Bivalent binding by intermediate affinityof nimotuzumab

A contribution to explain antibody clinical profile

Greta Garrido,1,†,* Ilia A. Tikhomirov,2,† Ailem Rabasa,1 Eric Yang,3 Elias Gracia,4 Normando Iznaga,1 Luis E. Fernandez,1Tania Crombet,1 Robert S. Kerbel3 and Rolando Perez11Center of Molecular Immunology; 4National Institute of Oncology and Radiobiology; Havana, Cuba; 2YM Biosciences Inc.;3Sunnybrook Health Sciences Center; Toronto, ON Canada†These authors contributed equally to this work.Keywords: EGFR, monoclonal antibodies, cancer immunotherapy, tumor targeting, nimotuzumab, affinity, avidityAbbreviations: EGFR, epidermal growth factor receptor; TKI, tyrosine kinase inhibitor; mAb, monoclonal antibody; FBS,fetal bovine serum; FITC, fluorescein iso-thiocyanate; HRCE, human renal cortical epithelial cells; HEC, human epidermal cellsuspensions; PI, propidium iodide; KD, dissociation constant

Nimotuzumab adalah antibodi-penargetan EGFR yang telah menunjukkan hasil yang menggembirakan klinis dalam ketiadaan parahefek samping diamati dengan antibodi anti-EGFR lain yang disetujui. Kami menyelidiki apakah perilaku klinis yang berbedanimotuzumab berhubungan dengan profil mengikat bivalen / monovalen. Sifat mengikat nimotuzumab dan cetuximab,perkembangan sebagian besar antibodi anti-EGFR, telah diteliti secara in vitro menggunakan permukaan Chip dan sel-sel dengan berbagai EGFR tingkat ekspresi. Pengamatan eksperimen menunjukkan bahwa dalam kontras dengan cetuximab, sifat intrinsiknimotuzumab ikatan yang bivalen yang diperlukan untuk lampiran stabil ke permukaan sel, menyebabkan nimotuzumab selektif mengikat sel-sel yang mengekspresikan sedang sampai tingkat ekspresi EGFR yang tinggi. Pada kondisi ini, kedua antiboditerikat bivalently dan akumulasi untuk derajat yang sama. Ketika konsentrasi EGFR rendah, interaksi monovalen nimotuzumab adalah sementara, sedangkan cetuximab terus berinteraksi kuat dengan reseptor. Kami membandingkan in vitro antitumor kemanjuran nimotuzumab dan cetuximab. Cetuximab menurunkan kelangsungan hidup sel dan menginduksi apoptosis untuk semua diuji baris sel, efek yang tidak tergantung pada tingkat ekspresi EGFR. Sebaliknya, nimotuzumab juga memicu signifikan anticellular efek, namun kapasitas antitumor yang menurun bersama dengan tingkat ekspresi EGFR. Cetuximab fragmen Fab adalah mampu mempengaruhi kelangsungan hidup sel tumor, sedangkan fragmen nimotuzumab benar-benar kehilangan efek ini. Percobaan tumor xenograft menggunakan sel dengan ekspresi EGFR yang tinggi menunjukkan pertumbuhan yang sama efek menghambat tumor untuk kedua antibodi. penelitian ini menunjukkan penjelasan untuk profil klinis nimotuzumab, dimana aktivitas antitumor diperoleh dalam ketiadaan parah toksisitas karena sifat-sifatnya mengikat bivalen untuk EGFR.

INTRODUCTION

Terapi bertarget merupakan tren utama dalam pengembangan obat baru untuk pengobatan kanker, didorong oleh peningkatan pengetahuan dari perubahan genetik yang menyebabkan transformasi maligna dan kemajuan. Di antara target molekul yang saat ini dalam evaluasi klinis, reseptor faktor pertumbuhan epidermal (EGFR), juga dikenal sebagai HER1, telah banyak divalidasi dan beberapa antagonis EGFR, termasuk oral tirosin molekul kecil kinase inhibitor (TKI) dan antibodi monoklonal (mAbs) memiliki telah disetujui oleh FDA.1 Lima mAbs anti-EGFR telah dievaluasi dalam tahap II atau studi klinis fase III dengan positif atau hasil yang menggembirakan. Di antara mereka, cetuximab (chimeric IgG1 sebelumnya dikenal sebagai C225), telah dipelajari secara ekstensif berbagai ina dari types.2 tumor Selain itu, panitumumab, matuzumab dan zalutumumab telah diuji dalam beberapa jenis EGFR-positif tumors.3 Nimotuzumab (a IgG1 manusiawi sebelumnya dikenal sebagai h-R3) telah diteliti pada pasien dengan kepala dan neck4, 5 dan tumor glioma,6-8 dan beberapa uji klinis untuk indikasi tumor lainnya ongoing.9-12 EGFR umumnya diekspresikan dalam tumor epitel manusia dibandingkan dengan tingkat ekspresi diamati pada jaringan normal seperti kulit dan ginjal. Sebuah kelemahan dari terapi EGFR bertarget adalah toksisitas ruam kulit yang parah dan efek samping lain yang terkait bahwa mereka memprovokasi dalam sel ginjal dan mukosa gastro-intestinal. Efek samping diyakini disebabkan oleh reaksi dari anti- EGFR penargetan obat untuk reseptor dalam jaringan selain tumor.13, 14 Telah mendalilkan bahwa ada korelasi langsung antara efikasi klinis EGFR-penargetan agen dan keparahan induksi acneiform kulit rash.15, 16 Dalam uji klinis selesai sampai saat ini, nimotuzumab telah menunjukkan unik profil klinis keamanan, di mana aktivitas antitumor diamati dengan toksisitas yang sangat rendah profile.4-6 Terutama, kelas 3 dan 4 acneiform rash umumnya terkait dengan antibodi anti-EGFR lainnya adalah absent.17

Kami sebelumnya telah merumuskan model matematika berdasarkan pada fase II data percobaan klinis, untuk menjelaskan mengapa nimotuzumab mungkin memiliki khasiat klinis yang baik tanpa menunjukkan dampak buruk events.4 Menurut model ini teoritis, antibodi dengan afinitas menengah akan memiliki rasio yang lebih tinggi akumulasi pada tumor (yang memiliki tingkat ekspresi EGFR yang lebih tinggi) dengan menghormati jaringan normal, dibandingkan dengan antibodi afinitas tinggi. Nimotuzumab, yang Fab fragmen monovalen memiliki sepuluh kali lipat afinitas yang lebih rendah untuk domain ekstraselular dari EGFR Fab cetuximab, 18 akan berada dalam ini menguntungkan "afinitas jendela. "

Bukti yang muncul menunjukkan bahwa kemampuan antibodi terhadap mengikat bivalently (yaitu, mengikat dengan kedua lengan antibodi terhadap dua target secara bersamaan) sangat penting untuk menjaga berkepanjangan tinggal obat dalam tumor dan merupakan fitur penting untuk menghambat sel tumor proliferation.19-21 Pembentukan obligasi bivalen adalah tergantung pada kerapatan sasaran dan kinetika mengikat antibodi, seperti bahwa peningkatan densitas reseptor pada permukaan sel memfasilitasi pembentukan ikatan bivalen. Selain itu, tidak ada klinis bukti dari penelitian dengan antibodi anti-EGFR yang tinggi afinitas (yaitu, kekuatan interaksi monovalen) mengarah ke yang lebih besar khasiat meskipun mengikat monovalen kuat dapat menyebabkan tinggi toksisitas. Ketika

pasien membawa maju karsinoma sel skuamosa kepala dan leher (SCCHN) diobati dengan nimotuzumab dalam kombinasi dengan radioterapi, hampir semua efek samping yang dinilai sebagai I atau II. Toksisitas Iradiasi tidak ditambah dengan nimotuzumab dan, tidak ada ruam kulit adalah found.5 Namun, pengobatan dari populasi yang sama pasien dengan cetuximab dan radiasi terprovokasi bahwa 87% dari pasien mengembangkan acneiform rash.22 Bahkan lebih, survei EORTC terbaru mengindikasikan bahwa kelas 3 dan 4 dermatitis terjadi pada sekitar 49% pasien selama SCCHN terapi radiasi dengan bersamaan cetuximab.23 demikian, afinitas dan aviditas dari interaksi mengikat mungkin memainkan peran penting dalam profil klinis antibodi anti-EGFR

Dalam makalah ini, sifat pengikatan nimotuzumab, khususnya mengikat untuk sel tumor bivalen dan monovalen memiliki diferensial Ekspresi EGFR, dan efek pada sel-sel tumor tersebut, di perbandingan dengan cetuximab diselidiki. pola Binding sel nimotuzumab dan cetuximab untuk dari jaringan sehat (ginjal dan kulit) juga diperiksa.

Results

monovalen / profil ikatan yang bivalen. Kemampuan nimotuzumab dan cetuximab, serta fragmen Fab mereka, untuk mengikat tumor sel memiliki tingkat ekspresi yang berbeda dari EGFR ini pertama kali dianalisis dengan sitometri menggunakan lima sel tumor manusia yang berbeda baris (A431, H125, U1810, MDA-MB-231 dan U1906). Tingkat ekspresi EGFR dalam sel-sel diukur dengan western blot dan analisis cytometry aliran. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 1A, EGFR penurunan ekspresi dari A431 ke MDA-MB-231 sel baris, sedangkan ekspresi tidak terdeteksi pada sel U1906. Hasil yang sama diperoleh bila permukaan ekspresi EGFR adalah dianalisis (Gambar 1B). Hasil ini sesuai dengan sebelumnya laporan yang menunjukkan bahwa A431 sel mengekspresikan 2-3 x 106 EGFR molekul per sel, 32 sel H125 dan U1810 express 2.1 x 105 dan 7 x 103 EGFR molekul per sel, masing-masing, 33 sedangkan MDA-MB-231 sel memiliki ekspresi yang lemah, 34 dan U1906 sel baris tidak mengekspresikan EGFR pada all.3

Garis sel yang berbeda diinkubasi dengan meningkatnya konsentrasi nimotuzumab, cetuximab, atau Beatles mereka. Itu rasio antara kemampuan mengikat nimotuzumab dan cetuximab diukur dengan sitometri. Perbedaan nyata dalam pola mengikat antibodi diamati sebagai fungsi dari EGFR kepadatan dan mengikat mode (bivalen vs monovalen). Seperti ditunjukkan pada Gambar 1C, cetuximab menunjukkan mengikat konsisten untuk semua lini sel independen ekspresi EGFR. Sebaliknya, para flourescence berarti intensitas kurva kemiringan (FMI) menunjukkan nimotuzumab akumulasi secara signifikan dan positif mempengaruhi dengan meningkatkan ekspresi EGFR. Nimotuzumab dan cetuximab kurva mengikat yang sangat mirip pada semua tingkat konsentrasi untuk sel baris dengan moderat untuk ekspresi reseptor tinggi (H125 dan A431). Percobaan mengikat dilakukan dengan monovalen Fragmen Fab mengungkapkan bahwa cetuximab Fab mengikat adalah independen dari jumlah EGFR. Sebaliknya, mengikat monovalen tidak efisien dengan Fab nimotuzumab, dengan tingkat minimalmengikat pada berbagai tingkat ekspresi EGFR dan fragmen konsentrasi (1D Gbr.).

Untuk mempelajari interaksi antara antibodi dan EGFR mengumpulkan data secara terus menerus secara real time tanpa perlu enzimatik modifikasi antibodi, kami melakukan studi dengan Permukaan Plasmon Resonansi. Pengikatan nimotuzumab dan cetuximab dibandingkan dalam kondisi hanya mengizinkan monovalen (yaitu, kepadatan rendah EGFR) atau bivalen (yaitu, kepadatan tinggi EGFR) yang mengikat. Konsisten dengan hasil cytometry aliran, dalam kondisi monovalen (Gambar 2A), perbedaan yang signifikan yang diamati antara tingkat mengikat, dengan nimotuzumab menunjukkan terendah respon. Dalam kondisi yang mewakili kepadatan tinggi dengan EGFR memungkinkan interaksi bivalen (Gambar 2B), antibodi anti-EGFR berperilaku sangat mirip, terakumulasi ke tingkat yang setara.

Gambar 1. Pengikatan nimotuzumab, cetuximab dan fragmen monovalen mereka untuk sel tumor manusia dengan ekspresi EGFR yang berbeda. (A) imunoblot untuk total EGFR dan aktin dilakukan untuk sel-sel tumor yang ditunjukkan. (B) Sel tumor (abu-abu histogram) diwarnai dengan anti-EGFR antibodi (hitam histogram), diikuti dengan inkubasi dengan FITC-conjugated kelinci anti-tikus IgG-H & L. (C) baris sel tumor diinkubasi dengan antibodi nimotuzumab atau cetuximab diikuti dengan FITC-terkonjugasi IgG anti-manusia (Fab tertentu). (D) baris sel tumor diberi label dengan dua kali lipat konsentrasi yang lebih tinggi dari Fabs nimotuzumab atau cetuximab daripada konsentrasi yang digunakan untuk seluruh antibodi diikuti dengan FITC-conjugated anti-manusia IgG (Fab tertentu). (C dan D) Untuk setiap titik mewakili rata-rata sumur rangkap tiga. Data dinyatakan sebagai intensitas rata-rata fluoresensi (FMI); dan garis sel U1906 digunakan sebagai kontrol negatif untuk ekspresi EGFR (data tidak ditampilkan). Semua percobaan dilakukan setidaknya tiga kali dengan hasil yang sama. Data Perwakilan ditampilkan.

Nimotuzumab mengikat minimal untuk ginjal dan kulit nonmalignant sel. Kami menguji juga pengakuan jaringan normal oleh nimotuzumab, cetuximab dan fragmen Fab mereka dengan aliran cytometry. Ekspresi EGFR manusia ginjal kortikal epitel sel (HRCE) dan suspensi sel epidermis manusia (HEC) adalah ditandai dengan Immunoblot protein menggunakan A431 sel sebagai positif kontrol. Seperti yang diharapkan dari hasil yang dilaporkan sebelumnya oleh Nyata et al.35 HRCE dan HEC memiliki tingkat EGFR yang sama dan mereka Ekspresi EGFR adalah ≈ 100 kali lipat lebih rendah dari A431 sel (Gambar 3A dan B). Mengikat cetuximab untuk HRCE dan HEC signifikan dan konsentrasi tergantung. Nimotuzumab mampu mengenali budaya utama sel ginjal dan kulit normal namun Kapasitas pengakuan lebih rendah dengan faktor 2-3 dibandingkan dengan cetuximab (Gambar 3C). Cetuximab Fab terikat sel-sel dan mengikat adalah serupa dengan yang diamati dengan seluruh mAb (equimolar konsentrasi). Fab Nimotuzumab mengikat HRCE dan HEC telah terdeteksi terlepas dari konsentrasi Fab (Gambar 3D).

Gambar 2. Pemeriksaan cetuximab dan kinetika mengikat nimotuzumab menggunakan resonansi permukaan plasmon. (A) Dalam kondisi yang mengikat monovalen(dimaksudkan untuk mewakili mengikat sel dengan ekspresi EGFR rendah) antibodi menunjukkan perbedaan yang signifikan pada tingkat akumulasi, dengansangat sedikit mengikat terjadi dengan nimotuzumab, antibodi ligan-anti-EGFR, monomer EGFR analit-100 nM. (B) Dalam kondisi ikatan yang bivalen(dimaksudkan untuk mewakili mengikat sel dengan ekspresi EGFR yang tinggi), antibodi berperilaku sama dan akumulasi ke tingkat yang setara, ligan-Fc-EGFR chimera (dimer); analit-100 nM antibodi anti-EGFR. Percobaan dilakukan tiga kali dengan hasil yang sama. Data Perwakilan adalahditampilkan.

Efek anticellular Nimotuzumab tergantung pada konsentrasi EGFR. Untuk lebih mendapatkan wawasan tentang dampak dari perbedaan di monovalen dan bivalen mengikat antara nimotuzumab dan cetuximab, pertama kita diuji efeknya pada viabilitas sel dengan MTT tes untuk sel A431, H125, U1810 dan MDA-MB-231. Sebagai ditunjukkan pada Gambar 4A, cetuximab menurunkan viabilitas sel untuk semua baris sel diuji dalam cara yang tergantung konsentrasi. Persentase sel layak pulih setelah pengobatan dengan konsentrasi tertinggi cetuximab adalah serupa untuk empat sel jenis, yaitu, efeknya tidak tergantung pada tingkat ekspresi EGFR. Sebaliknya, kapasitas nimotuzumab untuk mengurangi kelangsungan hidup menjadi lemah karena tingkat ekspresi EGFR menurun.

Selanjutnya, kami meneliti kemampuan nimotuzumab dan cetuximab menginduksi apoptosis pada sel tumor termasuk dalam penelitian ini. Untuk tujuan ini, kami mengukur tingkat fragmentasi DNA oleh propidium iodida (PI) pewarnaan. Pengobatan dengan cetuximab pada 70 nM memicu peningkatan jumlah A431, H125, U1810 dan MDA-MB-231 sel apoptosis, dibandingkan dengan nontreated sel (Gambar 4). Nilai-nilai persentase sel dengan Fragmentasi DNA yang sama untuk semua baris sel. Pengobatan dengan nimotuzumab juga menghasilkan peningkatan persentase sel apoptosis pada A431, H125, U1810 dan MDA-MB-231 baris, tetapi efeknya menurun secara paralel dengan ekspresi EGFR tingkat (Gambar 4).

Selain itu, kami membandingkan in vitro antitumor kemanjuran antibodi fragmen monovalen pada A431 sel. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 4A dan B, berbeda dengan cetuximab Fab, nimotuzumab fragmen monovalen benar-benar hilang kapasitasnya untuk mengurangi viabilitas sel atau menginduksi apoptosis. Dalam konkordansi dengan hasil dilaporkan oleh kelompok lain, 21,36 cetuximab Fab ditampilkan lemah efek anticellular terhadap A431 sel dari cetuximab.

Akhirnya, kami meneliti efek dari nimotuzumab dan cetuximab pada sel-sel yang overexpress EGFR in vivo menggunakan A431 Model xenograft. Sebuah efek antitumor sebanding tercatat pada kelompok diobati dengan nimotuzumab dan cetuximab (Gambar 5). Sebaliknya, pada kelompok kontrol, tumor terus tumbuh dan volume tumor pada akhir percobaan itu hampir dua kali ukuran implan pada awal pengobatan. Serupa dalam hasil vivo telah dilaporkan sebelumnya dari perbandingan Penelitian menggunakan kedua anti-EGFR antibodies.37

Discussion

Nimotuzumab adalah salah satu dari sangat sedikit antibodi anti-EGFR yang telah disetujui untuk digunakan terapi dalam pengobatan kanker. Ia mengakui domain III dari wilayah ekstraselular EGFR, dalam area yang tumpang tindih dengan kedua patch permukaan diakui oleh cetuximab dan tempat pengikatan EGF.18 Mendorong kegiatan nimotuzumab telah dibuktikan dalam in vivo models38 dan beberapa uji klinis, terutama tahap I dan tahap II uji coba yang telah difokuskan pada kepala dan leher dan keganasan otak. 4-7 Secara total, nimotuzumab telah diberikan kepada lebih dari 4.000 pasien dan terutama tidak ada bukti ruam kulit yang parah telah dilaporkan.39 Meskipun nimotuzumab menghasilkan penghambatan fosforilasi EGFR dalam sel kulit normal, ada perubahan signifikan dalam status aktivasi molekul hilir ditemukan. Selain itu, karakteristik infiltrat limfositik, folikulitis atau perifolliculitis disebabkan oleh anti-EGFR antibodi belum diamati dalam nimotuzumab yang diobati pasien kulit samples.40, 41 Dalam hal ini, telah dilaporkan bahwa respon inflamasi bertanggung jawab untuk banyak tanda-tanda dan gejala yang berhubungan dengan kulit toxicity.42, 43 Namun, derajat penghambatan EGFR cukup untuk menyebabkan reaksi inflamasi yang mengarah ke ruam belum diketahui. Beberapa penelitian menggunakan kulit sampel dari pasien yang diobati dengan agen anti-EGFR mengungkapkan bahwa pengurangan fosforilasi EGFR tidak berhubungan dengan toxicity.44, 45

Sebuah paradigma saat ini dalam terapi antibodi antitumor yang ditargetkan adalah untuk mengejar calon obat afinitas tertinggi. Sementara ini mungkin terus untuk antibodi

menargetkan antigen tumor tertentu, tumorassociated antigen seperti EGFR, yaitu molekul yang diekspresikan pada tumor tetapi juga ubiquitously disajikan dalam yang normal jaringan, paradigma ini mungkin tidak berlaku sebagai biodistribusi dan sifat penetrasi tumor mungkin terpengaruh sangat tinggi affinity.46

Model matematika sebelumnya yang diperkirakan dibangun sebuah "jendela afinitas" (KD antara 10-7 dan 10-9 M) untuk antibodi anti-EGFR untuk terapi yang optimal index.4 Affinity dari nimotuzumab adalah sepuluh kali lebih rendah daripada afinitas cetuximab (KD untuk fragmen Fab: 2,1 x 10-8 dan 2,3 x 10-9 M, masing-masing) 18,47 dan akan jatuh dalam jendela afinitas optimal yang diprediksi.

Studi ini memberikan hasil eksperimen yang memperpanjang "Afinitas jendela" hipotesis dengan menambahkan komponen untuk aviditas model. Hasil kami menunjukkan bahwa antibodi dengan menengah afinitas istimewa akan menargetkan jaringan overexpressing Target antigen antibodi karena ini bergantung pada ikatan yang bivalen untuk stabil lampiran ke permukaan sel. Zuckier et al.48 menyelidiki pengaruh afinitas dan kepadatan antigen antibodi pada lokalisasi. Dalam penelitian tersebut hanya fragmen Fab afinitas tinggi terikat efektif, independen dari kepadatan antigen. Sebaliknya, antibodi afinitas rendah diperlukan aviditas diberikan oleh bivalenmengikat untuk lampiran yang efektif, yang dapat terjadi hanya jika antigen kepadatan tinggi.

Kami melaporkan hasil yang sama ketika membandingkan mengikat nimotuzumab, cetuximab dan fragmen monovalen yang berhubungan ke berbagai tumor manusia dengan berbagai tingkat EGFR berekspresi. Dalam penelitian kami, cetuximab fragmen Fab terikat semua lini sel terlepas dari tingkat ekspresi EGFR, sedangkan nimotuzumab Fab memiliki mengikat secara signifikan berkurang sel-sel dengan konten EGFR tinggi (≈ 106 molekul / sel). Ketika Kapasitas pengikatan antibodi utuh diuji, cetuximab menunjukkan mengikat konsisten untuk semua lini sel, independen tingkat relatif ekspresi EGFR. Sebaliknya, lereng FMI kurva yang menunjukkan akumulasi nimotuzumab secara signifikan dan positif dipengaruhi oleh peningkatan ekspresi EGFR, sehingga pada media untuk ekspresi EGFR yang tinggi, cetuximab dan nimotuzumab kurva mengikat memiliki lereng yang sama dan dekat satu sama lain. Selain itu, cetuximab dapat mencapai kedua mengikat monovalen dan bivalen sel-sel normal ginjal dan kulit. Namun, kami hanya bisa mendeteksi pengakuan minimal dan reaktivitas sel non-ganas dengan nimotuzumab. Perbedaan ditandai dalam pola pengikatan nimotuzumab dan cetuximab ke sel-sel dari jaringan normal dapat berkontribusi untuk menjelaskan profil toksisitas diferensial mereka. Namun, lebih lanjut dalam percobaan in vitro harus dirancang untuk menentukan efek nimotuzumab pada sel normal. Laporan sebelumnya telah menunjukkan cetuximab yang efisien menghambat in vitro EGFR aktivasi dalam keratinosit epidermal manusia cultures.49

Dari hasil ini, kita bisa memprediksi bahwa nimotuzumab akan memiliki serapan preferensial di overexpressing tumor EGFR, disertai dengan serapan rendah pada jaringan normal (yaitu, kulit dan ginjal) dan akibatnya mengurangi kejadian toksisitas. Hadir penemuan juga menunjukkan sinergi potensi nimotuzumab dengan agen yang meningkatkan ekspresi EGFR, seperti radiasi yang mengandung rejimen. Laporan terbaru memberikan dukungan kepada hipotesis ini. Akashi dan rekan kerja menunjukkan bahwa pengikatan nimotuzumab dan penghambatan berikutnya dari fosforilasi EGFR adalah terdeteksi hanya untuk tumor baris sel dengan tingkat menengah atau tinggi ekspresi EGFR (10 4 reseptor per sel atau lebih tinggi).50 Pada sisi lain, Diaz dan kolaborator menunjukkan superioritas pengobatan gabungan nimotuzumab dan radiasi atas setiap terapi tunggal terhadap glioblastoma menggunakan murine dalam model vivo.51 Dalam laporan terbaru dari multicenter, double blind, uji klinis acak, peningkatan kelangsungan hidup yang signifikan diamati untuk pasien dengan tumor EGFR-positif yang diobati dengan nimotuzumab.5 Masih harus ditunjukkan apakah tingkat ekspresi EGFR merupakan penanda prediktif nimotuzumab ini kemanjuran klinis, berbeda dengan antibodi afinitas tinggi seperti cetuximab, yang telah menunjukkan bahwa tingkat ekspresi EGFR bukan penanda prediktif manfaat klinis.52

Gambar 4. Dalam efek in vitro nimotuzumab dan cetuximab pada sel-sel dengan tingkat ekspresi EGFR yang berbeda. (A) Sel diobati dengan antibody (3.5-3,500 nM) atau fragmen Fab mereka (7-7,000 nM) selama 96 jam. Viabilitas sel diukur dengan MTT assay. Sel yang tidak diobati dimasukkan sebagai maksimum sel titik viabilitas. Persentase sel layak ditentukan dengan menggunakan rumus berikut: [sel diperlakukan Abs540-620 nm / sel yang tidak diobati Abs 540-620 nm] x 100. Setiap titik mewakili rata-rata sumur rangkap tiga. The error bar menunjukkan SD. (B) Sel diobati dengan antibodi (70 nM) atau mereka fragmen Fab monovalen (140 nM) selama 24 jam difiksasi dengan metanol dingin / aseton dan diwarnai dengan PI (400 mg / ml). Persentase sel dengan Fragmentasi DNA (sel apoptosis) dianalisis dengan sitometri. Untuk kedua percobaan garis sel U1906 digunakan sebagai kontrol negatif untuk EGF berekspresi dan fenritenide itu digunakan sebagai kontrol positif dalam apoptosis (data tidak ditampilkan). Salah satu wakil dari tiga percobaan adalah ditunjukkan di setiap kasus.

Gambar 5. Pengaruh antibodi anti-EGFR pada pertumbuhan mapan A431 xenograft Tumor sel diinokulasi subkutan pada tikus SCID. Pengobatan antibodi (1 mg / inokulasi terdiri dari empat suntikan intraperitoneal setiap 48 jam, dimulai pada hari ke 10 setela inokulasi tumor. Kelompok kontrol menerima 1x PBS. Ukuran tumor diukur setiap injeksi hari dan volume ditentukan dengan menggunakan rumus berikut: ½ diameter yang lebih besar x (diameter lebih kecil) .2 Setiap titik mewakili rata-rata empat tikus. The error bar mengindikasikan SD. Salah satu eksperimen wakil dari dua ditampilkan

Ini juga telah dihipotesiskan bahwa interaksi afinitas yang sangat tinggi antara antibodi dan antigen tumor dapat mengganggu penetrasi intra-tumor yang efisien, sehingga merusak dalam penargetan vivo.53 Adams et al.54 melaporkan bahwa sifat intrinsik afinitas mengatur pengiriman kuantitatif antitumor-rantai tunggal Fv (scFv) molekul dari pembuluh darah menjadi massa tumor. Sementara molekul afinitas yang lebih rendah dipamerkan pewarnaan tumor efisien, afinitas yang lebih tinggi molekul scFv tersebut terutama dipertahankan dalam perivaskular tumor daerah. Selain itu, dalam percobaan in vitro telah menunjukkan bahwa ikatan yang bivalen meningkatkan penghambatan proliferasi sel tumor,36,55 EGFR downregulation 21 dan EGFR sinyal penghambatan.20 Kami mengkonfirmasi hasil laporan ini, fragmen Fab monovalen cetuximab berpengaruh anticellular lemah dari cetuximab pada A431 sel. Dengan demikian, bivalen mengikat oleh afinitas antara anti-EGFR antibodi memberikan keuntungan farmakologis.

Sebuah studi sebelumnya juga menunjukkan peningkatan tergantung dosis dalam sirkulasi TGFα sebagai akibat dari gangguan lingkaran autokrin dengan pengobatan cetuximab.56 Membandingkan efek cetuximab dan nimotuzumab pada rilis ligan, kelompok yang sama ditemukan penurunan dalam medium sel akumulasi TGFα ketika MDA-MB-231 sel diinkubasi dengan nimotuzumab dibandingkan dengan cetuximab (Tony Mutsaers, komunikasi pribadi). Perbedaan dalam profil mengikat kedua antibodi terhadap MDA-MB-231, rendah EGFR-mengekspresikan garis sel tumor, membantu menjelaskan perbedaan mencegah internalisasi TGFα. Temuan ini sangatrelevan karena penghambatan tangkap

setempat TGFα oleh EGFR dalam dermis memungkinkan ligan untuk meredakan dan bertindak sebagai faktor chemotactic, seperti yang disarankan oleh Coffey et al.57 Fenomena ini dapat menjelaskan acneiform letusan diamati dengan cetuximab perawatan di mana sel-sel inflamasi telah diamati.

Berdasarkan struktur kristal dari fragmen Fab nimotuzumab dan ekstraseluler wilayah EGFR 58 model komputasi kompleks antara dua molekul adalah dibangun.18 Menurut model ini, nimotuzumab menghambat EGFR EGF-dependent aktivasi, tetapi tidak dapat mengubah keseimbangan basal antara "tertambat" (aktif) dan aktif (siap ligan mengikat dan dimerisasi) konformasi reseptor. Ada beberapa laporan yang menunjukkan adanya aktivasi EGFR ligan-independen pada jaringan normal,59 yang diperlukan untuk kelangsungan hidup sel epitel normal. 60 Mekanisme ini dari menghambat sinyal EGFR yang memungkinkan aktivitas basal EGFR oleh nimotuzumab bisa menjadi faktor lain yang berkontribusi terhadap obat yang profil toksisitas jinak. Temuan klinis terbaru dari Rojo dan kolaborator, yang disebutkan di atas, bisa menunjukkan validitas model ini.40 Namun demikian, eksperimen untuk mendirikan konfirmasi mengikat tepat nimotuzumab terikat EGFR sedang dilakukan.

Dalam Gambar 6 dirangkum pengamatan eksperimental dibahas atas dalam representasi skematis. Ketika ekspresi EGFR sedang sampai tinggi, semua antibodi berperilaku sama dalam mereka mengikat dengan kedua lengan dan terakumulasi untuk gelar serupa. Ketika konsentrasi EGFR rendah, seperti pada jaringan normal, cetuximab terus berinteraksi kuat dengan reseptor. Sebaliknya, interaksi monovalen nimotuzumab bersifat sementara. Model ini akan menjelaskan serapan preferensial nimotuzumab di EGFR tumor mengekspresikan dan profil toksisitas rendah, menyediakan dasar mekanistik untuk sebelumnya mendalilkan "afinitas jendela" hypothesis.4

Singkatnya, kami telah menyediakan elemen untuk memahami interaksi dinamis nimotuzumab dengan reseptor yang normal dan sel-sel tumor. Temuan kami menunjukkan bahwa sifat intrinsik nimotuzumab memerlukan ikatan yang bivalen untuk lampiran stabil, yang mengarah ke nimotuzumab selektif mengikat untuk EGFR sel overexpressing. Ini EGFR-density ketergantungan memungkinkan kita untuk menjelaskan beberapa pengamatan klinis terkait dengan farmakologis perilaku nimotuzumab, khususnya, aktivitas antitumor tanpa kulit parah dan toksisitas ginjal. Kami mengusulkan model bivalen mengikat sebagai penyempurnaan dari sebelumnya "jendela afinitas" hipotesis. Jenis penelitian translasi klinis mungkin memiliki dampak pemberian alasan untuk administrasi kronis antibodi dan kombinasi terapi dengan profil toksisitas yang rendah. Secara khusus, toksisitas membatasi kemampuan untuk bersama-mengelola saat ini disetujui antibodi anti-EGFR dengan terapi konvensional dan agen ditargetkan lain (misalnya, EGFR TKI, antagonis anti-VEGF). Nimotuzumab akan lebih cocok untuk perawatan kombinasi tersebut dan menggabungkan nimotuzumab dengan TKI adalah terutama menarik strategi. Di sisi lain, penelitian ini ditujukan kami

untuk mengevaluasi ekspresi EGFR pada pasien yang diobati dengan nimotuzumab dan, untuk mendefinisikan perannya sebagai penanda prediktif mungkin.

Materi dan Metode

Antibodi dan reagen. Anti-EGFR mAbdari manusia nimotuzumab (h-R3) 24 diperoleh di Pusat Molekuler Imunologi. Anti-EGFR mAb cetuximab (C225), sebuah

bentuk chimeric manusia-tikus dari mouse asli monoclonal 225, awalnya dijelaskan oleh Kawamoto et al.25 diproduksi oleh Merck Pharma GmbH. Antibodi terhadap total EGFR dan

Gambar 6. Skema representasi dari sifat mengikat nimotuzumab sebagai fungsi dari konsentrasi EGFR. Tidak seperti cetuximab, nimotuzumab memerlukan ikatan yang bivalen (dua lengan) untuk lampiran stabil, yang mengarah ke sana selektif mengikat sel-sel mengekspresikan sedang sampai tingkat EGFR yang tinggi. Ketika konsentrasi EGFR rendah, seperti pada jaringan normal, cetuximab terus berinteraksi kuat dengan reseptor. Sebaliknya, interaksi monovalen nimotuzumab bersifat sementara, sehingga hemat jaringan sehat dan menghindari para toksisitas. Ketika ekspresi EGFR sedang sampai tinggi, semua antibodi berperilaku sama dalam bahwa mereka mengikat bivalently, yang merupakan modus yang paling stabil mengikat.

aktin digunakan untuk percobaan western blot dan diperoleh dari Santa Cruz Biotecnology Inc (Santa Cruz Biotechnology). Antibody IgG anti-manusia (Fab tertentu) terkonjugasi untuk FITC (fluorescein iso-tiosianat) dan anti-EGFR ekstraseluler domain manusia digunakan untuk analisis cytometry aliran dan dibeli dari Sigma dan Abcam, masing-masing. Retinoid sintetik fenretinide adalah disediakan oleh Calbiochem. Manusia EGF dibeli dari Pusat Rekayasa Genetika dan Bioteknologi.

Pemurnian fragmen Fab. Nimotuzumab dan fragmen Fab cetuximab yang dihasilkan oleh papain pencernaan. Para mAbs (2 mg / ml) diinkubasi dengan papain (1:100 w: w, Sigma) pada 37 ° C selama 4 jam dan reaksi dihentikan dengan 20 iodoacetamide mM (Sigma). Tercerna mAb dan Fc fragmen dihapus dengan melewatkan campuran oleh-protein Sebuah kolom. The Fab fraksi kemudian didialisis luas terhadap 1x PBS, pH 7,4. Kemurnian Beatles dianalisis dengan 10% SDSPAGE gel.

Jalur sel dan kondisi budaya.

Baris sel berikut yang digunakan pada percobaan: yang A431 karsinoma epidermoid manusia (CRL-1555, ATCC), MDA-MB-231 payudara manusia adenokarsinoma (HTB-26, ATCC), yang U1906 kecil manusia kanker paru-paru sel, 26 yang H125 adenokarsinoma paru-paru manusia dan yang U1810 sel paru cancer.27 baris your manusia non-kecil yang dibudidayakan di DMEM: F12 (Life Technologies) ditambah dengan 10% serum janin sapi (FBS) dan penisilin-streptomisin (Hidup Technologies). Sel ginjal manusia kortikal epitel (HRCE) diperoleh dari Lonza Group dan dipelihara dalam pertumbuhan medium basal sesuai dengan instruksi manufaktur itu.

Persiapan manusia suspensi sel epidermis.

Manusia suspensi sel epidermis (HEC) disusun dari normal kulit (operasi plastik payudara). Untuk memfasilitasi penghapusan epidermis dari dermis, biopsi kulit pertama kali ditempatkan di 0,5% dingin asetat asam selama 48 jam. Sel suspensi diperoleh dari epidermis disc oleh tripsinization (0,3% tripsin pada suhu 37 ° C selama 1 jam), menurut dengan metode yang dijelaskan previously.28 Viabilitas, sebagaimana ditentukan oleh tripan biru pengecualian, adalah > 85%.

Analisis Western blot.

Lisat sel disiapkan dalam Ripa penyangga (1x PBS, 1% Nonidet P-40, 0,5% natrium deoxycholate, 0,1% SDS) dengan 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 5 mM EDTA dan

1 phenylmethylsulphonylfluoride mM yang baru ditambahkan ke larutan lisis sebelum setiap percobaan. Konsentrasi protein ditentukan menurut protein asam bicinchoninic assay kit (Pierce). Ekstrak sel yang diterapkan menjadi 7,5% SDS-PAGE gel dan ditransfer ke membran difluorida polyvinylidine (Gelman). Polyvinylidine membran yang difluorida diblokir dengan NEGT penyangga (0.15 M NaCl, 5 mM EDTA, 500 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,02% Tween 20, 0,04% gelatin) dan diinkubasi dengan antibodi primer dijelaskan di atas. Kandungan protein yang divisualisasikan menggunakan lobak peroksidase-conjugated sekunder antibodi (BD Biosciences) diikuti oleh chemiluminescent Substrat (Pierce). Analisis

aliran cytometry untuk EGFR pengakuan. Permukaan EGFR ekspresi sel tumor manusia baris dianalisis dengan sitometri menggunakan antibodi spesifik dijelaskan di atas. Juga, sel-sel diinkubasi dengan nimotuzumab / mAbs cetuximab (0.218-1,000 nM) atau dengan konsentrasi yang lebih tinggi dua kali lipat nimotuzumab / cetuximab Beatles dari konsentrasi yang digunakan untuk seluruh antibodi diikuti oleh FITC-terkonjugasi IgG anti-manusia (Fab tertentu, 1:200 dilusi). Data diperoleh dengan Arus cytometer FACScan (BD Biosciences) dengan mengumpulkan minimal 10.000 peristiwa dan dianalisis menggunakan perangkat lunak WinMDI. Data dinyatakan sebagai fluoresensi berarti intensitas (FMI).

Permukaan plasmon resonansi.

Kinetika Antibodi mengikat di bawah monovalen (mewakili ekspresi EGFR rendah) dan bivalen (Mewakili ekspresi EGFR tinggi) kondisi yang mengikat diperiksa menggunakan Permukaan plasmon Resonansi (SPR; Biacore 3000). Untuk menguji kondisi ikatan yang bivalen, CM5 permukaan chip yang adalah ditambah dengan Fc-EGFR dimer menggunakan amina primer standar Wizard reaksi kopling. Meningkatnya konsentrasi antibody (Nimotuzumab dan cetuximab) yang mengalir selama 10 menit pada 30 ml / menit diikuti dengan 10 menit disosiasi fase. Monovalen sifat pengikatan antibodi diperiksa dengan kopling cetuximab, dan nimotuzumab ke permukaan CM5 chip menggunakan amina primer standar kopling penyihir reaksi. Meningkatkan konsentrasi EGFR monomer yang mengalir selama 10 menit pada 30 ml / menit diikuti dengan 10 menit disosiasi fase. Normalisasi chip ini dilakukan sesuai Pär Säfsten et al.29 regenerasi Efisien dari kedua permukaan chip yang dicapai dengan menggunakan dua berturut-turut suntikan 10 ml dari 50 mM NaOH. Kinetika dikonfirmasi oleh pas dengan perangkat lunak BiaEvaluation.

Uji viabilitas sel.

A431, H125, U1810, MDA-MB-231 dan U1906 viabilitas sel diukur dengan MTT assay.30 sel Tumor (1 x 104) yang diunggulkan di DMEM: F12 10% FBS di flat-bottomed Piring 96-baik (Costar). Setelah 12 jam, sel-sel beralih ke 1% FBS mengandung EGF manusia (500 pg / ml) dan nimotuzumab / mAbs cetuximab (3.5-3,500 nM) atau nimotuzumab / cetuximab Beatles (7-7,000 nM) ditambahkan, sel-sel diinkubasi selama 48 jam. Pengobatan diulang untuk tambahan 48 jam. Selanjutnya, MTT (1 mg / ml, Sigma) ditambahkan dan diinkubasi selama 4 jam pada suhu 37 ° C. Selanjutnya, kristal formazan yang terbentuk dibubarkan dengan DMSO. Absorbansi Perbedaan 540-620 nm adalah ditentukan menggunakan Sistem pembaca microwell (Organon Teknika). Sel yang tidak diobati dimasukkan sebagai viabilitas sel maksimum titik. Persentase sel layak ditentukan dengan menggunakan rumus berikut: [diperlakukan sel Abs540-620 nm / sel yang tidak diobati Abs540-620 nm] x 100.

Pengukuran apoptosis. Untuk mengukur induksi apoptosis, DNA fragmentasi dievaluasi dengan iodida propidium (PI) staining.31 A431, H125, U1810, MDA-MB-231 dan U1906 sel berlapis (0,25 x 106) di DMEM: F12 10% FBS di 6-baik piring (Costar). Dua belas jam kemudian, nimotuzumab / cetuximab mAbs (70 nM), nimotuzumab / cetuximab Beatles (140 nM) atau fenretinide (15 M) ditambahkan di DMEM: F12 1% FBS mengandung EGF manusia (500 pg / ml) dan sel-sel diinkubasi selama 48 jam. Pengobatan diulang untuk tambahan 48 h. Sel yang tetap dengan metanol dingin / aseton (4:1) dan bernoda dengan

inkubasi dengan larutan yang mengandung 400 mg / ml PI (Sigma) dan 100 mg / ml RNase (Sigma). Semua analisa dilakukan pada FACScan Arus cytometer dengan mengumpulkan minimal 20.000 peristiwa dan dianalisis menggunakan perangkat lunak WinMDI 2.8. Tumor tantangan uji. A431 sel (5 x 106/200 ml 1x PBS) diinokulasi subkutan (sc) ke sayap kanan 6-8 minggu tua parah serta imunodefisiensi (SCID) tikus (berat rata-rata, 23 g). Setelah 10 hari (rata-rata ukuran tumor, 200 mm3) hewan secara acak dipisahkan menjadi tiga kelompok (empat tikus per kelompok): diobati dan nimotuzumab atau cetuximab diobati. Setiap kelompok perlakuan terdiri dari empat intraperitoneal (ip) suntikan 1x PBS (kelompok kontrol) atau mAbs ditunjukkan (1 mg / injeksi) setiap 48 jam. Pengobatan dihentikan setelah total delapan suntikan. Ukuran tumor diukur setiap hari injeksi dan volume ditentukan menggunakan rumus berikut: ½ diameter x lebih besar (lebih kecil diameter) .2

Ucapan Terima Kasih

Kami berterima kasih kepada Dr Ernesto Moreno (Center of Molecular Imunologi) dan Dr Anthony J. Mutsaers (Kesehatan Sunnybrook Sciences Center) untuk tinjauan kritis terhadap naskah.

Catatan kaki

Karya ini didukung oleh YM BioSciences Inc