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INTRACELLULAR GAS SUPERSATURATION TOLERANCESOF ERYTHROCYTES AND RESEALED GHOSTS

B A R B A R A B . H E M M I N G S E N , * N I S A N A . S T E I N B E R G , * AND EDVARD A . H E M M I N G S E N t* D e p a r tm e n t o f M i c r o b i o l o g y , San D i e g o S t a t e U n i v e r s i t y , San D i e g o , C a l i f o r n i a 9 2 1 8 2 ; a n d t T h eP h y s i o l o g i c a l R e s e a r c h L a b o r a t o r y , S c r i p p s I n s t i t u t i o n o f O c e a n o g r a p h y , La J o l l a , C a l i f o r n i a 9 2 0 9 3A BSTR A CT I n t a c t m a m m a l i a n , a v i a n , a n d a m p h i b i a n e r y t h r o c y t e s were s a t u r a t e d w i t h up t o 3 0 0 a tm n i t r o g e n o rargon ga s a n d r a p i d l y d e c o m p r e s s e d . D e s p i t e t h e p r o f u s e n u c l e a t i o n o f ga s b u b b l e s i n t h e s u s p e n d i n g f l u i d , n o e v i d e n c eo f i n t r a c e l l u l a r ga s b u b b l e n u c l e a t i o n wa s f o u n d ; a l l or m o s t o f t h e c e l l s r e m a i n e d i n t a c t a n d l i t t l e or n o h e m o g l o b i ne s c a p e d . I n t e r n a l b u b b l e s were s i m i l a r l y a b s e n t f r o m r e s e a l e d g h o s t s o f human e r y t h r o c y t e s as s h o w n b y l a c k o fd i s i n t e g r a t i o n a n d b y r e t e n t i o n o f a n e n t r a p p e d f l u o r e s c e n t c o m p o u n d . T h e a b s e n c e o f b u b b l e s may i n d i c a t e t h a t m u c ho f t h e i n t e r n a l w a t e r d o e s n o t h a v e t h e same n u c l e a t i o n p r o p e r t i e s a s e x t e r n a l w a t e r .

INTRODUCTIONT h e a b i l i t y o f s i n g l e - c e l l e d e u c a r y o t i c a n d p r o c a r y o t i co r g a n i s m s t o t o l e r a t e r e m a r k a b l y h i g h g a s s u p e r s a t u r a -t i o n s w i t h o u t t h e f o r m a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r b u b b l e s h a sb e e n s h o w n o n l y r e c e n t l y ( H e m m i n g s e n a n d H e m m i n g s e n ,1 9 7 8 ; 1 9 7 9 ; 1 9 8 3 ) . F o r e x a m p l e , s o m e m i c r o o r g a n i s m s ,s u c h a s b a c t e r i a w i t h o u t g a s v e s i c l e s a n d y e a s t , a r e u n a f -f e c t e d b y d e c o m p r e s s i o n f r o m 3 0 0 a t m n i t r o g e n s a t u r a t i o n( H e m m i n g s e n a n d H e m m i n g s e n , 1 9 7 8 ; 1 9 7 9 ; 1 9 8 0 ) e v e nt h o u g h t h e t h r e s h o l d f o r s p o n t a n e o u s h o m o g e n e o u sn u c l e a t i o n o f b u b b l e s i n p u r e w a t e r o r a q u e o u s s o l u t i o n sc o n t a i n e d i n s m a l l g l a s s t u b e s i s o n l y 1 8 0 - 1 9 0 a t m ( H e m -m i n g s e n , 1 9 7 5 ; 1 9 7 8 ) . O t h e r s , s u c h a s T e t r a h y m e n a w i t h -o u t f o o d v a c u o l e s a n d E u g l e n a , a r e a f f e c t e d a n d d a m a g e dt o v a r i o u s d e g r e e s b y t h e s e e x t r e m e g a s s u p e r s a t u r a t i o n s .T h e d a m a g e a p p e a r s t o b e c a u s e d b y e x t e r n a l b u b b l e s o ro t h e r f a c t o r s r a t h e r t h a n i n t r a c e l l u l a r b u b b l e s ; h o w e v e r ,t h e h i g h c o n c e n t r a t i o n o f d i s s o l v e d g a s e s a n d t h e p r e s s u r e sp e r s e d o n o t a p p e a r t o b e i m p o r t a n t ( H e m m i n g s e n a n dH e m m i n g s e n , 1 9 7 9 ; 1 9 8 3 ) . I n o n l y o n e s p e c i a l c a s e i sd a m a g e c l e a r l y c a u s e d b y t h e f o r m a t i o n o f i n t r a c e l l u l a rb u b b l e s , n a m e l y , i n T e t r a h y m e n a w i t h f o o d v a c u o l e s( H e m m i n g s e n a n d H e m m i n g s e n , 1 9 8 3 ) . B y u s i n g a d i r e c tc i n e p h o t o m i c r o g r a p h i c t e c h n i q u e , d e c o m p r e s s i o n f r o m1 7 5 a t m a n d h i g h e r n i t r o g e n s a t u r a t i o n s c a n b e s e e n t op r o d u c e b u b b l e s w i t h i n t h e c e l l s ; t h e i r s u b s e q u e n t r a p i de x p a n s i o n l e a d s t o c e l l d i s i n t e g r a t i o n . When t h e c e l l s a r et r e a t e d t o r e m o v e f o o d v a c u o l e s , n o b u b b l es f o r m w i t h i nt h e m e v e n w i t h n i t r o g e n s a t u r a t i o n s . 2 0 0 a t m .I t a p p e a r s t h e n t h a t r e s i s t a n c e t o t h e f o r m a t i o n o f g a sb u b b l e s i s a p r o p e r t y u n i q u e t o t h e i n t r a c e l l u l a r e n v i r o n -m e n t , o f w h i c h 7 0 - 8 0 % i s w a t e r . T h i s c h a r a c t e r i s t i c o fM r . S t e i n b e r g ' s p r e s e n t a d d r e s s i s t h e D e p a r t m e n t o f B a c t e r i o l o g y ,U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , D a v i s , CA 9 5 6 1 6 .

l i v i n g c e l l s r a i s e s t h e p o s s i b i l i t y t h a t c e l l u l a r w a t e r ma yd i f f e r f r o m e x t e r n a l w a t e r o r w a t e r i n f o o d v a c u o l e s i n i t ss u s c e p t i b i l i t y t o g a s b u b b l e n u c l e a t i o n . W e h a v e a t t e m p t e dt o o b t a i n m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t t h i s p h e n o m e n o n b ye x a m i n i n g e r y t h r o c y t e s , a t y p e o f c e l l t h a t l e n d s i t s e l f t oo s m o t i c m a n i p u l a t i o n a n d f r o m w h i c h g h o s t s c a n b e p r e -p a r e d . S u c h g h o s t s p r e s u m a b l y c o n t a i n f e w e r c e l l u l a rc o m p o n e n t s a n d m o r e w a t e r t h a n i n t a c t e r y t h r o c y t e s . A l s o ,e r y t h r o c y t e s d i f f e r m a r k e dl y f r o m t h e t y p e s o f c e l l s wei n v e s t i g a t e d e a r l i e r b o t h w i t h r e s p e c t t o t h e n a t u r e o f t h ec e l l e n v e l o p e a n d t o t h e i n t r a c e l l u l a r c o m p o s i t i o n a n ds t r u c t u r e .T h e s t a n d a r d p r o c e d u r e s t h a t w e u s e d e a r l i e r ( H e m -m i n g s e n a n d H e m m i n g s e n , 1 9 7 9 ) t o i n du c e g a s s u p e r s a t u -r a t i o n s b y r a p i d d e c o m p r e s si o n w e r e a p p l i e d t o h u m a n ,r a b b i t , c h i c k e n , a n d t o a d e r y t h r o c y t e s , o r t o g h o s t s o fh u m a n e r y t h r o c y t e s s e a l e d i n t h e p r e s e n c e o f t h e f l u o r e s -c e n t c o m p o u n d , d a n s y l - L - g l u t a m a t e . Damage w a s a s s e s s e db y p o s t d e c o m p r e s s i o n e n u m e r a ti o n a n d b y t h e e s c a p e o fh e m o g l o b i n f r o m t h e c e l l s o r o f t h e f l u o r e s c e n t c o m p o u n df r o m t h e g h o s t s .

M A T E R I A L S AND METHODSP r e p a r a t i o n o f E r y t h r o c y t e s

A l l s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r a n d r e a g e n t g r a d ec h e m i c a l s a n d w e r e f i l t e r e d t h r o u g h a f i l t e r ( 1 . 2 - , u m p o r e s i z e ; M i l l i p o r e /C o n t i n e n t a l W a t e r S y s t e m s , B e d f o r d , MA ) t o r e m o v e s u s p e n d e d p a r -t i c l e s . U n l e s s s t a t e d o t h e r w i s e , a l l c e n t r i f u g a t i o n s w e r e a t r o o m t e m p e r a -t u r e f o r 2 m i n a t - 1 , 0 0 0 g .W h o l e b l o o d w a s d r a w n i n t o E D T A ( K 3 ) V a c u t a i n e r s ( B e c t o n -D i c k i n s o n & C o . , R u t h e r f o r d , N J ) f r o m a d u l t h u m a n d o n o r s , 5 - 6 wk o l dNew H a m p s h i r e c h i c k e n s , a n d a d u l t t o a d s ( B u f o m a r i n u s ) . B l o o d f r o ma n a d u l t New Z e a l a n d r a b b i t w a s d r a w n w i t h a 2 6 g a u g e n e e d l e i n t o a3 - m l s y r i n g e c o n t a i n i n g 2 mg E D T A ( N a 2 ) i n 1 m l o f s a l i n e ( 0 . 8 5 %w t / v o l N a C I ) s t e r i l i z e d b y f i l t r a t i o n . W h o l e h u m a n b l o o d w a s u s e d f r e s ho r w a s s t o r e d b e f o r e u s e i n V a c u t a i n e r s f o r u p t o 1 d a t r o o m t e m p e r a t u r e( 1 9 - 2 2 0 C ) o r f o r u p t o 1 wk a t 0 . 2 - 5 0 C . J u s t b e f o r e u s e , 2 m l o f h u m a n

B I O P H Y S . J . B i o p h y s i c a l S o c i e t y * 0 0 0 6 - 3 4 9 5 / 8 5 / 0 4 / 4 9 1 / 0 6 $ 1 . 0 0V o l u m e 4 7 A p r i l 1 9 8 5 4 9 1 - 4 9 6 4 9 1

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b l o o d w a s d i l u t e d w i t h 8 m l o f s a l i n e , t h e c e l l s c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n ,w a s h e d t w o o r t h r e e t i m e s w i t h 1 0 m l s a l i n e , a n d f i n a l l y s u s p e n d e d i n 1 0m l s a l i n e o r i n o n e s e r i e s o f e x p e r i m e n t s t h e s a m e v o l u m e o f s o l u t i o n s o fd i f f e r e n t N a C I c o n c e n t r a t i o n s . C h i c k e n a n d r a b b i t e r y t h r o c y t e s , w a s h e da n d d i l u t e d a s a b o v e , w e r e u s e d i m m e d i a t e l y o r w e r e s t o r e d a t 0 . 2 - 5 0 C f o ru p t o 2 d . S t o r e d c e l l s w e r e w a s h e d a n d r e s u s p e n d e d i n s a l i n e i m m e d i a t e l yb e f o r e u s e . T h e pH o f a r e p r e s e n t a t i v e s u s p e n s i o n w a s 7 . 2 t o 7 . 4 .I m m e d i a t e l y a f t e r c o l l e c t i o n , t o a d b l o o d w a s c e n t r i f u g e d f o r 2 0 - - 3 0 m i n a t- 1 6 0 g ( 2 - 8 C ) i n s e a l e d 2 5 0 , u l N a t e l s o n c a p i l l a r y t u b e s w i t h o u ta n t i c o a g u l a n t o r , i f t h e v o l u m e e x c e e d e d 4 m l , i n a s i n g l e 1 5 - m l c e n t r i f u g et u b e . A f t e r t h e e r y t h r o c y t e s w e r e p o o l e d , e n o u g h s t e r i l e E a g l e ' s m i n i m a le s s e n t i a l m e d i u m (MEM) ( m o d i f i e d A u t o - P O W , F l o w L a b o r a t o r i e s ,M c L e a n , V A ) c o n t a i n i n g a d d ed s o di u m b i c a r b o n a t e ( 0 . 2 8 m g / m l ) a n df e t a l c a l f s e r u m ( 1 0% v o l / v o l ) ( f r e e z i n g p o i n t d e p r e s s i o n - 0 . 5 1 O C ) w a sa d d e d t o r e p l a c e t h e t o a d s e r u m ( f r e e z i n g p o i n t d e p r e s s i o n a b o u t - 0 . 5 5 0 )a n d t h e s u s p e n s i o n h e l d a t - 5 0 C f o r u p t o 2 4 h . B e f o r e u s e , 1 - 2 m l o f t h i ss u s p e n s i o n w a s d i l u t e d t o 1 0 m l w i t h s a l i n e , t h e c e l l s w a s h e d t w o o r t h r e et i m e s w i t h t h e s a m e v o l u m e a n d f i n a l l y s u s p e n d e d i n 4 m l s a l i n e o rs o l u t i o n s o f d i f f e r e n t N a C l c o n c e n t r a t i o n s . S u s p e n s i o n s o f t h e n u c l e a t e de r y t h r o c y t e s w e r e m i x e d b y g e n t l e i n v e r s i o n o f t h e t u b e s .

P r e p a r a t i o n o f S e a l e d G h o s t sT h e g h o s t s w e r e p r e p a r e d a c c o r d i n g t o a m o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d o fJ o h n s o n ( 1 9 7 5 ) f r o m h u m a n e r y t h r o c y t e s w i t h i n 2 4 h o f c o l l e c t i o n . T h ee r y t h r o c y t e s w e r e w a s h e d t h r e e t i m e s a t r o o m t e m p e r a t u r e i n 5 mM T r i sH C I , pH 7 . 4 ; 1 4 0 mM N a C I ; a n d 1 mM E D T A , a n d t h e n s u s p e n d e d i n 1 0o r 8 0 t i m e s ( S t a r o s e t a l . , 1 9 7 4 ) t h e p e l l e t v o l u m e i n c o l d h e m o l y z i n gb u f f e r ( 5 mM T r i s H C l , pH 7 . 4 ; 7 mM N a C l ; 1 mM E D T A ) . T h e g h o s t sw e r e w a s h e d t h r e e t i m e s i n t h e s a m e v o l u m e o f c o l d h e m o l y z i n g b u f f e ra n d p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 0 C f o r 3 0 m i n a t 1 0 , 0 0 0 g o r 2 0 m i n a t1 4 , 6 0 0 0 g . T h e d e n s e r e d b u t t o n u n d e r n e a t h t h e g h o s t p e l l e t w a s r e m o v e da f t e r e a c h w a s h ( J o h n s o n , 1 9 7 5 ) . P e l l e t s w e r e s u s p e n d e d b y g e n t l ei n v e r s i o n o f t h e t u b e s t o m i n i m i z e t r a u m a . T h e u n s e a l e d g h o s t s w e r e t h e nw a s h e d t w i c e m o r e i n h e m o l y z i n g b u f f e r w i t h o u t EDTA.

T h e p e l l e t f r o m t h e f i n a l w a s h w a s s u s p e n d e d i n 9 m l o f 5 mMT r i s - H C I , pH 7 . 4 ; 1 4 0 mM N a C l ; 1 0 m g / m l d a n s y l - L - g l u t a m i c a c i d( S i g m a C h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , MO) a n d i n c u b a t e d a t 3 2 . 5 - 3 8 0 C f o r 3h w i t h g e n t l e m i x i n g b y i n v e r s i o n f o u r o r f i v e t i m e s . T h e s e a l e d g h o s t sw e r e w a s h e d i n c o l d s u s p e n s i o n b u f f e r ( 5 mM T r i s - H C I , p H 7 . 4 ; 1 4 0 mMN a C I ) u n t i l t h e c o n c e n t r a t i o n o f d a n s y l - L - - g l u t a m i c a c i d i n t h e s u p e r n a -t e n t w a s 0 . 0 5 t o 0 . 1 , u g / m l . T h i s p r o c e d u r e y i e l d e d a p e l l e t w i t h a v o l u m eo f - 0 . 5 m l t h a t w a s s u s p e n d e d t o 6 - 7 m l w i t h f r e s h s u s p e n s i o n b u f f e r a n ds t o r e d o n i c e f o r u p t o 7 h b e f o r e u s e .

E x p e r i m e n t a l M e t h o d sA l l e x p e r i m e n t s w e r e d o n e a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 1 9 - 2 2 0 C ) . F or e ac he x p e r i m e n t , 2 m l o f w a s h e d a n d r e s u s p e n d e d b l o o d c e l l s o r 1 m l o f t h eg h o s t p r e p a r a t i o n w a s p l a c e d i n t o e a c h o f t w o 8 m l o r 5 m l b e a k e r s ,r e s p e c t i v e l y , a n d s t i r r e d m a g n e t i c a l l y a t - 2 3 0 r p m . A l i q u o t s o f b l o o d c e l l sw e r e r e m o v e d a n d d i l u t e d 1 x 1 0 ' t o 8 x 1 0 ' i n s a l i n e a n d n u m b e r sd e t e r m i n e d w i t h a C o u l t e r c o u n t e r ( m o d e l B ; C o u l t e r E l e c t r o n i c s ,C h i c a g o , I L ) . T h e e x p e r i m e n t a l s u s p e n s i o n w a s r a p i d l y c o m p r e s s e d t oe l e v a t e d n i t r o g e n o r a r g o n p r e s s u r e s a n d e q u i l i b r a t e d f o r 3 0 m i n a sp r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( H e m m i n g s e n a n d H e m m i n g s e n , 1 9 7 9 ) ; t h i s e q u i l i -b r a t i o n t i m e i s t w o t o t h r e e t i m e s t h a t n e c e s s a r y t o s a t u r a t e t h es u s p e n d i n g l i q u i d , a n d h e n c e t h e c e l l s , w i t h g a s ( s e e A p p e n d i x ) . T h ec o n t r o l s u s p e n s i o n w a s m a i n t a i n e d i n t h e d a r k i n room a i r a n d s t i r r e d a tt h e s a m e r a t e . W i t h i n 1 0 m i n a f t e r r a p i d ( - 0 . 7 - 1 . 5 s ) d e c o m p r e s s i o n , c e l lc o u n t s w e r e p e r f o r m e d . T h e c o n t e n t s r e m a i n i n g i n e a c h b e a k e r wered i v i d e d a p p r o x i m a t e l y e q u a l l y . O n e p o r t i o n was c e n t r i f u g e d a n d t h es u p e r n a t a n t a s s a y e d f o r h e m o g l o b i n b y t h e c y a n m e t h e m o g l o b i n t e c h -n i q u e ( K i t N o . 5 2 5 - A ; S i g m a C h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , M O ) . T h e o t h e rw a s f r o z e n a n d t h a w e d a t l e a s t t w i c e ( 3 - 5 t i m e s f o r a m p h i b i a n c e l l s ) top r o d u c e c o m p l e t e h e m o l y s i s , a n d t o t a l h e m o g l o b i n was d e t e r m i n e d . T h ea m o u n t o f h e m o g l o b i n l o s t b y c o n t r o l a n d e x p e r i m e n t a l e r y t h r o c y t es u s p e n s i o n s w a s c a l c u l a t e d u s i n g a s t a n d a r d c u r v e p r e p a r e d w i t h human

h e m o g l o b i n f o r t h e m a m m a l i a n c e l l s , a n d o n e p r e p a r e d w i t h p i g e o nh e m o g l o b i n f o r t h e a v i a n a n d a m p h i b i a n c e l l s .

G h o s t s n u m b e r s w e r e f o u n d b y d i l u t i n g a l i q u o t s I x 1 0 - 4 i n f r e s hs u s p e n s i o n b u f f e r b e f o r e c o u n t i n g w i t h t h e C o u l t e r c o u n t e r ( C o u l t e rE l e c t r o n i c s ) . A t t h e e n d o f t h e e x p e r i m e n t s , t h e c o n t e n t s o f t h e c o n t r o la n d e x p e r i m e n t a l b e a k e r s w e r e d i v i d e d i n h a l f . O n e s e t w a s c e n t r i f u g e d a sb e f o r e a n d t h e a m o u n t o f f l u o r e s c e n t l a b e l i n t h e s u p e r n a t a n t f o u n d b yp l a c i n g 2 0 0 , l i n v i r g i n b o r o s i l i c a t e g l a s s t u b e s ( 1 2 x 7 5 mm) c o n t a i n i n g4 . 8 m l 9 5 % e t h a n o l , e x c i t i n g a t 3 5 0 n m , a n d m e a s u r i n g f l u o r e s c e n c e a t5 0 0 n m w i t h a T u r n e r 4 3 0 s p e c t r o f l u o r o m e t e r (AMSCO I n s t r u m e n tC o m p a n y , C a r p e n t e r i a , C A ) . T h e o t h e r s e t w a s f r o z e n a n d t h a w e d f i v et i m e s t o r e l e a s e a l l o f t h e f l u o r e s c e n t l a b e l . T h e c o n c e n t r a t i o n o fd a n s y l - L - g l u t a m i c a c i d r e l e a s e d w a s d e t e r m i n e d b y r e f e r e n c e t o s t a n d a r dc u r v e s p r e p a r e d f o r e a c h b a t c h o f r e s e a l i n g s o l u t i o n . R e l e a s e b y t h e g h o s t se x p o s e d t o g a s s u p e r s a t u r a t i o n s a n d t h e c o n t r o l g h o s t s w a s c a l c u l a t e d a sp e r c e n t a g e o f t h e t o t a l l a b e l i n t h e f r e e z e / t h a w l y s a t e .

R E SU LT SA l l o f t h e e r y t h r o c y t e s w e r e u n a f f e c t e d b y d e c o m p re s s i o nf r o m n i t r o g e n s a t u r a t i o n s o f 1 7 5 - 2 0 0 a t m ( F i g . 1 ) . W i t hh i g h e r s a t u r a t i o n s , s o m e o f t h e c h i c k e n a n d t o a d e r y t h r o -c y t e s s u s t a i n e d d a m a g e a s i n d i c a t e d b y a d e c r e a s e i n c e l ln u m b e r a n d l o s s o f h e m o g l o b i n t o t h e s u s p e n d i n g f l u i d ,w h i l e l i t t l e o r n o d a m a g e o f t h e m a m m a l i a n e r y t h r o c y t e sw a s a p p a r e n t . M o s t e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d w i t h 3 0 0a t m n i t r o g e n s a t u r a t i o n s , w h e r e t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e nt h e t w o e r y t h r o c y t e t y p e s w e r e m o s t p r o n o u n c ed . T h el a r g e r , n u c l e a t e d e r y t h r o c y t e s f r o m c h i c k e n s a n d t o a d sw e r e s o m e w h a t l e s s t o l e r a n t t o t h e h i g h e r s u p e r s a t u r a t i o n st h a n w e r e t h e m a m m a l i a n o n e s ; - 2 0 % o f t h e c e l l s d i s a p -p e a r e d a n d t h e a m o u n t o f h e m o g l o b i n t h a t a p p e a r e d i n t h es u s p e n d i n g f l u i d r e f l e c t e d t h e d e g r e e o f c e l l d i s i n t e g r a t i o n .T h e m a m m a l i a n e r y t h r o c y t e s w e r e n o t o b v i o u s l y a l t e r e d i na p p e a r a n c e i n t h e p h a s e - c o n t r a s t m i c r o s c o p e b y e x p o s u r et o a n y o f t h e n i t r o g e n s u p e r s a t u r a t i o n s . H o w e v e r , t h es u r f a c e o f s o m e o f t h e n u c l e a t e d c e l l s a p p e a r e d w r i n k l e d ,p a r t i c u l a r l y a f t e r d e c o m p r e s s i o n f r o m 3 0 0 a t m n i t r o g e n ,a n d s o m e d e b r i s , c h i e f l y c e l l - f r e e n u c l e i a n d n u c l e i s u r -r o u n d e d b y m e m b r a n e s , w a s p r e s e n t .

B e c a u s e a r g o n i s m o r e s o l u b l e i n w a te r t h a n n i t r o g e na n d h a s a l o w e r b u b b l e - n u c l e a t i o n t h r e s h o l d ( H e m m i n g s -e n , 1 9 7 7 ) , w e a l s o e x p o s e d h u m a n a n d t o a d e r y t h r o c y t e s t oh i g h a r g o n s u p e r s a t u r a t i o n s . Human c e l l s w e r e a s t o l e r a n ta s w h e n e x p o s e d t o t h e s a m e n i t r o g e n s u p e r s a t u r a t i o n s ;f r e s h l y c o l l e c t e d t o a d e r y t h r o c y t e s s h o w e d a b o u t t h e s a m er a n g e o f s t a b i l i t y a s i n t h e e x p e r i m e n t s w i t h n i t r o g e n ( d a t an o t s h o w n ) . I n s e p a r a t e e x p e r i m e n t s , t o a d a n d h u m a ne r y t h r o c y t e s w e r e s a t u r a t e d w i t h n i t r o g e n u s i n g a s l o w ,s t e p w i s e c o m p r e s s i o n p r o c e d u r e ( H e m m i n g s e n a n d Hem-m i n g s e n , 1 9 7 9 ) w i t h 8 m i n p a u s e s f o r e q u i l i b r a t i o n o v e r2 . 5 h . A f t e r 2 0 m i n a t t h e f i n a l s a t u r a t i o n p r e s s u r e o f 2 0 0a t m , t h e c e l l s w e r e r a p i d l y d e c o m p r e s s e d ; l i t t l e o r n od a m a g e w a s n o t e d ( d a t a n o t s h o w n ) .I n a s e r i e s o f e x p e r i m e n t s , h u m a n a n d t o a d e r y t h r o c y t e sw e r e s u s p e n d e d i n h y p o t o n i c s a l i n e s o l u t i o n s j u s t b e f o r ee q u i l i b r a t i o n a t 3 0 0 a t m n i t r o g e n . W i t h d e c r e a s i n g N a C lc o n c e n t r a t i o n t h e r e w a s l i t t l e r e l e a s e o f h e m o g l o b i n f r o mhuman e r y t h r o c y t e s i n b o t h t h e e x p e r i m e n t a l a n d c o n t r o l

B I O P H Y S I C A L J O U R N A L VOLUME 4 7 1 9 8 59 2

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3/6

100806040

I 20c X a o)

c 1 0 0 -00_a )0E

6 0 -0E 4 0

40

2 0 2 0c oE

8 01 0 0 -4 0

2 0 r

M AMM A L SR = R a b b i t , H = HumanH n

175 2

a2

A225~ R

2 5 C

TOAD

I175 2 00 225 250Gas s a t u r a t i o n ( A T M )

A R275 300

3

2 75 300

F I G U R E 1 E x p o s u r e o f m a m m a l i a n , a v i a n , a n d a m p h i b i a n e r y t h r o c y t e st o v a r i o u s n i t r o g e n s a t u r a t i o n s f o l l o w e d b y r a p i d d e c o m p r e s s i o n . U n c o m -p r e s s e d c o n t r o l s u s p e n s i o n s s h o w e d l i t t l e o r n o d e c r e a s e i n c e l l n u m b e r o rr e l e a s e o f h e m o g l o b i n . T h e n u m b e r o f e x p e r i m e n t s i s g i v e n o n t h e b a r s ,a n d t h e r a n g e o f d a t a i s s h o w n b y t h e l i n e s . A l l b a r s i n a c l u s t e r r e p r e s e n tr e s u l t s o b t a i n e d w i t h t h e g a s s a t u r a t i o n g i v e n b e l o w . C e l l n u m b e r s r a n g e df r o m 7 t o 1 1 x 1 0 8 / m l f o r a n u c l e a t e d e r y t h r o c y t e s a n d 1 t o 4 x 1 0 8 / m lf o r n u c l e a t e d o n e s .s u s p e n s i o n s u n t i l t h e N a C l c o n c e n t r a t i o n r e a c h e d 0 . 4 %( F i g . 2 ) . F r a g m e n t a t i o n o f t h e c e l l s w a s n o t o b s e r v e d u n t i lt h e N a C l c o n c e n t r a t i o n d r o p p e d t o 0 . 3 % ( d a t a n o t s h o w n ) ;t h e s a m e d e g r e e o f c e l l d i s a p p e a r a n c e w a s f o u n d i n b o t ht h e c o n t r o l a n d e x p e r i m e n t a l s u s p e n s i o n s . T o a d e r y t h r o -c y t e s e x p o s e d t o h y p o t o n i c s o l u t i o n s w e r e g e n e r a l l y n om o r e a f f e c t e d b y e x p o s u r e t o 3 0 0 a t m n i t r o g e n s u p e r s a t u -r a t i o n t h a n c e l l s s u s p e n d e d i n 0 . 8 5 % N a C l ( d a t a n o ts h o w n ) .W a s h e d g h o s t s p r e p a r e d b y l y s i n g h u m a n e r y t h r o c y t e si n 1 0 v o l o f h y p o t o n i c b u f f e r w i t h E D T A a n d s e a l e d i n t h ep r e s e n c e o f d a n s y l - L - g l u t a m a t e , w e r e n o t a f f e c t e d b y a n yo f t h e n i t r o g e n o r a r g o n s u p e r s a t u r a t i o n s u s e d ( T a b l e I ) . I nt h e f i r s t s e r i e s o f e x p e r i m e n t s , t h e g h o s t s w e r e m o s t l ys p h e r e s ( 4 - 5 . 5 , u m i n d i a m e te r ) w i th s o m e d i s k a n d c u p

Ca 10)a )a .

0 . 5 0 . 6 0 . 7N a C I c o n c e n t r a t i o n ( P e r c e n t ) 0 . 9

F I G U R E 2 S u s p e n s i o n o f h u m a n e r y t h r o c y t e s i n h y p o t o n i c s o l u t i o n s a n de x p o s u r e t o 3 0 0 a t m n i t r o g e n s a t u r a t i o n f o l l o w e d b y r a p i d d e c o m p r e s s i o n .A l l b a r s i n a c l u s t e r r e p r e s e n t r e s u l t s o b t a i n e d a t t h e N a C I c o n c e n t r a t i o ng i v e n b e l o w . C e l l c o n c e n t r a t i o n s r a n g e d f r o m 7 . 7 t o 2 1 x 1 0 8 / m l .s h a p e s . I n t h e s e c o n d s e r i e s , m o r e d i s k - a n d c u p - s h a p edg h o s t s w e r e p r e s e n t a n d t h e s p h e r e s w e r e l a r g e r ( - 8 0 %w e r e 5 - 6 . 8 ,m i n d i a m e t e r , w i t h a f e w 8 ,m i n d i a m e t e r ) .T h e p e l l e t s w e r e a l w a y s w h i t e , i n d i c a t i n g t h e d e p l e t i o n o fh e m o g l o b i n . G h o s t s f r o m b o t h p r e p a r a t i o n s b e c a m ei n c r e a s i n g l y l e a k y w i t h t i m e b u t r e l e a s e o f t h e f l u o r e s c e n tl a b e l w a s e s s e n t i a l l y t h e s a m e i n t h e c o m p r e s s e d a n du n c o m p r e s s e d p r e p a r a t i o n s . A f t e r d e c o m p r e s s i o n , m o s t o ft h e g h o s t s r e m a i n e d a n d c o u l d b e s e e n i n t h e m i c r o s c o p ea n d c o u n t e d b y t h e C o u l t e r c o u n t e r . A f e w e x p e r i m e n t sw e r e p e r f o r m ed u s i n g w a s h e d g h o s t s p r e p a r e d b y l y s i n gh u m a n e r y t h r o c y t e s i n 8 0 v o l o f t h e h y p o t o n i c b u f f e r , ap r o c e d u r e t h a t i s s u p p o s e d t o r e m o v e m o r e o f t h e c y t o -p l a s m ( S t a r o s e t a l . , 1 9 7 4 ) . T h e r e s u l t s w e r e e s s e n t i a l l y t h es a m e a s t h o s e r e p o r t e d i n T a b l e I . T h e t h r e s h o l d f o rs p o n t a n e o u s n u c l e a t i o n o f a r g o n b u b b l e s i n t h e s a l i n e a n di n t h e s u s p e n s i o n b u f f e r c o n t a i n i n g d a n s y l - L - g l u t a m a t e ,w a s c h e c k e d b y a m e t h o d u s i n g g l a s s t u b i n g ( H e m m i n g s -e n , 1 9 7 5 ) , a n d w a s f o u n d t o b e i d e n t i c a l t o t h e t h r e s h o l d f o rp u r e w a t e r a n d o t h e r a q u e o u s s o l u t i o n s ( d a t a n o t s h o w n ) .I n a l l o f t h e e x p e r i m e n t s w i t h e r y t h r o c y t e s , b o t hu n s t r e s s e d a n d o s m o t i c a l l y s t r e s s e d , a n d w i t h g h o s t s ,e x p e r i m e n t a l p r e p a r a t i o n s w e r e e x a m i n e d a t a m a g n i f i c a -t i o n o f 1 , 0 0 0 w i t h a p h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p e w i t h i n 1 . 5m i n a f t e r d e c o m p r e s s i o n ; u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s a b u b b l e- 0 . 5 , u m i n d i a m e t e r c a n b e r e s o l v e d . I n n o c a s e w e r ei n t e r n a l g a s b u b b l e s o b s e r v e d ; n o b u b b l es w e r e a s s o c i a t e dw i t h a n y o f t h e d e b r i s .

DISCUSSIONO u r r e s u l t s s h o w t h a t t h e i n t r a c e l l u l a r e n v i r o n m e n t o fa n u c l e a t e m a m m a l i a n e r y t h r o c y t e s i s r e s i s t a n t t o g a sb u b b l e f or m a ti o n e v e n w h e n s u b j e c t e d t o s u c h e x t r e m en i t r o g e n a n d a r g o n s u p e r s a t u r a t i o n s t h a t p r o f u s e , s p o n t a -n e o u s n u c l e a t i o n o f b u b b l e s o c c u r s i n t h e e x t e r n a l w a t e r .Had b u b b l e s n u c l e a t e d i n t r a c e l l u l a r l y , t h e i r i n e v i t a b l ee x p a n s i o n w o u l d h a v e p r o d u c e d d a m a g e , i . e . , l e a k a g e o fh e m o g l o b i n i n t o t h e s u s p e n d i n g f l u i d a n d d e s t r u c t i o n o f

HEMMINGSEN E T A L . G a s S u p e r s a t u r a t i o n o f E r y t h r o c y t e s a n d G h o s t s

-1

UN go ' .- 7

4 9 3

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4/6

T AB LE IHUMAN ERYTHROCYTE G H O S T S R EMAINING AND R E L E A S E OF INCO RPO RAT ED DANSYL-L-GLUTAMIC ACIDA FT E R S A T UR A T IO N W ITH G AS AND RAPID DECOMPRESSION

P e r c e n t o f d a n s y l - L - g l u t a m i c a c i d r e l e a s e d tP e r c e n t o fg h o s t s r e m a i n i n g a f t e r s t i r r i n gE q u i l i b r a t i o n T i m e s i n c e a f t e r w i t h o u t a f t e rG a s p r e s s u r e l a s t w a s h d e c o m p r e s s i o n * c o m p r e s s i o n d e c o m p r e s s i o n

a t m hS e r i e s N o . IN 2 3 0 0 0 . 5 9 6 1 9 2 0

N 2 2 5 0 5 . 0 9 6 2 8 3 0N 2 3 0 0 7 . 0 9 6 4 2 3 7

S e r i e s N o . 2Ar 3 0 0 1 . 0 8 2 3 5 4 4A r 2 5 0 3 . 0 8 8 5 0 5 0N 2 3 0 0 6 . 0 9 2 5 2 6 6

* T h e c o n c e n t r a t i o n o f g h o s t s r a n g e d f r o m 2 . 6 t o 4 . 9 x 1 0 8 / m l . T h e r e w a s n o d e c r e a s e i n n u m b e r o f g h o s t s a f t e r s t i r r i n g i n a i r a t I a t m a m b i en tp r e s s u r e .t D a n s y l - L - g l u t a m i c a c i d r e l e a s e d i s g i v e n a s a p e r c e n t o f t h e t o t a l p r e s e n t i n t h e s a m p l e . I n s e r i e s N o . 1 , t h e t o t a l a m o u n t o f d a n s y l - L - g l u t a m i c a c i dp r e s e n t r a n g e d f r o m 1 . 1 8 t o 1 . 3 1 g g / m l . I n s e r i e s N o . 2 , t h e t o t a l r a n g e d f r o m 2 . 2 9 t o 2 . 4 0 , u g / m l .t h e c e l l s , a s h a s b e e n s h o w n w i t h c i l i a t e s ( H e m m i n g s e na n d H e m m i n g s e n , 1 9 8 3 ) .T h e a b s e n c e o f b o t h h o m o g e n e o u s a n d h e t e r o g e n e o u sn u c l e a t i o n o f b u b b l e s i n t h e e r y t h r o c y t e s s t r e n g t h e n s o u re a r l i e r s u g g e s t i o n , b a s e d o n r e s u l t s w i t h o t h e r t y p e s o fc e l l s , t h a t b u b b l e s d o n o t n u c l e a t e b e c a u s e o f t h e p a r t i c u l a rp h y s i c a l c o n d i t i o n s t h a t e x i s t i n t h e i n t r a c e l l u l a r e n v i r o n -m e n t . T h e l a c k o f h e t e r o g e n e o u s n u c l e a t i o n i s s t r i k i n gg i v e n t h e l a r g e n u m b e r o f i n t e r f a c e s , b o t h h y d r o p h i l i c a n dh y d r o p h o b i c , t h a t e x i s t i n c y t o p l a s m . I n s i m p l e r a q u e o u ss y s t e m s , t h e p r e s e n c e o f s o l i d i n t e r f a c e s t e n d s t o f a c i l i t a t et h e h e t e r o g e n e o u s n u c l e a t i o n o f b u b b l e s , p a r t i c u l a r l y i ft h e s e s u r f a c e s a r e h y d r o p h o b i c i n c h a r a c t e r ( G e r t h a n dH e m m i n g s e n , 1 9 8 0 ) . Y e t , i n c y t o p l a s m , t h e b u b b l e n u c l e a -t i o n t h r e s h o l d a p p e a r s t o e x c e e d t h a t o f h o m o g e n e o u sn u c l e a t i o n i n s o l u t i o n s . P e r h a p s s u c h i n t e r f a c e s a r e i n t h ei n t r a c e l l u l a r e n v i r o n m e n t c o a t e d w i t h s u r f a c t a n t s t h a tp r o v i d e a t r a n s i t i o n l a y e r b e t w e e n t h e i n t e r f a c e a n d w a t e r .T h e s e l a y e r s w o u l d p r e v e n t d i r e c t c o n t a c t o f t h e w a t e r w i t ht h e h y d r o p h o b i c s u r f a c e s a n d t h e r e b y p r e v e n t b u b b l en u c l e a t i o n .T h e m e r e p r e s e n c e o f d i s s o l v e d s o l u t e s i n t h e c e l l u l a rw a t e r , a n d t h e r e s u l t i n g d e c r e a s e d g a s s o l u b i l i t y , i n c r e a s e dv i s c o s i t y , a n d d e c r e a s e d s u r f a c e t e n s i o n o f t h e l i q u i d w o u l dn o t m a r k e d l y a f f e c t t h e t h r e s h o l d f o r h o m o g e n e o u s b u b b l en u c l e a t i o n a s s t u d i e s w i t h a q u e o u s s o l u t i o n s o f e l e c t r o l y t e sa n d s u r f a c t a n t s h a v e s h o w n ( H e m m i n g s e n , 1 9 7 8 ) . T h el a c k o f b u b b l e s s t r o n g l y i n d i c a t e s t h a t t h e q u a n t i t y o fi n t r a c e l l u l a r w a t e r w i t h n o r m a l n u c l e a t i o n p r o p e r t i e s i si n s u f f i c i e n t t o a l l o w t h e n u c l e a t i o n p r o c e s s t o o c c u r . S u c hi n s u f f i c i e n c y may c o m e a b o u t i n t h r e e w a y s : ( a ) T h e t o t a lv o l u m e o f i n t r a c e l l u l a r w a t e r may b e t o o s m a l l t o p e r m i tb u b b l e n u c l e a t i o n . ( b ) T h e t o t a l v o l u m e may b e l a r g ee n o u g h b u t i t i s s o s u b d i v i d e d b y t h e v a r i o u s c o m p o n e n t s o ft h e c y t o p l a s m i c m a t r i x ( W e i n s t e i n , 1 9 7 4 ; W o l o s e w i c k a n d

P o r t e r , 1 9 7 9 ; B r i n k l e y , 1 9 8 1 ) t h a t o n l y s u b c r i t i c a l p o o l sa r e p r e s e n t . ( c ) T h e w a t e r p r e s e n t i s m o s t l y a s s o c i a t e d w i t hm a c r o m o l e c u l e s a n d s u c h b o u n d o r o r d e r e d w a t e r ma y b el e s s l i k e l y t o u n d e r g o t h e s p o n t a n e o u s s t r u c t u r a l r u p t u r et h a t m u s t o c c u r f o r b u b b l e n u c l e a t i o n .A l t h o u g h a d e f i n i t i v e a s s e s s m e n t o f e a c h o f t h e s ep o s s i b i l i t i e s c a n n o t y e t b e m a d e , i t a p p e a r s t h a t a t t h eh i g h e s t g a s s u p e r s a t u r a t i o n s u s e d i n o u r e x p e r i m e n t s t h et o t a l v o l u m e o f w a t e r w i t h i n t h e e r y t h r o c y t e s i s w e l l a b o v et h e c r i t i c a l v o l u m e n e c e s s a r y f o r h o m o g e n e o u s n u c l e a t i o no f b u b b l e s . B a s e d i n p a r t o n d a t a p u b l i s h e d e l s e w h e r e

( H e m m i n g s e n , 1 9 7 7 ; 1 9 7 8 ) , t h e n u c l e a t i o n d e n s i t y f o rb u b b l e s i n b u l k w a t e r ma y b e e s t i m a t e d f r o m c i n e m i c r o -g r a p h i c r e c o r d i n g s m a d e d u r i n g d e c o m p r e s s i o n f r o m a r g o ns a t u r a t i o n p r e s s u r e s o f u p t o 2 0 2 a t m . B u b b l e s b e g i n t on u c l e a t e s p o n t a n e o u s l y i n t h e w a t e r a t - 1 5 0 a t m a n d t h en u m b e r o f b u b b l e s p e r v o l u m e u n i t i n c r e a s e s w i t h i n c r e a s -i n g g a s s u p e r s a t u r a t i o n s . F r o m 1 7 0 t o 2 0 0 a t m a r g o ns u p e r s a t u r a t i o n s , t h e n u m b e r i n c r e a s e s g r a d u a l l y b y a b o u ta f a c t o r o f 1 0 p e r 1 0 a t m i n c r e a s e i n s u p e r s a t u r a t i o n ,r e a c h i n g 1 0 7 b u b b l e s / c m 3 a t 2 0 0 a t m . A s s u m i n g t h a t as i m i l a r r a t e o f i n c r e a s e a l s o o c c u r s i n a p r e s s u r e r a n g ea b o v e 2 0 0 a t m , w e may e x t r a p o l a t e t h a t 1 0 1 0 b u b b l e s / c m 3o r 1 b u b b l e / 1 0 0 , m 3 w i l l n u c l e a t e a t 2 3 0 a t m a r g o n . T h u s ,w i t h a r g o n s u p e r s a t u r a t i o n s o f 2 3 0 a t m , a t l e a s t 1 b u b b l ec a n b e e x p e c t e d t o n u c l e a t e i n a v o l u m e o f w a t e r c o r r e -s p o n d i n g t o t h e v o l u m e o f t h e human e r y t h r o c y t e ( 9 4 I m 3 )a n d m o r e b u b b l e s i n t h e l a r g e r ( A n d r e w , 1 9 6 5 ) n u c l e a t e de r y t h r o c y t e s . E l e v a t e d s a t u r a t i o n p r e s s u r e s s u c h a s t h e 2 5 0a n d 3 0 0 a t m a r g o n w e h a v e t e s t e d w i t h human e r y t h r o -c y t e s w o u l d d r a m a t i c a l l y i n c r e a s e t h e n u m b e r o f b u b b l e sn u c l e a t i n g i n t h e s e v o l u m e s ; y e t n o s i g n i f i c a n t r e l e a s e o fh e m o g l o b i n w a s a p p a r e n t . A t e q u i v a l e n t n i t r o g e n s u p e r s a -t u r a t i o n s , t h e n u m b e r o f b u b b l e s f o r m e d p e r v o l u m e u n i tw o u l d b e s m a l l e r b e c a u s e t h i s g a s h a s a h i g h e r n u c l e a t i o n

B I O P H Y S I C A L J O U R N A L VOLUME 4 7 1 9 8 59 4

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t h r e s h o l d i n w a t e r a n d s o l u t i o n s ( H e m m i n g s e n , 1 9 7 8 ) .N e v e r t h e l e s s , t h e v o l u m e s o f t h e e r y t h r o c y t e s a n d t h ep r o c a r y o t i c a n d e u c a r y o t i c c e l l s w e h a v e e x a m i n e d a r ew i t h i n t h e m i n i m u m v o l u m e s r e q u i r e d f o r h o m o g e n e o u sn u c l e a t i o n o f n i t r o g e n a n d a r g o n b u b b l e s .T h e e x t e n t o f t h e i n c r e a s e i n i n t r a c e l l u l a r g a s s u p e r s a t u -r a t i o n t o l e r a n c e r e l a t i v e t o t h a t o f b u l k w a te r c a nn o t b ee s t i m a t e d d u e t o t h e d r a i n a g e o f s o m e g a s f r o m t h e c e l l sa f t e r t h e n u c l e a t i o n o f e x t r a c e l l u l a r b u b b l e s i n t h e l a t e rp h a s e s o f d e c o m p r e s s i o n ( H e m m i n g s e n a n d H e m m i n g s e n ,1 9 7 9 ; 1 9 8 0 ) . T h e h a l f - t i m e f o r g a s d i f f u s i o n e q u i l i b r i u m t ob e e s t a b l i s h e d b e t w e e n t h e e r y t h r o c y t e s a n d t h e e x t e r i o rw a t e r i s s i m i l a r ( R o u g h t o n , 1 9 5 9 ; F o r s t e r , 1 9 6 4 ) t o t h eh a l f - t i m e f o r t h e f a s t e s t d e c o mp r e s s i o ns u s e d b y u s , - 0 . 1 s .T h e r e f o r e , a g a s s u p e r s a t u r a t i o n o f a t l e a s t t e n s o f a t m o -s p h e r e s h i g h e r t h a n t h e n u c l e a t i o n t h r e s h o l d f o r w a t e r i sg e n e r a t e d i n t r a c e l l u l a r l y d u ri n g d e c o m pr e s s i o n s f r o m t h eh i g h e s t e q u i l i b r a t i o n p r e s s u r e s u s e d .T h e i n t r a c e l l u l a r r e s i s t a n c e o f e r y t h r o c y t e s t o b u b b l en u c l e a t i o n i s m a i n t a i n e d w h e n s o m e w a t e r i s a d d e d o s m o t i -c a l l y a n d e v e n w h e n s e a l e d g h o s t s a r e p r e p a r e d . T h u s , i ta p p e a r s t h a t g h o s t s ma y n o t b e s i m p l e m e m b r a n e - b o u n dv e s i c l e s t h a t c o n t a i n w a t e r a n d s o l u t e s b u t may r e t a i ne n o u g h o f t h e i r o r i g i n a l i n t e r n a l m a c r o m o l e c u l a r c o n s t i t u -e n t s t o a f f e c t t h e n u c l e a t i o n p r o p e r t i e s o f t h e e n t r a p p e ds o l u t i o n .

F a r t o o l i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e c r i t i c a l v o l u m e o f l i q u i dr e q u i r e d f o r g a s b u b b l e n u c l e a t i o n o r a b o u t t h e i n t e r n a lo r g a n i z a t i o n o f e r y t h r o c y t e s o r o t h e r c e l l s t o d e c i d ew h e t h e r t h e o b s e r v e d s t a b i l i t y o f t h e i n t r a c e l l u l a r e n v i r o n -m e n t i s t h e r e s u l t o f t h e s u b d i v i s i o n o f t h e w a t e r i n t os u b c r i t i c a l p o o l s o r i s a t t r i b u t a b l e t o t h e a s s o c i a t i o n o f m o s to f t h e w a t e r w i t h c e l l c o n s t i t u e n t s . W h i l e a l l i n v e s t i g a t o r sa g r e e t h a t s o m e w a t e r i s c a p t u r e d b y m a c r o m o l e c u l e s a sw a t e r o f h y d r a t i o n , s o m e ( e . g . , L i n g , 1 9 7 9 ; F u l t o n , 1 9 8 2 )a r g u e t h a t m u c h o f t h e c e l l u l a r w a t e r i s m o r e o r d e r e d t h a ni s b u l k w a t e r ; o t h e r i n v e s t i g a t o r s a r g u e a g a i n s t t h i s v i e w( e . g . , F i n c h , 1 9 7 9 ) . W e d o n o t k n o w i f w a t e r s t r u c t u r e d b y

1 0 --c0

C u 3-U )

c LC )0 -0 .

h y d r a t i o n o r b y a s s o c i a t i o n w i t h c e l l c o n s t i t u e n t s h a sa l t e r e d n u c l e a t i o n p r o p e r t i e s , b u t i n v i e w o f t h e f a c t t h a tt h e n u c l e a t i o n b e h a v i o r o f b u l k w a t e r i s a l t e r e d n e a r i t sf r e e z i n g p o i n t ( H e m m i n g s e n , 1 9 7 5 ) a n d i n t h e p r e s e n c e o fh i g h c o n c e n t r a t i o n s o f w a t e r s t r u c t u r i n g s o l u t e s ( e . g . , Mga n d N a ) ( H e m m i n g s e n , 1 9 7 8 ) , w e w i s h t o s p e c u l a t e t h a tt h i s i s t h e c a s e a n d t h a t o u r p r e s e n t r e s u l t s ( a s w e l l a s t h o s ef r o m e a r l i e r s t u d i e s , e . g . , ( H e m m i n g s e n a n d H e m m i n g s e n ,1 9 7 9 ; 1 9 8 0 ; 1 9 8 1 ; 1 9 8 3 ) may r e f l e c t e x t e n s i v e s t r u c t u r i n ga n d s t a b i l i z a t i o n o f c e l l w a t e r .A f r a c t i o n o f t h e n u c l e a t e d a v i a n a n d a m p h i b i a ne r y t h r o c y t e s w e r e d a m a g e d u p o n e x p o s u r e t o t h e h i g h e s tg a s s u p e r s a t u r a t i o n s u s e d i n o u r e x p e r i m e n t s . A l t h o u g h f o rt h i s c e l l t y p e i t c a n n o t b e e x c l u d e d t h a t b u b b l e s ma y h a v en u c l e a t e d i n t r a c e l l u l a r l y , t h i s s e e m s u n l i k e l y b e c a u s e , a f t e rd e c o m p r e s s i o n , b u b b l e s w e r e c o n s p i c u o u s l y a b s e n t i n t h er e m a i n i n g i n t a c t c e l l s , i n c e l l s w i t h v a r i o u s d e g r e e s o fd a m a g e , a n d i n c e l l f r a g m e n t s . T h e s e o b s e r v a t i o n s a r e i nc o n t r a s t t o t h o s e m a d e o n T e t r a h y m e n a a f t e r d e c o m p r e s -s i o n f r o m g a s s a t u r a t i o n p r e s s u r e s o f 2 5 0 a t m a n d a b o v e , ap r o c e d u r e t h a t p r o d u c e s i n t e r n a l b u b b l e s , p r o v i d e d t h ec e l l s c o n t a i n f o o d v a c u o l e s ( H e m m i n g s e n a n d H e m m i n g s -e n , 1 9 8 3 ) . I n n e i t h e r s y s t e m i s t h e d a m a g e d u e t o f a c t o r si n h e r e n t i n t h e e x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e o t h e r t h a n e x t r e m eg a s s u p e r s a t u r a t i o n , b e c a u s e t h e c e l l s a r e n o t a f f e c t e d b y as l o w , s t e p w i s e r e l e a s e o f p r e s s u r e ( d a t a n o t s h o w n ) , ap r o c e d u r e t h a t p r e v e n t s t h e f o r m a t i o n a n d g r o w t h o fe x t e r n a l b u b b l e s a n d p o t e n t i a l i n t e r n a l b u b b l e s . D i r e c tp h o t o m i c r o g r a p h i c e v i d e n c e f o r t h e a b s e n c e o f i n t e r n a lb u b b l e s i n t h e n u c l e a t e d e r y t h r o c y t e s c a n n o t b e o b t a i n e db e c a u s e a t t h e d a m a g i n g s a t u r a t i o n p r e s s u r e s l a r g e num-b e r s o f e x t e r n a l b u b b l e s o b s c u r e t h e e v e n t s t h a t ma y b et a k i n g p l a c e w i t h i n t h e c e l l s . W e c o n s i d e r i t m o s t l i k e l yt h a t t h e d a m a g e i s d u e t o f o r c e s e x e r t e d b y t h e e x t e r n a lb u b b l e s o n t h e p l a s m a m e m b r a n e s . T h e l a r g e s i z e o f t h en u c l e a t e d e r y t h r o c y t e s a n d t h e g r e a t e r r i g i d i t y o f t h e i rp l a s m a m e m b r a n e s ( W a u g h a n d E v a n s , 1 9 7 6 ) m a y p l a y ar o l e i n t h e i r s u s c e p t i b i l i t y t o e x t e r n a l b u b b l e s . T h e a n u -

_______________ 1 0 0 ) o oC o '

80 .200 Xc u04 0 F

200 C )

- A /M i n u t e s

F I G U R E 3 E q u i l i b r a t i o n w i t h a i r o f o x y g e n - d e p l e t e d s o l u t i o n s a n d e r y t h r o c y t e s u s p e n s i o n s a s a f u n c t i o n o f t i m e . Th e c e l l s o f T e t r a h y m e r ap y r i f o r m i s w e r e s u s p e n d e d i n 2 m l L L s a l t s ( H e m m i n g s e n a n d H e m m i n g s e n , 1 9 8 3 ) , c o m p r e s s e d t o 2 0 0 a tm w i t h n i t r o g e n , a n d d e c o m p r e s s e da t t h e t i m e s i n d i c a t e d .HEMMINGSEN E T A L . G a s S u p e r s a t u r a t i o n o f E r y t h r o c y t e s a n d G h o s t s 4 9 5

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c l e a t e d e r y t h r o c y t e s a p p e a r t o b e m o r e r e s i s t a n t t o d a m a g eb y e x t e r n a l b u b b l e s t h a n t h e n u c l e a t e d e r y t h r o c y t e s a n da l s o m a n y o f t h e s p e c i e s w i t h o u t c e l l w a l l s w e h a v ee x a m i n e d p r e v i o u s l y . T h e h u m a n e r y t h r o c y t e m e m b r a n es k e l e t o n ( G r a t z e r , 1 9 8 1 ; M a r c h e s i , 1 9 8 3 ) p r o b a b l ye n a b l e s t h e c e l l s u r f a c e t o w i t h s t a n d t h e m e c h a n i c a l a n ds u r f a c e t e n s i o n f o r c e s t h a t a r e l i k e l y g e n e r a t e d b y t h ef o r m a t i o n a n d g r o w t h o f b u b b l e s a d j a c e n t t o i t ; c e r t a i n l y ,r e c e n t s t u d i e s s u g g e s t t h a t t h i s s k e l e t o n a i d s i n p r o t e c t i n gt h e e r y t h r o c y t e s a g a i n s t s h e a r f o r c e s w i t h i n t h e c i r c u l a t o r ys y s t e m ( M o h a n d a s e t a l . , 1 9 8 2 ) .

APPENDIXA t t h e r e q u e s t o f t h e r e v i e w e r s , w e a r e p r e s e n t i n g d a t a ( F i g . 3 ) t o s h o wt h a t u n d e r o u r e x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e s t h e e r y t h r o c y t e s a n d g h o s t s a r ef u l l y g a s e q u i l i b r a t e d i n t h e t i m e w e a l l o w . S a l i n e ( 0 . 8 5 % N a C I ) ,s u s p e n s i o n s o f e r y t h r o c y t e s i n s a l i n e ( o x y g e n c a p a c i t y 1 0 . 5 v o l % ) , a n dh e m o l y z e d e r y t h r o c y t e s i n s a l i n e ( s a m e o x y g e n c a p a c i t y ) w e r e d eo x y g e -n a t e d b y e q u i l i b r a t i o n w i t h h e l i u m a t a t m o s p h e r i c p r e s s u r e f o r a t l e a s t 1h . D e o x y g e n a t i o n w a s v e r i f i e d b y m e a s u r i n g p o l a r o g r a p h i c a l l y t h e o x y -g e n t e n s i o n o f t h e l i q u i d w i t h a m i c r o o x y g e n e l e c t r o d e . Two m i l l i l i t e r s o fl i q u i d w e r e t h e n p l a c e d i n o u r e x p e r i m e n t a l b e a k e r s a n d e q u i l i b r a t e d w i t ha i r a t 1 a t m u s i n g o u r s t a n d a r d s t i r r i n g s p e e d . T h e o x y g e n t e n s i o n o f t h el i q u i d s w a s m e a s u r e d a s a f u n c t i o n o f t i m e a f t e r s t a r t o f a i r e q u i l i b r a t i o n .T h e c u r v e s a r e d r a w n t h r o u g h t h e m e a n s o f t w o s e t s o f e x p e r i m e n t s w i t he a c h l i q u i d . T h e p r e s e n c e o f h e m o g l o b i n c a u s e s a d e l a y i n t h e e q u i l i b r a -t i o n d u e t o t h e a d d e d q u a n t i t y o f g a s t h a t m u s t b e t a k e n u p . A t f u l l a i rs a t u r a t i o n , t h e c o n t e n t o f t h e o x y g e n b o u n d t o h e m o g l o b i n i s t w e n t y t i m e st h a t i n p h y s i c a l s o l u t i o n i n a l l o f t h e l i q u i d . T h i s h i g h o x y g e n c a p a c i t y w a su s e d t o d r a m a t i z e t h e e f f e c t o f a l a r g e g a s s i n k o n t h e e q u i l i b r a t i o n . T h ed i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s u s p e n s i o n s o f i n t a c t c e l l s a n d h e mo l y z ed c e l l sr e f l e c t s t h e d i f f u s i o n r e s i s t a n c e a c r o s s t h e c e l l b o u n d a r y ( F o r s t e r , 1 9 6 4 a ) ,a n d p r o b a b l y a v i s c o s i t y e f f e c t .

A b o u t 5 x 1 0 5 c e l l s p e r m l o f t h e c i l i a t e T e t r a h y m e n a p y r i f o r m i ss t r a i n G L , w h i c h a r e m u c h l a r g e r t h a n h u m a n e r y t h r o c y t e s , w e r ee q u i l i b r a t e d w i t h n i t r o g e n . G a s b u b b l e s w i l l f o r m w i t h i n t h e s e c e l l s w h e nt h e y a r e e q u i l i b r a t e d w i t h a t l e a s t 1 7 5 a t m n i t r o g e n a n d r a p i d l y d e c o m -p r e s s e d ; t h e e x p a n d i n g g a s b u b b l e s d i s i n t e g r a t e t h e c e l l s ( H e m m i n g s e n ,1 9 8 2 ; H e m m i n g s e n a n d H e m m i n g s e n , 1 9 8 3 ) . T h e c i l i a t e s a p p e a r t o b ef u l l y n i t r o g e n e q u i l i b r a t e d a f t e r 1 5 m i n , b e c a u s e e x p o s u r e f o r 3 0 o r 6 0m i n d o e s n o t s i g n i f i c a n t l y c h a n g e t h e n u m b e r s o f d i s i n t e g r a t e d c e l l s .

As w o u l d b e e x p e c t e d f r o m e a r l i e r s t u d i e s ( e . g . , F o r s t e r , 1 9 6 4 a , b ) ,t h e s e e x p e r i m e n t s s h o w t h a t c e l l s i n c o n t a c t w i t h g a s s a t u r a t e d s o l u t i o n sa r e f u l l y g a s e q u i l i b r a t e d i n t h e t i m e a l l o w e d b y o u r e x p e r i m e n t a lp r o t o c o l .W e t h a n k A . S t e p h e n Dahms f o r t h e h e l p f u l s u g g e s t i o n s t h a t a i d e d u s i nt h e p r e p a r a t i o n o f t h e d a n s y l - L - g l u t a m a t e - l o a d e d g h o s t s . W e a l s o t h a n kR o g e r A . S a b b a d i n i , E r i c M . R u n t e , a n d Pa m W i l e y f o r t h e i r h e l p i no b t a i n i n g s p e c i m e n s .T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d i n p a r t b y g r a n t H L 1 6 8 5 5 t o E . A . H e m m i n g s e nf r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h .R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 9 F e b r u a r y 1 9 8 4 a n d i n f i n a l f o r m 1 8 O c t o b e r1 9 8 4 .

R E F E R E N C E SA n d r e w , W. 1 9 6 5 . C o m p a r a t i v e H e m a t o l o g y . G r u n e & S t r a t t o n , I n c . ,New Y o r k . 1 8 8 p p .

B r i n k l e y , B . R . 1 9 8 1 . S u m m a r y : O r g a n i z a t i o n o f t h e c y t o p l a s m . C o l dS p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . X L V I : 1 0 2 9 - 1 0 4 0 .F i n c h , E . D . 1 9 7 9 . N u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e s t u d i e s o f t h e s t a t e o fw a t e r a n d i o n s i n a q u e o u s c y t o p l a s m . I n T h e A q u e o u s C y t o p l a s m . A .D . K e i t h , e d i t o r . M a r c e l D e k k e r , I n c . , New Y o r k . 6 1 - 8 9 .F o r s t e r , R . E . 1 9 6 4 a . R a t e o f g a s u p t a k e b y r e d c e l l s . V o l . I . R e s p i r a t i o n .I n H a n d b o o k o f P h y s i o l o g y . W. 0 . F e n n a n d H . R a h n , e d i t o r s .A m e r i c a n P h y s i o l o g i c a l S o c i e t y , W a s h i n g t o n , D C . 8 2 7 - 8 3 7 .F o r s t e r , R . E . 1 9 6 4 b . D i f f u s i o n o f g a s e s . V o l . I . R e s p i r a t i o n . H a n d b o o k o fP h y s i o l o g y . W. 0 . F e n n a n d H . R a h n , e d i t o r s . A m e r i c a n P h y s i o l o g i c a lS o c i e t y , W a s h i n g t o n , D C . 8 3 9 - 8 7 2 .F u l t o n , A . B . 1 9 8 2 . How c r o w d e d i s t h e c y t o p l a s m ? C e l l . 3 0 : 3 4 5 - 3 4 7 .G e r t h , W. A . , a n d E . A . H e m m i n g s e n . 1 9 8 0 . H e t e r o g e n e o u s n u c l e a t i o n o fb u b b l e s a t s o l i d s u r f a c e s i n g a s - s u p e r s a t u r a t e d a q u e o u s s o l u t i o n s . J .C o l l o i d I n t e r f a c e S c i . 7 4 : 8 0 - 8 9 .G r a t z e r , W. B . 1 9 8 1 . T h e r e d c e l l m e m b r a n e a n d i t s c y t o s k e l e t o n .B i o c h e m . J . 1 9 8 : 1 - 8 .

H e m m i n g s e n , B . B . , a n d E . A . H e m m i n g s e n . 1 9 7 8 . T o l e r a n c e o f b a c t e r i at o e x t r e m e g a s s u p e r s a t u r a t i o n s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n .8 5 : 1 3 7 9 - 1 3 8 4 .

H e m m i n g s e n , B . B . , a n d E . A . H e m m i n g s e n . 1 9 8 0 . R u p t u r e o f t h e c e l le n v e l o p e b y i n d u c e d i n t r a c e l l u l a r g a s p h a s e e x p a n s i o n i n g a s v a c u o l a t eb a c t e r i a . J . B a c t e r i o l . 1 4 3 : 8 4 1 - 8 4 6 .H e m m i n g s e n , B . B . , a n d E . A . H e m m i n g s e n . 1 9 8 3 . I n t r a c e l l u l a r b u b b l ef o r m a t i o n : d i f f e r e n c e s i n g a s s u p e r s a t u r a t i o n t o l e r a n c e s b e t w e e n

T e t r a h y m e n a a n d E u g l e n a . J . P r o t o z o o l . 3 0 : 6 0 8 - 6 1 2 .H e m m i n g s e n , E . A . 1 9 7 5 . C a v i t a t i o n i n g a s - s u p e r s a t u r a t e d s o l u t i o n s . J .A p p l . P h y s i c s . 4 6 : 2 1 3 - 2 1 8 .H e m m i n g s e n , E . A . 1 9 7 7 . S p o n t a n e o u s f o r m a t i o n o f b u b b l e s i n g a s -s u p e r s a t u r a t e d w a t e r . N V a t u r e ( L o n d . ) . 2 6 7 : 1 4 1 - 1 4 2 .H e m m i n g s e n , E . A . 1 9 7 8 . E f f e c t s o f s u r f a c t a n t s a n d e l e c t r o l y t e s o n t h en u c l e a t i o n o f b u b b l e s i n g a s - s u p e r s a t u r a t e d s o l u t i o n s . Z . N a t u r f o r s c h .

3 3 a : 1 6 4 - 1 7 1 .H e m m i n g s e n , E . A . 1 9 8 2 . C i n e p h o t o m i c r o g r a p h i c o b s e r v a t i o n s o n i n t r a -c e l l u l a r b u b b l e f o r m a t i o n i n T e t r a h y m e n a . J . E x p . Z o o l . 2 2 0 : 4 3 - 4 8 .H e m m i n g s e n , E . A . , a n d B . B . H e m m i n g s e n . 1 9 7 9 . L a c k o f i n t r a c e l l u l a r

b u b b l e f o r m a t i o n i n m i c r o o r g a n i s m s a t v e r y h i g h g a s s u p e r s a t u r a t i o n s .J . A p p I . P h y s i o l . R e s p i r . E n v i r o n . E x e r c i s e P h y s i o l . 4 7 : 1 2 7 0 - 1 2 7 7 .J o h n s o n , R . M . 1 9 7 5 . K i n e t i c s o f r e s e a l i n g o f w a s h e d e r y t h r o c y t e g h o s t s .J . M e m b r . B i o l . 2 2 : 2 3 1 - 2 5 3 .L i n g , G . N . 1 9 7 9 . T h e p o l a r i z e d m u l t i l a y e r t h e o r y o f c e l l w a t e r a n d o t h e rf a c e t s o f t h e a s s o c i a t i o n - i n d u c t i o n h y p o t h e s i s c o n c e r n i n g t h e d i s t r i b u -t i o n o f i o n s a n d o t h e r s o l u t e s i n l i v i n g c e l l s . I n T h e A q u e o u s C y t o p l a s m .A . D . K e i t h , e d i t o r . M a r c e l D e k k e r , I n c . , New Y o r k . 2 3 - 6 0 .

M a r c h e s i , V . T . 1 9 8 3 . T h e r e d c e l l m e m b r a n e s k e l e t o n : r e c e n t p r o g r e s s .B l o o d . 6 1 : 1 - 1 1 .M o h a n d a s , N . , M . R . C l a r k , B . P . H e a l t h , M. R o s s i , L . C . W o l f e , S . E .

L u x , a n d S . B . S h o h e t . 1 9 8 2 . A t e c h n i q u e t o d e t e c t r e d u c e d m e c h a n i c a ls t a b i l i t y o f r e d c e l l m e m b r a n e s : r e l e v a n c e t o e l l i p t o c y t i c d i s o r d e r s .B l o o d . 5 9 : 7 6 8 - 7 7 4 .R o u g h t o n , F . J . W. 1 9 5 9 . D i f f u s i o n a n d s i m u l t a n e o u s c h e m i c a l r e a c t i o nv e l o c i t y i n h a e m o g l o b i n s o l u t i o n s a n d r e d c e l l s u s p e n s i o n s . P r o g .B i o p h y s . B i o p h y s . C h e m . 9 : 5 5 - 1 0 4 .S t a r o s , J . V . , B . E . H a l e y , a n d F . M . R i c h a r d s . 1 9 7 4 . Human e r y t h r o c y t e s

a n d r e s e a l e d g h o s t s . A c o m p a r i s o n o f m e m b r a n e t o p o l o g y . J . B i o l .C h e m . 2 4 9 : 5 0 0 4 - 5 0 0 7 .W a u g h , R . , a n d E . A . E v a n s . 1 9 7 6 . V i s c o e l a s t i c p r o p e r t i e s o f e r y t h r o c y t em e m b r a n e s o f d i f f e r e n t v e r t e b r a t e a n i m a l s . M i c r o v a s c . R es . 1 2 : 2 9 1 -3 0 4 .W e i n s t e i n , R . S . 1 9 7 4 . T h e m o r p h o l o g y o f a d u l t r e d c e l l s . I n T h e R e dB l o o d C e l l . D . N . S u r g e n o r , e d i t o r . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , New Y o r k .2 1 3 - 2 6 8 .

W o l o s e w i c k , J . J . , a n d K . R . P o r t e r . 1 9 7 9 . M i c r o t r a b e c u l a r l a t t i c e o f t h ec y t o p l a s m i c g r o u n d s u b s t a n c e . A r t i f a c t o r r e a l i t y . J . C e l l B i o l . 8 2 : 1 1 4 -1 3 9 .

496 B I O P H Y S I C A L JOURNAL VOLUME 4 7 1 9 8 5