BIOFERTILISASI

TIM PENGAJAR BIOFERTILISASI2013

PUPUK HAYATI PEMFIKSAS N2- SIMBIOTIK

1. Rhizobium2. Endofitik bakteria.

3. Azolla - BGA

• Beijerinck in Holland was the first to isolate and cultivate a microorganism from the nodules of legumes in 1888.

• Endosimbiosis bakteria• Spesifik inang

RHIZOBIUM

Rhizobium dan tanaman Inang

Alfalfa

Trivolium (Clover)

Pea (Pisum sativum)

Rhizobium is a type of bacterium that:- lives in soil and around and inside of the roots of certain plants (legumes). -surrounded by a halo of protective covering called a capsule:The slimy capsule, made of exopolysaccharide, protects rhizobium from drying out. I helps the bacterium stick to root hairs during other stages of its life cycle, when rhizobium forms a symbiotic partnership with plants like clover.

Kingdom: EubacteriaScientific Name: Rhizobium trifoliiImage Courtesy of: Dazzo, FrankImage Width: 2 micronsImage Technology: TEM

Cell surface components like capsular polysaccharides (KPS), exopolysaccharides (EPS) or lipopolysaccharides (LPS) may play a role in an additional signalling process and/or protect bacteria against plant defence.

Characteristics Of Rhizobium:

•All rhizobium are root nodulating gram negative, non spore forming bacteria•Rhizobium are strictly aerobic .•The cells are rod shaped and are 0.5-0.9 µm x 1.2-3.0 µm size. • Rhizobium contain the enzyme complex called nitrogenase • They are typically motile. T move by a single polar flagellum or two to six peritrichous flagella.•They are chemoorganotrophic and grow well in the presence of oxygen and utilize a wide range of relatively simple carbohydrates and amino compounds.• It is incapable of fixing atmospheric nitrogen on ordinary media but can only do so in nodules on roots of a legume partner.

• Rhizobium is surrounded by a slimy capsule made of exopolysaccharide, which protects it from drying out. And it also helps the bacterium stick to root hairs during various stages of its life cycle.

• Rhizobium is a type of nitrogen fixing bacteria that lives in soil and forms a symbiotic association with the root cells of leguminous plants.

• The Rhizobium are host specific, e.g., one species of Rhizobium seems able to nodulate only one species of legume…??

• Colonies are white pigmented, circular, convex, semi-translucent, raised and mucilaginous

FAKTOR YANG MEMPENGARUHI PERTUMBUHAN & AKTIVITAS

• Temperatur• Kosentrasi Hidrogen / pH

• Nutrisi mineral

Temperatur

• Temperature for bacteroid tissue formation in nodules appears to be 20-30°C,

• nitrogen fixation in the range of 12-32°C.

• Among the tropical legumes, the bacterial strains was most effective at 33°C on soybean.

Nitrogenase activity was higher in the temperature range of 24 to 33°C with little activity beyond the upper limit

Konsentrasi Hidrogen / pH

• Acid conditions of soil result in deficiencies of calcium, magnesium and potassium, soil acidity may lead to reduced uptake of molybdenum which can be corrected by liming.

Nutrisi Mineral

• Ca-P atau Ca-S menstimulasi nodulasi• Kekurangan Ca menekan pembentukan

Nodula.• Molibdenum menstimulasi aktivitas

nitrogenase

NH3

Tanaman Rhizobia

Fotosintat

Fix N : 180 – 580 (kg/h/thn)

Hubungan simbiosis mutualisme inang - Rhizobium

Adanya enzim nitrogense; Ketersediaan sumber energi (carbon) Adanya sistem perlindungan enzim

nitrogenase dari inaktivasi oleh oksigen; dan leghemoglobin

Pemindahan yang cepat nitrogen hasil fiksasi dari tempat penambatan nitrogen untuk mencegah terhambatnya enzim nitrogenase

PERSAYARATAN DAN MEKANISME FIKSASI NITROGEN

MEKANISME BIOKIMIA DARI PROSES FIKSASI N2

Enzim nitrogenase

http://www.biosci.ohio-state.edu/pcmb/osu_pcmb/pcmb_lab_resources/pcmb102_activities/n_fixation/rhizobium_nfixation.html

Mekanisme fiksasi N & hubungan interaksi

MEKANISME PEMBENTUKAN NODULA

Gambar 3. (Kanan) Akar dengan nodula dibentuk oleh bakteri (Rhizobium). (Kiri) Nodula Akar berkembang sebagai hasil dari simbiosis antara bakteri Rhizobium dengan rambut akar pada tanaman. (A) Bakteria mengenal rambut akar dan mulai membelah, (B) Masuknya rhizobia ke akar melalui infeksi sehingga bakteria masuk ke dalam sel akar (C) membelah/membagi menjadi bentuk nodula

the physiological events leading to infection can be summarized as follows:

MEKANISME PROSES INFEKSI

Plants release phenolic compounds (flavonoids, yellow molecule) induce the production of specific bacterial lipochitooligosaccharides (LCO or Nod factor, red molecule).This signal triggers the development of symbiotic nodules on host.

(Sumber; Juan E. González, 2006)

ENZIM NITROGENASE• Terdiri dua komponen

– The Fe protein– The MoFe protein

• Tidak dapat aktif sebagai katalis dengan sendirinya

PERANAN FERREDOXIN DAN FE-MO DALAM ENZIM NITROGENASE

• Ferredoxin mereduksi Fe protein

Mengikat dan menghidrolisis ATP pada Fe protein menyebabkan perubahan protein Fe yang memberikan fasilitas terjadinya reaksi

• Fe protein mereduksi MoFe protein, dan MoFe protein mereduksi N2

BEBERAPA REAKSI YANG DIKATALISIS ENZIM NITROGENASE

N2 = N=N (79%)

TEKNIK KULTUR RHIZOBIUM

Akar legum segar dari lapangan dibersihkan dengan air untuk membuang semua tanah dan partikel organik.

Akar yang terinfeksi nodula dipotong hingga 2-3 mm setiap bagian dari nodula, utuh dan tidak rusak. Celupkan selama 10 detik ke dalam etanol 95% atau isopropanol dipindahkan ke larutan sodium hypoklorit 2.5 – 3% (v/v) atau clorox 1 : 1 (v/v) dan rendam selama 4-5 menit.

Nodula dihancurkan dalam pipa steril dengan tangkai gelas steril (+)kan air & piring berisi lapisan pada permukaan YMA (Yeast Manitol Agar) berisi congo red. Cawan petri yang berisi inokulan diinkubasi pada suhu 25-28 0C selama 3 -10 hari, bergantung pada strain dan penampakan koloni yang spesifik. Koloni rhizobia adalah mucoid, bundar/bulat dan menunjukkan sedikit atau tidak ada absorpsi congo red. Isolat dari koloni rhizobia tunggal kemudian dimurnikan dan disebut sebagai Rhizobium

1. ISOLASI STRAINS RHIZOBIA

Mengumpulkan dan menyiapkan nodula akar di lapangan

2. Indentifikasi tanaman inang

3. Identifikasi Tanah

1. Indentifikasi

Lokasi

2. ISOLASI DARI NODULA SEGAR

Produksi massal inokulan (Rao, 1987)

Inokulasi Legume

1. Bentuk culture cair (yeast extract mannitol broth) langsung diinokulasikan ke dalam tanah atau dg cara mencampurkan pada benih.

improved by the use of 10% sugar or .40% neutral gum arabic in the suspending fluid.

2. Bentuk padat : menggunakan carrier.Bahan carrier : • gambut, a 200 mesh sieve dinetralakna dg CaCO3,.• arang sekam,• dedak,.• Bahan organik/ kompos • Campuran.

Fungsi Carrier :• Menjaga viabilitas sel .• Meningkatkan ketahanan sel rizobiua terutama dalam

konsisi kering.• Meningkatakan kepadatan sel.

Cara aplikasi :1. Lansgung dicampurkan dg benih 2. 25 g of inokulan ditambah 100 ml air atau larutan gula

dan gum arab camapuran slurry diapalikasikan pada benih.

Mikroba endofitik adalah mikroba yang seluruh atau

sebagian dari siklus hidupnya menempati jaringan

tanaman hidup dan tidak menyebabkan infeksi yang nyata seperti gejala penyakit pada

tanaman (Sturz dan Nowak, 2000).

ENDOFITIK

These images confirm the presence of endophytic bacteria (labeled with green fluorescent protein) on the surface of a poplar root (A, arrows), and in the interior of a poplar root shown in cross-section (B) and lateral sections (C and D).

(Walsh & Genzer, 2009)

Endophytes are of agronomic interest as they can enhance plant growth in non-leguminous crops and improve their nutrition through nitrogen fixation (Boddey et al 2003).

Endophyte fungal, actinomycetal, bacterial .

Endophytic bacteria reside within the interior of plants without causing disease or forming symbiotic structures. Thus, they inhabit various tissues of seeds, roots, stem and leaves (Johri 2006).

Majority of them are non-specific regarding their host preference which holds greater promises for plant growth promotion and increased yield in agriculturally important grasses such as sugarcane (Saccharum sp), rice (Oryza sativa), wheat (Triticum aestivum), sorghum ((Sorghum bicolor), maize (Zea mays), Panicum maximum, Brachiaria spp and Pennisetum purpureum

Mekanisme invasi bakteri endofitikQuadt-Hallmann et al.,1997. menjelaskan:

Beberapa cara masuknya bakteri • Melalui stomata, lentisel, luka termasuk • trachoma yang rusak, titik tumbuh akar lateral • radikula yang sedang tumbuh, • jaringan akar meristematik yang tidak terdiferensiasi.• serangan pada dinding sel rambut akar, • melalui proses enzimatik: degradasi ikatan polisakarida dinding sel. jalan alternatif lainnya diduga bakteri masuk melalui penyerapan unsur hara tanaman secara pasif akibat transpirasi tanaman.

Bell dkk. (1995): adanya enzim hidrolitik yang dapat membedakan antara mikroba endofitik dengan mikroba rizosfer.

Fig. 1. Model of leaf colonization by phyllobacteria.

Efek Endofitik terhadap tanaman Mempercepat pertumbuhan tanaman inang.

Walsh & Genzer, 2009

Endofit tanaman yang terinfeksi sering tumbuh lebih cepat dari yang tidak terinfeksi , melalui mekanisme:

(Gangwar & Kaur, 2009 Walsh & Genzer, 2009), Setiawati et al, 2009,, ) Fiksasai N2 udara : suplay N bagi tanaman produksi endofit phytohormones seperti asam asetat indole-3¬ (IAA), sitokinin, sekresi siderophores (Fe chelating ligan) endofitik bisa meningkatkan serapan nutrisi seperti nitrogen dan fosfor. Enzim dan produk metabolit lain yg memacu pertumbuhan tanaman sebagai Pelarut fosfat memprouksi antipatogen substances, hydrogen cianide

(

MEKANISME INTERAKSI SIMBIOSI ANTARA TANAMAN DG ENDOFITIK (Usuki 1 &Narisawa 2, 2007)

Konsep Pertukaran nutrisi antar Endofitik dg tanaman inang

Dari Bakteri ; 1. Endofitik memfiksasi N suplay NH3 untuk tanaman 2. Endofitik menghasilakn fitohormon : IAA, Sitokini dan berbagai senyawa lain.

Dari Tanaman : Transfer karbon/ gula dan asam amino .

Jenis Gula terutama sukrosa dan glukosa untuk endofitik

(Sumber ; Safiyh Taghavi et al., 2008)1

Metabolic pathways involved in the production of plant growth hormones (IAA, diacetyl, acetoin, and 2,3-butanediol) found on the genomes of selected endophytic bacteria

Prosedur Isolasi Bakteri Endofitik dari Jaringan Tanaman( Suto (2001):

1. Tanaman dicuci dengan air yang mengalir lalu dibilas dengan akuades.2. Bagian tanaman dipisahkan : atas bagian yang tua, sedang dan muda. 3. Ketiga bagian tersebut secara terpisah dipotong-

potong dengan panjang 1 cm.4. Potongan tanaman disterilisasi permukaannya

dengan direndam pada alkohol 75 % selama 2 menit.5.Tanaman yang sudah steril permukaannya dimaseras (ditumbuk) dengan mortar steril.

6. Lakukan pengenceran sampai 10-2 dengan larutan buffer fosfat.7. Ekstrak tanaman yang dihasilkan yang mengandung

bakteri endofitik dimasukkan kedalam ampul steril dan disimpan di lemari pendingin.8. Isolasi bakteri endofitik dari ekstrak tanaman dilakukan dengan menginokulasikan 0,1 ml ekstrak

tanaman pada media nutrien agar 10 %. dan diinkubasikanselama 3 hari sampai satu minggu

CARA APLIKASI ENDOFITIK

1. Aplikasi langsung semprot inokulan pada bagian tanaman 2. Campur dengan benih saat tanaman3. Perendaman benih sebelum tanam

AZOLLA

Deskripsi

• Paku air: mengapung di permukaan air• Ukuran : 0.8-2.5 cm long with tiny scale-like 2- lobed leaves; lobes each 1-2 mm long; • Warna daun : Hujau atau kemerahan.• Main stem with pinnate branches; branches longer towards base giving plant a triangular shape.• Roots with fine lateral rootlets, appearing feathery.• Produces both male and female spores.

Distribution

Native to tropical Africa, South Africa, India, China, Japan, Malaysia, Philippines, Vietnam, New Guinea, Australia, Bangladesh, Pakistan, Sri Lanka, Korea, Southeast Asia, New Zealand, Indonesia

HabitatSubtropical and tropical; in lakes, slow moving streams and rivers, marshes (rawa), ponds, wetlands, paddy fields, ditches(parit)

General information

• Azolla pinnata has been used for centuries in Southeast Asia as a fertilizer in rice production.

• A. pinnata's symbiotic relationship with the cyanobacteria Anabaena azollae, which fixes nitrogen and grows in a cavity in the dorsal lobe of the fern's leaves.

• A. pinnata dies in the summer heat and the decaying plants release nitrogen to the soil.

• A. pinnata is also considered a weed, however. It can quickly spread to cover open areas of water.

Blue green algae (pemfiksasi N) simbion pada tanaman Azolla (Anabaena azollae)

KARAKTERISTIK Pertumbuhan Azolla :

•Laju pertum-buhan Azolla adalah 0,355 – 0,390 gram per hari (di laboratorium) dan 0,144 – 0,860 gram per hari (di lapang).

•Pada umumnya biomassa Azolla maksimum tercapai setelah 14 –28 hari setelah inokulasi.

•Dengan menginoku-lasikan 200 g Azolla segar per m2 setelah 3 minggu, Azolla tersebut akan menutupi seluruh permukaan lahan tempat Azolla tersebut ditumbuhkan. 30 – 45 kg N/ha setara dengan 100 kg urea.

• Tumbuh lebih baik pada musim penghujan daripada musim kemarau.

Kegunaan :

• Sumber N dapat mengganti pupuk urea sampai 100 kg• Pakan ternak/hijauan, pakan ikan, terutama ayam dan itik• Menekan pertumbuhan gulma• Tanaman hias• Kontrol terhadap perkembangan nyamuk• Menahan gulma• Stimulan dalam bioremediasi • Pelindung bibit dalam kemasan

Azolla segar dapat melindungi bibit Aren , sawit 3 – 7 hari.

Cara perbanyakan Azolla

1. Buat stok Azolla dalam bak plastik atau di kolam yang tidak ada ikannya.

2. Semprot/ tamabahkan stok setiap 3 bulan sekali dengan pupuk P ( 1 sendok SP-36 per liter air). Sp-36 digerus halus agar mudah larut dalam air. Stok ini digunakan untuk bibit yang akan ditanam di lapang

3. Bila di lapang petak sawah dibatasi dengan bambu seluas 1m2

Cara lain perbanyakan Azolla

1. Buat media Azolla dalam bak plastik, isi dg 10 kg tanah

2. Tambahkan air sampai tergenang 5 cm di atas permukaan tanah

3. Tambahkan 200 g SP-36 . Sp-36 digerus halus agar mudah larut dalam air. Aduk sampai merata dalam media

4. Tambahakan Amonium molibdat 0,01 – 0,02 g

Cara Aplikasi AzollaA. Penggunaan bIomasa hidup: Tebar Azolla bersamaan atau 1 minggu sebelum padi ditanaman Setelah lapangan penuh dengan Azolla,

lahan dibajak agar Azolla terbenam penaman padi dan Azolla yang tidak terbenam dibiarkan tumbuh.

Azolla yang tumbuh di permukaan ini dapat : ~ mengambil N yang hanyut dan menguap ~ menahan pertumbuhan gulma

B. Dalam bentuk Kompos Azolla proses pengomposan 5 – 7 hari.

C. Pembenaman langsung dg inkubasi 2 minggu.