Biología Molecular de la Piel - Ramiro Esteban Lorente

AdminCarrera de Especialización en Dermatología

MODULO I Año 2010

Biología Molecular de la Piel

Carrera de Especialización en Dermatología

Directora: Prof. Dra. Ana María Lorenz

MODULO I Año 2010

Autor: Dr. Ramiro E. Lorente

FACULTAD DE MEDICINA - UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN

“…the minute you let her under your skin

then you begin to make it better…”

Paul McCartney

Biología Molecular de la Piel | 2

Ilustración de tapa: Microfotografía electrónica de una Célula de Langerhans en migración.

CONTENIDO

INTRODUCCION 4

HISTORIA DE LA BIOLOGIA MOLECULAR 5

LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 8

EPIDERMIS 8LA MEMBRANA BASAL 15UNIONES INTERCELULARES 17CÉLULAS NO KERATINOCÍTICAS DE LA EPIDERMIS. 19DERMIS 22PROTEÍNAS DE LA MATRIZ EXTRACELULAR 22COMPONENTES CELULARES DE LA DERMIS 24HIPODERMIS 25

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR UTILIZADAS EN DERMATOLOGÍA 27

PROCESAMIENTO DEL TEJIDO 27REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA 28SECUENCIAMIENTO DE ADN 29TRANSCRIPCIÓN - REVERSA PCR (RT-PCR) 30WESTERN BLOT 31MICROARRAY 32PROTEÓMICA CON ESPECTROMETRÍA DE MASA 34MODELOS DE ANIMALES TRANSGÉNICOS

35RATONES TRANSGÉNICOS 35

CONCLUSIONES 37

AGRADECIMIENTOS 38

BIBLIOGRAFÍA 38

Referencias Bibliográficas 38

Biología Molecular de la Piel | 3

INTRODUCCIONEl término Biología Molecular fue

introducido por Warren Weaver que se desempeñaba como Director de la Sección de Ciencias Naturales de la Fundación Rockefeller en un reporte de 1938:

“...y gradualmente está llegando una nueva rama de la ciencia – Biología Molecular – que está comenzando a dejar al descubierto muchos secretos concernientes a la unidad fundamental de la célula viviente….donde técnicas modernas están siendo usadas para investigar cada vez mas detalles minúsculos de ciertos procesos vivientes”1;

También podemos citar la opinión que W. Astbury tiene sobre biología molecular:

"...no tanto una técnica como un enfoque, un enfoque desde el punto de vista de las llamadas ciencias básica con la idea principal de la búsqueda por debajo de las manifestaciones a gran escala de la biología clásica para el plan molecular correspondiente. Le preocupan particularmente las formas de las moléculas biológicas y es predominantemente tridimensional y estructural - lo que no significa, sin embargo, que no es más que un refinamiento de la morfología - debe indagar al mismo tiempo en la génesis y función”2;

Una mejor explicación acerca del origen del término, viene de lo que dice Francis Crick sobre porque

comenzó a llamarse a sí mismo biólogo molecular:

“…me vi forzado a mi mismo a llamarme biólogo molecular porque cuando un clérigo inquisidor me preguntó acerca de lo que había hecho, me cansé de explicarle que era una mezcla de cristalógrafo, biofísico, bioquímico y genetista, una explicación que en cada caso encontraba muy difícil de entender…”3.

El Human Genome Project da la siguiente definición de biología molecular: “Es el estudio de la estructura, función y composición de moléculas biológicamente importantes”4.

Este trabajo se ocupará primero del desarrollo de la biología molecular, y luego en describir la estructura de la piel haciendo énfasis en los componentes moleculares de importancia.

Biología Molecular de la Piel | INTRODUCCION 4

HISTORIA DE LA BIOLOGIA MOLECULAR

Al principio del siglo XX el campo de la genética estaba regulado por las leyes Mendelianas de Segregación y de Segregación Independiente5, pero los procesos de reproducción génica, mutación y expresión eran desconocidos. Thomas H. Morgan crea un equipo de investigación que toma a la mosca de la fruta (Drosophila) como modelo para estudiar la relación entre los genes y los cromosomas en el proceso hereditario6,7. Un estudiante de Morgan, Hermann J. Müller, reconoce en los genes las bases para la vida, y direcciona su trabajo para investigar su estructura, descubre que los rayos x tenían efectos mutagénicos en la mosca Drosophila y utiliza este fenómeno para estudiar el tamaño y naturaleza de los genes. A pesar de los grandes avances de Müller, este reconoce que no puede extender su investigación al nivel de explicar las propiedades fundamentales de los genes y sus acciones. En un ensayo publicado 1936 dice: “El genetista por sí mismo es inútil para analizar nuevas propiedades (en los genes). Aquí los físicos, así como los químicos deben dar un paso adentro. ¿Quién será voluntario para hacerlo?.8.

En la siguiente década mucho físicos famosos mostraron atención por la biología, más específicamente por la herencia biológica, en 1944 el físico Erwin Schrödinger publico “What

is life?” (¿Qué es la vida?)9, proponiendo de una manera entusiasta como la física cuántica podría explicar la estabilidad, incluso la mutabilidad de los genes10, reducía los genes a la física especulando con cristales aperiódicos involucrados en la codificación de la herencia. Muchos científicos jóvenes físicos y biólogos se vieron fuertemente influenciados por este libro, llevándolos a considerar nuevas direcciones en la investigación, lo que años más tarde tendría gran influencia en la Biología Molecular.

Biología Molecular de la Piel | HISTORIA DE LA BIOLOGIA MOLECULAR 5

Otro físico famoso interesado por la biología era Max Delbrueck discípulo del físico cuántico Neil Börh, quien como su maestro buscaban en contraparte con Schödinger no buscaban explicar los procesos biológicos reduciéndolos a fenómenos físicos sino entendiendo como cada disciplina podía complementar a la otra.

Figura 1 – Max Delbrueck y Salvador Luria

Delbrueck visitó el laboratorio de moscas de Müller, pero considero que la Drosophila era demasiado compleja para descifrar los mecanismos de auto reproducción (característica única de los seres vivos) y prefirió utilizar a los bacteriófagos (bacteriophages) como objeto de investigación, creando al inicio de la década de 1940 junto con Salvador Luria “The Phage Group” marcando un punto muy importante en el desarrollo de la biología molecular.

En un famoso experimento llevado a cabo por Hershey, A.D. y Marta Chase prueban que los genes no estaban compuestos por proteínas sino por ácido desoxirribonucleico11.

Delbrueck facilitaba la colaboración entre biólogos y físicos pero era esquivo a los detalles químicos que tendían puentes entre las dos disciplinas. Fue Linus Pauling un colega de Delbrueck del Cal Tech quien al contrario de este utilizó sus conocimientos en química estructural para estudiar la estructura de las macromoléculas. Su trabajo en la teórica de los enlaces químico facilitó el entendimiento sobre la estabilidad de grandes macromoléculas. Este concepto abarca tanto a las proteínas como a los ácidos nucleicos y era un requisito para poder estudiar su estructura. Pauling utilizo cristalografía por rayos x y sumado a la construcción de modelos a escala, descubre la estructura alfa helicoidal de las proteínas y eventualmente propone un modelo para la estructura del ADN12. James Watson era un estudiante de Luria del “Phage Group” que reconoció la necesidad de utilizar cristalografía para poder llegar a la estructura del ADN, y Francis Crick un físico que inspirado por Erwin Schrödinger se volvo hacia la biología y contribuyo en la teoría de la cristalografía por rayos x. Estos dos científicos coincidieron en el Laboratorio Cavendish de la Universidad de Cambridge y trabajaron en conjunto utilizando datos de cristalografía de rayos x de ADN aportados por Maurice Wilkins y Rosalind Franklin del King's College de Londres para crear un modelo de la


estructura helicoidal doble del ADN que fue finalmente publicada en 195313, lo que trajo aparejado el comienzo del periodo clásico de la Biología Molecular.

Figura 2 – James Watson y Francis Crick

Ya con la estructura del ADN en la mano, los biólogos moleculares centraron su atención en dilucidar los mecanismos de la función y reproducción genética. Se puso énfasis en tratar de secuenciar el código genético. Los primeros pasos fueron secuenciando proteínas la primera fue la de Insulina a final de los años ’50, y durante las dos décadas siguientes se fueron desarrollando y mejorando técnicas de secuenciación. Además de las técnicas de secuenciación, hubo aportes importantísimos desde la inmunología con el desarrollo de anticuerpos monoclonales, (trabajo que le valió el premio Nobel a César Milstein en 1984), de inestimable valor para el desarrollo de nuevas técnicas de biología molecular.

Figura 3 - César Milstein

Con el desarrollo de la técnica de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa en Inglés) hacia 1985 por Kary Mullis14, se dio impulso a un programa desarrollado por el Departamento de Energía y el Instituto Nacional de Salud de los EEUU para secuenciar el genoma humano y estudiar el impacto de la radiación de las bombas de Hiroshima y Nagasaki sobre el genoma humano. De éste proyecto derivo el más conocido como “El Proyecto Genoma Humano”, que se vio envuelto en muchas controversias entre el consorcio internacional de centros de secuenciación y las compañías privadas avocadas a la misma tarea en una especie de carrera genética. La secuencia del genoma en bruto fue publicada hacia 200115, marcando un antes y un después en la biología molecular.


LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR

La piel humana está dividida en dos capas primarias, la epidermis o capa externa y la dermis o capa interna. Estas dos capas están separadas por una estructura llamada membrana basal. Debajo de la dermis hay una capa de tejido conectivo laxo, llamada hipodermis o tejido celular subcutáneo, que se continúa en profundidad con la capa de tejido graso. La piel de un adulto promedio cubre aproximadamente un área de 2 m2.

Desde el nacimiento a la madurez, el área de la piel se extenderá siete veces. Puede llegar a pesar hasta el 15% del peso total del cuerpo adulto16, es el órgano más grande, y recibe hasta un tercio de la volemia. La piel constituye una barrera contra el medio ambiente al mismo tiempo contribuye a mantener la homeostasis del medio interno. Es un órgano capaz de autoregenerarse, y puede soportar agresiones mecánicas y químicas, hasta un cierto límite. Su espesor puede variar desde 0,5 mm en la membrana timpánica a 0,6 mm en la planta de los pies.

EpidermisLa epidermis es la capa mas

externa de la piel, es avascular y deriva del ectodermo embrionario.

Es una capa relativamente uniforme en espesor y tiene entre 75 y 150µm, excepto en palmas y plantas donde tiene entre 0,4 y 0,6 mm. La capa epidérmica se encuentra en constante renovación en un ciclo que dura entre

26 y 45 días, se produce una renovación total de la epidermis cada aproximadamente 2 meses. La

epidermis constituye un epitelio escamoso estratificado compuesto por keratinocitos y la dividimos en 5 capas: estrato córneo, lúcido, granuloso, espinoso y capa basal o stratum germinatuvm.

El estrato córneoEl estrato córneo, es la capa

superficial y está compuesta de células muertas keratinizadas llamadas corneocitos. Está compuesto por células muertas dispuestas en capas finas apiladas y están llenas en un 80% de keratina de ahí el nombre de keratinocitos, rodeadas de una matriz extracelular lipídica, y tienen la función

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 8

↑ Figura 4 - Corte Histológico de piel humana de la zona interescapular

↓ Figura 5- Corte Histológico de piel humana de la Palma de la mano, (se observa capa córnea más gruesa y compactada)

de barrera de la epidermis. La regulación de la permeabilidad, descamación, actividad antimicrobial, exclusión de toxinas y absorción selectiva, están a cargo de la matriz extracelular. La resistencia mecánica, hidratación, promotores de inflamación mediados por citokinas, y protección del daño por radiación UV, son provistas por los corneocitos.

En condiciones normales el estrato córneo está compuesto de keratinocitos completamente diferenciados. Las células más superficiales son descamadas por los traumas mecánicos y químicos de la vida diaria y en parte debido a la degradación proteolítica de los desmosomas.

La keratina es una fibra dura, insoluble, resistente a cambios de pH y a la digestión enzimática de tripsina y pepsina. Se han identificado 54 genes funcionales de keratina, que codifican para 34 tipos de keratina epiteliales y 17 pilosas. Mutaciones a nivel de estos genes se traducen en múltiples enfermedades.

El estrato lúcidoEl estrato lúcido se encuentra

directamente por debajo del estrato córneo. Esta capa puede encontrarse en áreas donde la piel es gruesa como en palmas y plantas, y puede estar ausente en piel fina como la de los párpados. Puede tener entre una y cinco células de espesor, los límites celulares son difíciles de distinguir en el microscopio de luz. Es una capa transicional donde hay enzimas lisosomales activas que degradan el núcleo y las organellas antes de que las células pasen al estrato córneo.

El estrato granulosoEl estrato granuloso se encuentra por debajo del estrato córneo o del estrato lúcido cuando este está presente. Las células en ésta capa tienen núcleo activo. El nombre deriva de los gránulos de keratohialina contenidos en las células de esta capa compuestos principalmente de profilaggrina, filamentos intermedios de keratina, y loricrina. En ésta capa comienza a formarse la envoltura de las células cornificadas. La


Tabla 1 - Expresión de genes de keratina y enfermedades asociadas

profilaggrina polimérica se convierte en filaggrina en un proceso dependiente de Ca. Los monómeros de filaggrina agregan keratina para formar macrofilamentos, la filaggrina luego es degradada, quedando macrofilamentos de keratina. La loricrina es una proteína rica en cisteína que constituye el principal componente de la envoltura cornificada que se une a estructuras desmosomales. Esta proteína junto con involucrina, cystatina A, proteínas pequeñas ricas en prolina (SRP1, SRP2, y cornifina), elafina, envoplakina son subsecuentemente cruzadas en la membrana plasmática por las transglutaminasas tisulares (TGM1 y TGM3 principalmente) formando la envoltura de los corneocitos.↓ Figura 6 - Ictiosis Laminar

Mutaciones en los genes que codifican para las diferentes proteínas mencionadas producen trastornos en la normal queratinización por ejemplo: mutaciones en el gen que codifica TGM1 están involucradas en casos de Ictiosis Laminar; mutaciones en el gen que codifica filaggrina están involucradas en casos de Ictiosis Vulgar; mutaciones en el gen que codifica loricrina están involucradas en casos de Síndrome de Vohwinkel con Ictiosis y pseudoainhum.

↓ Figura 7 - Pseudoainhum

También hay situaciones donde la alteración no está en la formación sino en la producción de autoanticuerpos por ejemplo en la dermatitis herpetiforme existen anticuerpos contra la TGM3. ( ↓Figura 8).


↓Figura 8 - Dermatitis

Herpetiforme

Las células de esta capa también contienen gránulos pequeños llamados cuerpos de Odland. En realidad ya son numerosos en las células de la parte superior del estrado espinoso, y se ubican en la periferia celular a medida que pasan el estrato granuloso. Vierten su contenido lipídico en el medio extracelular, contribuyendo a la función de barrera y cohesión celular en la capa córnea.

El estrato espinosoEl estrato espinoso es la capa

debajo del estrato granuloso. El nombre deriva por la configuración en espículas que tiene las estructuras citoplasmáticas de las células de esta capa que constituyen los desmosomas característica sobresaliente de esta capa. Los desmosomas (↓ Figura 9↓Figura 10,↓ Figura 11) estás constituidos por una parte intracelular denominada placa y una parte extracelular denominada core. La placa contiene los polipéptidos plakoglobina, desmoplakina 1 y 2, keratocalmina, desmoyokina, y plakofilina y el core contienen glicoproteínas transmembrana que son desmogleína 1 y 3, y desmocolinas 1 y 2 que son parte de la familia de cadherinas que se encargan de la adhesión en la porción extracelular, y son dependientes de Ca. La importancia del calcio como mediador


Tabla 2 - Enfermedades resultantes de la alteración de los desmosomas

de la adhesión queda demostrada en dos condiciones que exhiben discohesión epidérmica característica, la enfermedad de Darier (↓ Figura 14) o keratosis folicular y Hailey-Hailey (↓Figura 12) o pénfigo crónico benigno familiar. Ambas enfermedades son producidas por mutaciones en lo genes que regulan el transporte de calcio, el SERCA2 (sarco-endoplasmatic reticulum Ca++ATPasa type 2 isoform) en la enfermedad de Darier17 y el ATP2C1 (ATPasa, Ca++

transporting type 2C, member 1) regulador de la concentración citoplasmática de calcio en la enfermedad de Hailey-Hailey.↓ Figura 9 - Desmosoma en esquema

Las células en esta capa comienzan a sintetizar grandes cantidades de keratina K1/K10 que se agrega a la K5/K14 que todavía está presente de la capa basal, pero no se sintetiza nuevo ARNm para éstas keratinas,

excepto en alteraciones hiperproliferativas.↓ Figura 10 - Proteínas desmosomales

↓ Figura 11 - Microfotografía electrónica. Desmosoma

En estados hiperproliferativos como psoriasis, keratosis actínicas, y reparación de heridas la síntesis de


↓ Figura 12 - Hailey-Hailey

keratina K1/K10 así como el ARNm para éstas sufren downregulation, y se favorece la síntesis y traducción del ARNm para keratina K6/K16. El ARNm para K6/K16 está normalmente presente en la epidermis pero solo es traducido cuando hay una estimulación de la proliferación. La alteración de las proteínas que componen los desmosomas se traducen en varias enfermedades como se expone en la tabla 2.

El estrato basal

El estrato basal es la capa interna de la epidermis. Está compuesta de una capa simple de células mitóticamente activas. Estas células responden a varios factores como la

matriz extracelular, factores de crecimiento, hormonas, y vitaminas. El metabolismo de la piel está mediado por glucosa, y la utilización de esta por parte de la piel es comparable a la del músculo. Una vez q la célula deja la capa basal esta comienza una migración hacia arriba que dura entre 2 y 3 semanas, le toma aproximadamente 14 días en moverse desde la capa basal al estrato córneo y otros 14 días pasar a la parte superior del estrato córneo y descamar.

↓ Figura 14 - Enfermedad de Darier

Las células pluripotenciales (stemlike cells) epidérmicas comprenden aproximadamente un 10% del total de células basales. Estas células tienen un ciclo celular muy lento y cuando se dividen las células hijas que se diferenciarán a medida que se mueven hacia la capa córnea son llamadas “células amplificadoras


↓ Figura 13 - Keratodermia estriada

transitorias” (↓ Figura 16), éstas constituyen el 50% de la población de keratinocitos basales.

Una parte de la población de células madre puede ser encontrada en las criptas epidérmicas de las crestas de la dermis y en el bulbo de los folículos pilosos.

Las células en división pasan por el ciclo celular y la fase G1 es acortada en estados como la reparación de heridas.

El ciclo celular normal de un keratinocito es de alrededor de 300 horas pero puede ser tan corto como 36 horas en ciertos estados patológicos como la psoriasis↓ Figura 15 - Psoriasis

Las stem cell y las células amplificadoras transitorias, tienen ambas capacidad para división celular limitada o continúa, y son las que tienen más probabilidad de residir el

tiempo suficiente en la piel para sufrir modificaciones genéticas que lleven a desarrollar cáncer de piel.

El uso de células madres provenientes de la capa basal de la piel es un área de creciente investigación y desarrollo18.

↓ Figura 16 - Esquema. Células Amplificadoras


↑ Figura 17 - Esquema de la matriz de la membrana basal

La membrana basalLa zona de membrana basal o unión

dermo-epidérmica, constituye la interface entre dermis y epidermis. Está dividida en dos zonas llamadas lámina lúcida y lámina densa, según su densidad en la microscopía electrónica. La principal función reside en servir de anclaje entre la dermis y la

epidermis y proveer resistencia ante fuerzas cizalladoras externas. Sirve como soporte de la epidermis, determina la polaridad de crecimiento, dirige la organización del citoesqueleto en las células basales, provee señales de desarrollo, y actúa como barrera semipermeable.

La membrana basal está formada por las interacciones específicas entre las proteínas, laminina, colágeno tipo IV, nidogen, y perlecam. También

encontramos fibronectina, y glicosaminoglicanos.

Encontramos una menor cantidad de colágeno tipo VII, pero éste juega un papel importante en el anclaje de células a la lámina densa.

Puede ser dividida en tres redes supramoleculares: el complejo hemidesmosoma-filamento de anclaje,

la membrana basal propiamente dicha, y la fibrillas de anclaje. El rol crítico de ésta región de mantener la integridad estructural de la piel, se pone de manifiesto con el gran número de mutaciones en los componentes de la unión dermoepidérmica que causan enfermedades ampollosas como por ejemplo el colágeno tipo VII. Estas son agrupadas de acuerdo al grado de escisión dentro de la unión dermoepidérmica, por ejemplo la más


superficial es la “epidermólisis bullosa simple” donde hay escisión de los keratinocitos basales; “epidermólisis bullosa de la unión” escisión entre la lámina lúcida y la lámina densa y la “epidermólisis bullosa distróficas” que es la más profunda donde existe escisión entre la sublámina densa y los filamentos de anclaje.


Uniones IntercelularesAdemás de los desmosomas ya

descriptos, hay otros tipos de uniones intercelulares, que no tan solo contribuyen a la interacción mecánica, sino que son responsables de la interacción bioquímica y de señales entre células. Estas uniones incluyen Uniones ocluyentes (tight), uniones adherentes (adherens), y uniones GAP.

Uniones adherentesLas uniones

adherentes están constituidas por estructuras transmembrana, que se asocian con el esqueleto de actina, parte de la red de filamentos de los keratinocitos. Los componentes transmembrana están constituídos por E-

cadherina, que formas interacciones adhesivas hemofílicas calcio dependiente con la E-cadherina de la

célula adyacente. El anclaje principal a citoesqueleto de actina es mediante α-catenina además de otros componentes como p120ctn, β-catenina, plakoglobina, α-actinina, vinculina, VASP (vasodilatador stimulated phosphoprotein).

No se han identificado dermatosis asociadas a anormalidades primarias en la estructura de los componentes de las uniones adherentes, aunque la plakoglobina, asociada a una mutación en la enfermedad de Naxos, también es componente de los desmosomas.↓ Figura 18 - Microfotografía electrónica. Uniones gap

Uniones gapLas uniones gap comprenden

grupos de canales intercelulares, conocidos como conexones, que directamente forman conexiones entre


← Figura 19 - E-cadherinas. Unión Ca dependiente

↓ Figura 20 - Esquema. Uniones gap

el citoplasma de keratinocitos adyacentes (también presentes en otras células). Hay descriptas cerca de trece conexinas diferentes en el humano. Los conexones se originan mediante el ensamblaje de seis conexinas dentro del complejo de Golgi que son transportadas a la membrana plasmática, donde se asocian con otros conexones para formar la unión gap.

Las uniones gap pueden ser homotípicas o heterotípicas dependiendo del tipo de conexinas. La formación y estabilidad de las uniones gap están reguladas por la quinasa de proteína C, Src quinasa, concentración de Ca, calmodulin, AMPc, y el pH local. Mediante las uniones gap, células vecinas comparten metabolitos de bajo peso molecular (<1000 Da) e intercambian iones, esto permite la coordinación intercelular y uniformidad.

Alteración en genes que codifican para conexinas, están implicados en varias formas de queratodermias y pérdida de la audición. Hay genodermatosis específicamente asociadas a conexinas, como el síndrome de Vohwinkel, formas autosómicas dominantes y recesivas de eritrokeratodermias, síndrome de Clouston, y síndrome KID (queratitis, ictiosis, deafness [sordera]).

Uniones ocluyentes Las uniones ocluyentes

intercelulares constituyen los mayores reguladores de la permeabilidad en el epitelio simple y están presentes en la piel con un rol clave manteniendo la función de barrera de la piel. Están constituidas por proteínas transmembrana e intracelulares como

occludina, molécula de unión adhesiva, y caludinas. Además del control de la permeabilidad, las uniones ocluyentes, contribuyen al mantenimiento de la polaridad celular. Las claudinas tendrían la capacidad para regular la permeabilidad epidérmica ya sea con la formación de uniones oclusivas o mediante la unión directa a ciertos factores de transcripción. La asociación con otros factores de transcripción como Kruppel like factor 4 (Klf4), o enzimas como Transglutaminasa 1, que son conocidos reguladores de la permeabilidad al producir los enlaces cruzados en las proteínas de la envoltura de los corneocitos, no está del todo establecida, pero en ratones donde se produce la ablación genética de claudina 1, o Klf4 o transglutaminasa 1, muestra patrones similares en la alteración de la barrera epidérmica. Esto sugiere que para un correcto control de la permeabilidad de la piel, además de las uniones


↓ Figura 21 - Esquema. Unión ocluyente

ocluyentes en la capa granulosa se necesita una correcta organización de la envoltura de los corneocitos en la capa córnea.

↓Figura 22 - Esquema. Proteínas de unión ocluyente

No se han asociado dermatosis con anormalidades primarias en las proteínas de las uniones oclusivas, sin embargo, se ha notado expresión anormal de algunos componentes como la ocludina en dermatosis inflamatorias como la psoriasis. (↓Figura 15)

Células no keratinocíticas de la epidermis.

Los melanocitos son células dendríticas derivadas de la cresta neural sintetizadoras pigmentos que residen principalmente en la capa basal. Bajo el microscopio de luz, son reconocidas por su citoplasma pálido, núcleo ovoide, y el color de melanosomas llenos de pigmento, que son la organella distintiva de estas células. Los melanocitos ya pueden ser detectados el piel a los 50 días de gestación y bajo condiciones normales no se dividen. En la piel normal, el número de melanocitos es el mismo a

pesar del color de piel, un melanocito cada 36 células basales aproximadamente.

↑ Figura 23 – Melanocito. Tinción para tirosinasa

Las dendritas de los melanocitos son las responsables de distribuir el pigmento a un gran número de keratinocitos. La principal diferencia entre la piel clara y oscura es la cantidad y distribución de los melanosomas y la actividad de los melanocitos.

La función de los melanocitos se pone de manifiesto en patologías como el vitíligo, donde se produce una depleción de melanocitos por acción autoinmune.


↓ Figura 24 - Vitiligo

Otros desórdenes de la pigmentación son causados por defectos en la melanogénesis, que puede estar en la síntesis de melanina, producción de melanosomas, y transporte de melanosomas y transferencia a los keratinocitos. La interacción entre melanocitos y keratinocitos es crítica para la homeostasis y diferenciación del melanocito, influyendo en la proliferación, dendricidad y melanización. El estudio de los melanocitos ha crecido notablemente sobre todo como parte del estudio de los melanomas, donde se han descubierto nuevos mecanismos de supervivencia tumoral, con prometedoras implicancias terapéuticas.19

Las células de Merkel, son mecanoreceptores de adaptación lenta tipo 1, localizados en sitios de alta sensibilidad táctil. Están presentes entre los keratinocitos basales en regiones particulares del cuerpo, incluyendo piel cubierta de pelos y en

piel sin pelos de los dedos, labios, cavidad oral, y la hoja externa de los folículos pilosos. Al igual que otras células no keratinocíticas las células de Merkel tienen un citoplasma pálido en las tinciones.

↑Figura 25 - Carcinoma de células de Merkel. Marcado hinmunohistoquímico mostrando patrón punteado perinuclear característico.

↑Figura 26 - Carcinoma de células de Merkel. Muestra rápido crecimiento. Nódulo violáceo en dedo del pie.

Los marcadores inmunohistoquímicos incluyen K8, K18, K19, y K20 péptidos de keratina. K20 está restringido a las células de Merkel en la piel así que se considera el marcador más confiable. Ultraestructuralmente son fácilmente reconocibles por los gránulos densos, limitados por membrana, que se coleccionan en oposición al aparato de Golgi y próximos a una neurita


amielinizada. Estos gránulos son similares a los encontrados en neuronas y contienen sustancias similares a neurotransmisores y marcadores de células neuroendocrinas, incluyendo metaencefalina, péptido vasoactivo intestinal, enolasa neurona-específica, y sinaptofisina. Las células de Merkel pueden sufrir transformación originando neoplasias (carcinoma neuroendocrino primario) que son particularmente agresivos y difíciles de tratar.

Figura 27 - Célula de Langerhans en epidermis.

Las Células de Langerhans son células dendríticas procesadoras y presentadoras de antígenos de la epidermis. Aunque no son exclusivas de la epidermis representan del 2% al 8% del total de células epidérmicas. Se encuentras comúnmente en posición supra basal, pero pueden estar distribuidas por la capa basal, espisona, o granulosa. Se tiñen pálidamente en los preparados histológicos, y tienen un núcleo complejo. El citoplasma contiene estructuras características llamadas gránulos de Birbeck. Su función principal es tomar muestras y presentar antígenos a las células T de la epidermis. A raíz de su función estas células están implicadas en

mecanismos patológicos como dermatitis de contacto, leishmaniasis cutánea, e infección por HIV.

Las células de Langerhans están reducidas en la epidermis de pacientes con ciertas condiciones patológicas como psoriasis, sarcoidosis, y dermatitis de contacto. Su funcionalidad se ve afectada por la radiación UV, especialmente la UVB.

Por su efectividad como presentadora de antígenos y estimulación de linfocitos, estás células están siendo estudiadas como vehículos para el tratamiento de tumores y el desarrollo de vacunas anti-tumorales.20,21

↑ Figura 28 - Microfotografía electrónica de una Célula de Langerhans en epidermis. Flechas indican Gránulos de Birbeck. En recuadro se puede apreciar la forma en “raqueta”, las flechas curvas indican la fusión tipo “cierre” de la parte vesicular. N indica el núcleo


DermisLa dermis está constituida por

elementos tejido conectivo fibroso, filamentoso, y difuso, que soporta redes vasculares y nerviosas, apéndices epidérmicos y muchos tipos de células incluyendo fibroblastos, macrófagos, mastocitos, y células transitorias del sistema inmune. La dermis forma la mayoría de la piel y la provee de flexibilidad, elasticidad, y resistencia a la tensión. Protege el cuerpo de traumatismos mecánicos, retiene agua, colabora en la termorregulación e incluye receptores para estímulos sensoriales.

La dermis interactúa con la epidermis en el mantenimiento de ambas capas, colaborando durante el desarrollo y la morfogénesis de la unión dermoepidérmica, y los apéndices epidérmicos, e interactúan en la remodelación de la piel luego de una injuria.

La dermis puede ser dividida en dos regiones principales, la dermis papilar superior, y la dermis reticular inferior.

Estas regiones pueden ser identificadas en los cortes histológicos ya que difieren en la organización del tejido, la densidad celular y la distribución de vasos y nervios.

La dermis papilar colinda con la epidermis, moldea su contorno, y tiene usualmente el doble del espesor de la dermis. La dermis reticular forma el grueso de la dermis. Está compuesta principalmente por fibras colágenas gruesas, organizadas in grandes haces de fibras entretejidas, con ramas de fibras elásticas rodeando los haces. En la piel normas, las fibras elásticas y los haces colágenos

aumentan de tamaño progresivamente hacia la hipodermis. El plexo subpapilar, es un plano horizontal de vasos, marcando el límite entre la dermis papilar y la dermis reticular. El límite inferior de la dermis reticular está definido por la transición de tejido conectivo fibroso a tejido conectivo adiposo en la hipodermis.

Proteínas de la matriz extracelular

ColágenoEl colágeno es la principal proteína

estructural encontrada en la dermis y es secretada por fibroblastos dérmicos como procolágeno, que se transforma en colágeno en el medio extracelular por acción de las enzimas ADAMTS-2, 3, y 4 (a desintegrin and a metalloproteinase with thrombospondin repeats)22 actuando como procolageno-N-proteinasa y por BMP1/Tolloid-like family (bone morphogenetic protein 1; Tolloid identifica originalmente la misma enzima en la Drosophila) actuando en el lado C terminal (↓ Figura 32). Una


← Figura 29 - Estructura helicoidal triple del colágeno.

actividad defectuosa en las procolageno-N-proteinasas, se encuentran en el síndrome de Ehlers-Danlos VIIc (↓ Figura 30), con una fragilidad extrema de la piel.

↓ Figura 30 - Síndrome de Ehlers-Danlos

El principal tipo de colágeno que encontramos en la piel es el colágeno tipo I, uno de los tipos de colágeno formadores de fibras, representa alrededor del 77% al 85% del colágeno presente. El colágeno tipo III, también formador de fibras representa casi todo el colágeno restante. Los colágenos tipo V y VI, también pueden estar presente en pequeña cantidad. Los colágenos tipo IX y XII, no son formadores de fibras por sí mismos, y

los encontramos asociados a los costados de los formadores de fibras principales como monómeros, extendiéndose en la matriz circundante asociándose con los proteoglicanos, ayudando a relacionar las fibras colágenas con los demás componentes de la matriz extracelular.↓ Figura 32 - Ensamblaje de las fibras de colágeno

El colágeno proporciona a la piel su fuerza, para darse una idea, el colágeno es el que le proporciona al cuero de vaca su fuerza y durabilidad. Los aminoácidos que forman al colágeno son prolina, glicina, hidroxiprolina, e hidroxiglicina.Elastina


↓ Figura 31 - Comparación entre la fibra de colágeno y la elastina.

La elastina es la proteína que le proporciona a la piel su elasticidad. Esta previene a la piel de ser permanentemente remodelada.

La elastina al igual que el colágeno (↓ Figura 31), es una proteína formadora de fibras y tiene una gran cantidad de glicina y prolina en su composición pero carece de grandes cantidades de hidroxiprolina. Las fibras de elastina forman estructuras similares a un resorte que permite ser estirada y luego retornar a su forma original. La cantidad de elastina en la piel representa menos del 2% de su peso seco.

Alteraciones en los genes que codifica para elastina da lugar a fenotipos de cutis laxa.

Proteoglicanos y glicosaminoglicanos

Los Proteoglicanos y glicosaminoglicanos (PGs y GAGs), constituyen la sustancia basal, que se encuentra entre las fibras colágenas y elastina. Dentro de estas categoría están incluido el condrotitín sulfato y dermatán sulfato (versican, decorin, biglycan), condrotitín sulfato y dermatán sulfato proteoglicanos (syndecan, perlecan), y condroitín-6-sulfato proteoglicanos. Aunque estas proteínas solo representan cerca del 0,2% del peso seco de la dermis, estas moléculas son muy importantes ya que son capaces de retener 1000 veces su volumen en agua, y tienen un rol muy importante en la hidratación de la piel determinando su volumen y compresibilidad.

También encontramos en la dermis acido hialurónico que es mucho más abundante en la piel fetal donde facilita

la migración celular. Este material puede asociar factores de crecimiento y facilita la conexión celular con otros materiales de la matriz extracelular.

Componentes celulares de la dermis

Los componentes celulares de la dermis son fibroblastos, macrófagos, y mastocitos. Son encontrados más frecuentemente alrededor de la región papilar y rodeando los vasos del plexo subpapilar. También podemos encontrarlos en la dermis reticular entre las fibras colágenas.

Los fibroblastos son células mesenquimáticas que migran a través del tejido y son responsables de la síntesis y degradación de los componentes fibrosos y no fibrosos de la matriz proteica y de algunos factores solubles. Los fibroblastos proveen de un marco estructural a la matriz extracelular a la vez que promocionan la interacción dermo-epidérmica mediante la síntesis de mediadores solubles. Juegan un rol importante en la reparación de heridas y cicatrización donde aumentan su proliferación y actividad sintética.↓ Figura 33 - Fibroblastos


Los macrófagos, monocitos y células dendríticas dérmicas, constituyen el sistema de células fagocíticas mononucleares en la piel. Figura 34 - Macrófago fagocitando bacterias (en amarillo)

Los macrófagos derivan de precursores en la médula ósea, se diferencian en monocitos circulantes en el torrente sanguíneo, luego migran a la piel para diferenciarse en macrófagos. Estas células son fagocíticas, procesan y presentan antígenos, son microbicidas, tumoricidas, secretan factores de crecimiento, citoquinas y otras moléculas inmunomoduladoras, y están involucradas en la reparación de heridas y remodelación de tejidos.

Los mastocitos son células secretoras especializadas que en la piel están presentes en gran densidad en la dermis papilar, cerca de la unión dermoepidérmica, y alrededor de vasos sanguíneos y nervios del plexo subpailar. También son comunes en la grasa subcutánea. Los mastocitos son identificados histológicamente por un núcleo oval y redondeado y por abundantes gránulos oscuros citoplasmáticos. La superficie de los mastocitos está cubierta con fibronectina que probablemente asegura a la célula a la matriz de tejido conectivo. En determinados estados

de activación pueden volverse hiperproliferativos e hiperplasicos (mastocitosis). Los mastocitos son responsables de la reacción de hipersensibilidad inmediata en la piel y en el mantenimiento de estados inflamatorios subagudos y crónicos.↓ Figura 35 - Urticaria

Sintetizan y secretan gránulos cargados de histamina, heparina, triptasa, quimasa, carboxipeptidasa, factor quimiotático neutrofilico, y factor quimiotáctico eosinofílico anafiláctico.

Hipodermis

El tejido de la hipodermis aísla al cuerpo, sirve como reserva energética, amortigua y protege la piel y facilita su movilidad sobre las estructuras subyacentes. Tiene efecto cosmético moldeando el contorno corporal. El límite entre la dermis reticular y la hipodermis, es una transición abrupta del tejido conectivo fibroso de la dermis al tejido adiposo de la hipodermis. A pesar de la separación “anatómica”, las dos regiones están estructuralmente y funcionalmente conectadas por una red de vasos y nervios y la continuidad de apéndices epidérmicos. Folículos pilosos en


crecimiento activo pasan la dermis y se extienden en la grasa subcutánea, y las glándulas sudoríparas apócrinas y écrinas, están normalmente confinadas a esta profundidad de la piel.

Los adipocitos de la hipodermis están organizados en lóbulos definidos por septos de tejido conectivo, que contienen los vasos, nervios y linfáticos. ↓ Figura 36 - Adipositos Subcutáneos

La síntesis y acumulación de grasa es continua ya sea mediante la acumulación de lípidos dentro de los adipocitos, proliferación de adipositos existentes, o mediante la recluta de nuevas células del mesénquima indiferenciado.La hormona leptina, secretada por los adipocitos, provee una señal de retroalimentación de larga duración regulando la masa grasa. Los niveles de leptina son más elevados en los adipositos subcutáneos que en los mesentéricos, sugiriendo un rol del a leptina en el control de la distribución de los adipositos.

La importancia de la grasa subcutánea se pone de manifiesto en los pacientes con síndrome de Werner (defecto molecular en la enzima RecQ DNA helicasa), donde la grasa

subcutánea está ausente en áreas de lesión óseas, o con esclerodermia, donde la grasa subcutánea es reemplazada por tejido conectivo fibroso. Estas regiones tienden a desarrollar úlceras crónicas. La piel de pacientes con esclerodermia es tensa y dolorosa.


Técnicas de biología molecular utilizadas en dermatología

Los avances en biología molecular están cambiando rápidamente nuestro conocimiento sobre la biología de la piel y sus enfermedades.

El aumento de información se traslada en nuevos diagnósticos moleculares que están transformando la práctica clínica de la dermatología. Pero hay que usarlos de una manera prudente.

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Biología Molecular de la Piel | Técnicas de biología molecular utilizadas endermatología

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http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/glossary/glossary_m.shtml

En este capítulo, se profundizara sobre las técnicas de biología molecular útiles en dermatología. Como enfermedad modelo utilizaremos el melanoma. Se discutirá el rango de técnicas disponibles por el dermatólogo para elucidar las bases moleculares del melanoma, para luego realizar un tratamiento efectivo. Se estudiara las técnicas de biología molecular que permiten analizar ADN, ARN y proteínas de las células del melanoma. Luego, se analizaran las posibles terapias genéticas. Todo esto contribuirá con importante información para el pronóstico, consejo terapéutico

y screening a futuro del melanoma.

Procesamiento del tejidoPara determinar los cambios

moleculares producidos que llevaron a la formación de un melanoma, primero hay que terminar como se procesara la muestra elegida la obtención de ADN, ARN o proteínas.

El melanoma extraído puede ser procesado de cuatro formas diferentes. (↓ Figura 37)

1. El tejido en fresco puede ser colocado en un medio de cultivo y las células del melanoma pueden ser cultivadas en una incubadora. Estas células permiten obtener más células que las de la muestra original y exponerlas a distintas condiciones.

2. Procesar el tejido fresco con búferes y reactivos para extraer ADN, ARN y proteínas de toda la masa tumoral y en calidad elevada.

3. El tejido puede ser fijado en formol (para microscopia óptica) o en glutaraldehido (para microscopia electrónica) y luego ser analizado histológicamente en distintas formas, incluyendo tinciones de rutina, inmunohistoquímica o hibridación in situ.

4. La muestra puede ser congelada para una extracción diferida del ADN, ARN o proteínas. También nos permite obtener cortes para el estudio histológico.

19 Rabinovich GA y col. Targeted inhibition of galectin-1 gene expression in tumor cells results in heightened T cell-mediated rejection; A potential mechanism of tumor-immune privilege. Division of Immunogenetics, Hospital de Clinicas José de San Martín, Buenos Aires, Argentina. Cancer Cell. 2004 Mar;5(3):241-51

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↓ Figura 37 - Procesamiento de una muestra de tejido

Otra opción es usar micro disección por captura laser (LCM)

para aislar células individuales del melanoma para su posterior análisis a partir de un preparado histológico visualizado en el microscopio. (↑ Figura 38)

Luego de la extracción del ADN, ARN o proteínas del melanoma, queremos detectar las posibles mutaciones en proto-oncogenes o en genes supresores de tumores responsables de la neoplasia. Por ejemplo, suponiendo que es conocido en el melanoma la mutación del gen “toomuchsun”, para obtener solo este gen del total del ADN, podemos utilizar la técnica de biología molecular Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) que nos permitirá aislar el gen buscado y amplificar la cantidad del mismo para hacerlo medible. El ADN amplificado por PCR que contiene el gen, puede ser clonado en plásmidos bacteriales para una fácil manipulación y luego ser secuenciado usando técnicas de secuenciación por fluorescencia automatizada (Fig. 4.4). En base a los resultados de la

secuenciación, sobremos si la mutación se encuentra presente en el gen toomuchsun en el tumor bajo estudio.

Reacción en Cadena de la Polimerasa

Objetivo de la técnica: amplificar una porción específica de ADN

Requerimientos: se necesita conocer la secuencia especifica del ADN problema (al menos las porciones finales)

Conceptos sobresalientesLa doble cadena de ADN puede ser

separada en cadenas únicas aumentando la temperatura (desnaturalización); (↓ Figura 40) aumentando la temperatura nuevamente, la cadena única pude unirse (hibridar) a secuencias de nucleótidos complementarias formando una doble cadena nuevamente (re naturalización).


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↓ Figura 39 - Secuenciamiento de ADN por fluorescencia automático

↑ Figura 38 - Captura por Microdisección Láser

Durante el proceso de hibridación, los nucleótidos A de una cadena, se unen con los nucleótidos T de la cadena complementaria, mientras que los nucleótidos C se unen a los nucleótidos G y viceversa

Cadenas cortas de ADN llamadas oligonucleótidos, son diseñadas para hibridarse con una secuencia especifica de ADN.

MétodoLos cebadores (primers) son

oligonucleótidos diseñados para hibridarse en secuencias específicas situadas en los extremos del ADN de interés. Estos cebadores son agregados a una mezcla, junto con los desoxinucleótidos trifosfato (dATP (A), dTTP (T), dGTP (G) and dCTP (C) )

, el ADN problema, ADN polimerasa termoestable y buffer.

La mezcla se coloca en tubos de PCR en un termociclador, que controla la temperatura de la reacción durante varios ciclos

Durante cada ciclo se realizan los siguientes pasos: 1. Desnaturalización 2. Hibridación del cebador 3. Elongación de la cadena de ADN a partir del primer 4. Repetición del ciclo completo 30 a 40 veces- (↓ Figura 40)

Secuenciamiento de ADN

Objetivo de la técnica: Determinar la secuencia u orden de los nucleótidos (AGCT).

Requerimientos: El ADN a secuenciar puede ser el producto de una PCR o ADN clonado presente en plásmidos.

Conceptos sobresalientes El método de “terminación de la

cadena” o Sanger es el preferidoLa incorporación de un

didesoxinucleótido en la cadena naciente de ADN termina su extensión, lo que produce varios fragmentos de ADN de longitud variable.

Mediante electroforesis, se separan los diferentes fragmentos de ADN según su tamaño.

MétodoUn cebador se hibrida al ADN a

secuenciar y la ADN polimerasa sintetiza una segunda cadena complementaria.


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↓ Figura 40 - Esquema de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La síntesis de la segunda cadena es interrumpida al azar por la incorporación de nucleótidos análogos marcados con fluorescencia (didesoxinucleótido ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP). Los fragmentos de ADN que presentan este nucleótido análogo en su extremo pueden ser identificados ya que cada uno de los 4 didesoxinucleótido está marcado con un fluorocromo distinto.

Los distintos fragmentos de ADN son separados mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida

El fluorocromo presente en cada fragmento de ADN es leído a través de un detector de fluorescencia e indica el orden de la secuencia de ADN.

Una vez determinada la existencia de la mutación en el gen bajo estudio, se puede determinar si esta influye en el nivel de mRNA y de proteínas dentro de la célula. Para el analizar ARN, primero se lo debe convertir en ADN usando la técnica de Transcripción Reversa (RT). Luego, el ADN complementario (cADN) puede ser amplificado mediante PCR. Además esta técnica permite monitorear la cantidad de producto formado en cada ciclo de amplificación, y es conocida también como PCR cuantitativa en tiempo real.

Transcripción - reversa PCR (RT-PCR)

Objetivo de la técnica: Amplificar ARN mensajero (mARN) por PCR. El ARNm es convertido primero en ADN

complementario y luego se amplifica por PCR la región especifica a niveles detectables.

Requerimientos: El material puede ser ARN celular total (incluyendo ARN ribosomal, ARN de transferencia y ARN mensajero) o ARN purificado.

Conceptos sobresalientesPara facilitar el estudio del ARN,

primero se debe convertir el ARN en ADN complementario por medio de una enzima llamada transcriptasa reversa (es una enzima ADN polimerasa dependiente de ARN).

Método

La transcripción reversa puede convertir mARN en cADN a través de tres métodos diferentes, dependiendo de los cebadores utilizados para el paso inicial. (← Figura 41)

1. Cebadores hexamericos al azar, que contienen 6 nucleótidos (6-mer) que contienen todas las posibles combinaciones de dA, dG, dC y dT. Estos cebadores se hibridaran a la secuencia complementaria correspondiente en el ARN molde.

2. Cebadores de oligonucleótidos que contienen solo dT e hibridan en la cadena complementaria de dA nucleótidos presentes en el extremo de las moléculas de ARNm (cola poli A)

3. Cebador que solo hibrida en una secuencia especifica de mARN


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Luego que obtenemos cADN, se agregan los cebadores que se hibridaran a una secuencia específica que permitirá la amplificación por PCR.

Para medir las proteínas producto del gen mutado, se utiliza la técnica de Western Blot (Fig. 4.6), también conocida como Imunoblot, ya que utiliza anticuerpos para detectar la proteína de interés. Además esta técnica nos permite medir el tamaño de la proteína y revelar si se presenta en distintas formas.

Western Blot

Objetivo de la técnica: medir el tamaño y la cantidad de proteínas presentes en la muestra

Requerimientos: anticuerpos específicos para la proteína de interés

Conceptos sobresalientes Anticuerpos policlonales que

reaccionan a varios epitopes de una proteína antigénica son obtenidos inyectando la proteína en un animal y aislando los anticuerpos de la fracción de las inmunoglobulinas del suero.

Anticuerpos monoclonales que reaccionan a un solo epitope de una proteína antigénica son obtenidos inmunizando a un ratón con el antígeno, luego se unen los linfocitos reactivos del ratón en una línea celular de un mieloma para crear células que producirán anticuerpos indefinidamente.


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Un anticuerpo secundario es utilizado para detectar el anticuerpo primario unido a la proteína de interés. Los anticuerpos pueden ser visualizados al agregarles

fluorescencia o una enzima que produzca luz o color a través de una reacción enzimática.

↑ Figura 42 - Western Blot

MétodoUna mezcla de proteínas

solubilizadas es separada en un gel de poliacrilamida y transferida electroforéticamente a una membrana. Esta se coloca en un buffer que contiene el anticuerpo. Los anticuerpos que se unieron son luego detectados a través de técnicas cromogenicas o por quimioluminiscencia. (↑ Figura 42)

Para investigar los cambios en la expresión génica de todos los genes de células tumorales como el melanoma, se utiliza la técnica de Micromatriz o Microarray. Con ella se puede conocer cuales genes se expresan en forma incorrecta (disminuida o aumentada) comparándolas a células normales (←Figura 43)

Esta poderosa técnica, utiliza secuencias de oligonucleótidos


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← Figura 41 – Transcriptasa InversaA- Una transcriptasa inversa puede convertir a cDNA del mRNA de tres maneras diferentes, dependiendo del primer utilizado para la etapa inicial RT: (1) cebadores aleatorios hexamericos, (2) oligo dT primers, y (3) primers específicos del gen. Después de que el ARNm se ha convertido a cDNA, los primers que se pueden hibridar con secuencias específicas son añadidos y amplificación por PCR se lleva a cabo.B- PCR en tiempo real es capaz de medir con precisión la cantidad de producto de PCR de forma continua (eje y) después de cada ciclo (eje x). Cada trazado línea representa la cantidad de presente del producto de PCR en una muestra diferente. En las muestras que inicialmente contienen transcripciones de ARNm de genes más, PCR en tiempo real demostrará un aumento exponencial de producto de la PCR tempranamente después de unos pocos ciclos de PCR.

representando miles de genes que son desarrollados en un chip; luego, el mARN de los melanomas y los de los melanocitos normales es separado y convertido en sondas marcadas que son hibridadas en los chips. El nivel de hibridación de los oligonucleótidos de un gen dado indica cuanto mARN de ese gen está presente. La ventaja de esto es la posibilidad de analizar en forma cuantitativa el nivel de expresión de miles de genes de una sola vez.

Microarray

Objetivos: Analizar la expresión de mARN de miles de genes en un solo experimento

Requerimientos: ARN total o mARN

Conceptos sobresalientes

Hibridación a ADN. Se utiliza el mismo principio de hibridación que el aplicado en PCR, excepto que muchos genes diferentes son evaluados simultáneamente. El ADN es químicamente sintetizado en la superficie de miles de puntos específicos. (← Figura 43). Si las células están expresando ARNm del gen correspondiente, el ARNc se hibridara en el lugar y generara una señal cuya intensidad será en relación al nivel de expresión.

MétodoARN es convertido en cADN

mediante transcripción reversa. La transcripción in vitro del cADN se realiza con nucleótidos

marcados con biotina dando como resultado cARN marcado (←Figura 43). Las moléculas de cARN marcado son hibridadas a pequeños fragmentos de ADN presentes en un chip. El chip es teñido con estreptavidina ficoeritrina; la estreptavidina se une a la biotina del cARN y la ficoeritrina genera una señal fluoresecente.

Generalmente, los patrones de expresión génica de dos muestras son comparados, normal vs tumor, tratado vs no tratado.

Alternativamente, los oligonucleótidos del microarray pueden utilizarse. (← Figura 43). Usando esta posibilidad, el ARN es directamente marcado con fluoresceína o con nucleótidos radioactivos y son hibridados a los oligonucleótidos en un portaobjetos o en una membrana. Cuando se usan sondas radioactivas, las muestras son hibridadas en microarrays separados. Si las muestras de mARN a comparar son marcadas con fluorocromos distintos, las 2 muestras pueden ser hibridadas en el mismo array en forma simultánea.

Un scanner mide la intensidad de la señal de cada punto y un software determina cuales genes están sobre o subexpresados en una muestra comparada con la otra.


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Para realizar el análisis comparativo de miles de genes diferentes, se utiliza un poderoso software. Este software puede comparar resultados de múltiples experimentos o grupos de resultados de acuerdo a la expresión génica.

Agregado al uso de micromatrices para analizar todo el ARNm producido por una célula, se puede estudiar todas las proteínas producidas en ellas. El termino Proteómica representa a todas las proteínas producidas dentro de una células en un momento dado.

La espectrometría de masa es una técnica que nos permite el estudio de la Proteómica, que provee de mediciones con gran precisión de la masa de proteínas

mediante la ionización de las mismas y la medición de la aceleración de las partículas a través de un tubo hacia un detector en el lado opuesto.

↑ Figura 44 - Proteómica con espectrometría de masa

También se puede utilizar matrices de proteínas, donde anticuerpos específicos son inmovilizados en un portaobjetos o membrana. Este array puede analizar mezclas complejas de proteínas mediante la captura y la detección especifica de proteínas.


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← Figura 43 - Arrays de Ácidos Nucleicos.

Proteómica con Espectrometría de Masa

Objetivo de la técnica: La Proteómica representa a todas las proteínas celulares que son expresadas en condiciones particulares.

Requerimientos: mezcla de proteínas celulares o péptidos derivados de esas proteínas, son purificados de una población celular definida.

Conceptos sobresalientesLa espectrometría de masa

puede medir con gran precisión el tamaño o la masa de proteínas, péptidos o fragmentos de péptidos mediante la ionización de los mismos con carga positiva y luego ser medir el tiempo que necesitan los iones para moverse a través de un tubo hacia el detector. (TOF – tiempo de vuelo) (↑ Figura 44)

La masa de los péptidos ionizadas se correlaciona con precisión con el tiempo de vuelo, péptidos pequeños se mueven más rápido (menor TOF) que los péptidos mayores (mayor TOF)

Método El primer paso es disminuir la

complejidad de la mezcla de proteínas o péptidos celulares, previamente a la espectrometría de masa. Los 2 métodos principales para separar proteína/péptidos son mediante electroforesis bidimensional y la cromatografía liquida.

En la electroforesis bidimensional, las proteínas son primero separadas según su punto isoeléctrico (primera dimensión); luego se las separa aun más según su tamaño en un gel de poliacrilamida (segunda dimensión), donde las proteínas más pequeñas corren más rápido en el gel que las mayores. Las proteínas presentaran un lugar único en el gel que puede ser físicamente removido y ser analizado mediante espectrometría de masa.

La cromatografía liquida puede usarse también para separar proteínas mientras transcurren a través de columnas que contienen distintos tipos de resinas. Las proteínas son separadas en función de su hidrofobicidad (cromatografía de fase reversa), carga eléctrica (cromatografía de intercambio catiónico/aniónico) y tamaño (cromatografía de exclusión molecular).

Luego de separar las proteínas, se realiza la espectrometría de masa. Primero se ionizan las proteínas con carga positiva usando láseres o ionización por electrospray y nanospray. Basados en el tiempo de vuelo del ion cargado, la espectrometría de masa puede medir la relación masa/carga de cada péptido.

Con la ayuda de poderosas computadoras y software de bioinformática, se puede medir la relación masa/carga, que permite


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la identificación de la secuencia de un péptido y a la proteína que contiene a este péptido.

Modelos de animales transgénicos

Luego de haber identificado diferentes genes que se asocian por ejemplo al desarrollo de melanoma, se podrán utilizar modelos animales para probar si causan cáncer. Estos estudios nos permitirán investigar los mecanismos de la carcinogénesis y demostrar que ese gen mutado es capaz de producir una neoplasia.

Los modelos animales más usados para el estudio del cáncer son los ratones transgénicos y los ratones “knock-out”.

Los ratones transgénicos son normales excepto que cada célula contiene el nuevo gen que nos interesa. El gen a ser estudiado, en micro inyectado en un ovulo de ratón fecundado, que se integrara en forma aleatoria en el genoma del ratón y que estará presente en todas las células del mismo. (↑Figura 45) Aunque el gen se encuentra presente en cada célula, su expresión puede ser limitada a tejidos específicos usando promotores/ estimuladores que solo se expresen en determinados tejidos. Los promotores/ estimuladores son la porción del gen (que usualmente se

encuentra en el extremo 5´ o upstream de la región codificante) que inicia o regula el nivel de expresión del ARNm. Los promotores/ estimuladores que aseguraran qué genes son expresados sólo en melanocitos incluiría los promotores del gen relacionadas a la síntesis de melanina, como la tirosinasa.

Ratones Transgénicos

Objetivo: modelos de ratones transgénicos permiten a los investigadores estudiar los efectos de un transgen (gen de interés) en una célula, en un tejido o en todo el animal. El transgen puede ser expresado en forma selectiva en tipo particular de célula o tejido usando un promotor/estimulador que regula la expresión génica en ese tipo específico de células.

Requerimientos: Un transgen o gen de interés, cuya función biológica se quiera caracterizar en un modelo animal (ej. El gen toomuchsun);

Una región reguladora (promotor/estimulador) que expresara en forma selectiva el transgen en un tejido específico (ej. Melanocitos)

Tecnología apropiada para crear un ratón transgénico.

Conceptos sobresalientes

Luego de la inyección de un gen en un ovulo fecundado de ratón o en una célula embrionaria,


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↑ Figura 45 - Ratones transgénicos

el transgen se integra en el genoma al azar. (↑ Figura 45). A medida que las células embrionarias se dividen y dan lugar al desarrollo de un ratón, el transgen integrado estará presente en todos los tipos de células, tejido y órganos del ratón. La expresión de este transgen solo ocurrirá donde la región promotor/estimulador es activa.

Cualquier fenotipo que desarrolle el ratón, ayudara a entender los efectos biológicos del gen bajo estudio.

Método Se construye un transgen,

definido como el gen más la región reguladora (promotor/enhancer) que es preparado para la inyección.

El transgen en micro inyectado en óvulos fertilizados y se integra en el genoma, generalmente en un sitio único.

Estos óvulos fecundados son luego implantados en una madre receptora, quien luego parirá a

ratones “precursores” heterogéneos.

Se habla de ratón “heterogéneo” porque el gen se encuentra solo en uno de los dos cromosomas pares

Los ratones precursores son criados ratones normales no transgénicos. La progenie será tanto transgénicos y no transgénicos heterocigotos según las leyes mendelianas.

Para obtener solo ratones homocigotos que contengan el transgen en ambos pares de cromosomas, dos ratones heterocigotos son cruzados. Ratones transgénicos homocigotas tendrán el doble de la dosis de transgen que llevara a fenotipos diferentes y a efectos biológicos distintos que a los ratones heterocigotos.


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Conclusiones

El campo de la biología molecular crece a pasos agigantados.

En la actualidad no hay prácticamente ninguna disciplina biológica que no se haya visto beneficiada con los nuevos conocimientos que va aportando, a la vez que nos obligan a cambiar nuestro enfoque y llevar nuestro razonamiento hacia el nivel molecular.

Es imprescindible que el dermatólogo de hoy tenga incorporados conocimientos básicos de biología molecular, ya que de lo contrario no podrá estar a la altura no tan sólo de las nuevas técnicas diagnósticas y de investigación sino de los nuevos tratamientos que se van imponiendo a medida que la biología molecular descubre los mecanismos moleculares de las enfermedades que vemos día a día.

En la práctica médica diaria y más aún en la dermatología, donde la observación constituye la base del proceso diagnóstico, cuando estudiamos una lesión macroscópica en un paciente, pensando en las posibles causas, sin darnos cuenta nos trasladamos al nivel molecular teorizando que interacciones moleculares estarán implicadas en lo que observamos y decidimos que técnicas de biología molecular podríamos aplicar para establecer un diagnóstico, implementar un tratamiento, y mejorar el pronóstico.

Tal vez el estudio de la biología molecular pueda ser “opcional” en otras ramas de la medicina pero para el dermatólogo, debe considerarse como la membrana basal desde donde crece y se diferencia su formación como especialista.

Biología Molecular de la Piel | Conclusiones 39

Agradecimientos

A Piwi (por aguantarme el mal humor, por darme amor)

A Augusto, a Francisco, a Nacho (por darme tres razones para seguir)

A mi Madre (sobran razones)

A la Prof. Dra. Constanza E. Lorente (por su valioso asesoramiento)

A mi Familia (porque es la única que tengo)

A la Prof. Dra. Ana María Lórenz (por darme la oportunidad de formarme en dermatología, por siempre tratar de inspirar a sus alumnos)

A la Dra. María Elena Ricaud (por la paciencia)

A los Sres. Docentes de la carrera (por la falta de mezquindad al compartir sus conocimientos)

Al Sr. José Luis Carrazana, Secretario de la Cátedra de Dermatología (por su siempre buena disposición)

Biología Molecular de la Piel | Agradecimientos 40

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6. Molecular Biology of the Gene, 5th Ed. James Watson y Col. Pearson Education Inc. 2004

7. Collagen – Structure and Mechanics , Ed. Springer Science , 2008

8. Dermatopathology, Werner Kempf and col. Ed. Steinkopff Verlag – Springer Science, 2008

9. Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine. 16 Vol. Wiley 2006

10. Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, Second Edition, CRC PRESS 2004

11. Histología de Di Fiore, Ed. El Ateneo, 2001

12. Biología Molecular: La Nueva Frontera, Eduardo Cadenas, Universidad de Alicante, 1986

13. La Biología Molecular y la Investigación en Dermatología, Orozco Topete, Rocío. Revista de Investigación Clínica. Vol. 55, Nº 2 - Marzo-Abril 2003:168-171

14. Molecular Cell Biology, Lodish and col. 5th Edition - Freeman, 2003

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Biología Molecular de la Piel - Ramiro Esteban Lorente

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