywords: medicinal plants; Relative Importance index; herbal shops-pharmacy; homegardens; Ethnobotany;exotic plants. Resumen

Se estudió la medicina herbolaria utilizada por la población de un barrio periurbano de la ciudad de Tandil (Buenos Aires). Se analizan las especies usadas por la población, las dolencias tratadas, la importancia relativa de las mismas, los espacios de obtención de los recursos herbolarios y su relación con la medicina pública. Se realizaron 40 entrevistas semiestructuradas en unidades domésticas y censos en sitios de expendio de fitoterápicos. El 83% utiliza plantas medicinales, se halló un total de 46 especies (5,7 por persona), 22 usos terapéuticos para dolencias de 11 sistemas corporales. El 47,5% son recolectadas en huertas o jardines, el 25% son obtenidas de comercios, el 15% se extraen de las sierras y el 12,5% en terrenos baldíos. Huerta y baldío aportan especies exclusivas y se complementan como sitio de obtención de las especies con mayor importancia relativa; el resto proviene principalmente de los comercios. Se observó que la medicina folklórica y la formal se complementan.

Palabras Clave: plantas medicinales; índice de importancia relativa; farmacias y herboristerías; huertas; etnobotánica; plantas exóticas

——————————————————————————————————————————————————— Recibido | Received: December 4, 2009 Aceptado en versión corregida | Accepted in revised form: March 17, 2010 Publicado en línea | Published online: May 25, 2010 Declaración de intereses | Declaration of interests: the authors have no competing interests. Financiación | Funding: none declared This article must be cited as: Norma Inés Hilgert, Mariela de Lourdes Higuera, María Julia Kristensen. 2010. La medicina herbolaria en el contexto urbano. Estudio de caso en un barrio de la ciudad de Tandil, Argentina. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 9(3): 177-190. {EPub May 25, 2010}.

*Contactos | Contacts: [email protected]





Hilgert et al. Medicina herbolaria urbana Running title


INTRODUCCIÓN

La Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Organización Panamericana de la Salud (OPS) reconocen la importancia de la medicina tradicional o folklórica y están abocadas a diseñar estrategias nacionales para su regulación e incorporación al sistema médico formal, con resultados aún deficientes (Hilgert, 2009). El uso de plantas, dentro de esta modalidad de la medicina, está muy difundido en toda Latinoamérica. Habitualmente las áreas donde se desarrolla y conserva son las rurales, no obstante con la inmigración de la población a las grandes urbes su uso se expande y difunde en un nuevo ámbito (Nigenda et al., 2001).

A nivel mundial se observa una tendencia al establecimiento de las poblaciones en contextos urbanos; se estima que alrededor de la década del 30 del presente siglo el 85% de la población latinoamericana se concentrará en las ciudades. Dentro de éstas, las áreas periurbanas son las que presentan mayor tasa de migraciones, tanto desde zonas rurales como desde otras ciudades (UN, 1998 -en Kuchelmeister, 2000/1-). Es altamente probable, en consecuencia, hallar en esos espacios mosaicos pluriculturales con distinto tiempo de permanencia y con diferente historia de apropiación y transmisión en sus conocimientos y valores culturales originarios (Pochettino et al., 1997). Del mismo modo, también es probable que allí se conserven ambientes ruderales y/o naturales con distinto grado de modificación que alberguen recursos vegetales con valor utilitario de procedencias variadas.

La utilidad de un recurso para un individuo o una sociedad dada depende del modo de percibir el entorno, percepción que se forja a partir de la combinación de factores biofísicos y socioculturales (Cotton, 1996). Es fundamental identificar los dominios culturales que intervienen en esta acción, tratar de entender por qué un grupo usa algunos recursos de su entorno y no otros. Del mismo modo es crucial interpretar las decisiones basadas en la información acumulada a través de las generaciones y aquellas tomadas en función de la necesidad de adaptarse a nuevas circunstancias, que resultan de la creatividad e iniciativas propias de los individuos (Vickers, 1994, Neis et al., 1999, Berkes et al., 2000, Davidson- Hunt, 2006, Murray et al., 2006).

Uno de los modos de interpretar estas decisiones es analizando la importancia cultural del recurso (Bennet & Prance, 2000, Garibay-Orijel et al., 2007). Se ha propuesto que la inclusión y el

aprovechamiento de especies exóticas pueden deberse a una estrategia de diversificación (Albuquerque, 2006), es decir que han sido intencionalmente introducidas para cubrir demandas que las nativas no cubrían. Del mismo modo, se considera que la versatilidad, en términos de categorías de usos y disponibilidad, favorecen el uso de un determinado recurso en lugar de otro también disponible (Albuquerque & Lucena, 2005, Albuquerque, 2009).

Para comprender estos procesos en un contexto urbano, es aceptable pensar que los patrones de apropiación, uso y transmisión de los conocimientos son particulares y difieren de los descriptos para comunidades tradicionales y rurales. En estos espacios nuevos cambian los mecanismos de transmisión y adquisición del conocimiento, se complica la red de relaciones, se desdibujan los modeladores y, fundamentalmente, se descontextualiza el conocimiento del entorno natural que éstas prácticas habitualmente incluían. En efecto, el viejo conocimiento empírico familiar, en ocasiones es reemplazado por el consejo de un vendedor o de anuncios publicitarios. De pronto la gente conoce la utilidad de una droga vegetal aunque ignora qué planta o plantas la componen o, en el caso de saberlo, son incapaces de reconocerlas en estado natural (Hermann et al., 2001, Pardo de Santayana y Gómez Pellon, 2003, Pochettino et al., 2008, Arenas, 2007).

Se ha señalado la importancia de la comercialización de recursos herbolarios en el contexto urbano (Bye & Linares, 1983, 1990, Cortella et al., 2001). En las ciudades, los mercados y las pequeñas huertas domiciliarias, constituyen los sitios donde obtener estos recursos reemplazando el entorno natural donde esas personas los hubiesen recolectado.

La relación entre la medicina herbolaria y los alimentos medicinales es otro aspecto que viene siendo objeto de estudio desde hace unos años (Etkin & Ross, 1982, 1994, Cox, 1994, Moerman, 1994, Pochettino, 2003, Grivetti, 2006, Pardo de Santayana et al., 2006, Pieroni & Quave, 2006). Es común que algunos alimentos se consuman en diferentes momentos de la vida de la persona con el objeto de propiciar la conservación de la salud o su restauración. Por ejemplo el consumo de alimentos fuertemente condimentados con orégano durante el puerperio, en comunidades rurales del noroeste argentino (Hilgert & Gil, 2007). En el presente trabajo analizamos el elenco de especies medicinales




usadas en el Barrio las Tunitas de la ciudad de Tandil y la importancia de las mismas en el sistema de salud folklórico. Identificamos y analizamos el rol de los diferentes espacios de obtención de estos recursos. Analizamos el rol de la medicina herbolaria doméstica y el de la medicina formal en los hogares visitados. Y el tipo de dolencias que son tratadas con recursos herbolarios adquiridos en mercados en relación al total de dolencias atendidas en el contexto doméstico.

Dada la proximidad a las serranías y la disponibilidad de espacios ruderales, jardines y/o huertas esperamos hallar que los recursos utilizados provengan principalmente de materiales frescos recolectados o cultivados en sitios próximos. No obstante, para algunos usos terapéuticos fuertemente asociados a los contextos urbanos, esperamos hallar un patrón diferente. Del mismo modo, suponemos que hay una complementariedad entre el sistema de salud formal y el hogareño.

Se analiza la medicina herbolaria en un barrio periférico de la ciudad de Tandil, considerando las especies involucradas, su modo de obtención y su relación con la medicina del sistema público. Para ello se:

Identifican las plantas que se usan como medicinales en el barrio las Tunitas y se estima la Importancia Relativa de las mismas.

Analiza el rol de los distintos espacios de obtención de los recursos herbolarios empleados en la

medicina doméstica. Analiza la comercialización de plantas

medicinales en farmacias y herboristerías. Comparan las dolencias tratadas en la medicina

herbolaria y en el centro médico del barrio. Área de estudio

La población estudiada se localiza en la “zona 5” (INDEC 2001) del barrio Las Tunitas, ubicado en la periferia de Tandil. Esta ciudad está inserta en valles

que descienden desde las Sierras de Tandil (Sistema de Tandilia) hacia la Depresión del río Salado, en el sudeste de la provincia de Buenos Aires, entre los 37º 10’ y 37º 30’ S y los 59º a 59º 15’O. Posee 168.086 habitantes (INDEC, 2001) y en los 90’ su casco urbano ocupaba una superficie de 22,07 km2 y el suburbano de 30,27 km2. El barrio Las Tunitas se ubica en el sector sudoeste de la planta urbana de la ciudad, con su vértice norte a poco más de diez cuadras de la plaza principal; corresponde al caserío asentado en las laderas de los cerros ubicados entre las Avenidas Díaz Vélez, Estrada y las calles Granaderos y Uspallata (Figura 1). Según el censo poblacional de 2001, cuenta con 1367 personas en 334 hogares. La mayor parte de las personas (85%) es oriunda de Tandil, un 1,3% proviene de otros lugares de la provincia de Buenos Aires, un 1,45% de otras provincias argentinas y el resto nacieron en otros países, pero vivieron gran parte de su vida aquí (INDEC, 2001).

Estimamos que los pobladores del barrio por proximidad tienen posibilidades de mantener contacto con el entorno natural, hacer uso de los recursos naturales disponibles y contar con un espacio para huertas familiares, en concordancia con lo observado por Pardo de Santayana y Gómez Pellón en España (2003). Esta situación particular, dentro de la vida urbana, es la que nos llevó a considerar el barrio como una unidad de estudio.

El ambiente natural, con modificaciones antrópicas por la urbanización y la actividad agrícola, se enmarca desde el punto de vista biogeográfico en el Dominio Chaqueño, Provincia Pampeana, Distrito Oriental. La vegetación local son pastizales o seudo-estepas formadas por hierbas que no superan un metro de altura alternando con subfrútices y arbustos (Cabrera y Willink, 1980).




Figura 1: Área estudiada: ubicación del Barrio Las Tunitas

El 43 % de los habitantes de Las Tunitas cuenta

con alguna obra social para atender sus problemas de salud (INDEC, 2001). El servicio de salud público tiene en el barrio un Centro de Atención Primaria de Salud (CAPS). La misma disponía en el momento del trabajo de campo de consultorios, enfermería farmacia y cuenta con 2 enfermeras, 2 médicos y un odontólogo. Según las estadísticas de la propia sala, en el año 2005 la mayor cantidad de pacientes atendidos fueron los niños de 1 a 4 años, y los

jóvenes de 15 a 24 años, que coincidentemente son los grupos etarios más populosos (Fuente: Centro de Atención Primaria de Salud del barrio -Zona 5-). Los motivos de consulta más frecuentes son las infecciones respiratorias, los cuidados del embarazo, las mialgias y artralgias (Tabla 1).




Tabla 1. Frecuencia relativa (FR) de motivos de consultas efectuados por pacientes atendidos en 2005 Motivos de consulta

Frecuencia

relativa (%)

Infecciones respiratorias, tos y catarro 31,4

Control general de salud 19,4

Otros 7,6

Infecciones dérmicas, heridas 5,9

Mialgias, lumbalgias y artralgias (dolor muscular/articular) 5,2

Cuidados de embarazo, parto y puerperio 4,2

Anticoncepción 3,9

Dolor abdominal 2,9

Hipertensión 2,9

Asma bronquial 2,7

Miantisis, pediculosis, sarna 2,7

Desórdenes menstruales 2,4

Vaginitis 2,2

Otitis media aguda 2,0

Infección urinaria 1,4

Reacción alérgica 1,4 (Fuente: Centro de Atención Primaria de Salud)

MATERIALES Y MÉTODOS

Se relevó la información disponible en el CAPS del barrio y en las estadísticas oficiales sobre la salud local de la “zona 5” (INDEC, 2001), las características socioculturales de los pobladores y su procedencia. La unidad de muestreo fue la unidad doméstica entendida como “una unidad compleja que incluye tres componentes: social -grupo de personas que comparten la residencia-, espacial -el espacio físico que habitan-, y económico -actividades de subsistencia del grupo que se realizan parcial o totalmente en ese ámbito-” según lo propuesto por Crivos y Martínez (1996).

Entre el 2005 y 2006 se visitó la totalidad de las casas del barrio (334) y se trabajó con aquellas familias donde alguno de sus integrantes accedió a participar del presente estudio (52 hogares, 15% del total). Se realizaron entrevistas semiestructuradas.

Inicialmente se realizaron dos enlistados libres, 1) lista de las enfermedades que son tratadas con herbolaria en la unidad doméstica y 2) lista de hierbas empleadas. Con esta base, se analizaron de modo

particular, mediante entrevistas semiestructuradas, las plantas y dolencias enlistadas. Se preguntó sobre la procedencia y/o modo de obtención de las plantas usadas, las partes empleadas, los métodos de preparación, la enfermedad que es tratada y cuál es la acción de esa medicina (propiedad terapéutica reconocida por el usuario). Además se consignó la edad y, cuando fue posible, origen étnico o nacionalidad de quien se ocupa de la medicina casera en la unidad doméstica encuestada, de modo de tener un indicador del grupo cultural al que adscribe el mismo. La información se organizó en planillas Excel de acuerdo a los diferentes aspectos analizados.

Se recolectaron muestras de herbario de las plantas utilizadas en el sitio de donde las obtienen y junto a algunos de los encuestados y/o muestras de lo adquirido en los comercios. El material fresco fue identificado por Carla Irureta y lo expendido por Mariela Higuera; se encuentra depositado en el Centro de Investigaciones y Estudios Ambientales (CINEA) de Tandil. La nomenclatura utilizada corresponde a la de la base de datos Iris del Instituto Darwinion (www.darwinion.edu.ar) y en el caso de taxones exóticos, a la de Tropicos del Missouri Botanical Garden; las clasificaciones de estatus y hábitat se hicieron siguiendo a Cabrera (1963-1970), Frangi (1973, 1975) y Zund (1977). Se consideran exóticas todas aquellas que no son propias de la vegetación local.

Para indagar acerca del comercio de las plantas medicinales en la ciudad de Tandil, se identificaron los sitios de expendio de productos fitoterápicos (plantas medicinales y derivados) en el macro centro comercial de la ciudad a partir de información propiciada por la Dirección de Rentas de la Municipalidad de Tandil. Se censaron 13 farmacias y 7 herboristerías y/o dietéticas, en las que se consultó acerca de las especies vendidas, la procedencia del recurso y la frecuencia de venta.

Con el objeto de cuantificar la importancia relativa de cada especie reportada, se empleó el estimador RI propuesto por Bennet & Prance (2000) el que evalúa el estatus de cada especie en el sistema cultural en estudio. Este índice se calcula en función del número normalizado de propiedades farmacológicas atribuidas localmente a cada especie y el número normalizado de tipo de dolencias tratadas con cada una. Por otra parte, analizamos la correlación entre el orden de menciones de las especies dado en el enlistado libre por los entrevistados y el RI, para ello usamos el coeficiente




Gamma diseñado para datos ordinales y que es preferible al de Spearman y Kendall cuando hay muchos casos pareados. Para esta comparación usamos el orden de los valores de RI de mayor a menor y el orden de mención de menor a mayor, para que ambos denoten la importancia en el mismo sentido y consideramos sólo las especies con un RI mayor o igual a 50.

Examinamos las relaciones entre las dolencias tratadas en el CAPS y en los hogares; la relación entre el número de menciones de las propiedades terapéuticas de los recursos comprados en los comercios y las de los empleados en la medicina casera. Para ambos análisis se realizaron correlaciones de Spearman.

Para todos los casos se utilizó el programa STATISTICA (StatSoft, Inc. 2004).

RESULTADOS

La medicina herbolaria Se citaron 46 taxones (41 exóticos) usados como

medicinales pertenecientes a 46 géneros y 30 familias botánicas. Las familias más representadas fueron: Lamiaceae (14,28%), Asteraceae (8,16%); Apiaceae, Alliaceae, Myrtaceae, Rutaceae, Simarubaceae, Solanaceae, Urticaceae y Verbenaceae incluyen 2 taxones, y del resto uno solo. Entre las especies usadas se hallaron 4 formas de vida: hierbas (56%), arbustos (23%), árboles (19%) y un liquen. La parte con más usos registrados fueron las hojas (34 taxones) seguidas de la parte aérea (5), raíces y partes reproductivas (4), corteza (2) y látex (1). En cuanto a la forma de preparación las infusiones (36) son las más frecuente , seguidas de las compresas y decocciones (9), jarabes y tópicos (3), baños de asiento, buches e ingestión (2) y, finalmente, lavajes y sahumerios (1) (Tabla 2).

El número de especies citadas por persona en promedio fue 5,7 (DS= 3,1). En efecto, se ha hallado una gran heterogeneidad en el uso de los recursos entre las unidades domésticas (un 50% de las especies tiene un solo reporte y un 25% dos). Con respecto al índice de Importancia Relativa el Aloe spp. (aloe vera) fue la especie con RI más elevado 100, seguida de Ruta chalepensis (ruda), Rosmarinus officinalis (romero), Marrubium vulgare (malva rubia) y Matricaria recutita (manzanilla) (Tabla 2).

Al comparar el orden de menciones de las especies en el enlistado libre con el RI calculado, encontramos una correlación positiva (Gamma = 1, Z = 2.18, p= 0.029).

Las dolencias tratadas con plantas medicinales corresponden a 11 sistemas corporales o sistemas de dolencias (e.g. respiratorio, circulatorio) y se reconocieron 22 usos terapéuticos. El mayor número de reportes fue para el sistema digestivo (41) seguido de sistema dérmico y respiratorio (13), urinario (10); y las propiedades farmacológicas más citadas fueron tónico digestivo (15), analgésico (11), cicatrizante (11) y hepato-protectores (10). A su vez, entre los usos terapéuticos los más citados fueron tónico digestivo (15), analgésico (11), antitusivo (8) y diurético (7).

Al analizar que relación hay entre los porcentajes de las dolencias tratadas en el CAPS y en los hogares hallamos que no hay asociación (R = -0.260842, t = -1.35098, p = 0.188803). Es decir que hay dolencias que se tratan de modo exclusivo en uno de los sistemas y otros son susceptibles de ser tratadas en ambos espacios. De este modo, alergias, asma, hipertensión, dolores musculares y articulares, cuidados de embarazo, parto y puerperio, anticonceptivos e infecciones urinarias prácticamente se atienden sólo en el CAPS. En cambio, las infecciones dérmicas, respiratorias y ginecológicas, las diarreas y el dolor de estómago se tratan tanto en el hogar como en el puesto. Finalmente para los problemas circulatorios, hepáticos y nerviosos, los parásitos intestinales, las conjuntivitis, las jaquecas y para el control de la natalidad se emplea la medicina doméstica.

Teniendo en cuenta las propiedades terapéuticas (22) asignadas a los recursos, comparamos el número de ítems de los productos vendidos para cada una, con el número de usos registrados en la medicina doméstica. Hallamos que sólo 8 propiedades terapéuticas están asignadas a los productos vendidos en los comercios y no encontramos una relación estadística entre dichas frecuencias (R=0.204467, t= 0.934139, p=0.361374).




Tabla 2. Taxones usados por la población de las Tunitas: Importancia relativa (RI), uso asignado, modo de administración, partes usadas, status y hábito.

Familia , nombre científico (nombre vulgar)

Proc

eden

cia

Nº r

epor

tes

RI Uso medicinal Modo administración

Part

e us

ada

Stat

us

Háb

ito

Alliaceae, Allium cepa L. (Cebolla)

Co 1 16 Para la tos Infusión Bulbo E H

Alliaceae, Allium sativum L. ( Ajo)

Co 1 35 1) Para los parásitos 2) Para el dolor de muelas. Para bajar la presión. Para mejorar la circulación

1) Ingestión. Se come crudo en ayunas mezclado con vinagre 2) Compresas. Se parte en 2 formando una cruz y se ata en mano contraria al dolor de muelas

Bulbo E H

Amaranthaceae, Alternathera pugens Kunth (Yerba del pollo)

Co 1 16 Para el empacho; para problemas digestivos Infusión Hojas N H

Apiaceae, Apium graveolens L. (Apio)

Co 1 16 Para los gases en los bebés Infusión Parte aérea E H

Apiaceae, Foeniculum vulgare Mill. (Hinojo)

Sa Ba

2 16 Para los parásitos Infusión Hojas E H

Apiaceae, Pimpinella anisum L. (Anís)

Co 1 16 Para los gases Infusión Semillas E H

Asteraceae, Achyrocline satureioides (Lam.) DC. (Marcela)

Sa Hu

4 50 Para problemas de hígado, estómago y para el empacho

Infusión concentrada Parte aérea N a

Asteraceae, Artemisia absinthium L. (Ajenjo)

Sa Co

3 35 Para abortar; para los parásitos; para la diabetes Infusión poco concentrada Hojas E a

Asteraceae, Baccharis articulata (Lam.) Pers. (Carqueja)

Sa 2 31 Para orinar y problemas de vesícula Infusión Hojas N A

Asteraceae, Matricaria recutita L. (Manzanilla)

Sa Ba

6 57 1)Para los enfriamientos; contra la diarrea y gases en bebes 2) Para el cuidado del cabello

1) Infusión 2) Decocción

Flores y hojas

E H

Bignoniaceae, Tabebuia impetiginosa (Mart. ex DC.) Standl. (Lapacho)

Co 2 31 Para problemas de corazón y riñón Infusión Corteza E A

Bombacaceae, Ceiba insignis (Kunth) P.E. Gibas & Semir (Palo borracho)

Co 1 16 Para los piojos Decocción Hojas E A

Cecropiaceae, Cecropia pachystachya Trécul (Ambay)

Co 2 19 Para problemas bronquiales Infusión. Se mezcla con anacahuita Hojas, cogollos

E A

Chenopodiaceae, Chenopodium quinoa Willd. (Quinoa)

Ba 1 16 Para cicatrizar y desinfectar las quemaduras Compresas Hojas E H

Clusiaceae, Hypericum connatum Lam. (Cucharera)

Sa 1 16 Para el corazón Infusión Parte aérea N a

Crassulaceae, Sedum cf. spectabile Boreau (Bálsamo)

Hu 2 20 Para desinfectar y calmar el dolor en heridas Compresas. Se prepara con azúcar o azufre rallado

Hojas E H

Euphorbiaceae, Euphorbia serpens Kunth (Yerba meona)

Co 1 16 Para problemas de riñón, cálculos y orinar mejor

Infusión Hojas N H

Geraniaceae, Erodium cicutarium (L.) L'Hér. ex Aiton (Alfilerillo)

Hu 1 16 En úlceras varicosas Compresas, se aplican con paños limpios Hojas E H

Lamiaceae, Lepechinia vesiculosa (Benth.) Epling (Salvia)

Hu 1 16 Para dolores menstruales Infusión Hojas E a




Lamiaceae, Marrubium vulgare L. (Malva rubia )

Ba 4 63 1) Hemorroides 2) Problemas de garganta 3) Para cicatrizar heridas. Para el estómago

1) Baños de asiento 2) Buches 3) Compresas

Hojas E H

Lamiaceae, Mentha x piperita L. (Menta negra)

Hu 2 20 Para el estómago; para los parásitos. Infusión amarga Hojas E H

Lamiaceae, Mentha x rotundifolia (L.) Huds. (Menta)

Hu 3 41 1) Para el hígado y para acelerar la digestión; Como refrescante estomacal; para la tos. 2) Para el dolor de muelas

1) Infusión 2) Se frota una hoja sobre la mejilla contigua varias veces durante el día

Hojas E H

Lamiaceae, Ocimum basilicum L. (Albahaca)

Co 1 16 Para dolor de estómago e inflamación intestinal Infusión. Se prepara junto con orégano Hojas E H

Lamiaceae, Origanum vulgare L. (Orégano)

Co 5 41 1) Para la tos 2) Para la inflamación de estómago e intestino, dolores intensos y gases

1) Infusión. Con tomillo 2) Infusión

Hojas E H

Lamiaceae, Rosmarinum officinalis L.(Romero)

Hu 5 66 1) Para el estómago; molestias intestinales; dolor de cabeza; dolor de hígado 2) Para el cuidado del cabello 3) Para cicatrizar heridas 4) Para la tos

1) Infusión 2) Decocción fría 3) Compresas 4) Jarabe. Con eucaliptus, cáscara de naranjas y azúcar negra o miel. No deben tomar las embarazadas ni se debe tomar de noche porque quita el sueño

Ramas tiernas

E a

Lamiaceae, Thymus vulgaris L. (Tomillo)

Co 1 16 Para la tos Infusión. Con azúcar y orégano Hojas E a

Lauraceae, Laurus nobilis L. (Laurel)

Sa Ba

2 20 1) Para la suerte (alejar las malas ondas que te enferman) 2) Para la tos

1) Decoctado, hervir martes y jueves 2) Jarabe

Hojas E A

Liliaceae, Aloe spp. (Aloe vera)

Hu 15 100 1) Para cicatrizar y desinfectar heridas y quemaduras; várices; hemorroides; cansancio de pies 2) Para el cutis, el acné; para los piojos; detiene la caída del cabello 3) Empacho 4) Para adelgazar; para el estreñimiento y en úlceras internas

1) Compresas 2) Tópico. Se macera y se prepara una crema con un poco de alcohol para que se conserve 3) Decocción 4) Ingestión. Se come como verdura en guiso. Se macera con miel y cualquier bebida espirituosa, para que el alcohol conserve el preparado, se mezcla y se toma una cucharada todas las mañanas en ayunas

Pencas sin piel

E H

Monimiaceae, Peumus boldus (Mol) Looser (Boldo)

Co 1 16 Para el estómago Infusión Hojas E H

Moraceae, Ficus carica L. (Higuera)

Hu 1 16 Para eliminar verrugas Tópico. Se aplica la leche la mayor cantidad de veces posible

Látex E A

Myrtaceae, Eucalyptus spp. (Eucalipto)

Ba 4 25 1) Desinfección de ambientes 2) Para la tos y la gripe; en resfríos

1) Sahumerio, se deja hervir en agua sobre el fuego para purificar el ambiente 2) Jarabe con romero, cáscaras de naranja y azúcar

Hojas E A

Myrtaceae, Blepharocalyx salicifolius (Kunth) O. Berg (Anacahuita)

Co 2 19 Para la tos Infusión. Con ambay Hojas N A

Phytolaccaceae, Phytolacca dioica L. (Ombú)

Co 1 16 Para cicatrizar heridas Compresas con decocción Hojas N A

Poaceae, Zea mays L. (Barba de choclo)

Co 1 16 Para orinar mejor Infusión Estigmas E H

Polygonaceae, Rumex crispus L. (Lengua de vaca)

Ba 1 16 Para abortar Decoctado. Se hierve la raíz en 2 lts de agua, hasta que quede 1lt.

Raíz E H

Rutaceae, Ruta chalepensis L. (Ruda)

Hu 2 90 1) Para los piojos y la sarna 2) En infecciones vaginales 3) Para abortar; para regular el ciclo menstrual cuando hay atraso. En problemas y dolor de estómago. Enfriamientos. Detiene la diarrea. Mejora la circulación

1) Decocción mezclada con vinagre: Se lava la cabeza 2 veces al día 2) Infusión 3) Baños de asiento

Parte aérea E a




Referencias: Comprada (Co); Sierras (Sa); Huerta (Hu); Baldío (Ba); Exótica (E); Nativa (N); Hierba (H); Árbol (A); Arbusto(a); Liquen (L); Enredadera (E)* Material no colectado,* identidad probable a partir de lo hallado por Pérez y Pochettino (2009).

En cuanto a la procedencia de los recursos

herbolarios utilizados, algunas especies se pueden obtener de 2 o más formas. El 47,5% son recolectadas en huertas o jardines propios o de familiares, el 25% son obtenidas de comercios, el 15% se extraen de las sierras y el 12,5% en terrenos baldíos. En un solo caso se halló cultivada una especie serrana nativa, la marcela (Achyrocline satureoides). No se registró la venta de recursos herbolarios locales. De las especies citadas como medicinales, 15 prosperan en las serranías aledañas a la ciudad, 5 son nativas y el resto están asilvestradas. De ellas, sólo 3 (todas nativas) son obtenidas exclusivamente de ese ambiente (Usnea hieronymi; Hypericum connatum y Baccharis articulata); en tanto que otras 4 son colectadas además en baldíos o jardines. Sólo una de las plantas disponibles en el entorno no ha sido citada como colectada sino como comprada (Tilia sp.).

Al considerar los diferentes espacios de obtención de los recursos según la importancia de los

mismos se puede observar que ninguna de las 7 especies con RI igual o mayor a 50 se compra, y que huerta y baldío son indispensables ya que tienen especies exclusivas y se complementan perfectamente, el resto de las fuentes es prescindible. En efecto, el huerto provee 5 de estas 7 especies y las otras dos se colectan en los baldíos. En el caso de la marcela y la manzanilla, además de la huerta y el baldío respectivamente, pueden ser recolectadas en las sierras (Tabla 2). Para el resto de las especies (con RI menor a 50), en este sentido hay una complementariedad muy grande, ya que casi todas se obtienen de un único espacio. En este grupo de plantas, los comercios son los que aportan más especies exclusivas (Tabla 3).

Entre los comercios y las huertas se obtienen el 75% de las especies usadas, son las dos procedencias más complementarias. La sierra es la que menos complementa al resto aportando sólo 2 especies exclusivas.

Rutaceae, Citrus limon L. Burm. f. (Limón)

Co 1 41 1) Problemas de hígado 2) Para la tos

1) Infusión 2) Infusión. Con romero y miel

Jugo E A

Simarubaceae, Quassia amara L. (Aquacia)

Co 1 16 Para los piojos Decocción mezclada con alcohol, se lava la cabeza varias veces al día

Corteza y partes

leñosas

E A

Solanaceae, Nicotiana glauca Graham (Palan-palan)

Co 1 16 Para el estreñimiento Decocción Hojas N a

Solanaceae, Solanum sisymbriifolium Lam. (Espina colorada)

Ba 1 16 Para orinar mejor. En problemas del riñón Infusión Hojas N H

Teaceae, Camellia sinensis L. Kuntze (Té verde)

Co 1 25 Mejora la digestión. Calma los nervios. Para orinar mejor

Infusión Hojas E a

Teaceae, Camellia sinensis L. Kuntze (Té común)

Co 4 16 Para la conjuntivitis Tópico. Se prepara la infusión, y cuando está tibia se lava varias veces al día

Hojas E a

Tiliaceae, Tilia sp.(Tilo) Co 1 16 Para calmar los nervios Infusión Hojas E A Urticaceae , Parietaria officinalis L.(Buscapina)*

Hu 1 16 En problemas del estómago Infusión Hojas E H

Urticaceae, Urtica urens L. (Ortiga)

Ba 2 20 Detiene la caída de cabello Lavajes. Se hace una decocción, se filtra y lava la cabeza con el preparado 2 o 3 veces por semana

Hojas E H

Usneaceae, Usnea hieronymii Kremphl. (Yerba de la piedra, barba de la piedra)

Sa 3 35 1) Para orinar mejor. En problemas de riñón. Para la memoria 2) Dolores de garganta

1) Infusión 2) Buches

Talo N L

Verbenaceae, Aloysia citriodora Palau (Cedrón)

Hu 5 41 Para el estómago. Para el hígado. Contra el estreñimiento. Calma los nervios

Infusión. Como bajativo luego de las comidas. Se colocan algunas hojas en el mate

Hojas E a

Verbenaceae, Lippia turbinata Griseb. (Poleo)

Hu 1 16 Dolores de estómago. Contra el estreñimiento. Mejora la digestión

Infusión. Se colocan hojas en el mate. Después de comer

Hojas N a

Zingiberaceae, Zingiber officinale Roscoe (Jengibre)

Co 2 31 Para la digestión. Mejora la circulación y los problemas para orinar

Infusión concentrada Raíz E H




Tabla 3. Procedencia de las especies con RI menor a 50.

Procedencia Spp. totales

Spp.

exclusivas (%

del total)

Spp.

compartidas

Compra 23 22 1 (Sa)

Huerta 10 9 1 (Sa)

Baldío 9 6 3 (Sa)

Sierras 7 2 5 (Co, Hu, Ba)

Comprada (Co); colectada en las Sierras (Sa); Huerta (Hu); Baldío (Ba).

El 17 % de los hogares encuestados no utiliza

plantas con fines medicinales. En relación a la procedencia de las personas, en dos de las unidades domésticas encuestadas los informantes eran extranjeros (una señora chilena y un matrimonio español) y en otras tres trabajamos con integrantes de descendientes de tres etnias diferentes: Mapuches, Guaraníes y Tehuelches. Las unidades domésticas integradas por descendientes de nativos americanos forman parte de los hogares que citaron más plantas útiles y usos más diversos.

Evaluación del comercio de la flora medicinal En la ciudad de Tandil existen 40 farmacias y 5

dietéticas registradas (comercios donde entre otras cosas se expenden productos fitoterápicos). Aunque no todas las farmacias los venden. Algunas dietéticas están inscriptas en otros rubros, como mini mercados o poli rubros, por lo que no podemos precisar el total de comercios dedicados a este rubro.

En las encuestas realizadas a estos centros formales de venta de plantas medicinales y productos elaborados a partir de ellas (tinturas madres, pastillas, cápsulas) se halló que en ninguna se expenden plantas extraídas, cultivadas y/o fraccionadas en la zona. Los materiales provienen, en su mayoría, de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires o del Gran Buenos Aires, donde están radicadas las plantas fraccionadoras o procesadoras. En ocasiones, el material a la venta lleva explícita la procedencia de la droga vegetal (se han podido detectar algunas provenientes de Córdoba y Misiones).

Al compilar los registros de las ventas de un mes del invierno del 2006 se computaron 341 eventos; los que incluyen 43 especies. Entre ellos las especies más mencionadas fueron Tilia ssp. (tilo), Malva sylvestris

(malva), Matricaria recutita (manzanilla), Cecropia pachystachya (ambay), Ginkgo biloba (ginkgo), Senna acutifolia y S. angustifolia (sen), Valeriana officinalis (valeriana), Aesculus hippocastanum (castaño de indias), Cymbopogon citratus (cedrón), Blepharocalyx salicifolius (anacahuita), Passiflora coerulea (pasionaria), Hydrocotyle asiatica (centella asiática), Hamamelis virginiana (hamamelis), Hypericum perforatum (hipérico), Mentha x piperita (menta piperita), Alternathera pugens (yerba del pollo), Poemus boldus (boldo), Melissa officinalis (melisa), Zea mays (barba de choclo), Silybum marianum (cardo mariano), Rosmarinus officinalis (romero) y Thea sinensis (té verde). Los usos más frecuentes fueron especies sedantes, digestivas y circulatorias (Figura 2).

Figura 2. Usos más frecuentes en comercios encuestados.

Frecuencia de usos de los productos fitoterápicos vendidos (total = 341) en los comercios encuestados (n = 20) durante un mes de invierno, ordenados según sus propiedades farmacológicas. N=341.

DISCUSIÓN El número de especies empleadas es menor al

citado para otros trabajos realizados en la región (Pochettino et al., 1997, Cambi et al., 1999, Hermann et al., 2001). En todos los casos, al igual que en nuestra área, el mayor número de citas fue para dolencias del sistema digestivo. En Bahía Blanca también fue el aloe la especie más usada (Hermann et al., 2001). En este mismo trabajo, se citan más usos terapéuticos a los hallados en el presente, no obstante, dado que Hermann et al. (op cit.) no mencionan la totalidad de usos considerados, es imposible analizar si las diferencias se basan, por ejemplo, en el modo de categorizarlos.

Hallamos un mayor número de especies exóticas empleadas, gran parte ruderales, lo que coincide con lo citado por numerosos autores (Cambi et al., 1999,

0 10 20 30

Propiedades farmacológicas

Porcentaje de uso

diurético

hipotensor

hepatoprotector

adelgazante

laxante

circulatorio digestivo

sedante




Bennet & Prance, 2000, Hermann et al., 2001). Por otra parte, los usuarios no las distinguen u organizan conceptualmente según su origen, lo que puede ser interpretado como una adaptación cultural a especies con gran disponibilidad en ambientes peri domésticos y en áreas disturbadas (Voeks, 1996, Hilgert & Gil, 2006).

Teniendo en cuenta los usos potenciales de estos recursos, cabe señalar que 25 de estas especies son además comestibles (Alonso, 1998), 13 de las cuales fueron incluidas en el listado de malezas comestibles del cono sur (Rapoport et al., 2009). De éstas, una sola es nativa de la región y dos más son alimentos americanos (el maíz y la quinua) el resto son todas especies que provienen del viejo mundo con antiguos datos de usos tanto comestibles como medicinales. Es probable por lo tanto, que su inclusión en la región, cuando no accidental, haya sido con diferentes fines, algunas como alimenticias, otras como ornamentales y solo algunas como terapéuticas, en concordancia con lo propuesto por Bennet & Prance (2000). Sería muy interesante indagar sobre estos potenciales usos con doble finalidad (alimentos nutracéuticos o medicina alimentaria) y generar iniciativas que incentiven la inclusión de ese recurso en la culinaria local, teniendo en cuenta principalmente la importancia de la diversidad en la dieta y las limitantes económicas de los habitantes del barrio.

En relación al modo de obtención, el rol que juegan los diferentes espacios cambia según la importancia del recurso. Para las especies con RI más alto es fundamental la presencia de huertos o baldíos, en cambio para el resto las especies los diferentes espacios se complementan. Dentro de este segundo grupo los comercios cobran gran importancia. Lo que podría reflejar que estas especies son las de más reciente incorporación en la farmacopea familiar (por ello aún tienen una importancia relativa baja y se obtienen en el espacio más urbano conceptualmente hablando). Por otra parte, al comparar con otros resultados de la región, el hecho que las especies empleadas provengan principalmente de huertos muestra una diferencia con lo hallado por Cambi et al. (1999) y Hermann et al. (2001) para poblaciones céntricas y aledañas a Bahía Blanca, donde la principal fuente son los comercios. Dada la ausencia de materiales nativos locales en los comercios y, a pesar que la recolección se realiza con mayor intensidad en las sierras que en terrenos baldíos, consideramos probable que la recolección de especies medicinales no implica un riesgo para la

conservación local y que no hay problemas de sobreexplotación asociados a estos usos, semejantes a los reseñados para otras regiones de Argentina (Lagrottería de Galán et al., 1986, Martínez 2005). Si bien debería realizarse una investigación especial al respecto. Una sola especie disponible en el arbolado urbano no es colectada sino comprada, se trata del tilo –el cual es exótico-. Esto puede deberse a distintos factores, quizás los usuarios no reconocen el árbol.

Respecto a la heterogeneidad en el uso de los recursos hallada entre las unidades domésticas, podría deberse a una erosión en estos saberes o a un enriquecimiento activo, fruto de la interacción de personas con distintas bases culturales y de las influencias propias del ambiente urbano. Conocer el modo de transmisión y de generación de cambios en los conocimientos de un grupo dado, nos permite predecir su variabilidad y estabilidad cultural a lo largo del tiempo y del espacio. Al respecto, se han definido diferentes formas de transmisión: horizontal -entre individuos de una misma generación-, vertical -de padres a hijos- y oblicua -entre líneas genealógicas emparentadas-. Y, si se consideran el número de emisores y receptores del saber, se reconocen dos modos: desde una persona hacia muchas (eg. un maestro hacia sus alumnos) y desde muchos hacia una persona (e.g. un inmigrante frente a la comunidad donde se inserta) (Hewlett & Cavalli-Sforza, 1986, Aunger, 2000, Lozada et al., 2006). Estos mecanismos cobran diferente importancia según el contexto sociocultural en el que se insertan. Estudios previos analizan las características del sistema médico de grupos inmigrantes en grandes ciudades, el modo en que se reorganizan las prácticas y los saberes tradicionales en estos ambientes donde la interacción de humanos entre sí es mayor que con el entorno natural (Pieroni et al., 2005, Pieroni & Quave, 2005, Verma et al., 2007). En nuestro caso, 74 especies reportadas en la bibliografía como medicinales están disponibles en las serranías locales y no son reconocidas, o al menos no fueron mencionadas como recurso medicinal (Higuera, 2007). Gran parte de éstas son nativas; que no sean utilizadas como medicamento ni reconocidas como tales, podría reflejar una dinámica de relación con el entorno natural diferente a la de los asentamientos rurales.

Probablemente cada familia o grupo familiar inmigrante al entorno urbano del barrio haya aportado al llegar un bagaje de información –




transmisión vertical y oblicua- y haya traído los recursos susceptibles de ser trasladados y cultivados. Luego, cada generación fue incorporando nuevos saberes –transmisión horizontal- y soslayando otros, y, fundamentalmente primaron las relaciones y los intercambios con los vecinos que la exploración y búsqueda con el ambiente que los alberga. Probablemente sea más apropiado en estos espacios multiculturales pensar que un proceso de globalización del conocimiento más que de pérdida. Sería interesante analizar los mecanismos locales de transmisión del conocimiento, suponemos que en este contexto, a diferencia de lo comúnmente hallado, los principales modeladores son los intercambios horizontales y oblicuos.

Finalmente, al analizar el tipo de dolencias tratadas en la medicina doméstica y en el puesto de salud, observamos un uso complementario de ambos sistemas de salud.

CONCLUSIONES

Con el desarrollo de este trabajo se aporta información sobre las características de la medicina herbolaria de un barrio periurbano de la ciudad de Tandil (Buenos Aires). Se halló que huertas y baldíos son los principales sitios de obtención de las especies utilizadas. Esto pone en evidencia la necesidad de planificar el futuro desarrollo urbano de la ciudad, de modo de asegurar la conservación de espacios destinados a huertas y jardines familiares y/o comunitarios. Por otra parte, dada la complementariedad hallada entre la medicina herbolaria doméstica y la medicina formal, es importante que las políticas y acciones de salud acerquen y contemplen a ambos sistemas.

AGRADECIMIENTOS

A los pobladores de las Tunitas por su amabilidad y colaboración. A G. Gil por su ayuda con el análisis matemático y estadístico de los datos; C. Irureta que identificó las plantas recolectadas; C. Gutiérrez, P. Cichero, M.L. Pochettino y los revisores anónimos por sus comentarios que ayudaron a mejorar la presentación de este trabajo.

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Antioxidant and free radical scavenging activity of Sida rhomboidea. Roxb methanolic extract determined using different in vitro models

[Actividades antioxidante y neutralizante de radicales libres del extracto metanólico de Sida rhomboidea. Roxb determinadas por diferentes modelos in vitro]

Menaka C THOUNAOJAM, Ravirajsinh N JADEJA, Ranjitsinh V DEVKAR*, AV RAMACHANDRAN

Division of Phytotherapeutics and Metabolic Endocrinology,Department of Zoology, Faculty of Science, The M.S. University of Baroda,Vadodara-390002, Gujarat, India

——————————————————————————————————————————————————— Abstract

Antioxidant potential of Sida rhomboidea.Roxb methanol extract (MESR) was evaluated using in vitro models such as lipid peroxidation, metal chelation and reducing potential. Its free radical scavenging ability was also examined using in vitro assays for 1, 1-diphenyl-2-picryl-hydrazil (DPPH,) superoxide (.O2), hydrogen peroxide (H2O2), nitric oxide (NO.) and hydroxyl radical (HO.) radical scavenging. MESR recorded dose dependent effect on inhibition of lipid perodixation (IC50= 92.15±1.21µg/ml), effective metal chelation (IC50=65.69±1.22µg/ml) and higher reducing potential (ODmax=1.20±0.27). MESR could efficiently scavenged DPPH (IC50=63.23±1.59µg/ml), .O2 (IC50=142.36±2.59µg/ml), H2O2 (IC50=125.96±3.00 µg/ml), NO. (IC50=85.36±2.01 µg/ml) and HO. (IC50=90.45±1.88 µg/ml) radicals in a dose dependent manner. Results obtained herein can be attributed to the presence of polyphenols (35.60±1.20 mg/ml gallic acid equivalent-polyphenols), flavanoids (26.94±0.94 mg/ml quercetin equivalent-flavanoids) and ascorbic acid (28.71±1.14 mg/ml ascorbic acid) in MESR. These observations suggest antioxidant and free radical scavenging potentials of MESR that adds a new dimension to its already established therapeutic uses. Keywords: antioxidant, free radical, Sida rhomboidea Roxb.

Resumen

El potencial antioxidante del extracto metanólico de Sida rhomboidea.Roxb (MESR) fue evaluada por modelos in vitro tales como peroxidación

lipídica, quelación de metales y potencial reductor. Su capacidad de neutralizar radicales libres fue determinada in vitro en ensayos de DPPH, superóxido (.O2), peróxido de hidrógeno (H2O2), óxido nítrico (NO.) and el radical hidroxil (HO.). MESR mostró una inhibición dosis dependiente de la peroxidación lipídica, (IC50= 92.15±1.21 µg/ml), una quelación efectiva de metales (IC50=65.69±1.22 µg/ml) y un alto potencial reductor (ODmax=1.20±0.27). MESR neutralizó eficientemente el DPPH (IC50=63.23±1.59 µg/ml), .O2 (IC50=142.36±2.59 µg/ml), H2O2 (IC50=125.96±3.00 µg/ml), NO. (IC50=85.36±2.01 µg/ml) y HO. (IC50=90.45±1.88 µg/ml) de una manera dosis dependiente. Los resultados pueden ser atriuidos a la presencia en el MESR de polifenoles (35.60±1.20 mg/ml polifenoles equivalentes al ácido gálico), flavanoides (26.94±0.94 mg/ml flavanoides equivalentes a la quercetina) y ácido ascórbico (28.71±1.14 mg/ml). Estas observaciones sugieren actividades antioxidante y neutralizante de radicales libres en MESR que añaden una nueva dimensión a sus conocidas aplicaciones terapéuticas.

Palabras Clave: antioxidante, radical libre, Sida rhomboidea Roxb. ——————————————————————————————————————————————————— Recibido | Received: February 23, 2010 Aceptado en versión corregida | Accepted in revised form: April 24, 2010 Publicado en línea | Published online: May 25, 2010 Declaración de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiación | Funding: University Grants Commission, New Delhi This article must be cited as: Menaka C Thounaojam, Ravirajsinh N Jadeja, Ranjitsinh V Devkar, AV Ramachandran. 2010. Antioxidant and free radical scavenging activity of Sida rhomboidea. Roxb methanolic extract determined using different in vitro models. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 9(3): 191-198. {EPub May 25, 2010} *Contactos | Contacts: [email protected]






Thounaojam et al. Antioxidant and free radical scavenging activity of Sida rhomboidea


INTRODUCTION

Reactive oxygen species (ROS) or free radicals (FR) are formed as an essential part of aerobic life and metabolism in any living system. These FR are however scavenged by inherent enzymatic and non-enzymatic antioxidant defense systems in the body to keep oxidative damage under check. But, excessive production of FR induces damage to biomolecules such as carbohydrates, protein, lipids and DNA (Halliwell, 1994) thus inducing the onset of diseases. Increased intracellular generation of ROS has been proposed as a mechanism of tissue injury associated with a variety of pathological manifestations like diabetes, cancer, neurodegenerative disease, inflammation, atherosclerosis and thrombosis (Jadeja et al., 2009). Many synthetic antioxidants like butyrated hydroxyanisole, butylated hydroxytoluene (BHT) and tert-butylhydroquinone (TBHQ) are commercially available but studies have shown that these synthetic antioxidants are prone to cause negative health effects (Stich, 1991). Hence, an alternative antioxidant with less toxic effects is desirable.

Sida rhomboidea. Roxb. (SR; fam. Malvaceae) is a weed found in marshy places throughout India. In Ayurveda it is known as “Mahabala” and is useful against fever, heart diseases, burning sensations, urinary disorders, piles and all kinds of inflammation (Puri, 2002). In North Eastern parts of India, decoctions prepared from leaves of SR are consumed for its therapeutic potential against various ailments including obesity and diabetes. It has been shown to have significant analgesic activity (Venkatesh et al., 1999). Recent studies from our laboratory have documented its hypolipidemic (Thounaojam et al., 2009a,b), antidiabetic (Thounaojam et al., 2010a) and cardioprotective (Thounaojam et al., 2010b) properties. Chronic oral administration of SR in mice is non toxic up to 3000mg/kg bodyweight dose (Thounaojam et al., 2010c).

There are no pharmacological studies highlighting the role of SR extract as a natural antioxidant. Large diversity of analytical methods is now available to determine antioxidant capacity of various herbs, spices, fruits etc. These assays differ from each other in terms of their mechanisms and expression of results for specific free radicals and their reaction conditions (Visavadiya et al., 2010). Since, these methods are widely used in physiology, pharmacology, nutrition and agro chemistry, it is difficult to select the most appropriate method(s) so

as to avoid inappropriate applications and misinterpretation of the results (Cao and Prior, 1998; Magalhaes et al., 2008). In this context, it is advantageous to choose the most appropriate and commonly employed assay for the assessment of antioxidant property of a phytochemical extract in question. Hence, the present inventory encompasses an array of analytical methods to understand the biological activity of SR as a natural antioxidant.

MATERIALS AND METHODS

Plant material Fresh leaves of SR were collected from the

natural habitats of North East India, identified by Dr. Hemchand Singh, a taxonomist in the Department of Botany, D.M college of Science, Manipur University, Imphal and herbarium (voucher specimen No-216) was deposited at Department of Botany, D.M college of Science, Manipur University, Imphal.

Extraction Leaves of SR were collected in the month of

June, shade-dried and grinded to fine powder. Hundred grams of this powder was subjected to extraction using methanol in a Soxhlet apparatus and the resultant filtrate was concentrated under reduced pressure by rotary evaporator (Buchi, Germany). A semi solid paste obtained was later stored at 00C. The extractive value of MESR was 21 % w/w, which was later dissolved in Milli Q water (Millipore India Pvt Ltd) and subjected to antioxidant and free radical scavenging assays.

Total polyphenol estimation Total polyphenolic compounds were determined

as per Chandler and Dodds (1993). MESR (1 ml) was mixed with 1 ml of 95% ethanol, 5 ml of distilled water and 0.5 ml of 50% Folin Ciocalteu reagent. This mixture was allowed to react for 5 min and later 1 ml of 5% Na2CO3 was added. Thereafter, it was thoroughly mixed and placed in dark for 1 h and the absorbance was determined at 725 nm. The calibration curve was prepared using gallic acid solution at various concentrations in methanol. Concentration of polyphenols was expressed in terms of mg/ml equivalent-gallic acid/100 mg plant extract.

Total ascorbic acid estimation SR powder (5 gm) was taken into an extraction

tube and 100 ml of EDTA: TCA (2:1) extracting




solution was added and the mixture was shaken for 30 min on a shaking platform, and then centrifuged at 800 X g for 20 min. Its volume was adjusted to 100 ml in a volumetric flask with EDTA: TCA (2:1) solution. 20 ml of this solution was taken and 1% starch indicator (2-3 drops) was added and titrated against 20% CuSO4 solution with appearance of dark brown colour indicating the end point (Barakat et al., 1973). The amount of ascorbic acid was expressed as mg/ ml/100 mg plant extract.

Total flavanoids estimation Total flavanoid content was determined using

aluminum chloride colorimetric method (Chang et al., 2002). 1 ml of MESR was mixed with 3 ml of methanol, 0.2 ml of 10% aluminum chloride, 0.2ml of 1 M potassium acetate and 5.6 ml of distilled water. The reaction mixture was allowed to stand at room temperature for 30 min and later absorbance was obtained at 415 nm. Calibration curve was prepared using quercetin solution at various concentrations in methanol. The concentration of flavanoids was expressed in terms of mg/ml equivalent- quercetin/100 mg plant extract.

Lipid peroxidation assay A modified thiobarbituric acid reactive species

(TBARS) assay was performed to determine the amount of lipid peroxide formed (Ruberto et al., 2000). Egg yolk homogenate (0.5 ml of 10% v/v) and 0.1 ml of MESR or ascorbic acid (AA) were added to a test tube and made up to 1 ml with distilled water. 0.05 ml of FeSO4 (0.07 M) was added to induce lipid peroxidation and the mixture was then incubated for 30 min. 1.5 ml acetic acid (20%) and 1.5 ml thiobarbituric acid (0.8% w/v in 1.1% sodium dodecyl sulphate) were added and the resultant mixture was vortexed and heated at 95 °C for 60 min. 5.0 ml of butanol were added to each tube and centrifuged at 1000 X g for 10 min. Absorbance of the upper layer was obtained at 532 nm.

Metal iron chelating activity The metal chelating activity of MESR and AA

were estimated as per the method of Dinis et al. (1994). MESR extract (0.94 ml) or EDTA (at varying concentrations) was added to 0.02 ml FeCl2 (2 mM) and adding 0.04 ml ferrozine started the reaction. The contents were mixed thoroughly and allowed to stand for 10 min and later absorbance was obtained at 562 nm.

Assay of total reducing power The antioxidant activity was evaluated in terms

of reducing power as per the method of Oyaizu (1986). MESR (2.5 ml) or AA (at varying concentration) was mixed with 2.5 ml of phosphate buffer (200mM, pH 6.6) and 2.5ml of 1% potassium ferricyanide. This mixture was placed in a water bath at 50°C for 20 min. The resulting solution was cooled rapidly on ice, mixed with 2.5 ml of 10% trichloroacetic acid and centrifuged at 1000 X g for 10 min. 5.0 ml supernatant was mixed with 5 ml of distilled water and 1ml of 1% ferric chloride. Absorbance of the resultant mixture was obtained after 10 min at 700 nm. Increased absorbance is indicative of increased reducing power.

DPPH radical scavenging activity Free radical scavenging activity of MESR or AA

was measured by DPPH (1, 1-diphenyl-2-picryl-hydrazil) as per Yokozawa et al. (1998). 1 ml of DPPH (0.08mM) was added to 0.3 ml of MESR or AA (at varying concentrations). The reaction mixture was mixed thoroughly and allowed to stand at room temperature for 30 min, and later absorbance was obtained at 517 nm.

Superoxide (.O2) radical scavenging activity The assay was based on the capacity of the

sample to inhibit blue formazan formation by scavenging the superoxide radicals generated in riboflavin-light-NBT system (Beauchamp and Fridovich, 1971). 50 mM phosphate buffer (pH 7.6), 20 µg riboflavin, 12 mM EDTA, and NBT (0.1 mg/3 ml) were mixed and the resultant mixture was exposed to direct sunlight for 150 sec and later, absorbance was obtained at 590 nm. This process was repeated with various concentrations of MESR and AA.

Hydrogen peroxide (H2O2) radical scavenging activity

The ability of MESR or AA to scavenge hydrogen peroxide was determined (Ruch et al., 1989). 40 mM solution of hydrogen peroxide (H2O2) was prepared in phosphate buffer solution (PBS, pH 7.4). Various concentrations of 0.5 ml of the MESR or AA were added to 1ml of H2O2 solutions in PBS. After 10 min, the absorbance was obtained at 230 nm.




Nitric oxide (NO.) radical scavenging activity Nitric oxide generated from sodium

nitroprusside was measured by the Griess reagent (Green et al., 1982). Various concentrations of MESR or AA were mixed with sodium nitroprusside (1mM in PBS) and incubated at 25°C for 150 min. 0.5ml of this solution was mixed with equal volume of Griess reagent (1% sulfanilamide, 2% orthophosphoric acid, and 0.1% naphthalene ethylene diamine dihydrochloride) and absorbance was obtained at 546 nm.

Hydroxyl radical (HO·) scavenging activity Hydroxyl radicals generated by the Fenton

reaction were measured as per Chung et al. (1997). The Fenton reaction mixture constituted of 0.2ml FeSO4·7H2O (10mM), 0.2ml EDTA (10mM) and 0.2ml 2-deoxyribose (10mM) mixed with 1.2 ml phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4). MESR (0.2ml) or AA (at varying concentrations) was added to Fenton reaction mixture followed by 0.2ml H2O2 (10 mM) and incubation at 37 °C for 4h. Later, 1ml TCA (2.8%) and 1ml TBA (1%) were added in reaction mixture and placed in a boiling water bath for10 min. The resultant mixture was brought to room temperature and centrifuged at 395 X g for 5min and absorbance was obtained at 532 nm.

Statistical analysis Data were expressed as mean ± S.D for three

parallel measurements using Graph Pad Prism version 3.0 for windows, Graph Pad Software, San Diego, California, USA. Statistical analysis was done by student’s t test and p<0.05 considered as significant. The 50 % inhibitory concentration (IC50) was calculated from the dose response curve (Graph Pad Prism Version 3.0) obtained by plotting percentage inhibition versus concentrations. Linear regression analysis was done for total reducing power assay. Percentage (%) inhibition was calculated as: - [(absorbance of control – absorbance of test sample) ÷ absorbance of control] × 100.

RESULTS

Quantitative phytochemical analysis revealed the presence of 35.60±1.20 mg/ml gallic acid equivalent-polyphenols, 26.94±0.94 mg/ml quercetin equivalent-flavanoids and 28.71±1.14 mg/ml ascorbic acid per 100 mg MESR.

Lipid peroxidation assay showed a dose dependent (50-600 μg/ml) response of MESR (p<0.05) with 600 μg/ml being the optimal concentration (Figure.1). Figure 1. Effect of MESR and AA on inhibition of lipid peroxidation

Data expressed as mean± S.D for three measurements. **p<0.001 compared to control

IC50 value for MESR was 92.15±1.21μg/ml whereas that of AA was 62.36±1.09 μg/ml indicating that the lipid peroxidation inhibitory activity of MESR was less than AA (Table. 1). Table 1. Fifty percent inhibitory concentration (IC50) of MESR and AA.

Assay IC50 (μg/ml) MESR AA

Inhibition of lipid peroxidation 92.15±1.21 62.36±1.09 Metal chalation 65.69±1.22 43.26±0.98 DPPH radical scavenging 63.23±1.59 60.47±1.42 Superoxide radical scavenging 142.36±2.59 40.23±1.00 Hydrogen peroxide radical scavenging 125.96±3.00 50.19±1.37

Nitric oxide radical scavenging 85.36±2.01 39.09±1.21 Hydroxyl radical scavenging 90.45±1.88 90.45±1.88

Ferrozine induced metal chelating assay

revealed that MESR showed a dose dependent (50-500 μg/ml) metal chelating property (p<0.05) (Figure.2).




Figure 2. Effect of MESR and AA on metal chelation.

Data expressed as mean ± S.D for three measurements. **p<0.001 compared to control. Figure 3. Reducing potential of MESR and AA

Data expressed as mean ± S.D for three measurements. **p<0.001 compared to control.

IC50 values of MESR (65.69±1.22 μg/ml) and

that of AA (43.26±0.98 μg/ml) were comparable (Table.1). Antioxidant potential in form of inhibition of metal chelation was superior to inhibition of LPO (65.69±1.22 μg/ml vs. 92.15±1.21μg/ml). MESR recorded linear increase in optical density (r2=0.95)

with increase in concentration (50-800 μg/ml) with maximum absorbance being 1.20 (800 μg/ml). Ascorbic acid recorded relatively higher absorbance values (Figure.3).

The DPPH free radical scavenging assay revealed a dose dependent potential (p<0.05) of MESR (50-500 μg/ml) (Figure.4A), with IC50 value being 63.23±1.59 μg/ml whereas, that of AA was 60.47±1.42 μg/ml (Table.1). Similarly, scavenging assays for .O2, H2O2 and NO. radicals were performed in which MESR recorded a dose dependent response (p<0.05) (Figure.4B,4C and 4D). The IC50 values of MESR for O2, H2O2 and NO. radicals vs. IC50 values of AA were recorded to be 142.36±2.59 μg/ml vs. 40.23±1.00 μg/ml, 125.96±3.00 μg/ml vs. 50.19±1.37 μg/ml and 85.36±2.01 μg/ml vs. 39.09±1.21 μg/ml respectively (Table.1). HO. scavenging assay also recorded a dose dependent effect (p<0.05) of MESR (50-600 μg/ml) (Figure.4E), with an IC50 value of 90.45±1.88 μg/ml that was comparable with IC50 value of 90.45±1.88 μg/ml observed in AA (Table.1).

Figure 4. DPPH (A), superoxide (B), hydrogen peroxide (C), nitric oxide (D) and hydroxyl radical scavenging potential of MESR and AA.

Data expressed as mean± S.D for three measurements. **p<0.001 compared to control




DISCUSSION Present study investigates antioxidant and free

radical scavenging potential of MESR based on its ability to (i) inhibit/promote various biological processes such as lipid peroxidation, metal chelation and reducing potential (ii) scavenge biologically important oxidants such as NO, .O2 , HO. and H2O2 and (iii) scavenge non biological stable free radicals (DPPH).

Lipid peroxidation is initiated by the abstraction of a hydrogen atom in an unsaturated fatty acyl chain and later propagated as a chain reaction (Droge, 2002; Kohen and Nyska, 2002). Lipid peroxides are involved in numerous pathological events, including inflammation, metabolic disorders and cellular aging (Oyaizu, 1986). Therefore, inhibition of lipid peroxidation is of great importance in the induction/onset of diseases involving free radicals. Egg yolk lipids undergo a non-enzymatic lipid peroxidation when incubated with ferrous sulphate yielding a carbonyl product such as malonaldehyde (MDA). We recorded dose dependent inhibition of MDA formation by MESR. Metal chelating capacity is an important antioxidant mechanism because it reduces concentration of catalyzing transition metal during lipid peroxidation (Diplock, 1997). In the present study, we recorded significant dose dependent metal chelating potential of MESR. Hence, results obtained from metal chelating capacity assay using MESR further validate results obtained in lipid peroxidation assay. Previous studies have reported a direct correlation between antioxidant activities and reducing power of certain plant extracts (Jadeja et al., 2009). In the reducing power assay, the presence of antioxidants in the sample reduced Fe3+/ferricyanide complex to the ferrous form. Inhibitory effect on lipid peroxidation, effective metal chelation and higher reducing potential of MESR recorded in this study suggests that MESR has a strong antioxidant property. Previous studies have correlated the reducing capacity of phytocompounds to its electron-donating ability (Aruoma, 2003; Roginsky and Lissi, 2005). Hence it can be assumed that effective electron donating ability attributed to the observed overall antioxidant property of MESR.

Free radicals are produced in living system during normal metabolic process or in presence of xenobiotics that initiates oxidative damage. MESR could quench DPPH free radicals in a dose dependent

manner and the IC50 value was also comparable to that of AA. These observations suggest that MESR has free radical scavenging ability. DPPH radical is a stable FR that has been widely used to evaluate the FR scavenging ability of natural antioxidant (Ruch et al., 1989). Antioxidants, on interaction with DPPH, either transfer an electron or hydrogen atom to DPPH, thus neutralizing its FR character (Oyaizu, 1986). In keeping with our previous assumption of effective electron donating ability of MESR, observations on stabilizing DPPH free radicals observed herein are further validated.

NO. radical plays multiple roles in a variety of biological processes viz. as an effector molecule, neuronal messanger, vasodilator, antimicrobial agent, etc (Hagerman et al., 1998). It has been reported to react with .O2 radical to form peroxynitrite radicals (ONOO-) that cause toxicity to biomolecules such as proteins, lipids and nucleic acids (Yermilov et al., 1995). During the process of inflammation, cells of the immune system generate superoxide radicals in which NADPH oxidase plays an important role in induction of vascular complications (Droge, 2002; Kohen and Nyska, 2002). .O2 further decomposes into singlet oxygen and HO. that results in massive mitochondrial damage. MESR significantly inhibits generation of NO. and HO. radicals in a dose dependent manner. These observations further highlight the importance of MESR in preventing physiological deletoriation caused by NO. and .O2 radicals.

HO. radical is the most reactive among ROS that causes peroxidation of membranes lipids and is known to be highly mutagenic and carcinogenic (Miyake and Shibamoto, 1997). H2O2 radical is also known to produce OH. radical by crossing cell membrane rapidly and by reacting with Fe2+ and Cu2+ ions. The same has been related to the initiation of many toxic effects (Miller et al., 1993). It is therefore biologically advantageous for cells to control the accumulation of H2O2. MESR was found to be highly potent in scavenging H2O2 radical thus validating previous observations pertaining to its antioxidant potential. These results suggest that in vitro FR scavenging activity of MESR was evident from the results obtained in DPPH, NO., .O2, OH. and H2O2 scavenging assays.

Quantitative assay of phytocompounds of MESR revealed high contents of total polyphenols, flavanoids and ascorbic acid. Plant polyphenols are




multifunctional and act as hydrogen-donating antioxidants and metal chelators. Velioglue et al. (1998) reported a high correlation between total phenolic content and antioxidant potential in some fruits, vegetables and grain products. Hence, high phenolic content observed in MESR can be attributed to its FR scavenging ability. Also, the presence of flavanoids and ascorbic acid in the MESR could be a possible reason for its significant antioxidant property (Jadeja et al., 2009).

CONCLUSIONS

It can be concluded from the present study that MESR possesses potent antioxidant and FR scavenging properties that have been demonstrated using a variety of in vitro experimental models. Hence, this study makes valuable addition to the existing wealth of information on this indigenous natural antioxidant.

ACKNOWLEDGEMENTS The authors are grateful to University Grants

Commission, New Delhi for providing Financial Assistance in the form of JRFSMS scholarship.

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© 2010 The Authors © 20xx Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 9 (3), 199-205





Evaluation of the hepatoprotective activity of Portulaca oleracea L. on D-galactosmaine-induced hepatic injury in rats

[Evaluación de la actividad hepatoprotectora de Portulaca oleracea L. en el daño hepático inducido por D-galactosamina en ratas]

Vunta PRABHAKARAN a, Bagepalli Srinivas ASHOK KUMAR b*, Devangam SHESHADRI SHEKAR c, Rudrappa NANDEESH d, Peta SUBRAMANYAM e, Divati RANGANAYAKULU e

aDepartment of Pharmacognosy, S.V. Polytechnique College, Tirupathi, Andhra Pradesh (India). bDepartment of Pharmacognosy, Sri K.V.College of Pharmacy, Chickballapur, Karnataka (India), c Sri K.V. College of Pharmacy, Chickballapur, Karnataka (India),

dDepartment of Pharmacognosy, Sree Siddhaganga College of Pharmacy, Tumkur, Karnataka (India). eDepartment of Pharmacology, Sri Padmavathi School of Pharmacy, Tiruchanoor, Tirupathi (India).

Abstract

The suspensions of methanol and petroleum ether extracts of entire plant of Portulaca oleracea in carboxy methyl cellulose (CMC) were evaluated for hepatoprotective activity in Wister albino rats by inducing hepatic injury with D-galactosamine (400 mg/kg). D-galactosamine induced hepatic damage was manifested by a significant increase in the activities of marker enzymes. Biochemical data exhibited significant hepatoprotective activity of Methanol extract of Portulaca oleracea at oral dose of 200 and 400 mg/kg against D-galactosamine. Silymarin was used as reference standard also exhibited significant hepatoprotective activity against D-galactosamine. The biochemical observations were supplemented with histopathological examination of rat liver sections. Phytochemical analysis of both pet ether and methanol extracts of Portulaca oleracea was also carried out.

Keywords: Portulaca oleracea; Silymarin; carboxy methyl cellulose; D-Galactosamine; hepatoprotective activity

Resumen

Las suspensiones de los extractos en methanol y eter de Portulaca oleracea (planta complete) en carboxi-metil celulosa (CMC) fueron evaluadas por su actividad protectora en ratas Wister albino contra el daño hepático inducido con D-Galactosamina. El daño causado por la D-Galactosamina se manifestó como un aumento significativo en la actividad de los marcadores enzimáticos. Los resultados bioquímicos mostraron un efecto protector importante del extracto metanólico de Portulaca oleracea contra dosis orales de 200 and 400 mg/kg de D-Galactosamina. La droga de referencia, silimarina, también mostró un efecto protector importante. Las observaciones bioquímicas fueron suplementadas con la evaluación histopatológica de secciones de hígado. Se efectuó un análisis fitoquímica de ambos extractos.

Palabras Clave: Portulaca oleracea; silimarina; carboxi-metil celulosa; D-Galactosamina; actividad hepatoprotectora

Recibido | Received: December 7, 2009 Aceptado en versión corregida | Accepted in revised form: April 24, 2010 Publicado en línea | Published online: May 25, 2010 Declaración de intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiación | Funding: This work was self financed. This article must be cited as: Evaluation of the hepatoprotective activity of Portulaca oleracea L. on D-galactosmaine-induced hepatic injury in rats. 2010. Vunta Prabhakaran, Bagepalli Srinivas Ashok Kumar, Devangam Sheshadri Shekar, Rudrappa Nandeesh, Peta Subramanyam, Divati Ranganayakulu. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 9(3): 199-205. {EPub May 25, 2010}.

*Contactos | Contacts: E-mail: [email protected]. Phone: +91-9986946780: Department of Pharmacognosy, Sri K.V.College of Pharmacy, Chickballapur, Karnataka (India).






Prabhakarn et al. Hepatoprotective activity of P. oleracea on D-galactosamine-induced hepatic injury in rats


INTRODUCTION Hepatitis is common disease in the world

especially in the developing countries. Despite considerable progress in the treatment of liver diseases by oral hepatoprotective agents, search for newer drugs continues because the existing synthetic drugs have several limitations. Hence, there are many researchers of traditional medicines attempting to develop new drugs for hepatitis (Liu 1989).

Portulaca oleracea L. ((Portulacaceae) is a warm-climate annual, it is known as Lonika in Sanskrit, Peddapayilikura in Telugu. The plant is succulent, herbaceous, erect or decumbent growing up to 30 cm height with cylindrical stem of 2-3 mm in diameter. P. oleracea used traditionally for alleviating pain and swelling (Okwuasaba et al., 1987). The entire plant is usually cut into small pieces and eaten with salt; applied topically to soothe skin (Ghazanfar 1994). It also exhibits a wide range of pharmacological effects, including antibacterial (Zhang et al., 2002), analgesic, anti-inflammatory (Chan et al., 2000), and skeletal muscle- relaxant activities (Parry et al., 1987; Parry et al., 1993). A bronchodilatory effect in asthmatic patients, skeletal muscle relaxant, and antifertility effect were also reported for P. oleracea (Elkhayat et al., 2008). It is also consumed as a vegetable, widely sold in United Arab Emirates and Oman (Miller and Morris, 1988) and has been reported to be rich in α-linolenic acid and β-Carotene (Liu et al., 2000). In addition to flavonoids, coumarins (Awad, 1994) and monoterpene glycoside (Sakai et al., 1996), it also contains neither N-Trans-feruloyltyramine (Mizutani et al., 1998), dopamine, dopa, high concentrations of noradrenaline (Feng et al., 1981), ferulic acid (Chen, 2000), adenosine (Meng et al., 1981) and portulene (Elkhayat et al., 2008). This plant species is also a popular remedy in Trinidad and Tobago for urinary problems, "cooling" and high cholesterol.

The hepatoprotective activities of hydroalcoholic extract of stems and leaves of P. oleracea in rats treated with CCl4- (Elkhayat et al., 2008) or rifampicin (Kulkarni et al., 2007) were previously reported. The present study was

designed to investigate the hepatoprotective activity of petroleum ether and methanol extract of P. oleracea against D-galactosamine induced hepatotoxicity in rats.

MATERIAL AND METHODS

Plant material The whole plant of P.oleracea was

collected from surrounding Tirumala hills, Tirupathi, Andhra Pradesh in the month of November. The plant was authenticated by comparing with the specimen by Dr. K. Madhava Setty, Department of Botany, Sri Venkateshwara University, Tirupathi, Andhra Pradesh. A specimen voucher (KVCP103) has been deposited in the herbarium of department of Pharmacognosy, Sri K.V. College of Pharmacy, Chickballapur, India. The plant was cut into small pieces and coarsely powdered. The coarse powder was passed through a No. 10 mesh and used for extraction.

Preparations of plant extracts The coarsely powdered plant material was

extracted with petroleum ether and methanol by using Soxhlet apparatus sequentially. Both extracts were concentrated to dryness in vacuum using a rotary flash evaporator and yield of methanol and petroleum ether extracts were 3.13 %w/w and 1.90 %w/w. Extracts were dried in a desiccator and preserved in refrigerated condition. Both petroleum ether and methanol extracts were suspended in 0.3 % CMC just before administration to rats.

Preliminary phytochemical screening A preliminary phytochemical screening for

steroids, flavonoids, glycosides, tannins, phenolic compounds, proteins and carbohydrates were carried out using a standard procedure described by Kokate (1986).

Animals Male albino rats of Wister strain weighing

about 150-200 g of either sex were acclimatized to the experimental room temperature 23 ± 2 °C, controlled humidity conditions (50-55 %) and 12 h light and 12 h dark cycle. They were caged




with a maximum of two animals in each polypropylene cage and were fed with standard food pellets (Kamadenu Enterprises, Bangalore) and water ad libitum. The study was conducted after obtaining ethical committee clearance from the institutional animal ethical committee of J.S.S. C P, J.S.S. College of Pharmacy, Ootacamund, Tamilnadu (India) No. IAEC/JSSCP/02/2004-2005.

Acute toxicity studies Petroleum and methanol extracts of P.

oleracea were studied for acute oral toxicity as per OECD (Organization for Economic Cooperation and development) guidelines No. 423, (2000). The extract was devoid of any toxicity in rats when given in dose up to 2000 mg/kg by oral route. Hence, for further studies 200- 400 mg/kg doses of extract were used.

Hepatoprotective activity Rats were randomly divided into seven

groups of six animals each. Group I: Served as control and received CMC (1 ml/kg p.o.) for a period of days. Group II: Received D-galactosmaine (400 mg/kg, i.p.) on 14th day. Group III: Received silymarin (25 mg/kg p.o.) for 14 days and hepatotoxicant on 14th day intraperitonially. Group IV and V: Received petroleum ether extract P. oleracea (200 and 400 mg/kg p.o.) for 14 days and hepatotoxicant on 14th day intraperitonially. Group VI and VII: Received methanol extract at dose P. oleracea (200 and 400 mg/kg p.o.) for 14 days and hepatotoxicant on 14th day intraperitonially.

After 24 h of administration galactosamine, animals were anaesthetized with pentathol sodium. Blood was collected by Sino-orbital puncture, and rats were sacrificed after the collection of blood samples and the livers were excised immediately for histopathological examination. The blood samples were allowed to clot for 30-40 min. Serum was separated by centrifugation for 15- 20 min at 2000 rpm was used for estimation of various biochemical parameters (Deshpande, et al., 2003).

Biological assays The activities of serum asparatate amino

transferase (ASAT, GOT), alanine amino transferase (ALAT, GPT) (Reitaman and Frankel, 1957), alkaline phosphatase (ALP) (King and Armstrong, 1934), total bilirubin (TB) (Malloy and Evelyn, 1987), total cholesterol (TC), total protein (TP), albumin triglycerides (TGL) (Foster and Dunn, 1973) were carried out.

Histopathology Small pieces of liver tissues were collected

in 10% formal saline for proper fixation. These tissues were processed and embedded in paraffin wax. They were cut into section of 5 to 6 microns in thickness were cut and stained with hematoxylin and eosin (Luna, 1966).

Statistical analysis The data were expressed as mean ± S.E.M.

The differences were compared using one-way ANOVA followed by Dunnett’s test using PRISM software (version 4). The results were considered significant when p<0.05.

RESULTS Petroleum ether and methanolic extracts of

P.oleracea showed the presence of alkaloids, flavonoids, steroids, saponins, fixed oils and tannins and phenolics. Table 1 showed effect of D-galactosmaine (group II) developed hepatocellular damage as evident from a significant elevation (P<0.01) in serum activities of AST, ALT, ALP, TGL, TP, Albumin and TB level when compared with control. The pet ether and methanolic extract of P. oleraceas showed significant restoration of the altered biochemical parameters (p<0.01 and p<0.05) at both the dose levels (200 and 400 mg/kg) when compared to d-galactosamine treated group. Silymarin also showed similar effect.




Figure 1. Histopathological observations.

Group 1. Rats treated with CMC solvent showing structure of normal liver (H&E 400x).

Group 2. Rats treated with D-galactosmaine showing severe periportal inflammation necrosis of zone1 hepatocytes and bile duct hyperplasia (H&E 400x).

Group 3. Rat treated with D-galactosmaine Silymarin showing focal necrosis and periprotal inflammation (H&E 400x).

Group 4. Rat treated with D-galactosmaine and 200 mg/kg of pet ether extract of P. oleracea showing foamy degeneration of hepatocytes (H&E 400x).

Group 5. Rat treated with D-galactosmaine and 200 mg of methanol extract of P.oleracea showing foamy degeneration of hepatocytes and regenerative activity (H&E 400x).

Group 6. Rat treated with D-galactosmaine and 400 mg of pet ether extract of P. oleracea showing foamy degeneration of hepatocytes (H&E 400x).

Group 7. Rat treated with D-galactosmaine and 400 mg of methanol extract of P. oleracea showing foamy




Table 1. Effect of the petroleum ether and methanol extracts of P. oleracea on D-galactosmaine induced hepatotoxicity in rats.

Sample Solvent D(+)galN Silymarin Pet ether extract Methanol extract

Dose (mg/kg)

- 400 25 200 400 200 400

TB (mg/dl)

0.78±0.10 4.03±0.07 1.62±0.09** 3.43±0.19** 4.12±0.09** 2.8±0.07** 1.92±0.07**

ASAT (U/L)

28.33±1.48 73.33±3.40 31.83±2.02 68.83±2.81** 75.83±2.77** 37.67±3.18** 45.67±2.60**

ALAT (U/L)

18.83±0.60 84.83±3.44 23.17±0.95 74.67±1.89** 76.17±2.46** 38.40±1.36** 36±1.21**

TGL (mg/dl)

79.83±0.87 25.67±1.76 71.17±2.27* 31.5±2.14** 36.67±0.88** 69.67±1.89** 79.33±1.82

TC (g/dl) 48.0±1.21 174±2.96 72.17±2.75** 172.83±4.21** 167.67±6.22** 106.67±5.94** 91.83±1.25**

Albumin (g/dl)

5.18±0.11 3.55±0.16 1.42±0.14** 3.23±0.15** 2.30±6.22** 6.37±0.11** 2.5±0.21**

TP (g/dl) 9.90±0.15 5.35±0.40 8±0.12** 4.33±0.23** 4.38±0.31** 2.6±0.23** 7.43±0.17**

ALP 197.68±6.82 373.33±17.7 215.17±6.46** 447.50±18.22** 415.83±4.32** 287.33±4.06** 244.33±5.28*

Mean ± S.E.M.; (n=6); *P<0.05, **P<0.01 as compared with control (CMC) Dunnett’s test. TB: Total bilirubine. ASAT: asparatate amino transferase. ALAT: alanine amino transferase. TGL: triglycerides. TC: Total cholesterol. TP: Total proteins. ALP: alkaline phosphatase

Histology of the liver sections of normal control animals (Group I) showed normal liver architecture The liver section of galactosmine treated (Group II) showed hepatic cells with severe toxicity characterized by inflammatory cell collection, scattered inflammation across liver parenchyma, focal necrosis and swelling up of vascular endothelial cells. Petroleum ether and methanol extracts of P.oleracea appeared to significantly prevent the galactosmine toxicity as revealed by the hepatic cells with well-preserved cellular architecture (Group III-VII).

DISCUSSION

Galactosamine induced experimental model system in rats is recognized to be much like viral hepatitis in humans from both morphological and functional points of view (Keppler et al., 1968). Galactosamine has great liver specificity because hepatocytes have high levels of galactokinase and galactose-1-uridyltransferase. Galactosamine does not affect other organs (Maley et al., 1986 and Keppler et al., 1970). Galactosamine causes hepatic injury with spotty hepatocyte necrosis and marked portal and parenchymal infiltration (Keppler and Decker, 1969). Galactosamine also causes depletion of uridine diphosphate (UDP) by increasing the

formation of UDP-sugar derivatives, which results in inhibition of RNA and protein synthesis leading to cell membrane deterioration (Decker et al., 1973; El-Mofty et al., 1975).

Galactosamine administration in rats disrupts the membrane permeability of the plasma membrane causing leakage of the enzymes from the cell, which leads to elevation in levels of serum enzymes (Mitra et al., 2000). Elevated serum enzymes are indicative of cellular leakage and loss of functional integrity of the cell membrane in liver (Drotman and Lawhorn, 1978). Hence significant rise in the transaminase levels could be taken as an index of liver damage. Further, intense galactosamination of membrane structure is thought to be responsible for loss of activity of ionic pumps. The impairment in the calcium pump, with consequent increase in the intracellular calcium is considered to be responsible for cell death (Tsai et al., 1997). The rise in ALAT activity is almost always due to hepatocellular damage and is usually accompanied by rise in ASAT (Rao et al., 1989). An increase in ALP reflects the pathological alteration in biliary flow (Plaa and Hewitt, 1989). Determination of serum bilirubin represents an index for the assessment of hepatic function and any abnormal increase in the levels of bilirubin in the serum indicate hepatobiliary disease and server disturbance of hepatocellular function




(Martin and Friedman, 1992). Increased levels of bilirubin in this study are in agreement with previous reports showing that d-GalN induced hepatitis is characterized by increased levels of bilirubin in serum (Sree Ramamurthy and Srinivasan, 1993; Maezona et al., 1996).The extract-mediated suppression of the increased bilirubin level suggests the possibility of the extract being able to stabilize biliary dysfunction. Hepatocellular damage due to alcohol, virus and drug induced hepatitis causes a modest hypertriglyceridemia (Glickman and Sebesin, 1982) which is due to the biochemical changes inferring with the transport of triglycerides out of liver. Our study also showed an increased accumulation of triglycerides in D (+) galactosamine induced rats, which is in agreement with previous reports (Koff et al., 1971; Cartwright et al., 1982). Pre treatment with methanol extract of P. oleracea and Silymarin for 14 days protected the rat livers from D-galactosamine induced histopathological changes.

CONCLUSION The results suggest that extracts from P.

oleracea possess significant protection against galactosamine induced hepatotoxicity in rats.

ACKNOWLEDGEMENTS The authors wish to thank the management,

Sri K.V.College of Pharmacy, Sri K.V. Naveen Kiran, Chairman, K.V.and Panchgiri Trust, Chickballapur, Karnataka (India) for providing necessary facilities and support for the completion of this work.

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Chemical and Biological Investigations of Pilocarpus spicatus essential oils

[Estudios químicos y biológicos del aceite esencial de Pilocarpus spicatus]

Adriana P. OLIVEIRA1*, Rodrigo A. S. CRUZ1, Gisele S. BOTAS1, Marcelo S. GONZALEZ3, Marcelo G. SANTOS4, Lenise A. TEIXEIRA2, Leandro M. ROCHA1.

1. Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense, Rua Mário Viana 523,

Santa Rosa, CEP 24241-000, Niterói, RJ, Brazil. 2. Laboratório de Controle Microbiológico, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense, Rua Mário Viana 523, CEP 24241-000, Niterói, RJ, Brazil. 3. Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal Fluminense, Morro do Valonguinho S/N, Centro, CEP 24020-140, Niterói, RJ, Brazil. 4. Departamento de Ciências, Faculdade de

Formação de Professores, Universidade Estadual do Rio de Janeiro, Dr. Francisco Portela 794, CEP 24435-000, São Gonçalo, RJ, Brazil. ——————————————————————————————————————————————————— Abstract

Essential oil was obtained by steam distillation of aerial parts of Pilocarpus spicatus Saint-Hilaire (Rutaceae) from the northern coast of Rio de Janeiro State and examined by GC–MS. A total of 17 components were identified accounting for 96,06% of the oil composition. The major components were limonene (41,87%), 2-undecanone (11,0%) and sabinene (10,78%). P. spicatus essential oil had inhibitory effects on the growth of bacteria (Escherichia coli and Staphylococcus aureus) and showed anticholinesterase activity in TLC assay. In addition, the volatile oil was toxic to larvae of the brine shrimp.

Keywords: Pilocarpus spicatus; antibacterial activity; anticholinesterase activity; cytotoxic activity; essential oil

Resumen

El aceite esencial fue extraido por arraste de vapor de las partes aéreas de Pilocarpus spicatus Saint-Hilaire (Rutaceae) de la costa Norte del estado de Rio de Janeiro y examinado por GC-MS. Fueron identificados 17 componentes que corresponden al 96,06% de la composición quìmica del aceite. Los componentes mayoritarios fueron el limoneno (41,87%), 2 undecanona (11,0%) y sabineno (10,78%). El aceite esencial de P. spicatus tiene efecto inhibitorio sobre el crecimiento bacteriano (Escherichia coli y Staphylococcus aureus) y presentando también actividad anticolinesterasa en ensayo de TLC. Adicionalmente el aceite volátil ha demostrado ser tóxico para las larvas de Artemia salina. Palabras Clave: Pilocarpus spicatus; actividad antibacteriana; actividad anticolinesterasa; actividad citotóxica; aceite esencial ——————————————————————————————————————————————————— List of abbreviations: CG-MS - Gas chromatography-mass spectrometry, TLC – thin layer chromatography ——————————————————————————————————————————————————— Recibido | Received: June 25, 2009 . Aceptado en versión corregida | Accepted in revised form: April 28, 2010. . Publicado en línea | Published online: May 25, 2010. . Declaración de intereses | Declaration of interests: the authors have no competing interests. . Financiación | Funding: none declared. This article must be cited as: Adriana P Oliveira, Rodrigo AS Cruz, Gisele S Botas, Marcelo S Gonzalez, Marcelo G Santos, Lenise A Teixeira, Leandro M Rocha. 2010. Chemical and Biological Investigations of Pilocarpus spicatus essential oils. Bol Latinoamer Caribe Plant Med Aromat 9(3): 206-211. {EPub May 25, 2010}. *Contactos | Contacts: [email protected]






Oliveira et al. Chemical and biological investigations of Pilocarpus spicatus essential oils


INTRODUCTION

Pilocarpus spicatus Saint-Hilaire (Rutaceae) is one of the various Pilocarpus spp. called ‘jaborandi’. Nowadays, the great importance of Pilocarpus spp. is due to the extraction of the alkaloid pilocarpine from the leaves (Pinheiro, 2002). The Rutaceae has secretory cavities lysigenous and schizo-lysigenous containing essential oils (Simões and Spitzer, 1999). The leaves of Pilocarpus microphyllus Stapf ex Wardleworth and Pilocarpus pennatifolius Lem produce 0.25-0.50% of essential oil (Lorenzi and Mattos, 2002).

In this way, a lot of essential oils from different species of the Pilocarpus genus have been analyzed and chemical substances as terpenoids, alcohols, aldehydes, hydrocarbons aliphatic and aliphatic ketones have been described (Craveiro et al., 1979; Santos et al., 1997; Andrade-Neto et al., 2000, 2002; Santos et al., 2004). In addition, chalepin is a coumarin extracted from P. spicatus essential oil. Experiment in vitro showed that binding of chalepin to glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase of T. cruzi, a protozoan exclusively transmitted by hematophagous triatomines (Rhodnius prolixus), disrupted flagellate development (Mafezoli et al., 2000; Pavão et al., 2002). Moreover, we observed a variety of effects of P. spicatus essential oil on Rhodnius prolixus -a vector of Chagas disease -which indicates their secondary metabolites, nowadays under investigation in our laboratory, as good candidates for the study of insect physiology, vector control population and perhaps, blockage of protozoan development in triatomine hosts (Melo et al., 2007).

It has well established that P. spicatus essential oil collected in the state of Ceará (Brasil) displays in vitro antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus (Santos et al., 1997). However, the chemical composition of P. spicatus essential oil showed qualitative and quantitative variation by the influence of local environmental conditions of soil and seasonal period of collections (Taveira et al., 2003).

A variety of plants has been reported to show acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activity and so may be relevant to the treatment of neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease (AD). (Mukherjee et al., 2007). Numerous essential oils and their monoterpene constituents have been investigated for their effects on AChE, and have

shown inhibitory activity. Although, several extracts of plants and essential oils already have been investigated, this is the first account in the Pilocarpus genus.

The brine shrimp lethality test (BST) is a simple and efficient method used to predict compounds or extracts as cytotoxic agents and that may have anticancer activity (Meyer et al., 1982). Although several essential oils have been tested against brine shrimp, P. spicatus essential oil cytotoxicity has not been investigated yet. In this work, studies were carried out to elucidate the chemical composition and analyses antibacterial, anticholinesterase and cytotoxicity activities in vitro of P.spicatus essential oil from Rio de Janeiro State (Brazil).

MATERIALS AND METHODS

Plant material Aerial parts of P. spicatus Saint-Hilaire

(Rutaceae) was collected in Sandy Coastal Plains (Restinga de Jurubatiba National Park) located on the northern coast of Rio de Janeiro State, Brazil (October 2004) and was identified by Dr. Marcelo Guerra Santos. The dried specimens were deposited in the herbarium of the Faculdade de Formação de Professores, UERJ (M. Guerra Santos 1.824) and of the Museu Nacional, UFRJ (M. Guerra Santos 1.406).

Extraction of the essential oil The essential oil was obtained by steam

distillation (1.37 kg of fresh plant) during 4 h in a Cleavenger-type apparatus (yield 0,42% v/w), and stored at 4°C until tested and analyzed.

Gas chromatography/mass spectrometry analysis Essential oil was analyzed by a GCMS-QP5000

(SHIMADZU) gas chromatograph equipped with a mass spectrometer using electron ionization. The gas-chromatographic (GC) conditions were as follows: injector temperature, 260°C; FID temperature, 280°C; carrier gas (Helium), flow rate 1 mL/min and split injection with split ratio 1:40. Oven temperature was initially 60°C and then raised to 240°C at a rate of 3°C/min. One microliter of each sample, dissolved in CH2Cl2 (1:100 mg/μL), was injected at ZB5MS column (i.d. = 0.25 mm, length 30 m, film thickness = 0.25 mm) column was used. The mass spectrometry (MS) conditions were ionization




voltage, 70 eV and scan rate; 1 scan/s. The percentage composition of the oils was computed by the normalization method from the GC peak areas. The identification of compounds was performed by comparison of Kovat’s index (KI), determined relatively to the retention times of a series of n-alkanes, with corresponding reference data (Adams, 1995) and MS fragmentation pattern was checked with NIST mass spectra libraries.

Microbial strain Staphylococcus aureus ATCC25923 and

Escherichia coli ATCC36298 obtained from the culture collections of the Laboratório de Controle Microbiológico, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense, were used for the antibacterial activity experiments. Overnight cultures were prepared by inoculating approximately 2 mL Tryptic soy broth (TSB; Difco) with 2-3 colonies of each organism. Bacterial strains were cultured overnight at 37ºC. Inocula were prepared by diluting overnight cultures in saline to approximately 108 CFU/mL.

Antibacterial activity Antimicrobial tests were carried out by disk

diffusion method (CLSI, 2006). Briefly, a suspension of microorganism (108 UFC/mL) was spread on the solid media plates of Tryptic soy agar (TSA; Oxoid). The disks (6 mm in diameter) were impregnated with the essential oil until saturation was reached and placed on the inoculated agar. Vancomycin (30 µg) and ampicillin (30 µg) were used as positive reference standards of the test. The inoculated plates were incubated at 37ºC for 24 h. Antimicrobial activity was evaluated by measuring the zone of inhibition against the test organisms. Each experiment was repeated three times.

TLC assay for acetylcholinesterase inhibitors TLC assay for acetylcholinesterase inhibitors

was done as described by Marston et al. (2002) with modifications. Sample of essential oil was dissolved in toluene (1:1) and 1µL was applied on the silica gel Alugram® SIL G UV254 for TLC (MACHEREY - NAGEL). Physostigmine (Sigma, 1µL at 5mM) was used as positive control. After the chromatographic run of the plate with toluene-ethyl acetate mixture (93:7), it was sprayed with DTNB/ATCI (Sigma)

reagent (1:1 solution of 0.4 mM 5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) in phosphate buffer (pH 7.4) and 2.0 mM acetylthiocholine iodide in water) until saturation of the silica. The plate was allowed to dry for 5 min, and then 1.5 U/mL of enzyme suspension of the rat brain was sprayed. After a while, a yellow background appeared, with white spots showing the inhibitory compounds. To confirm the result, it was done another plate under the same conditions (Rhee et al, 2003). It was used 1µL of p-anisaldehyde 10% as false inhibitor reference compound. Finally, DTNB solution was applied and after thiocholine solution obtained from enzymatic hydrolysis.

Acetylcholinesterase origin Acetylcholinesterase enzyme suspension of the

rat brain was obtained as it described to Cunha Bastos et al (1991) and Lima et al (1996) with modifications of Moura (1998).

Brine shrimp lethality test The protocol established by McLaughlin and

Rogers (1998) was employed with modifications. Essential oil dilutions at 50, 10, 1 and 0.1 mg/mL were prepared in DMSO and 50µL were transferred to vials. Seawater (5 mL) was added to each vial, resulting in final concentrations of 1000, 500, 100, 10 and 1 µg/mL, respectively. Second instar larvae of A. salina (ten per vial) were added. After 24 h contact, the survivors were counted and the LC50 calculated using the Trimmed Spearman-Karber method (Hamilton et al., 1977). Positive control test was done using sodium lauryl sulfate. All these experiments were performed in triplicate.

Statistical analysis All experiments were performed in triplicate.

The mean, standard deviation and coefficient of variation (CV) of the three experiments were determined. The CV values of 15.0 or height were considered statistically significant. The VC values were calculated using the Microsoft Excel program.

RESULTS

The chemical composition of P. spicatus essential oil was analysed by GC/MS and 17 components were identified, as shown in Table 1. The major components were limonene (41.87%), 2-undecanone (11.0%) and sabinene (10.78%).




Table 1. Chemical composition of Pilocarpus spicatus essential oil

Compounds a RI(min.) b KI c % 1 α-Pinene 6.613 935 5.08 2 Sabinene 7.983 974 10.78 3 β-Pinene 8.162 979 1.43 4 β-Myrcene 8.570 989 4.95 5 α-Terpinene 9.679 1017 2.04 6 Limonene 10.275 1031 41.87 7 (Z)-β-Ocimene 10.472 1037 1.05 8 (E)-β-Ocimene 10.915 1047 0.97 9 γ-Terpinene 11.432 1059 2.70 10 Terpinolene 12.626 1083 1.84 11 Terpinen-4-ol 17.086 1180 7.90 12 Undecanone-2 22.384 1292 11.00 13 Germacrene D 30.650 1477 1.34 14 Viridiflorene 31.261 1491 1.13 15 γ-Cadinene 32.230 1514 0.67 16 δ-Cadinene 32.412 1519 0.60 17 Elemol 33.493 1545 0.71

Total 96.06 a Compounds listed in order of elution from a ZB-5 MS column. b Retention time (minutes). c Kovats Index on ZB-5 MS column in reference to n-alkanes (Adams,1995).

The in vitro antibacterial activity of P. spicatus essential oil in comparison with the reference standard included in the study, are shown in Table 2. All the tested strains were sensitive to the essential oil. The differences in inhibition zones diameters of S. aureus (CV = 5.0%) and E. coli (CV = 3.9%) were not statistically significant. Table 2. Antibacterial activity of Pilocarpus spicatus essential oil

Microorganisms Essential oil

Antibiotics

DDa Vancomycinb Ampicillinc Staphylococcus aureus ATCC25923

12 20 nt

Escherichia coli ATCC36298

14 nt 32

a Zone of inhibition (mm). nt - not tested. b Vancomicin 30 (μg/disc), cAmpicilin 10 (μg/disc).

In the chromatographic assay for acetylcholinesterase inhibitors, two white spots were seen, one on the base (false positive) and other on the middle of the plate (a true inhibitory result).

P. spicatus essential oil showed toxicity against brine shrimp nauplii (Artemia salina L.) with a lethal concentration 50% (the concentration of test compound that kills 50% of A. salina) value of 3.98 μg/mL. Positive control test was done using sodium lauryl sulfate whose LC50 is approximately 22 µg/mL and the blank test (50 µL DMSO) no lethality of brine shrimp was observed.

DISCUSSION

P. spicatus essential oil from Rio de Janeiro State presents monoterpenoids, sesquiterpenoids and aliphatic ketones. Regarding the previously reported chemical composition of many essential oils of Pilocarpus genus has been described (Craveiro et al., 1979; Santos et al., 1997; Andrade-Neto et al., 2000, 2002). However, here we note that (Z)-β-ocimene and viridiflorene were detected for first time in P. spicatus. About this, it is necessary to point out that environmental factors strongly influence the chemical composition of essential oil (Kaastra, 1982)

P. spicatus essential oil collected in the state of Ceará (Brasil) displays in vitro antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus but no activity against E. coli was reported (Santos et al., 1997). It is not clear whether the antibacterial effect may be caused mainly by a single active constituent or by the combined action of the many active constituents found in essential oil. Terpenoids are active against bacteria but the mechanism of action of terpenes is not fully understood although is speculates to involve membrane disruption by lipophilic compounds (Cowan, 1999). It has been reported by Sacchetti et al. (2005) that essential oil with high terpenoids percentages was probably more effective, as a consequence of higher specificity of the assay for lipophilic compounds.

Several monoterpenes and other terpenoids are known to inhibit AChE (Houghton et al, 2006). The principal monoterpene identified in P. spicatus essential oil is limonene (41.87%), which is known to be an inhibitor of AChE (Miyazawa et al, 1997). In this oil, there are others monoterpenes that have anticolinesterase activity as α-Pinene, β-Pinene (Miyazawa and Yamafuji, 2005), α-Terpinene




(Miyazawa et al, 1997), γ-Terpinene (Perry et al, 2002) and sesquiterpene alcohol elemol (Miyazawa et al, 1997).

P. spicatus essential oil showed LC50 = 3.98 μg/mL that is a value less than 1000 µL/mL, which suggests good cytotoxic activity potential and indicating that they may possess a significant anti-tumor activity since McLaughlin et al (1998). The cytotoxic activity showed the P. spicatus essential oil should be more studied as regards a possible antitumoral activity.

CONCLUSION The present study is the first report of (Z)-β-

ocimene and viridiflorene for P. spicatus essential oil. In addition, showed antibacterial activity against Gram-negative (E. coli) and Gram-positive (S. aureus), anticholinesterase activity and cytotoxic activity in the BST. So, P. spicatus essential oil might represent a valuable source for pharmaceutical applications.

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Actividad de aceites esenciales de Canelo, Queule, Bailahuén y Culén frente a hongos fitopatógenos

[Activity of essential oils of Canelo, Queule, Bailahuen y Culen against phythopatogenic fungi]

Julio BECERRA*, Magalis BITTNER, Victor HERNÁNDEZ, Carolina BRINTRUP, José BECERRA, Mario SILVA.

Laboratorio de Química de Productos Naturales. Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas. Universidad de Concepción.

Abstract

Phytopatogenic fungi are the most harmful agents for plants. In this context, we tested the effect of four economically relevant Chilean species -Drimys winteri (Canelo), Psoralea glandulosa (Culén), Gomortega keule (Queule) y Haplopappus baylahuen (baylahuén)- on several fungi on the disk difussion assay. We obtained values of inhibition of P. glandulosa vs. Aspergillus nigra, G. keule vs.Rhizopus arrhizus, H. baylahuen vs. Fusarium oxysporum y D. winteri vs. Botritys cinérea. The growth of A. nigra in the presence of a 1% of the essential oils shown diverse effects on the fungi for each of the oils, resulting el the essential oils of G. keule the most active (54% inhibition), followed by H. baylahuen (38%), P. glandulosa (39%), and D. winteri (36%).

Keywords: Gomortega keule; Drimys winteri; Psoralea glandulosa; Haplopappus baylahuen; phythopatogenic fungi.

Resumen

Los agentes dañinos más comunes en las plantas son los hongos fitopatógenos. En este contexto se realizaron ensayos para determinar el porcentaje de inhibición de crecimiento de los hongos fitopatógenos al ser expuesto a aceites esenciales de cuatro plantas nativas chilenas: Drimys winteri (Canelo), Psoralea glandulosa (Culén), Gomortega keule (Queule) y Haplopappus baylahuen (bailahuén). Se realizaron ensayos cuantitativos por difusión en agar de P. glandulosa sobre Aspergillus nigra, G. keule sobre Rhizopus arrhizus, H. baylahuen sobre Fusarium oxysporum y D. winteri sobre Botritys cinérea. El crecimiento de A. nigra en placa con aceites esenciales al 1% demostró que el modo de acción sobre el hongo varía con cada aceite, resultando el aceite esencial de G. keule más activo inhibiendo un 54%, seguido de P. glandulosa (39%), H. baylahuen (38%) y D. winteri (36%).

Palabras Clave: Gomortega keule; Drimys winteri; Psoralea glandulosa; Haplopappus baylahuen; hongos fitopatógenos.

Recibido | Received: August 7, 2009. Aceptado en versión corregida | Accepted in revised form: April 29, 2009. Publicado en línea | Published online: May 25, 2010 Declaración de intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiación | Funding: This work was financed by Proyect Anillo PBCT ADI-38 (Universidad de Concepción, Chile), Proyect INNOVA CHILE 06FFCOIFC-48 VI region and Intern Proyect P.I. 209.111.055-1.0 (Universidad de Concepción, Chile). This article must be cited as: Julio Becerra, Magalis Bittner, Victor Hernández, Carolina Brintrup, José Becerra, Mario Silva. 2010. Actividad de aceites esenciales de Canelo, Queule, Bailahuén y Culén frente a hongos fitopatógenos. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 9(3): 212-215. {EPub May 25, 2010}.

*Contactos | Contacts: E-mail: [email protected]

Nota: El presente trabajo original es publicado como Premio de la “Cooperación Latinoamericana y Caribeña de Plantas Medicinales y Aromáticas” , entidad publicadora del Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, al Sr. Julio Becerra, ganador del Concurso al “Mejor Investigador Joven BLACPMA” 2009 y que fue presentado por el susodicho autor durante el 1° Congreso Internacional de Farmacobotánica de Chile realizado entre el 6-9 de enero 2009 en la ciudad de Chillán, Chile.





Becerra et al. Actividad de Aceites esenciales de Canelo, Queule, Bailahuén y Culén frente a hongos fitopatógenos


INTRODUCCION

Los agentes dañinos más comunes en las plantas son los hongos fitopatógenos. A nivel mundial estos hongos originan pérdidas que ascienden a miles de millones de dólares al año. El daño que ocasionan no sólo se refiere a las pérdidas de producción económica, sino también a las pérdidas en la producción biológica, es decir a la alteración que existe en el crecimiento y desarrollo de las plantas hospedantes atacadas por estos microorganismos (Agrios, 1988). En la última década han proliferado los estudios en búsqueda de nuevos agentes naturales provenientes de plantas en contra de organismos patógenos (Webster et al., 2008), muchos de estos estudios se están realizando en aceites esenciales, dada su acción ya que están conformadas por mezclas de un número variable de sustancias orgánicas olorosas y volátiles, que químicamente están constituidos por terpenos de bajo peso molecular, asociado a diversos grupos funcionales (Bittner et al., 2001).

Los aceites esenciales son obtenidos de distinto tipo de planta siendo de vital importancia conocer la actividad de los aceites esenciales de especies nativas.

En este contexto se realizaron ensayos para determinar el porcentaje de inhibición de crecimiento de los hongos fitopatógenos al ser expuesto a aceites esenciales a distintas concentraciones de plantas nativas chilenas.

MATERIAL Y MÉTODOS

Material Vegetal Para la obtención de los aceites esenciales Se

colectaron Hojas de arboles desde distintas localidades de la Octava Región. Las especies colectados fueron Drimys winteri (Canelo), Psoralea glandulosa (Culen), Gomortega keule (Queule) y Haplopappus baylahuen (Bailahuén), para su identificación se comparó con material del Herbario de la Universidad de Concepción, Chile (CONC) y fue clasificado por el Dr. Roberto Rodríguez Taxónomo del departamento de Botánica de la Universidad de Concepción.

Obtención del aceite esencial Las muestra colectadas (1000 g) fueron sometidas

a hidrodestilación durante 4 horas, usando un aparato tipo Clevenger (Montes et al., 2001). El aceite esencial obtenido se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se guardó bajo refrigeración (4ºC) en oscuridad.

Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM)

La composición de los aceites esenciales fue determinada en un cromatógrafo de gas con espectrómetro de Masa (GC-MS) (Agilent 7890) equipado con un inyector automático Agilent y usando una columna capilar HP-5 (30 m x 0,25 mm id, con una película de 0,25 µm de espesor). La temperatura del bloque de inyección fue de 200ºC. La temperatura del horno del GC fue programada como sigue: temperatura inicial 60ºC, se aplicó luego un incremento de 4 ºC min-1 hasta una temperatura final de 260ºC. Los porcentajes relativos de los componentes de los aceites esenciales fueron obtenidos para cada especie usando helio como gas portador con un flujo de 1.0 ml/min a volumen constante en un detector de masa (Agilent 5975). Para la identificación de los aceites esenciales se inyectó una muestra de 1.0 µl de 2% de solución de aceite en n-heptano con un reparto de 100:1. La identificación de los componentes de la esencia fue establecida utilizando la base de datos Nist/EPA/NIH MASS 2005 Espectral Library (Nist 05)

Actividad antifúngica Para realizar los test frente a hongos se usó un test

de difusión de aceite esencial por superficie en agar, a distintas proporciones usando como solvente del aceite DMSO, las soluciones preparadas fueron a 1%, 10%, 20%, 40%, 80% y 100%. Como control se uso una solución de ketoconazol 10 mg/ml DMSO y cultivo del hongo sin presencia de ninguna solución. Los hongos ensayados correspondieron a Botritys cinerea, Rhizopus arrhizus, Fusarium oxysporum, Aspergillus nigra. Las placas fueron cultivadas a 27°C, durante 10 días en ausencia de luz. Al término del ensayo se evaluó la actividad de los extractos frente a los hongos determinando el crecimiento en milímetros. Este ensayo se realizo por triplicado y los valores presentados corresponden a los valores promedios del ensayo.

RESULTADOS

En las tablas se muestran la composición de los aceites esenciales identificados mediante análisis de CGM, para la especie de Drimys winteri “Canelo” (Tabla 1), Gomortega keule “Queule” (Tabla 2), Haplopappus baylahuen “Baylahuen” (Tabla 3),” y Psoralea glandulosa “Culén” (Tabla 4).




Tabla 1. Composición de aceite esencial de Drimys winteri

Compuestos RT(min.) % Benzocicloheptano 8,3 39,0 Shyobunona 8,7 4,2 Azuleno 8,7 7,6 Naftaleno 10,2 17,4 Kaureno 14,6 2,8 Ciclohexadieno 9,2 9,1 Total 80,1

Tabla 2. Composición de aceite esencial de Gomortega keule.

Compuestos RT(min.) % Isoledano 8,6 3,2 Naftaleno 9,2 57,0 Kaureno 14,4 20,7 Azuleno 8,8 5,3 Antraceno 10,1 4,5 Total 90,7

Tabla 3. Composición de aceite esencial de Haplopappus (baylahuen) Compuestos RT(min.) % Naftaleno 8,9 5,3 Azuleno 9,7 9,7 Pineno 9,8 1,9 alfa-Cadinol 10,5 5,5 Benzeno 10,7 17,8 Ciclohexadieno 12,0 13,7 Bergamotol 13,3 2,2 Eicosano 16,6 5,2 Total 61,3

Tabla 4. Composición del aceite esencial de Psoralea glandulosa

Compuestos RT(min.) % Cariofileno 8,2 21,8 Naftaleno 9,0 9,7 Ledol 10,0 2,2 Fenol,4-(3,7 dimetil) 15,1 30,6 Fitol 15,1 3,5 Eicosano 14,9 3,8 Octadecano 21,4 3,9 Total 75,5

Keto= ketoconazol 10 mg/ml; DMSO= Dimetilsulfóxido; Gk= Gomortega keule; Pg= Psoralea glandulosa; Dw= Drimys winteri; Hb= Haplopappus baylahuen

El rendimiento y la densidad de los aceites esenciales obtenidos de las distintas especies estudiadas fue de 1,12% v/w y d=0,938 g/ml para Canelo, 1,37% v/w y d=0.932 g/ml para Queule, 1,43% v/w y d=1.015 g/ml para Bailahuén, 1,42 % v/w y 1.042 g/ml. para Culén.

El efecto de los aceites esenciales se expresa en el porcentaje de disminución del crecimiento usando un índice antifúngico (Wang et al., 2005). Los resultados

de la actividad del aceite de canelo frente a Botritys cinerea se expresan en la Tabla 5, los resultados de la actividad de aceite esencial de Bailahuén frente a Fusarium oxysporum se resumen en la Tabla 5, los resultados de la actividad del aceite esencial de queule frente a Rhizopus arrhizus se resumen en la Tabla 5, los resultados de la actividad del aceite esencial de culén sobre Aspergillus nigra se resumen en la Tabla 5. Tabla 5. Actividad de los aceites esenciales sobre los hongos

Figura 1. Crecimiento de Aspergillus nigra en placa con aceites esenciales al 1%.

A Haplopappus baylahuen 1% B Psoralea glandulosa 1%

C Drymis winteri 1% D Gomortega keule 1%

Aceite Actividad de Canelo sobre

B.cinerea

Actividad de Bailahuén

sobre F.oxysporum

Actividad de Queule sobre R. arrhizus

Actividad de Culén

sobre A. nigra

% I% I% I% I%

1 0 54 0 29

10 29 65 44 33

20 33 67 96 52

40 54 67 97 64

80 65 69 100 86

100 100 78 100 100

DMSO 0 31 0 0

Keto 15 51 6 14

Control 0 0 0 0




El efecto de los aceites esenciales frente al hongo A. nigra a la concentración mínima ensayada de 1% se ilustra en la Figura 1, siendo el aceite esencial de G. keule el más activo inhibiendo un 54%, seguido de H. baylahuen (38%), P. glandulosa (39%), D. winteri (36%).

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Los ensayos realizados con las soluciones de aceite esencial frente a las distintas cepas de hongos muestran una interesante actividad de inhibición de todos los aceites esenciales, la cual varía cuantitativamente (Tabla 5) y cualitativamente (Figura 1) (Bittner et al., 2009), ya que según el aceite se observan claras diferencias en el crecimiento de Aspergillus nigra al tratarlo con distintos aceites esenciales. El aceite esencial de canelo mostró una actividad frente a B. cinérea sobre el 10%, lo que demuestra porque este árbol presenta muchos usos como árbol sagrado del pueblo mapuche (Monsálvez et al., 2009).

Al defenderse los hongos de la acción de los aceites esenciales producen cambios en su forma de crecimiento, así como también cambios de color y forma, que se interpretan como estrategias usadas por los hongos para adaptarse a las condiciones desfavorables en que se encuentran en los ensayos frente a los aceites esenciales.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece el financiamiento entregado para la realización de este trabajo del Proyecto Anillo PBCT

ADI-38, de la Universidad de Concepción, al centro de Investigación y Capacitación Forestal VI Región Financiado con el proyecto INNOVA CHILE 06FFCOIFC-48 y al Proyecto Interno P.I. 209.111.055-1.0 de la Universidad de Concepción.

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http://www.scielo.cl/cgi-bin/wxis.exe/iah/?IsisScript=iah/iah.xis&base=article%5Edlibrary&format=iso.pft&lang=p&nextAction=lnk&indexSearch=AU&exprSearch=ARBERT,+CECILIA�

http://www.scielo.cl/cgi-bin/wxis.exe/iah/?IsisScript=iah/iah.xis&base=article%5Edlibrary&format=iso.pft&lang=p&nextAction=lnk&indexSearch=AU&exprSearch=BECERRA,+JOSE�

http://www.scielo.cl/cgi-bin/wxis.exe/iah/?IsisScript=iah/iah.xis&base=article%5Edlibrary&format=iso.pft&lang=p&nextAction=lnk&indexSearch=AU&exprSearch=CASANUEVA,+MARIA+E�






Estudio de secado por aspersión de extractos de Plectranthus amboinicus, Ocimum tenuiflorum, Passiflora incarnata, Matricaria recutita

y Melissa officinalis

[Spray drying study of Plectranthus amboinicus, Ocimum tenuiflorum, Passiflora incarnata, Matricaria recutita and Melissa officinalis]

Orestes D. LÓPEZ HERNÁNDEZ*, Rosa A. MENÉNDEZ CASTILLO, Caridad Margarita GARCÍA PEÑA, María L. GONZÁLEZ SANABIA, Antonio NOGUEIRA MENDOZA

Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM), Ave. 26 No. 1605 e/ Puentes grandes y Boyeros, Plaza. La Habana. Cuba. C.P. 10600

——————————————————————————————————————————————————— Abstract

The use of dried plant extracts is increasingly common in the pharmaceutical industry for the preparation of different forms of medication. The powder form is prepared by spray drying. This method furthermore provides various advantages over conventional extracts and tinctures, such as the absence of ethyl alcohol, easy storage, manipulation, transportation, and stability. The scaling up of unit operations before the industrial level, allows the study of the products and processes behaviour, avoiding a loss of resources when intermediate stages are omitted. This work present the results of spray drying studies of Plectranthus amboinicus, Ocimum tenuiflorum, Passiflora incarnata, Matricaria recutita, Melissa officinalis extracts and describes the feasibility of scaling up production while maintaining physicochemical and microbiologic quality.

Keywords: Plant extracts, spray drying

Resumen La utilización de los extractos secos, se difunde cada vez más en la industria Farmacéutica para la elaboración de diferentes formas terminadas de

medicamentos. Para su obtención en forma de polvo, se emplea el secado por aspersión. Este método, proporciona además a este tipo de producto, numerosas ventajas frente a los convencionales extractos fluidos y tinturas, como la de no contener alcohol etílico, fácil almacenamiento, manipulación, transportación y superior estabilidad. El escalado de las operaciones unitarias en los diferentes niveles que preceden al industrial, permite estudiar el comportamiento de los productos y procesos, evitando la pérdida de recursos que se ocasiona cuando se violan las escalas intermedias. En este trabajo se presentan los resultados de los estudios de secado por aspersión de extractos de Plectranthus amboinicus, Ocimum tenuiflorum, Passiflora incarnata, Matricaria recutita y Melissa officinalis, así como la factibilidad de ser escalados, obteniéndose productos de adecuada calidad fisicoquímica y microbiológica.

Palabras Clave: Extractos de plantas, secado por aspersión ——————————————————————————————————————————————————— Recibido | Received: July 2, 2009. Aceptado en versión corregida | Accepted in revised form: April 28, 2010. Publicado en línea | Published online: May 25, 2010. Declaración de intereses | Declaration of interests: the authors have no competing interests. Financiación | Funding: none declared This article must be cited as: Orestes D López Hernández, Rosa A. Menéndez Castillo, Caridad Margarita García Peña, María L González Sanabia, Antonio Nogueira Mendoza. 2010. Estudio de secado por aspersión de extractos de Plecthranthus amboinicus, Ocimun tenuiflorum, Passiflora incarnata, Matricaria recutita y Melissa officinalis. Bol Latinoamer Caribe Plant Med Aromat 9(3): 216-220. {EPub May 25, 2010}.







López Hernández et al. Secado por aspersión de extractos de plantas

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol.9 (x) 2010 | 217

INTRODUCCIÓN Las materias primas obtenidas a partir de

extractos de plantas se presentan en forma líquida como extractos o tinturas, las cuales tienen un elevado contenido alcohólico para su preservación de la contaminación por microorganismos, esta concentración de alcohol provoca reacciones adversas en estos productos. La obtención de extractos acuosos en polvo mediante secado por aspersión trae ventajas para la industria farmacéutica como su fácil almacenamiento, manipulación y transportación, superior durabilidad y versatilidad además de no contener alcohol. (Masters, 1991, Sharapín et al. 2000, De Sousa et al. 2000, De Medeiros et al. 2002, Shierstedt, 2002 y Candelas et al. 2003) La presencia de compuestos de bajo peso molecular, ocasiona pérdidas en el proceso por adhesión a las superficies internas del equipo, lo que trae como consecuencia baja recuperación de producto. Para contrarrestar este efecto negativo, se emplean aditivos inertes que actúan como coadyuvantes del secado. (López et al. 2008) Con el objetivo de obtener materias primas en polvo a partir de extractos de plantas, se utilizaron extractos acuosos de Plectranthus amboinicus “(Orégano francés)”, Ocimum tenuiflorum “(Albahaca morada)”, Passiflora incarnata “(Pasiflora)”, Matricaria recutita “(Manzanilla)”, Melissa officinalis “(Melisa)”.

MATERIALES Y MÉTODOS

Preparación de las muestras Se utilizaron extractos acuosos de P.

amboinicus, O. tenuiflorum, preparados por extracción con agua a temperatura de reflujo. Los restantes fueron preparados por repercolación según las normas ramales de M. officinalis, P. incarnata y M. recutita (NRSP 311). Todos a partir del material vegetal recolectado en la Estación experimental de plantas medicinales Dr. “Juan Tomás Roig”. Como aditivos coadyuvantes del secado se emplearon almidón soluble (Riedel de Haën 10020), maltodextrina DE < 20 (Roig Farma 0511620) y celulosa microcristalina MC 102 (Blanver 1343/00). Para el secado por aspersión se utilizaron en las diferentes escalas equipos de flujo de alimentación y aire de secado en paralelo, de atomizador de tipo tobera de dos fluidos en la escala de laboratorio y de

disco centrífugo para las escalas superiores. Los equipos utilizados fueron: Escala de laboratorio Mini spray dryer Büchi B-191, escala de Banco Nyro Atomizer Mobile Minor y escala piloto Nyro Atomizer Production Minor. Se emplearon temperaturas de entrada y salida de 120 y 80°C respectivamente.

Evaluación de las muestras Los extractos obtenidos después de realizar el

secado por aspersión fueron evaluados teniendo en cuenta los siguientes parámetros: humedad, cenizas, conteo microbiológico, el contenido de polifenoles en el extracto seco de P. amboinicus y la determinación de flavonoides totales en base a apigenina y quercetina en los extractos de P. incarnata, M. recutita y M. officinalis.

La determinación de el contenido de humedad, de las cenizas y el conteo microbiológico fueron realizados por los métodos generales reportados en la Farmacopea de los Estados Unidos USP 30, 2007. La determinación de apigenina y quercetina se realizó empleando un método espectrofotométrico, determinándose la apigenina a 336 nm y la quercetina a 370 nm. Las sustancias de referencias químicas utilizadas fueron preparadas en solución etanólica al 50 % a una concentración 8 mg/mL. Mientras que las muestras fueron preparadas pesando primeramente 0,2 g de extracto, se trasvasaron a un balón posteriormente se adicionaron 3 mL de etanol al 96 % y 10 mL de ácido sulfúrico al 10 %, reflujándose durante 30 minutos. Posteriormente se realizó la extracción del extracto acuoso con acetato de etilo (5 veces por 15 minutos) se reunieron las fracciones y se secaron con sulfato de sodio anhidro, seguidamente se filtraron y evaporaron hasta sequedad bajo presión reducida y se disolvieron en 50 mL con etanol al 96 %, y se trasvasó a un volumétrico de 100 mL completando volumen con la misma solución. Posteriormente se tomaron 5 mL y se trasvasó a un volumétrico de 25 mL para la determinación de quercetina. Se tomaron 2 mL y se trasvasó a un volumétrico de 10 mL para la determinación de apigenina.

La determinación de polifenoles totales se realizó empleando un método espectrofotométrico, determinándose a 700 nm

La solución de referencia se preparó pesando con exactitud 25 mg de ácido tánico (previamente desecado a 100 ºC durante 2 h) en un matraz aforado




de 100 mL. Para preparar la solución desarrolladora de color, se pesó 10 g de tungstato de sodio hidratado y 0,2 g de ácido fosfomolíbdico, se trasvasaron a un balón de 250 mL, se adicionó 5 mL de ácido fosfórico al 85 % en 75 mL de agua destilada, se reflujó durante 2h, se enfrió y se almacenó a temperatura ambiente. Se transfiere 3 mL de la solución de referencia a un matraz de 25 mL y añadir 2 mL de agua destilada y 2 mL . Se agitar y deja en reposo durante 5 minutos. Se toman 2 porciones de 2 mL de muestra y se diluyen a 25 mL adicionar 4 mL de agua destilada, 2 mL de la solución de desarrollo del color. Agitar y dejar en reposo durante 5 minutos. Después de reposar los 5 minutos, adicionar 1 mL de solución de carbonato de sodio al 20% a cada uno de los matraces, agitar, luego enrasar a 25 mL con agua destilada y homogenizar. Se leen las absorbancias de la solución de referencia y de las muestras a 700 nm utilizando la solución blanco en un término no mayor de 2 minutos.

Figura 1. Estudio de secado de O. tenuiflorum.

RESULTADOS

En la Figura 1 se muestran los gráficos del estudio de secado por aspersión del extracto acuoso de O. tenuiflorum. La Figura 2 en la parte superior muestra igualmente el estudio de secado por aspersión de los extractos de P. incarnata y M. recutita, y en la parte inferior los ensayos de secado realizados con el extracto de M. officinalis. Figura 2. Estudio de secado de P. incarnata, M. recutita y M. officinalis

En la Tabla 1, se muestran de forma comparativa

los resultados para las diferentes escalas del rendimiento, la humedad así como el contenido de los principales compuestos que se determinan a estos extractos y el conteo total de microorganismos en los obtenidos a escala de banco. Se excluyó el extracto de O. tenuiflorum por no haberse continuado el estudio en las escalas superiores.

Melissa officinalis

Pasiflora incarnata

Rend

Aditivo0 35 40 45

0

20

40

60

80

Matricaria recutitaRe

nd

Aditivo0 35 40 45

29

39

49

59

69

79

100/60 120/80

70

75

80

85

90

95

100

Rend

imie

nto

Temperatura




Tabla 1. Resultados tecnológicos, fisicoquímicos y microbiológicos en las diferentes escalas

Extracto Escala Rendimiento Humedad

(%) ≤ 10 %

Polifenoles (%) ≥ 3 %

Cenizas (%)

≤ 40 %

Quercetina (%)

Apigenina (%)

Conteo de bacterias ≤ 107

UFC/g

Conteo de Hongos

≤ 103 UFC/g

P. amboinicus

Laboratorio 62,20 6,15 5,08 36,15 NA NA NA NA Banco 78,15 7,99 5,98 32,97 NA NA 104 < 10 Piloto 95,40 7,73 4,13 27,12 NA NA 105 < 10

P.

incarnata Laboratorio 94,20 3,60 NA NA 1,16 1,78 NA NA

Banco 97,56 1,80 NA NA 1,95 3,00 104 < 10

M. recutita Laboratorio 96,40 3,00 NA NA 1,09 3,02 NA NA Banco 73,14 2,70 NA NA 1,69 3,44 104 < 10

M. officinalis

Laboratorio 96,50 4,10 NA 20,4 2,50 5,11 NA NA Laboratorio 97,70 5,50 NA 23,3 2,04 4,02 NA NA

Banco 94,70 5,50 NA 20,2 2,18 3,97 103 < 10 NA – No aplicable. Se refiere en el caso de Quercetina y Apigenina a que no se le determina al extracto de P. amboinicus, en el caso de los Polifenoles, a que no se le determina a los extractos restantes y en las columnas de conteo de bacterias y hongos a que no se realiza esta determinación en la escala de laboratorio por la pequeña cantidad de muestra que se obtiene.

DISCUSIÓN

Como se observa en la Figura 1, los rendimientos alcanzados con almidón soluble (A) en concentraciones de 10 y 15 % respecto a los sólidos del extracto y con maltodextrina (M) en concentraciones de 15 y 20 %, empleando un juego de temperatura de entrada y salida de 100 y 60 °C respectivamente, son muy bajos, siendo el mayor cercano a 60 % con un 15 % de maltodextrina, el incremento de las temperaturas de entrada y salida a 120 y 80 °C respectivamente provocó un pequeño incremento del rendimiento pero significativamente diferente para un 95 % de confianza. El estudio con este último juego de temperaturas empleando entonces como aditivo la celulosa microcristalina causó un incremento del rendimiento apreciable, siendo la concentración de 25 % significativamente diferente al resto de las concentraciones estudiadas, lográndose alcanzar un máximo rendimiento superior a 75 % lo cual garantiza que en escalas superiores se obtengan rendimientos superiores al 80 %.

En la Figura 2 se observa para el caso de la P. incarnata y M. recutita que el máximo valor de rendimiento se alcanza con 40 % de almidón soluble, para estos dos extractos solamente se estudió este aditivo por ser el más apropiado para extractos hidroalcohólicos. En el caso del extracto de M. officinalis solamente se estudiaron dos juegos de temperaturas, observándose que con el más bajo ya se alcanza un rendimiento de 70 % lo que indica que no es necesario el empleo de coadyuvantes del secado y

con el segundo juego de temperaturas el rendimiento es de 95 % lo que garantizará un elevado rendimiento en escalas superiores.

En la Tabla 1, se observa de forma comparativa para las diferentes escalas que se alcanzan elevados valores de rendimiento, lo que demuestra la reproducibilidad de los resultados obtenidos a escala de laboratorio. El contenido de humedad es de gran importancia en estos productos por ser altamente higroscópicos y en todos los casos se encuentran por debajo del 10 %, límite máximo establecido como parámetro de control de calidad en extractos secos. Los valores obtenidos en los extractos analizados demostraron que el contenido de cenizas se encuentra dentro de los límites establecidos, por debajo de 40 %.

Los resultados del conteo total de microorganismos demuestran que se encuentran dentro de los valores normados en la bibliografía reportada, ya que los valores del conteo de bacterias están por debajo de 107 UFC/g y los de los hongos ≤ 103 UFC/g. El contenido de polifenoles evaluados en el extracto seco de P. amboinicus fue mayor de 3 %, límite establecido como parámetro de control de calidad del mismo. Mientras que los valores obtenidos en la determinación de los flavonoides totales en base a apigenina y quercetina, en los extractos secos de P. incarnata, M. recutita y M. officinalis, se observan valores similares en las diferentes escalas, demostrándose que no existen diferencias entre las escalas analizadas pero aún no se




han definido sus límites para establecer las especificaciones de calidad del mismo.

CONCLUSIONES

El empleo del proceso de secado por aspersión aplicado a extractos de plantas, requiera o no de coadyuvantes del secado, proporciona la obtención de productos de calidad fisicoquímica y microbiológica adecuada con posibilidad de ser introducidos en la industria de productos fitoterapéuticos.

REFERENCIAS Candelas MG, Alanís M G. 2003. Estabilidad del licopeno

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Análisis de la calidad de los frutos de Salvia hispanica L. (Lamiaceae) comercializados en la ciudad de Rosario (Santa Fe, Argentina)

[Quality tests of Salvia hispanica L. (Lamiaceae) fruits marketed in the city of Rosario (Santa Fe province, Argentina)]

Mirian BUENO1, Osvaldo DI SAPIO2, Melisa BAROLO3, Héctor BUSILACCHI1, Mirta QUIROGA4, Cecilia SEVERIN*3

1Biología y 3Fisiología Vegetal, Facultad de Ciencias Agrarias, CC 14, (S2125ZAA) Zavalla. 2Área Biología Vegetal, Facultad de

Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Suipacha 531 (S2002LRK) Rosario. *CIUNR. Universidad Nacional de Rosario. 4Plantas Vasculares, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de Salta.

——————————————————————————————————————————————————— Abstract

The fruits of Salvia hispanica L. (“chía”) usually called "seeds", conteins linoleic and α-linolenic acids, representing the largest natural source of omega-6 and omega-3 fatty acids, respectively. These acids are important in human nutrition because they reduce the risk of cardiovascular diseases. The “seeds” have a high content of antioxidants; in adition, they are fiber-rich and do not contain gluten. The objective of this work was to evaluate the quality of commertial lots of “chia” seeds. Physico-botanical purity, weight of 1000 seeds, physiological germination and fatty acids were estimated. Seeds of other species were identified. Physico-botanical purity of the seeds ranged between 0 and 98,6 %, and germination percentage was between 23 and 92 %. There were no differences in the fatty acid content between lots. The analysis applied determined that the lots of “chia” seeds marketed in Rosario city are adulterated in whole or in part by seeds of other species.

Keywords: germination; physiological quality; Salvia hispanica L..

Resumen

Los frutos (clusas) de Salvia hispanica L. (“chía”) habitualmente llamados “semillas”, contienen ácido linoleico y α -linolénico, que representan la

mayor fuente natural de ácidos grasos omega-6 y omega-3 y son muy importantes en la nutrición humana por reducir los riesgos de padecer enfermedades cardiovasculares. Las semillas poseen alto contenido de antioxidantes, son ricos en fibras y no contienen gluten. Se planteó como objetivo, determinar la calidad de las semillas de chía comercializadas en la ciudad de Rosario. Se determinó: porcentaje de pureza físico-botánica, peso de 1000 semillas, germinación fisiológica y ácidos grasos. Se identificaron semillas de otras especies. El porcentaje de pureza varió entre 0 y 98,6 % y el de germinación entre 23 y 92 %. No hubo diferencias en el contenido de ácidos grasos entre los lotes analizados. Con este relevamiento se comprueba que en la ciudad de Rosario se comercializan lotes de “chía” de variada calidad, algunos con adulteración parcial o total con semillas de otras especies.

Palabras Clave: germinación; calidad fisiológica; Salvia hispanica L. ——————————————————————————————————————————————————— Recibido | Received: August 25, 2009 . Aceptado en versión corregida | Accepted in revised form: May 17, 2010 . Publicado en línea | Published online: May 25, 2010 . Declaración de intereses | Declaration of interests: the authors have no conflicting interests. Financiación | Funding: Subsidio Fundación Ciencias Agrarias. This article must be cited as: Mirian Bueno, Osvaldo Di Sapio, Melisa Barolo, Héctor Busilacchi, Mirta Quiroga, Cecilia Severin*. 2010. Análisis de la calidad de los frutos de Salvia hispanica L. (Lamiaceae) comercializadas en la ciudad de Rosario (Santa Fe, Argentina). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 9(3): 221-227. {EPub May 25, 2010}. *Contactos | Contacts: [email protected]





Bueno et al. Análisis de la calidad de los frutos de Salvia hispanica L. (Lamiaceae)


INTRODUCCIÓN

La familia Lamiaceae cuenta con unos 170 géneros y más de 3000 especies de amplia distribución en regiones tropicales y templadas. En Argentina existen alrededor de 26 géneros (Burkart, 1979). Son hierbas anuales o arbustos perennes, contienen aceites esenciales en pelos glandulares de las hojas y los tallos, por lo que han sido domesticadas para ser utilizadas como condimentos y en perfumes. Según León (1987), la mayoría de las especies cultivadas se originan en la región mediterránea: Rosmarius officinalis, Lavandula angustifolia, L. latifolia, Salvia spp., Mentha spp., Origanum vulgare, O. majorana, Ocimum basilicum, Thymus vulgaris y otros. Muchas labiadas se cultivan por el follaje ornamental, como Coleus spp., o por sus flores, tal es el caso de Salvia. En África y Asia se comen los tubérculos de Plectranthus y Solonostemon. En Mesoamérica las semillas de ciertos Hyptis y Salvia, se usan en la preparación de refrescos (León, 1987).

El género Salvia incluye unas 900 especies y se distribuye extensamente en varias regiones del mundo, como Sudáfrica, América Central, América del Norte, Sudamérica y Asia Sur-Oriental. Las plantas pueden ser herbáceas o leñosas, y sus flores muy atractivas en varios colores.

Salvia hispanica L., conocida como “salvia española”, “artemisa española”, “chía mexicana”, “chía negra” o simplemente “chía”, es una planta herbácea anual, originaria de las áreas montañosas del oeste y centro de México (Beltrán-Orozco y Romero, 2003). Para los Mayas era uno de los cultivos básicos y fue perseguida hasta casi su extinción por considerársela sacrílega, debido a que se ofrendaba a los dioses aztecas durante las ceremonias religiosas. A fines del siglo pasado resurgió el interés por la “chía”, ya que se la considera una buena fuente de fibra, proteínas y antioxidantes.

Las flores son hermafroditas, purpúreas a blancas y aparecen en cimas terminales; la floración se produce entre julio y agosto en el hemisferio norte. Los frutos, en grupos de 1-4 clusas, fueron utilizados por los habitantes precolombinos de Mesoamérica como fuente de alimentos y como medicina. Los frutos (clusas) habitualmente llamados “semillas” son indehiscentes, monospérmicos, ovales, suaves y brillantes, de color negro grisáceo con manchas irregulares rojizas en su mayoría y algunos blancos;

remojados en agua originan un líquido gelatinoso debido a la presencia de mucílagos en su superficie. La forma de propagación de esta especie es a través de sus semillas (Ayerza y Coates, 2006).

Ayerza (1995) midió la cantidad de aceite presente en semillas de “chía” y comprobó que representan la fuente natural más rica en ácidos grasos omega-3 comparada con el aceite de pescado y de algas, con la ventaja que no contienen colesterol. Las semillas, tienen entre sus componentes principales ácido linoleico y α-linolénico, representando la mayor fuente natural de ácidos grasos omega-6 y omega-3, importantes en la nutrición humana por reducir los riesgos de padecer enfermedades cardiovasculares. Poseen un 33 % de aceite, del cual el ácido linolénico representa el 62 % y el linoleico el 20 % (Bushway et al., 1981). La ingesta de cantidades suficientes de omega-3 aporta múltiples beneficios para la salud, disminución del riesgo cardiovascular, prevención de enfermedades del sistema nervioso y también disminución de los síntomas de enfermedades inflamatorias, como la artritis reumatoidea (Simopoulos, 1999). Poseen un alto contenido de antioxidantes (principalmente flavonoides), son ricos en fibras y no contienen gluten (Chen et al., 1984; Taga et al., 1984; Song et al., 2000). La cantidad de trabajos científicos que informan sobre las ventajas nutricionales de la chía con respecto a las otras fuentes de omega-3 y la comercialización de productos que la incluyen están creciendo rápidamente alrededor del mundo. Se la utiliza como ingrediente para hacer pan, barras energéticas, suplementos dietéticos para personas, alimentos para caballos, cerdos, gatos y perros, en dietas de aves para producción de huevos y carne, y en dietas de vacas lecheras para producción de leche, entre otros (Ayerza, 1995).

La calidad es un requisito básico de un producto, no sólo por su significación intrínseca, sino porque constituye la base sobre la que reposa la reproducibilidad de los parámetros de seguridad y eficacia. El control de calidad es necesario para evitar adulteraciones y falsificaciones, así como para garantizar que un producto reúna las características necesarias para ser seguro y eficaz. Los objetivos del control de calidad son, confirmar la identidad y pureza de una muestra, así como también valorar su contenido en principios activos (Busse, 2000; Cañigueral, 2002). Para dicho control de la calidad se deben emplear métodos de ensayos morfo-anatómicos, métodos físico-químicos y métodos




biológicos La incidencia de efectos adversos se ve favorecida en países con un bajo nivel de exigencia en el control de calidad. La Organización Mundial de la Salud indica la conveniencia de que cada país conforme un Comité Nacional de Expertos, el cual debe preparar un listado de especies vegetales, con sus respectivos requisitos de registro, evaluación de adversidades, procesos de cultivo, recolección, producción local, procesamiento de cada especie en cuestión, etc., y que tenga directa relación con el Ministerio de Salud (WHO, 1998).

Consideramos importante estudiar una serie de requisitos que conformen un manual de BMP (Buenas Prácticas de Manufactura), destinado a productores, elaboradores e industriales, que tiendan a orientarlos para lograr una calidad constante del producto, a través de un sistema de organización adecuado, para brindar seguridad al consumidor. En consecuencia y dado que se encuentran a la venta lotes de semilla de “chía” adulterados con semillas de otras especies, se ha creído conveniente plantear como objetivo del presente estudio, determinar la calidad de las semillas de Salvia hispanica L., comercializadas en la ciudad de Rosario (Santa Fe, Argentina).

MATERIALES Y MÉTODOS Se utilizaron 8 lotes de semillas de Salvia

hispanica L., adquiridos en distintas herboristerías y/o dietéticas ubicadas en diferentes zonas de la ciudad de Rosario (Santa Fe, Argentina). Siguiendo la metodología de ISTA 2003, se realizaron las siguientes determinaciones:

Pureza físico-botánica Se realizó sobre 10 g de cada una de las

muestras y consistió en separar, con ayuda de una pinza histológica las semillas intactas y las rotas, otras semillas, impurezas e inertes. Se pesaron las semillas puras y se expresó en porcentaje según la siguiente fórmula: Peso semillas puras Pureza (%) = x100 Peso total de la muestra

Se identificaron botánicamente las semillas de

otras especies presentes en cada uno de los lotes.

Peso de 1000 semillas Se determinó tomando 10 submuestras

compuestas por 100 semillas cada una, se pesaron y se calculó el promedio.

Germinación Esta especie no está listada en los manuales de

tecnología de semillas para los protocolos de germinación, pero existen recomendaciones para algunos géneros de la familia Lamiaceae que se utilizaron como referencias básicas (ISTA 2003).

Para cada uno de los lotes de semillas, se realizó el test en cajas de Petri con algodón y papel de filtro humedecido, el número de repeticiones fue de 4 cajas con 25 semillas cada una, para cada uno de los lotes elegidos.

El material se incubó en oscuridad, en cámara de crecimiento a 23 ± 2º C y a los 21 días se evaluó la germinación a través del recuento de semillas con protrusión visible de la raíz primaria.

Se aplicó análisis de la variancia, los resultados se expresaron en porcentaje y los datos se transformaron para su normalización mediante raíz cuadrada. Las medias de los tratamientos se compararon a través de Tukey al 0,001.

Ácidos grasos A través de análisis químicos realizados en el

laboratorio de la Bolsa de Comercio de Rosario, se determinaron los ácidos grasos presentes en los distintos lotes de semillas. La extracción de la materia grasa se realizó por el método Butt (Norma ISO 659), el aceite se extrajo de una porción de muestra molida con hexano p.a., se evaporó el hexano y se obtuvo el aceite para su posterior análisis.

Se realizó la determinación de acidez según Norma ISO 660. Este método consiste en determinar el contenido de ácidos grasos libres presentes en la muestra, por la técnica con etanol caliente e indicador. Como titulante se utilizó una solución acuosa de hidróxido de sodio o potasio 0,1N o 0,01N. Se realizó la preparación de los esteres metílicos de ácidos grasos para su aplicación en cromatografía en fase gaseosa según Norma ISO 5509. Dependiendo de la acidez obtenida es el método a aplicar para la obtención de los esteres metílicos. Se realizó la determinación de los esteres metílicos de ácidos grasos por cromatografía gaseosa según Norma ISO 5508.




Se emplearon: inyector para columna capilar en modo Split: 1/100; columna Capilar DB-23 (30 metros de longitud, 0,32 mm de diámetro interno y film de 0,25 um); Detector: FID; temperatura del inyector 250 °C; temperatura del horno 175 °C; temperatura del detector 300 °C; gas Carrier: Nitrógeno 5,0. La determinación se realizó de manera isotérmica.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Consultados los comerciantes sobre la

distribución de semillas de “chía” manifestaron desconocer cuantos y quienes son los proveedores

primarios en la ciudad de Rosario y de qué zonas del país proviene el material vegetal. Sería importante disponer de esta información para conocer los lotes de procedencia y sus zonas geográficas, lo cual contribuiría a establecer mejor la trazabilidad de las semillas que se comercializan.

Como resultado del análisis de pureza físico-botánica, se determinó que cinco lotes presentaron una pureza superior al 95%, un lote mostró muy baja pureza: 21,6%, mientras que en los dos restantes se observó ausencia total de semillas de “chía” (Tabla 1 y Figura 1).

Tabla 1. Pureza físico-botánica, germinación y peso de 1000 “semillas” de S. hispanica Lotes Pureza físico-botánica (%) Peso 1000 “semillas (g) Germinación (%)

I 95,409 0,9703a 27b

II 96,944 1,1019b 26b

III 98,135 0,9410a 23b

IV 21,640 1,2106c 92a

V 95,980 1,2536cd 87a

VI ausente ausente ausente

VII ausente ausente ausente

VIII 98,645 1,2941d 33b

Medias seguidas de igual letra en la vertical no difieren significativamente al 0,001 % de probabilidad (Tukey)

Figura 1. “Semillas” de S. hispanica intactas, rotas e inertes y semillas de otras especies en los 8 lotes comerciales.

I I

II

I

V V

VI

VII

0 2

4

6

8

10

Número de muestra

Otras especies Rotas e inertes

Semillas puras

Pureza




Tabla 2. Determinación de ácidos grasos en 4 lotes de “semillas” de S. hispanica Ácidos grasos (%)

I

Lotes II

III

VIII

Ácido mirístico 0,00 0,10 0,10 0,00 Ácido miristoleico 0,00 0,00 0,00 0,00 Ácido pentadecanóico 0,00 0,00 0,00 0,00 Ácido pentadecenóico 0,00 0,00 0,00 0,00 Ácido palmítico 7,90 8,50 8,40 6,10 Ácido palmitoleico 0,10 0,10 0,00 0,10 Ácido margárico 0,10 0,10 0,10 0,00 Ácido margaroleico 0,00 0,00 0,00 0,00 Ácido esteárico 3,40 3,40 3,40 2,80 Ácido oleico 8,10 7,80 7,90 7,20 Ácido linoleico 21,50 22,00 21,70 20,30 Ácido linolénico 57,60 56,60 57,00 62,70 Ácido nonadecanóico 0,10 0,10 0,10 0,20 Ácido nonadcenoico 0,20 0,20 0,20 0,10 Ácido araquídico 0,30 0,30 0,30 0,30 Ácido gadoleico 0,20 0,20 0,20 0,10 Ácido eicosadienóico 0,00 0,00 0,00 0,00 Ácido araquidónico 0,00 0,00 0,00 0,00 Ácido behénico 0,10 0,10 0,10 0,00 Ácido erúcico 0,00 0,00 0,00 0,00 Ácido lignocérico 0,00 0,00 0,00 0,00

Las semillas de otras especies presentes en los lotes correspondieron a: Echinocloa crus-galli L. Beauv., Anthemis cotula L., Panicum coloratum L., Lepidium bonariense L., Plantago lanceolata L., Chenopodium album L., Amaranthus quitensis K., Brassica napus L., Ammi majus L. y A. visnaga L., Polygonum aviculare L., Trifolium spp., Plantago spp. y algunas otras semillas no identificadas. En la Figura 1 se presenta la cantidad de semillas de otras especies, presentes en cada lote.

Según Applequist (2006), se ha informado en la literatura farmacognóstica que diferentes órganos de ciertas especies se encuentran inapropiadamente presentes en materiales vegetales que son ofrecidos como genuinos. Puede ser por una sustitución accidental (la planta es identificada erróneamente como la correcta o ser intercambiable con ésta), contaminación accidental (alguna parte de la planta errónea es colectada junto con la correcta) o fraude (la planta es deliberadamente sustituida por mezcla con las especies correctas). La adulteración puede también involucrar el uso de partes inapropiadas de la planta correcta, por ejemplo, la inclusión de tallos en un producto donde se usan solamente las hojas. En el lenguaje común, la “adulteración” implica la manufactura deliberada de productos de baja calidad. En la industria botánica, el término “adulteración” es usado genéricamente para referirse a cualquier inclusión de especies vegetales incorrectas o partes

de plantas en excesiva cantidad, ya sea deliberadamente o por accidente.

Coates y Ayerza (1998) atribuyeron el porcentaje de impurezas en muestras de chía (4,5-39%) a la habilidad para la limpieza, a las condiciones de la cosecha y a las malezas presentes en los cultivos. En el caso del material adquirido en la ciudad de Rosario, en los lotes IV y V, las semillas de otras especies probablemente hayan sido recolectadas junto con las de chía, mientras que en los lotes VI y VII, se determinó la sustitución total de chía por elevados porcentajes de semillas de Trifolium spp. (88,25%), además de otras especies. Esto demuestra que deberían implementarse métodos de control de calidad en toda la cadena de comercialización de los productos dietario-medicinales.

La presencia de semillas de otras especies e inclusive la sustitución total de las mismas en los lotes de “chía” analizados, indica que el comprador final de este producto dietario, desconoce exactamente qué está consumiendo, si el mismo es inocuo o puede ocasionarle algún problema a su salud. Por tanto, a pesar de que las drogas vegetales y sus derivados suelen presentar un margen terapéutico amplio, no están exentas de posibles efectos adversos, interacciones y contraindicaciones. De ahí que la evaluación de su seguridad deba realizarse a la luz de los criterios aplicados a los otros fitofármacos y sustentarse, siempre que sea posible, en la




existencia de documentación científica relevante (Carballo et al., 2005).

El peso de 1000 semillas pareciera ser una variable de gran amplitud; en este trabajo varió entre 0,94 y 1,29 g y no se discriminó entre “semillas” de distinto color, aunque la mayor proporción observada fue de color oscuro; las diferencias entre los lotes fueron estadísticamente significativas. Ixtaina et al. (2008) informaron que un peso de 1,323 g para las “semillas” oscuras fue significativamente superior a 1,301g para las blancas. Coates y Ayerza (1998) obtuvieron pesos entre 0,32 y 0,46 g, pero sin distinción de color.

Según Ferguson (1995), la prueba de germinación ofrece información suficiente sobre el desempeño de un lote de semillas, cuando este es de baja calidad. Determinó además que un lote que no presente dormición y con 70% de germinación, se deteriorará rápidamente en el almacenamiento en condiciones desfavorables. En el presente trabajo, se encontraron diferencias significativas entre los distintos lotes de “chía”. En la Tabla 1 se observa que sólo dos de los mismos presentaron altos porcentajes de germinación: lote IV (bajo porcentaje de pureza y 87% de germinación) y lote V (alta pureza y 92% de germinación); estos valores de germinación fueron superiores a los obtenidos por Coates y Ayerza (1998), que obtuvieron entre 75 y 79% de germinación, en “semillas” provenientes de cultivos ubicados en distintas localidades del Noroeste de Argentina (Catamarca, Salta, Jujuy, Tucumán y Santiago del Estero), región geográfica del país que reúne condiciones climatológicas muy favorables para su cultivo y similares, a las de las regiones de origen.

Las diferencias en los porcentajes de germinación de semillas, se podrían atribuir a las condiciones del ensayo o a las variaciones en las condiciones ambientales durante la maduración de las mismas. La calidad de las semillas disminuye también con el transcurso del tiempo y la tasa de deterioro depende de las condiciones ambientales durante el almacenamiento y el tiempo en que estas permanecen almacenadas. En nuestro caso, se desconoce el origen de las “semillas” de “chía” que se comercializan en la ciudad de Rosario, como así también, la fecha de su cosecha y las condiciones de almacenamiento de las mismas hasta su venta.

Se determinó además y de forma aleatoria el contenido de ácidos grasos en semillas de chía pertenecientes a los lotes I, II, III y VIII (Tabla 2).

Según datos bibliográficos, las “semillas” de “chía” contienen 80,30% de ácidos grasos poliinsaturados (Beltrán-Orozco y Romero, 2003). Ferguson (1995), determinó que la composición química de las semillas de soja, también con elevado contenido de ácidos grasos poliinsaturados, sufren importantes reducciones en su calidad fisiológica, en relativamente cortos períodos de tiempo. En este trabajo, el contenido de los ácidos linoleico y linolénico estuvieron dentro de los valores informados por Ayerza (2002) y no se observaron diferencias significativas en los resultados obtenidos entre los distintos lotes analizados.

CONCLUSIONES

Con este relevamiento se comprueba que en la ciudad de Rosario (Santa Fe, Argentina), se comercializan lotes de semillas de “chía” de variada calidad, comprendiendo aquéllos en los que la adulteración parcial o total se realiza con semillas pertenecientes a otras especies.

Este trabajo permite inferir que las diferentes muestras de semillas de “chía” de elevada pureza y bajo porcentaje de germinación que se analizaron, no presentan alteraciones en el contenido de los ácidos grasos, pero sí se ve alterada la capacidad dietaria y medicinal, al encontrarse que algunos lotes fueron adulterados con semillas de otras especies.

AGRADECIMIENTOS El presente trabajo fue financiado por la

Fundación Ciencias Agrarias.

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Comunicación | Communication



Celtis ehrenbergiana (Celtidaceae): meristematic tissue in the thorns

[Celtis ehrenbergiana (Celtidaceae): tejido meristemático en las espinas]

Vanesa G. PERROTTA and Ana M. ARAMBARRI*

Cátedra de Morfología Vegetal, Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata, Calle 60 y 119, C.C.31 – 1900 La Plata, Argentina

——————————————————————————————————————————————————— Abstract

The goal of this research is to establish the presence of meristematic tissue (buds) in the thorns of ¨tala¨ (Celtis ehrenbergiana). This species has been mentioned as having medicinal properties, and this tree has high ecological value since it protects the environment. Thorn samples have been processed by standard light microscope techniques. Only one of the two geminate thorns located at the apex of actively growing branches has two buds: one in the apical and the other in a lateral subapical position. It would be interesting to assay these portions which have numerous meristematic cells with division capacity using ¨in vitro¨ micropropagation technology.

Keywords: anatomy; Celtis ehrenbergiana; Celtidaceae; conservation; medicinal plants; thorns.

Resumen El tala (Celtis ehrenbergiana) es un árbol con espinas que posee propiedades medicinales, brinda alimento y refugio a otras especies y protege el

ambiente. Se realizó el estudio anatómico de las espinas de tala a fin de establecer la presencia de tejido meristemático (yemas). Las muestras de espinas fueron procesadas empleando técnicas estándares para microscopía óptica. Solamente una de las dos espinas geminadas localizadas en la proximidad del ápice de ramas en activo crecimiento presenta dos yemas: una apical y otra lateral en posición sub-apical. Sería interesante ensayar estas porciones con células meristemáticas en activa división con técnicas de micropropagación in vitro.

Palabras Clave: Celtis ehrenbergiana; Celtidaceae; conservación, espinas; plantas medicinales ——————————————————————————————————————————————————— Recibido | Received: December 4, 2009. Aceptado en versión corregida | Accepted in revised form: March 17, 2010. Publicado en línea | Published online: May 25, 2010 Declaración de intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiación | Funding: none declared. This article must be cited as: Celtis ehrenbergiana (Celtidaceae): meristematic tissue in the thorns. 2010. Vanesa G Perrotta, Ana M. Arambarri. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 9(3): 228-231. {EPub May 25, 2010}. *Contactos | Contacts: [email protected]






Perrotta y Arambarri Celtis ehrenbergiana buds in the thorns


INTRODUCTION

The ¨tala¨ is also known by the common names: ¨churqui tala¨, ¨desert hackberry¨, ¨huasteco¨, ïbirá yuazú¨, ¨shiny hackberry¨, ¨spiny hackberry¨, ¨tala amarillo ,̈ ¨tala árbol¨, ¨tala blanco ,̈ ÿoasí¨, ÿoasí-y guazú¨. It has a widespread distribution in the New World, the South of the United States, Mexico, Haiti, Puerto Rico, Brazil, Bolivia, Paraguay, Uruguay and Argentina. This tree has many applications, for example in Argentina, where native people use it for shade and firewood due to its high calorific power; its hard and heavy wood is used to make farm tools. In medicine, leaf infusion with honey is used to cure coughs, colds, headaches, chest pain, and acts as an expectorant, a hepatic protector, a digestive aid and may be used to control cholera (Hieronymus, 1882; Toursarkissian, 1980; Lahitte et al., 1995, 1998; Demaio et al., 2002; Barboza et al., 2006; Peña-Chocarro et al., 2006; Hernández et al., 2009). It has calcifying properties (Carrizo et al., 2005). The decoction of its leaves and branches is drunk in case of poisoning, and the decoction of the bark may be used for appetite stimulation, wound washes and disinfection (Martínez Crovetto, 1981). The root has tinctorial properties, giving a brown color resistant to water and sunshine (Del Valle Perea et al., 2007). The fruits are edible (Lahitte et al., 1998; Arenas, 2003). This native tree has educational, cultural, and ecological importance, contributing to the conservation of the environment. In Argentina, Buenos Aires province, with the objective to protect the ¨monte of tala¨, also known as ¨talar¨, the Gestión Talares Bonaerenses was created. These ¨talares¨ are very important, e.g., as a part of birds and several insect species diets, soil erosion control, and ecological balance preservation (Mérida and Athor, 2006; Aramburú et al., 2009). The ¨talar¨ is reducing its distribution area due to the agricultural frontier expansion; its seeds have lower germination ability, and the shoots present difficulty growing (Abedini and Ruscitti, 1996; Abedini et al., 2000).

Cell culture technology is one way to contribute to species conservation. Some assays of in vitro micropropagation had been carried out (Abedini et al., 2000; Adema et al., 2007), however when stems and thorns were used, difficulties were found in promoting new shoot development (Adema et al., 2007). According to Romanczuk (1976), the thorns of genus Celtis may have one node or a small number of nodes. Hunziker and Dottori (1976) distinguished between leafless thorns and leafy thorns. Romanczuk

and del Pero de Martínez (1978) on the basis of thorn characteristics recognized two groups of species: one having thorns with invisible nodes, and the other comprising species with visible nodes as they produce small branches with leaves on them. On the basis of these observations we believe that thorns have areas (buds) with meristematic cells, and locating these areas with meristematic activity might be useful for the multiplication of this species. Our objective was to analyze the anatomy of thorns and find one or more specific areas with meristematic tissue (buds).

MATERIALS AND METHODS Family Celtidaceae (= Ulmaceae), Celtis

ehrenbergiana (Klotzsch) Liebm. Synonyms: C. tala Gillies ex Planch., Momisia ehrenbergiana Klotzsch, M. integrifolia Wedd., M. lancifolia Wedd., Celtis tala Gillies ex Planch. var. weddelliana Planch., C. sellowiana Miq., C bonplandiana Planch., C. tala Gillies ex Planch. var. gaudichaudiana Planch., C. tala var. tala (= var. gilliesiana Planch.) f. obtusata Chodat & Hassl., C. pallida Torr., C. tala Planch. var. pallida (Torr.) Planch., C. spinosa Spreng. var. pallida (Torr.) M. C. Johnst., C. flexuosa Wedd. var. glabrifolia Griseb., C. tala Planch. var. chichape (Wedd.) Planch. f. subpilosa Kuntze, C. tala Planch. var. chichape (Wedd.) Planch. f. subtomentosa Kuntze, Sarcomphalus punctatus Urb. & Ekman, Celtis punctata (Urb. & Ekman) Urb. & Ekman (Berg and Dahlberg, 2001; Zuloaga et al., 2008).

It is a shrub or a tree up to 4-12(-15) m tall, with arching branches, and straight thorns, solitary or geminate, up to 2-8(-20) mm long. Leaves are simple and positioned one per node in an alternate arrangement. Petiole 2-8 mm in length, and ovate, elliptic or oblong leaf blade shapes up to 1-5(-10) x 0.5-3(-7) cm, with asymmetrical base, acute or obtuse apex and irregularly dentate margin; chartaceous to subcoriaceous consistency. Glandular (pluricellular) and non-glandular trichomes (cystoliths) are present all over the surfaces. Pocket domatia are found on the abaxial surface in the main vein axils (Dottori, 1976). Stipules are deciduous. Inflorescences have imperfect and perfect flowers. Fruit is a yellow to orange rounded drupe in fall; 0.4-1 cm long and 6 mm diam. (Romanczuk, 1987; Biloni, 1990; Berg and Dahlberg, 2001).

The study was performed using living thorn samples collected from trees growing in the Arboretum and Botanical Garden ¨C. Spegazzini¨, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales,




Universidad Nacional de La Plata, Argentina, where the LPAG herbarium and the laboratory are located and in which the study was carried out. Other specimens from the LP herbarium were also surveyed (acronym according to Holmgren et al. 1990). ARGENTINA. Buenos Aires province, Pdo. La Plata: City of La Plata, Oct-2008, A. M. Arambarri 301 (LPAG). San Luis province. La Capital: Alto Pencoso, Feb 1914, Rodrigo s.n. (LP 027957). Santa Fe province, Dpto. 9 de Julio: Tostado, Feb 1936, M.M. Job s.n. (LP 30395). Santiago del Estero province, Dpto. Guasayán: Cerrillos, Jan 1950, M.M. Job 2818 (LP 905690).

To analyze the thorn, freehand longitudinal semithin sections were obtained. Some thorn samples were cleared to complement the study using the method of Dizeo de Strittmatter (1973). Slides have been made with the sections and cleared thorn material stained with Safranin O in 80% ethanol and mounted in gelatin-glycerine. The microscopic slides were observed under light microscope (LM) Gemalux. LM images were captured by means of a color PAL CCD camera attached to an LM, and they were digitalized by means of Hyper Media Center software.

Figure 1. Celtis ehrenbergiana.

Thorn longitudinal view. A, longitudinal section: vt, vascular tissue of lateral bud; ab, apical bud; lb, lateral bud. B, thorn view at a more developed stage: vt, vascular tissue irrigating both buds; ab, dominant apical bud, with conspicuous leaves primordium; lb, lateral bud. Scales: A, 100 µm, B, 500 µm.

RESULTS AND DISCUSSION

The thorn longitudinal section (Fig. 1A) and the longitudinal cleared thorn (Fig. 1B) show two buds: one in the apical and the other in a lateral subapical position. From an exomorphological point of view, the

thorns of Celtis ehrenbergiana are straight and without nodes.

However, buds were found in the anatomy study, and node presence can be deduced. The presence of these thorns with conspicuous buds is in agreement with the description of Romanczuk and del Pero de Martínez (1978) about the existence of thorns giving branches which grow in zig-zag pattern. In the light of our results, only some thorns have active meristematic tissue (buds) and develop shoots. Perhaps this was one reason for new undeveloped shoots in the material assayed by Adema et al. (2007). It means that the selection of thorns is important when they are used in assays of in vitro micropropagation.

CONCLUSIONS

Only some thorns develop shoots. One of the two geminate thorns located at the apex of actively growing branches has two buds. Therefore, these portions which have numerous meristematic cells with division capacity might be assayed with cell culture technology.

ACKNOWLEDGEMENTS We are indebted to Néstor D Bayón for valuable

suggestions upon the manuscript and Romina Ywatani for the English translation. We wish to thank to Curators of LP and LPAG herbaria and anonymous reviewers.

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Effects of gamma radiation on the chemistry and antibacterial activity of artichoke leaves

[Efecto de la radiación gamma sobre la química y actividad antibacteriana de las hojas de alcachofa

(Cynara scolymus L.)]

Alexandre A. FERREIRA1, Alexandre S. LEAL2, Vany P. FERRAZ1, Yuri MACHADO1, Jacqueline A. TAKAHASHI1*

1Departamento de Química, Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos 6627 Pampulha, Belo

Horizonte, M.G., Brazil, 2Comissão Nacional de Energia Nuclear – CNEN, Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear - CDTN, Universidade Federal de Minas Gerais, M.G. , Brazil

Abstract

Gamma-irradiation has been widely used as a first choice sterilization method of raw medicinal plants to be used in the phytotherapic industry worldwide. A comparative evaluation of HPLC profiles of both irradiated and non-irradiated plants is useful to comply on the reliability of this methodology. In this work, a widely used medicinal plant, artichoke, was investigated before and after being gamma-irradiated on several doses, and HPLC profile of all samples was obtained. Also, chlorogenic acid content was measured and the antibacterial activity of extracts irradiated was tested by disc diffusion test. Results showed good stability of artichoke active constituents over gamma-irradiation, but the HPLC profile showed absence of some minor compounds after irradiation as well as different results on antibacterial assays, suggesting need of further studies in order to assure safety and pharmacological effects in gamma irradiated phytotherapics.

Keywords: Artichoke; Chlorogenic acid; Antibacterial activity; gamma Irradiation. Resumen

La radiación gamma ha sido ampliamente utilizada como el método de elección para la esterilización de las plantas medicinales para su uso en la industria fitoterápica en todo el mundo. Una evaluación comparativa de los perfiles por HPLC de plantas irradiadas y no irradiadas, es útil para demostrar la seguridad de este método de esterilización. En este trabajo, una planta medicinal muy utilizada industrialmente, la alcachofa, fue investigada antes y después de ser irradiada con diferentes dosis de radiación gamma y se obtuvieron los perfiles por HPLC de todas las muestras. Se ha medido el contenido de ácido clorogénico y también la actividad antibacteriana de los extractos irradiados. Los resultados mostraron una buena estabilidad de los componentes activos de la alcachofa, después del tratamiento con radiación gamma, pero el perfil del HPLC demostró la ausencia de algunos compuestos de menor importancia después de la irradiación así como diversos resultados en análisis bactericidas, sugiriendo la necesidad de otros estudios para garantizar la seguridad y efectos farmacológicos en fitoterápicos irradiados con irradiación gamma.

Palabras Clave: alcachofa; acido clorogenico; actividad antibacteriana; irradiación gamma.

List of Abbreviations: 2-dodecylcyclobutanone (2dDCB)

Recibido | Received: April 4, 2010. Aceptado en versión corregida | Accepted in revised form: April 28, 2010. Publicado en línea | Published online: May 25, 2010 Declaración de intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiación | Funding: This work was financed by FAPEMIG (Brazil) and IFS (Sweden). This article must be cited as: Alexandre A Ferreira, Alexandre S Leal, Vany P Ferraz, Yuri Machado, Jacqueline A Takahashi. 2010. Effects of gamma radiation on the chemistry and antibacterial activity of artichoke leaves. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 9(3):232-237. {EPub May 25, 2010}.






Ferreira et al. Effects of gamma irradiation on artichoke leaves


INTRODUCTION

The scientific use of phytotherapeutic medicines is increasing as well as the consumer attention towards the safety of plant based products. Microbial contamination in raw plant materials is a very common problem to be addressed, and the gamma irradiation process is nowadays the most used technique for microorganisms reduction (Koseki et al. 2002). However, some doubts have been considered on the safety of this methodology. A recent investigation to elucidate the genotoxic potential of 2-dodecylcyclobutanone (2dDCB) generated by gamma irradiation of plants and food containing from palmitic acid showed that 2dDCB was clearly toxic to healthy human colon epithelial cells and in cells presenting preneoplastic colon adenoma (Knoll et al., 2006). On the other hand, the literature there is no evidence that 2-alkylcyclobutanone occurs in non-irradiated foodstuffs (Delincée et al., 2002; Horvatovich et al., 2002).

Therefore, the investigation of the quali-quantitative contents of active compounds in herbal materials used as medicinal products, by means of analytical techniques, is of increasing interest to guarantee safety, efficacy, and quality of phytotherapeutic medicines (Mulinacci et al., 2004). These analytical techniques, besides providing chemical evidence on the safety of the radio-sterilized products would also provide methods for their quality control and sanitary inspection. HPLC has been widely used as a rapid, efficient and accurate method able to completely characterize and quantify complex matrices such as plant raw materials.

Cynara scolymus L. (artichoke) is an ancient herbaceous plant, originating from the Mediterranean area, widely cultivated all over the world and its head constitutes a much appreciated exotic food. Artichoke leaf extracts are also widely used to prepare herbal medicinal products and teas. The chemical components of artichoke leaves and heads are usually polyphenolic compounds, with caffeoylquinic acids and flavonoids as the major chemical components (Mulinacci et al., 2004; Wang et al., 2003), being documented as the active principles of this plant. Several clinical investigations showed the efficacy and safety of artichoke extracts in the treatment of hepato-biliary dysfunction and digestive complaints, such as loss of appetite, nausea, and abdominal pain (Wegener and Fintelmann, 1999). Antioxidant and

antimicrobial activities of artichoke extracts and isolated phenol constituents have also been reported (Zhu et al., 2004). Using antimicrobial disc assay, Zhu and co-workers showed that the n-butanol fraction exhibited a very significant antimicrobial activity against seven bacteria species, four yeasts, and four molds. Eight phenolic compounds, chlorogenic acid, cynarin, 3,5-di-O-caffeoylquinic acid, and 4,5-di-O-caffeoylquinic acid, luteolin-7-rutinoside, cynaroside, apigenin-7-rutinoside, and apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside were isolated and also showed antimicrobial activities (Zhu et al., 2004). On a systematic antioxidant activity-directed fractionation of the artichoke heads, chlorogenic acid, cynarin and other five active polyphenol compounds were isolated (Wang et al., 2003).

In 2004, to face international market demands, the Brazilian Sanitary Surveillance Agency (ANVISA) established new procedures for phytotherapic drugs registration, where inclusion of a complete description of sterilization method and the eventual alterations of active compounds is necessary (RDC nº 48, 2004). In the case of artichoke, a minimum concentration of total caffeoylquinic acid expressed as chlorogenic acid has been established. The gamma irradiation method is a sterilization form allowed in Brazil and in more than 37 other countries of the world, which has been frequently used for herbs sterilization (RDC nº 21, 2001). In the present work, the safety of gamma-irradiation on artichoke was studied by a using a simplified HPLC method and, indirectly, by comparative measurement of the antibacterial activity of irradiated and non-irradiated artichoke extracts.

MATERIAL AND METHODS

Plant Material C. scolymus L. (Artichoke) powdered leaves not

sterilized by gamma-irradiation were kindly supplied by Mr. Wantuir A. Gontijo (Melcorpo, Betim, MG, Brazil).

Chemicals and General Procedures A HPLC system Shimadzu Class-VP with an LC

workstation system controller (Class-LC10) coupled to a 7725-type manual injector through a 5 μm Shim-pack (Shimadzu, Kyoto, Japan; 250 mm x 4.6 mm i.d.) ODS column was used. Detector was a multichannel photodiode-array detector (SPD-M10AVP) operating at 200 to 500 nm. The solvents




used were of HPLC grade (Sigma-Aldrich Chemical Co.); chlorogenic acid was of USP grade (Sigma Chemical Co) and other solvents and chemicals were of analytical grade (Synth, Brazil).

Irradiation Six aliquots of the plant material (50 g each)

were irradiated in polyethylene vials on a 60Co gammacell, installed at the Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear (CDTN, Belo Horizonte, Brazil). The radiation doses applied to each sample were 5, 10, 15 and 30 kGy at room temperature. A non irradiated sample was stored to be used as a control.

Extraction procedure Upon irradiation, artichoke samples (1 g) were

extracted with 20 mL of an ethanol/water solution (1:1) under magnetic stirring, at room temperature, for 30 min, filtered and the solvent was removed at 40 ⁰C. The extracts obtained were weighted and the corresponding yields were calculated.

HPLC / DAD analysis The extracts were dissolved in 2 mL of a

methanol/water solution (1:1) and filtered in Sepack filters (0.45 μm); 20 μL of this solution were injected in the high pressure liquid chromatograph. Separations were carried out on a 250 mm x 4.6 mm reversed-phase column Shim-pack (5 µm) using a mobile phase of water-phosphoric acid 0.01% (solvent A) and acetonitrile (solvent B) at a constant solvent flow rate of 1 mL/min. A general elution method was developed using the following gradient: 0 min A 95%; 10 min A 80; 20 min A 70%; 40 min A 60%.; 50 min A 10%. The chromatograms were monitored on-line at 200 to 500 nm.

HPLC / DAD quantitative procedure The external standard method was applied to

quantify the content of chlorogenic acid and its derivatives in artichoke leaves. Quantification of chlorogenic acid was performed using a six-point regression curve, developed through the use of authentic standard, operating in the range of 2.34-75.00 μg/mL. Total caffeoylquinic acids were expressed as chlorogenic acid on the basis of their regression curve and in the sum of the peaks areas, identified by comparison of their UV spectra with those obtained for chlorogenic acid. Measurements

were performed at 326 nm. The r2 value obtained for chlorogenic acid was 0.9994 in the range of concentrations from 2.34 to 75.0 mg/L. The HPLC-DAD quantitative data were expressed as milligram per kilogram of dried extract.

Antimicrobial activity test Antibacterial activity was detected by the disc

diffusion method (Bauer et al. 1966) for Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus (ATTC 29213) and Lysteria monocytogenes (ATCC 15313) and Gram-negative Shigella sommei (ATCC 25931) and Proteus mirabilis (ATCC 25933). Chloramphenicol (30 µg) and distilled water were used as positive and negative controls, respectively (Takahashi et al., 2006). Experiments were run in triplicate and the results represent mean values of the three measurements.

RESULTS

Samples of artichoke leaves (1 g each, dry weight) were irradiated at doses of 5, 10, 15 and 30 kGy. Organoleptic analysis of irradiated samples did not show any alteration on the color, flavor or physical aspect. The extracts obtained were weighted and the corresponding yields were calculated to be 18.8% for the non-irradiated sample and 18.6, 18.6, 19.2, 20.6%, for the samples irradiated with 5, 10, 15, and 30 kGy, respectively. A slight raise on the yield was observed for the higher irradiation doses that may have been caused by the breakage of labile bounds as result of the radiation. Some polar molecules, barely soluble in organic solvents, can break into smaller molecules, raising the extractable content. Due to this increase on the extracts yield, access to stability of active compounds was accomplished by performing a HPLC analysis. Table 1. Chlorogenic acid and total caffeoylquinic acids concentrations on hydroalcoholic extracts prepared from irradiated artichoke leaves.

Dosis (kGy)

Extraction yield (%)

Chlorogenic acid (%)

Total caffeoylquinic acid derivatives

(mg/kg )

0 18.8 246 1099

5 18.6 288 1229

10 18.6 197 1141

15 19.2 244 1265

30 20.6 230 1111




Several HPLC methodologies for quali and quantitative analyses of polyphenol compounds in artichoke leaves and heads were described so far (see, for example, Mulinacci et al., 2004; Wang et al., 2003), but it seems that none of them has been used to compare irradiated and non-irradiated artichoke. In this work, the retention time for the active component of the extract (Schütz et al., 2006), chlorogenic acid (standard sample), was observed in approximately 21.20 min (Figure 1, peak 1).

Figure 1. HPLC profile of hydroalcoholic extract from irradiated (30 kGy) and non irradiated (0 kGy) artichoke leaves.

Chlorogenic acid 1; caffeoylquinic acid derivatives: 2 and 3. In the region of 28 min there were observed peaks present only in the HPLC profile of non-irradiated (0kGy) artichoke.

The remaining caffeoylquinic acid derivatives peaks (Figure 1, peaks 2 and 3) were identified on the basis of comparison of their UV spectra with that one obtained for chlorogenic acid (Figure 2).

Figure 2. UV spectra of authentic chlorogenic acid (a) and of caffeoylquinic acid derivative (peak 2 of artichoke hydroalcoholic extract chromatogram) (b).

HPLC chromatograms of artichoke from both

irradiated and non-irradiated samples were very similar concerning the major compounds profile. However, modifications on the minor compounds, as exemplified on Figure 1 (peaks at 28 minutes), were observed. Quantification of chlorogenic acid was performed using a six-point regression curve (Figure 3), developed through the use of authentic standard. Calibration curve of HPLC peak areas was constructed against the marker concentrations. Linear regression analysis was used to calculate the slope, intercept and the correlation coefficient (r2) of calibration line.

Total caffeoylquinic acids contents were determined (Table 1). The chlorogenic acid concentration in non irradiated artichoke samples was determined as 246 mg/kg of dried extract, and total caffeoylquinic acids were calculated as 1099 mg/kg (Figure 1). Chlorogenic acid concentrations of irradiated samples were determined in the range of 197-288 mg/kg. A good agreement in the content of chlorogenic acid and derivatives among non-irradiated and irradiated samples was found, inferring that these compounds were stable and were not decomposed by the irradiation. However, differences in minor compounds and in the quantity of major compounds observed in the HPLC profiles were noticed (Figure 1).

Since plant matrices are very complex, it seemed interesting to compare the biological response of irradiated and non-irradiated artichoke samples, as small changes like those observed in the HPLC profiles at the chromatographic conditions used in

a b




these experiments, can be enough to interfere on the extract bioactivity (Byun et al., 1999).

Antibacterial assay was chosen as it is a rapid and reliable assay and artichoke has been showed to be active in this test (Zhu et al., 2004). Extracts of irradiated artichoke were tested in vitro against four bacteria, and compared to a non-irradiated sample extract. Bacteria were chosen in order to cover a broad spectra of activity, being two Gram-positive and two Gram-negative. Antibacterial activity was noticed only against Listeria monocytogenes, a Gram-positive bacterium. Non-irradiated artichoke and artichoke irradiated up to a doses of 15 kGy showed the same inhibitory activity (9 ± 0 mm inhibition zone in all three measurements), but samples irradiated with 30 kGy repeatedly showed no activity towards L. monocytogenes. This is worth noticing, since it was expected that all samples would present the same activity against the tested bacteria. In this way, biological tests may be a strong argument in favour of the need of deeper studies not only for artichoke but in order to guarantee the safety and quality of raw plant material when gamma-irradiation is used as the sterilization procedure.

DISCUSSION

Since plant matrices are very complex mixtures of compounds, it seemed interesting to compare the biological response of irradiated and non-irradiated artichoke samples, besides the HPLC profile, since small changes such as those observed at the chromatographic conditions used in these experiments can be enough to interfere on the extract bioactivity.

Extracts of irradiated artichoke were tested in vitro against four bacteria, in comparison to a non-irradiated sample extract. None of them presented antibacterial effect against S. aureus, S. sommei and P. mirabilis. Antibacterial activity was noticed only against L. monocytogenes, a Gram-positive bacterium. Non-irradiated artichoke and artichoke irradiated up to a doses of 15 kGy showed the same inhibitory activity (9 mm inhibition zone), but samples irradiated with 30 kGy repeatedly showed no activity towards L. monocytogenes. This was an interesting finding since it was expected that all samples would present the same activity against the tested bacteria (Byun et al., 1999). In this way, biological tests results may be a strong argument in favor on the need of wider studies including other medicinal plants in order to guarantee safety and

quality of raw plant material when gamma-irradiation is used as the sterilization procedure.

CONCLUSIONS

HPLC analyses of chlorogenic acid and its derivatives contents on artichoke leaves both gamma irradiated and non-irradiated showed the same profile in terms of major compounds. However, some discrepancies were noticed concerning to the absence of peaks corresponding to some minor compounds and also when biological activity of such samples was investigated. In this way, it seems that complimentary techniques for the evaluation on the gamma irradiation effects of raw plant material should be developed in order to assure the users that this is a consumer-friendly technique, guaranteeing both safety and pharmacological effects of phytotherapics prepared by using gamma-irradiated plants.

ACKOWLEDGEMENTS The authors wish to thank the financial support

of FAPEMIG, IFS and CNPq.

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Mulinacci N, Prucher D, Peruzzi M, Romani A, Pinelli P, Giaccherini C. 2004. Commercial and laboratory




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New Brazilian rules for herbal medicines

[Nuevas normas brasileñas para fitoterápicos]

Ana Cecília BEZERRA CARVALHO1,2, João Paulo SILVÉRIO PERFEITO1,2, Leandro Viana COSTA E SILVA1,2, Livia SANTOS

RAMALHO1,2, Robelma France de OLIVEIRA MARQUES1, Dâmaris SILVEIRA2*

1Agência Nacional de Vigilância Sanitária. ANVISA. SIA, Trecho 5, Área Especial 57, Brasília, DF, Brasil. CEP 71205-050. 2Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade de Brasília. Campus Universitário Darcy Ribeiro, Asa Norte, Brasília, DF. CEP 70910-900. ———————————————————————————————————————————————————

Abstract Brazil has republished several normative instructions for the last months related to medicinal plants and herbal medicines in accordance to public policies which encourage the use of herbal medicines that present safety, efficacy, and quality patterns. This article reports the last published rules and their major changes comparing to the previous ones. Keywords: phytotherapy, herbal medicine, medicinal plants, regulation

Resumen

Brasil acaba de publicar varias normas relacionadas con las plantas medicinales y fitoterápicos con el fin de satisfacer las demandas de las políticas públicas vigentes en el país y fomentar la entrada de medicamentos a base de hierbas con la seguridad, eficacia y calidad para la población. Este artículo presenta las normas recientemente publicadas y presenta los cambios más importantes. Palabras Clave: fitoterápico, medicamento herbolario, plantas medicinales, regulación. ——————————————————————————————————————————————————— Recibido | Received: May 5, 2010. Aceptado en versión corregida | Accepted in revised form: May 14, 2010. Publicado en línea | Published online: May 25, 2010. Declaración de intereses | Declaration of interests: the authors have no competing interests. Financiación | Funding: none declared. This article must be cited as: Ana Cecília Bezerra Carvalho, João Paulo Silvério Perfeito, Leandro Viana Costa e Silva, Livia Santos Ramalho, Robelma France de Oliveira Marques, Dâmaris Silveira. 2010. New Brazilian rules for herbal medicines. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 9(3): 238-241. {EPub May 25, 2010}. *Contactos | Contacts: [email protected]





mailto:71205-050.%[email protected]�

Carvalho et al. New Brazilian rules for herbal medicines


Since 1967, Brazilian health policies have recognized the role of medicinal plants in the Public Health scenario, publishing specific regulations for herbal medicines regarding certain aspects such as

safety, quality, and efficacy (BRASIL, 1967). Table 1 summarizes the most important Brazilian published documents.

Table 1. Mainly Brazilian specific guidelines about medicinal plants regulation Category Legal Basis Main features Link Medicinal Plants Law

5991/1973 Controls medicines trade, pharmaceuticals and related supplies

http://www.anvisa.gov.br/legis/consolidada/lei_5991_73.htm

Medicinal Plants; Herbal medicines

MS/GM 971/2006

Approves the national policy of complementary practices

http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/PNPIC.pdf

Medicinal Plants; Herbal medicines

Decree 5813/2006

Approves the national policy of medicinal plants and herbal medicines

http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2004-2006/2006/Decreto/D5813.htm

Sanitary Surveillance

Decree 79094/1977

Determines monitoring of medicines, pharmaceutical supplies, drugs, cosmetics, toiletries, sanitizing and others.

http://www.anvisa.gov.br/legis/consolidada/decreto_79094_77.pdf

Herbal medicines RDC 14/2010 Regulates herbal medicines register http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2010/res0014_07_01_2010.html

Herbal medicines IN 05/2010 List of references to evaluate safety and efficacy of herbal medicines

http://www.in.gov.br/imprensa/visualiza/index.jsp?data=05/04/2010&jornal=1&pagina=91&totalArquivos=160

Herbal medicines IN 05/2008 List of plants with simplified register ftp://ftp.saude.sp.gov.br/ftpsessp/bibliote/informe_eletronico/2008/iels.dez.08/iels236/U_IN-ANVISA-5_111208.pdf

Herbal medicines RE 90/2004 Guide to toxicological test to herbal medicines

http://www.abrafito.org.br/legislacao.shtml#005

Herbal medicines RE 91/2004 Guide for changes on herbal medicines register

http://www.abrafito.org.br/legislacao.shtml#005

Pharmaceuticals RDC 17/2010 GMP for medicines http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2010/res0017_16_04_2010.html

Herbal medicines RDC 10/2010 Herbal drugs notification http://www.brasilsus.com.br/legislacoes/rdc/103202-10 MS: Health Ministry; GM: ANVISA Pharmaceuticals Bureau; RDC: Resolution; IN: Normative Instruction; RE; Resolution from ANVISA Council

Therefore, the regulation of herbal medicine and medicinal plants largely evolved in the last decade, stimulated by the foundation of the Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, and by the implementation of the National Policy of Integrative and Complementary Practice and National Policy of Medicinal Plants and Herbal Medicines (BRASIL, 2006a, 2006b; Carvalho et al., 2007; Carvalho et al., 2008). One of the most recent regulations is the RDC number 14, published on April 05th, 2010 (BRASIL, 2010d), which updated the technical requirements for industrialized herbal medicine registration. Indeed, few changes can be noted when comparing the latter to the previous guideline (RDC 48/2004) (BRASIL, 2004) concerning the requirements to prove efficacy and safety patterns. The demand on safety and

efficacy patterns still remains and they must be preceded by pre-clinical and clinical tests. The results must also be supported by scientific literature or traditional use of the plant species. A list of references that support the plant’s safety and efficacy patterns was published again as IN 05/10 (BRASIL, 2010c).

However, the new document includes innovations in the requirements for quality control. The Biological control is a new alternative to replace the chemical marker control for in vivo, ex vivo or in vitro validated tests, controlling the activity of the herbal medicine. Other inclusions refer to the need to evaluate the aflatoxins as recommended by the WHO magazine reports (WHO, 2007).




One innovative inclusion is the requirement to register alga and multicellular fungus based products as ANVISA is defining the specific guidelines for this purpose. There was a lack of requirements in order to register these sorts of products and the RDC 14/2010 filled in this gap. Another innovation is the possibility for an herbal drug to become the active substance in the herbal medicine, if its efficacy can be clinically tested and proved. Herbal drug registration was prohibited by the preceding rule (RDC 48/2004).

One of the several aspects that show the evolution of the Brazilian regulation in this field is the obligation to present pharmacologic surveillance reports for renewing herbal medicine registration in order to monitor adverse effects related to the herbal medicine in question.

The new regulation norms also affect imported herbal medicines. The authorization to import samples of herbal medicines can be done prior to their registration in order to process batch-to-batch quality analyses and clinical tests. Such analyses can be done by a third party Quality Control laboratory in Brazil instead of by a laboratory from the samples’ home country as long as the laboratory hired to perform these tests has herbal medicine certifications from Good Laboratory Practices – GLP and Good Manufacturing Practices - GMP (BRASIL, 2010b). Good Manufacturing Practices guideline was also updated on April 19th by RDC number 17/2010. This guideline brings specific requirements for herbal medicine industries. The normative requires technical qualification on herbal medicine aspects for all those involved in the manufacturing/inspection/liberation of these products. Other innovations added to this guideline are the mandatory control of pesticides and fumigant residues in final products and the rules about genetically modified herbal drug manufacturing (BRASIL, 2010a)

Two other guidelines were recently published. The RDC 47/2009 defines the rules on elaborating, harmonizing, improving, and publishing literature to inform patients and health professionals about herbal medicines and their rational use (BRASIL, 2009a). The other guideline, RDC 71/2009, defines the requirements of labeling all pharmaceutical products that are registered and sold. The labels must also be written in Braille and must have a tracking system, along with other requirements (BRASIL, 2009c).

Another newly published regulation, the RDC 10/2010, from March 10th, deals with herbal drugs that are used in medicinal teas and has, therefore, filled in another gap in the Brazilian regulation. With this norm, the industries can now register their herbal drug productions based on a list of 66 traditionally recognized as efficient and safe herbal species (BRASIL, 2010b).

CONCLUSIONS All these new rules present an evolution to the

Brazilian Regulation. However, even though the innovated sanitary regulation meets the Public Health Policies for Industries it is mandatory to carry on researches in order to appraise the Brazilian medicinal plants accordingly, as established by the Relação Nacional de Plantas de Interesse para o Sistema Único de Saúde (RENISUS) (BRASIL, 2009b).

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