8/3/2019 BDS Selectiva de DBt Con Rcccoccud

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A P P L I E D AND E N V I R O N M E N T A L M I C R O B I O L O G Y , J a n . 1 9 9 4 , p . 2 2 3 - 2 2 6 V o l . 6 0 , N o . 10 0 9 9 - 2 2 4 0 / 9 4 / $ 0 4 . 0 0 + 0C o p y r i g h t 1 9 9 4 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

S e l e c t i v e D e s u l f u r i z a t i o n o f D i b e n z o t h i o p h e n e b yR h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i s D - 1YOSHIKAZU IZUMI,* TAKASHI OHSHIRO, HIROSHI OGINO, YOSHIMITSU HINE,

AND MASAYUKI SHIMAOD e p a r t m e n t o f B i o t e c h n o l o g y , F a c u l t y o f E n g i n e e r i n g , T o t t o r i U n i v e r s i t y , T o t t o r i 6 8 0 , J a p a nR e c e i v e d 7 J u n e 1 9 9 3 / A c c e p t e d 2 0 O c t o b e r 1 9 9 3

A d i b e n z o t h i o p h e n e ( D B T ) - d e g r a d i n g b a c t e r i u m , R h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i s D - 1 , w h i c h u t i l i z e d DBT a s a s o l es o u r ce o f s u l f u r , w a s i s o l a t e d f r o m s o i l . DBT w a s m e t a b o l i z e d t o 2 - h y d r o x y b i p h e n y l ( 2 - H B P ) b y t h e s t r a i n , a n d2-HBP w a s a l m o s t s t o i c h i o m e t r i c a l l y a c c u m u l a t e d a s t h e d e a d - e n d m e t a b o l i t e o f DBT d e g r a d a t i o n . DBTd e g r a d a t i o n b y t h i s s t r a i n wa s s h o w n t o p r o c e e d a s D BT - * D BT s u l f o n e - - 2 - H B P . DBT a t an i n i t i a lc o nc en tr at i o n o f 0 . 1 2 5 mM w a s c o m p l e t e l y d e g r a d e d w i t h i n 2 d a y s o f c u l t i v a t i o n . DBT a t u p t o 2 . 2 mM w a sr a p i d l y d e g r a d e d b y r e s t i n g c e l l s w i t h i n o n l y 1 5 0 m i n . I t w a s t h o u g h t t h i s s t r a i n h a d a h i g h e r DBT-d e s u l f u r i z i n g a b i l i t y t h a n o t h e r m i c r o o r g a n i s m s r e p o r t e d p r e v i o u s l y .Numerous o r g a n i c s u l f u r c o m p o u n d s a r e f o u n d i n c o a l a n dc r u d e o i l . When t h e s e f o s s i l f u e l s a r e c o m b u s t e d , s u l f u r

d i o x i d e i s r e l e a s e d i n t o t h e a t m o s p h e r e , c a u s i n g a c i d r a i na n d a i r p o l l u t i o n . C h e m i c a l d e s u l f u r i z a t i o n o f p e t r o l e u m i sc a r r i e d o u t b y a n e x p en s i v e h y d r o ge n at i o n p r o c e s s f o r s u l f u rc o m p o u n d s t h a t u s e s i n o r g a n i c c a t a l y s t s a t a h i g h t e m p e r a -t u r e a n d a h i g h p r e s s u r e .R e c e n t l y , m i c r o b i a l d e g r a d a t i o n o f o r g a n i c s u l f u r c o m -p o u n d s h a s a t t r a c t e d a t t e n t i o n f o r i t s p o t e n t i a l a p p l i c a t i o n t ot h e d e s u l f u r i z a t i o n o f c o a l a n d p e t r o l e u m . Am o ng t h e o r -g a n i c s u l f u r c o m p o u n d s p r e s e n t i n f o s s i l f u e l s , d i b e n -z o t h i o p h e n e ( D B T ) a n d i t s d e r i v a t i v e s a r e r e g a r d e d a s r e p -r e s e n t a t i v e s . T h e r e h a v e b e e n s e v e r a l r e p o r t s o n t h ei s o l a t i o n o f D B T - d e g r a d i n g b a c t e r i a b y u s e o f DBT a s am o d e l c o m p o u n d . A B r e v i b a c t e r i u m s p . s t r a i n m i n e r a l i z e dD BT a s a s o l e s o u r c e o f c a r b o n , s u l f u r , a n d e n e r g y v i ab e n z o a t e t o c a r b o n d i o x i d e , s u l f i t e , a n d w a t e r ( 1 0 ) . T h ep a r t i a l m i c r o b i a l d e g r a d a t i o n o f D BT was d e m o n s t r a t e d b yo t h e r r e s e a r c h e r s , a n d m e t a b o l i t e s d e r i v e d f r o m t h e o x i d a -t i o n o f D BT were d e t e c t e d , d e p e n d i n g on t h e s t r a i n a n dc u l t u r e c o n d i t i o n s . U n d e r a e r o b i c c o n d i t i o n s , 3 - h y d r o x y - 2 -f o r m y l b e n z o t h i o p h e n e was f o r m e d b y a P s e u d o m o n a s s p .( 5 ) a n d 1 , 2 - d i h y d r o x y - 1 , 2 - d i h y d r o d i b e n z o t h i o p h e n e a n dd i b e n z o t h i o p h e n e 5 - o x i d e were g e n e r a t e d b y a B e i j e n i n c k i as p . ( 4 ) , a n d u n d e r a na er o b i c c o n d i t i o n s , b i p h e n y l wasf o r m e d b y D e s u l f o v i b n i o d e s u l f u r i c a n s M 6 ( 1 1 ) . T h e p a r t i a lDBT d e g r a d a t i o n p r o d u c t , 3 - h y d r o x y - 2 - f o r m y l b e n z o t h i o -p h e n e , was d e g r a d e d c o m p l e t e l y b y a m i x e d c u l t u r e ( 6 ) .R e c e n t l y , t w o b a c t e r i a l s t r a i n s , C o r y n e b a c t e r i u m s p . s t r a i nSY1 ( 8 ) a n d R h o d o c o c c u s r h o d o c h r o u s IGTS8 ( 2 ) , weres h o w n t o remove o n l y s u l f u r f r o m D B T , c o n v e r t i n g DBT t o2 - h y d r o x y b i p h e n y l ( 2 - H B P ) . T h e s e s t r a i n s a p p e a r p r o m i s i n gf o r t h e i r a b i l i t y t o s e l e c t i v e l y r e m o v e o r g a n i c s u l f u r w i t h o u tt h e l o s s o f c a r b o n a t o m s , w h i c h b r i n g a b o u t e n e r g y . F i g u r e1 s h o w s t h e p r o p o s e d p a t h w a y s o f D BT m i c r o b i a l d e g r a d a -t i o n r e p o r t e d p r e v i o u s l y .We h a v e i s o l a t e d a D B T - d e g r a d i n g b a c t e r i u m , t e n t a t i v e l yi d e n t i f i e d a s R h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i s D - 1 , w h i c h u t i l i z e sD BT a s a s o l e s o u r c e o f s u l f u r . T h i s r e p o r t d e s c r i b e s t h ed e s u l f u r i z a t i o n o f DBT b y g r o w i n g a n d r e s t i n g c e l l s o f s t r a i nD - 1 a n d c o m p a r e s t h e D B T - d e s u l f u r i z i n g a b i l i t y a n d t h e

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r . P h o n e : 8 5 7 - 3 1 - 5 2 6 7 . F a x : 8 5 7 - 3 1 - 0 8 8 1 .2 2 3

DBT m e t a b o l i c p a t h w a y o f R . e r y t h r o p o l i s D - 1 w i t h t h o s e o fR . r h o d o c h r o u s a n d a C o r y n e b a c t e r i u m s p .MATERIALS AND METHODS

M i c r o o r g a n i s m s . S e v e r a l s t r a i n s w h i c h u t i l i z e d D BT a s as o l e s o u r c e o f s u l f u r w e r e i s o l a t e d f r o m 1 5 0 s o i l s a m p l e sf r o m v a r i o u s a r e a s i n J a p a n b y t h e s e l e c t i v e e n r i c h m e n tm e t h o d w i t h medium A ( s e e b e l o w ) s u p p l e m e n t e d w i t h DBTa t 5 . 4 m M . S i n g l e - c o l o n y i s o l a t i o n wa s r e p e a t e d o n t h e s a m emedium c o n t a i n i n g 1 . 5 % a g a r a n d f i n a l l y c a r r i e d o u t o n an u t r i e n t a g a r m e d i u m . A m o n g t h e D B T - u t i l i z i n g s t r a i n s ,s t r a i n D - 1 was u s e d t h r o u g h o u t t h i s w o r k . The s t r a i n wa sm a i n t a i n e d o n s l a n t s o f medium A s u p p l e m e n t e d w i t h D BTa t 5 . 4 mM a n d c o n t a i n i n g 1 . 5 % a g a r .M e d i a a n d g r o w t h c o n d i t i o n s . M e diu m A i s a s u l f u r - f r e es y n t h e t i c med i um c o n t a i n i n g 5 g o f g l u c o s e , 0 . 5 g o fK H 2 P O 4 , 4 g o f K 2 H P O 4 , 1 g o f N H 4 C l , 0 . 2 g o fM g C l 2 - 6 H 2 0 , 0 . 0 2 g o f C a C l 2 , 0 . 0 1 g o f N a C l , 1 0 m l o fm e t a l s o l u t i o n , a n d 1 m l o f v i t am i n m i x t u r e i n 1 , 0 0 0 m l o fd i s t i l l e d w a t e r ( p H 7 . 5 ) . The m e t a l s o l u t i o n c o n t a i n e d 0 . 5 go f F e C l 2 4 H 2 0 , 0 . 5 g o f Z n C l 2 , 0 . 5 g o f MnCl2 4 H 2 0 , 0 . 1g o f N a 2 M o O 4 . 2 H 2 0 , 0 . 0 5 g o f C u C 1 2 , 0 . 0 5 g o fNa2WO4. 2 H 2 0 , a n d 1 2 0 m m o l o f H C l i n 1 , 0 0 0 m l o fd i s t i l l e d w a t e r . T h e v i t a m i n m i x t u r e was c o m p o s e d o f 4 0 0m g o f c a l c i u m p a n t o t h e n a t e , 2 0 0 m g o f i n o s i t o l , 4 0 0 m g o fn i a c i n , 4 0 0 m g o f p y r i d o x i n e h y d r o c h l o r i d e , 2 0 0 m g o fp - a m i n o b e n z o i c a c i d , a n d 0 . 5 m g o f c y a n o c o b a l a m i n i n 1 , 0 0 0m l o f d i s t i l l e d w a t e r ( 9 ) . U n l e s s o t h e r w i s e i n d i c a t e d DBTwas d i s s o l v e d i n e t h a n o l ( 2 7 m M ) a n d a dd e d t o s t e r i l i z e dmedium A . T h e n u t r i e n t a g a r medium was c o m p o s e d o f 1 0 go f p e p t o n e , 7 g o f meat e x t r a c t , 5 g o f y e a s t e x t r a c t , 3 g o fN a C l , a n d 1 5 g o f a g a r i n 1 , 0 0 0 m l o f d i s t i l l e d w a t e r .C u l t i v a t i o n was c a r r i e d o u t a t 3 0 C i n t e s t t u b e s c o n t a i n i n g 5m l o f medium w i t h r e c i p r o c a l s h a k i n g ( 3 0 0 s t r o k e s p e r m i n )o r i n 2 - l i t e r f l a s k s c o n t a i n i n g 5 0 0 m l o f medium w i t h r e c i p -r o c a l s h a k i n g ( 1 0 0 s t r o k e s p e r m i n ) .R e s t i n g - c e l l r e a c t i o n s . S t r a i n D - 1 was g r o w n i n m e diu m Ac o n t a i n i n g D BT a t 0 . 1 3 6 mM i n 2 - l i t e r f l a s k s f o r 2 d a y s . C e l l sw e r e h a r v e s t e d a t 4 ' C b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 , 0 0 0 x g f o r 1 5m i n , w a s h e d o n c e w i t h 0 . 8 5 % N a C l , a n d s t o r e d a t - 2 0 Cu n t i l u s e . The c e l l s were s u s p e n d e d i n 0 . 1 M p o t a s s i u mp h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) . D B T - e t h a n o l s o l u t i o n was a d d e dt o 1 m l o f t h e c e l l s u s p e n s i o n i n a t e s t t u b e ( 1 8 b y 1 8 0 m m ) ,

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A P P L . E N v I R O N . M I C R O B I O L .0 . 1 6 r

_ 0 . 1 2I IV X .mx0 . 0 8

\l k 0 m0 . 0 4

0, o i - . i . 2 - "VI - ' ' O ' "'

F I G . 1 . P r o p o s e d p a t h w a y s o f DBT d e g r a d a t i o n . ( I ) DBT. ( I I )1 , 2 - D i h y dr o x y - 1 , 2 - d i h y d r o d i b en z o t h i o p h e n e . ( I I I ) 3 - H y d r o x y - 2 -f o r m y l b e n z o t h i o p h e n e . ( I V ) B i p h e n y l . ( V ) B e n z o i c a c i d . ( V I )2 - H B P . ( V I I ) D i b e n z o t h i o p h e n e 5 - o x i d e .

8

z- 0 . 6

0

a0" o 4

2

0 o0 2 0 4 0 6 0 8 0C u l t i v a t i o n t i m e ( h )

F I G . 2 . D BT u t i l i z a t i o n b y R . e r y t h r o p o l i s D - 1 . T h e s t r a i n wasc u l t i v a t e d i n medium A s u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 1 2 5 mM DBT a s a s o l es o u r c e o f s u l f u r . S y m b o l s : 0 , g r o w t h ; A , p H ; 0 , D B T ; * , 2 - H B P .O D 6 6 0 , o p t i c a l d e n s i t y a t 6 6 0 nm.

a n d t h e r e s t i n g - c e l l r e a c t i o n was a l l o w e d t o p r o c e e d a t 3 0 Cw i t h r e c i p r o c a l s h a k i n g a t 3 0 0 s t r o k e s p e r m i n .A n a l y t i c a l m e t h o d s . G r o w t h wa s m e a s u r e d t u r b i d i m e t r i -c a l l y a t 6 6 0 n m . D e t e r m i n a t i o n o f D BT a n d i t s m e t a b o l i t e swas c a r r i e d o u t b y g a s c h r o m a t o g r a p h y . T h e c u l t u r e b r o t h o rt h e r e a c t i o n m i x t u r e w i t h r e s t i n g c e l l s i n a t e s t t u b e wasa c i d i f i e d t o pH 2 . 0 w i t h 1 N HCl a n d e x t r a c t e d w i t h a n 0 . 8v o l u m e o f e t h y l a c e t a t e . A p o r t i o n o f t h e e t h y l a c e t a t e l a y e rwas r e m o v e d a n d c e n t r i f u g e d , a n d 5 , u l o f t h e s u p e r n a t a n twas i n j e c t e d i n t o a g a s c h r o m a t o g r a p h ( G C - 1 4 A ; S h i m a d z u ,K y o t o , J a p an ) w i t h a f l a m e i o n i z a t i o n d e t e c t o r . T h e g a sc h r o m a t o g r a p h was e q u i p p e d w i t h a g l a s s c o l u m n ( 3 . 2 mmb y 1 m ) p a c k e d w i t h S i l i c o n e O V - 1 7 , 2 % C h r o m o s o r bWAW DMCS 8 0 / 1 0 0 (GL S c i e n c e s , T o k y o , J a p a n ) . T h e f l o wr a t e o f t h e n i t r o g e n c a r r i e r g a s was 1 5 m l / m i n . T h e c o l u m nt e m p e r a t u r e was p r o g r a m m e d f r o m 1 2 0 t o 2 5 0 C a t 5 C / m i n .T h e i n j e c t o r a n d d e t e c t o r t e m p e r a t u r e s w e r e m a i n t a i n e d a t2 5 0 a n d 3 3 5 C , r e s p e c t i v e l y . D BT a n d i t s m e t a b o l i t e s w e r ea l s o d e t e r m i n e d b y h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y( H P L C ) w i t h a n 8 8 0 - P U pump a n d a n 8 7 5 - U V v a r i a n t -w a v e l e n g t h UV m o n i t o r ( b o t h f r o m JASCO, T o k y o , J a p a n )a n d a L i c h r o s p h e r R P - 1 8 c o l u m n ( p a r t i c l e s i z e , 5 , u m ) ( 4 b y2 5 0 m m ; E . M e r c k AG, D a r m s t a d t , G e r m a n y ) . D e t e c t i o nwa s b a s e d u p o n t h e A 2 8 0 . T h e m o b i l e p h a s e wa s 2 0 mMp o t a s s i u m d i h y dr o g en p h o s p h a t e , t h e pH o f w h i c h wasa d j u s t e d t o 2 . 5 w i t h p h o s p h o r i c a c i d - m e t h a n o l ( 1 : 4 [ v o l /v o l ] ) . T h e f l o w r a t e was 1 m l / m i n . S u l f a t e was d e t e r m i n e dw i t h B a C l 2 b y t h e m e t h o d o f D o d g s o n ( 1 ) .C h e m i c a l s . DBT wa s o b t a i n e d f r o m Wako C h e m i c a l s ,O s a k a , J a p a n . 2-HBP was p u r c h a s e d f r o m N a c a l a i T e s q u e ,K y o t o , J a p a n . DBT s u l f o n e was o b t a i n e d f r o m A l d r i c h ,M i l w a u k e e , W i s . A l l o t h e r c h e m i c a l s w e r e o f a n a l y t i c a lg r a d e , c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e , a n d u s e d w i t h o u t f u r t h e rp u r i f i c a t i o n .

RESULTST a x o n o m i c c h a r a c t e r i s t i c s o f s t r a i n D - 1 . A m o n g t h e i s o -l a t e d s t r a i n s , o n e s t r a i n , d e s i g n a t e d D - 1 , s h o w e d t h e m o s tp o t e n t D B T - u t i l i z i n g a b i l i t y . T h e t a x o n o m i c c h a r a c t e r i s t i c so f t h e s t r a i n w e r e i n v e s t i g a t e d a t t h e N a t i o n a l C ol l ec ti o n o f

I n d u s t r i a l a n d M a r i n e B ac te ri a L t d . ( A b e r d e e n , U n i t e dK i n g d o m ) . S t r a i n D - 1 was a g r a m - p o s i t i v e , i m m o t i l e b a c t e -r i u m w h i c h f o r m e d c o c c o i d a n d s h o r t r o d c e l l s . T h e s t r a i nwas c a t a l a s e p o s i t i v e a n d o x i d a s e n e g a t i v e a n d d i d n o tp r o d u c e a c i d f r o m g l u c o s e f e r m e n t a t i v e l y . T h e s t r a i n g r e w a t3 7 C b u t n o t a t 4 1 C . C o l o n i e s o f t h e s t r a i n on n u t r i e n t a g a rw e r e r o u n d , r e g u l a r , e n t i r e , s m o o t h , s l i g h t l y m u c o i d , p a l eo r a n g e - p i n k , o p a q u e , a n d l o w c o n v e x . T h e d i a m i n o a c i d o ft h e c e l l w a l l o f t h e s t r a i n was m e s o - d i a m i n o p i m e l i c a c i d .C e l l s o f t h e s t r a i n c o n t a i n e d m y c o l i c a c i d s a n d 1 0 - m e t h y lo c t a d e c a n o i c a c i d ( t u b e r c u l o s t e a r i c a c i d ) . T h e s t r a i n u t i l i z e di n o s i t o l , m a n n i t o l , s o r b i t o l , s o d i u m a d i p a t e , s o d i u m c i t r a t e ,g l y c e r o l , t r e h a l o s e , p - h y d r o x y b e n z o i c a c i d , D - m a n n o s e , a c e t -a m i d e , s o d i u m l a c t a t e , a n d s o d i u m g l u t a m a t e b u t n o t m a l -t o s e , r h a m n o s e , m - h y d r o x y b e n z o i c a c i d , s o d i u m b e n z o a t e ,L - t y r o s i n e , o r D - g a l a c t o s e a s a s o l e s o u r c e o f c ar b o n . T h e r e -f o r e , a l t h o u g h i t s u t i l i z a t i o n o f m a l t o s e a n d mannose wa sa t y p i c a l , we t e n t a t i v e l y i d e n t i f i e d t h e s t r a i n a s R . e r y t h r o p -o l i s .DBT u t i l i z a t i o n b y s t r a i n D - 1 . F i g u r e 2 s h o w s t h e t i m ec o u r s e o f D BT u t i l i z a t i o n b y t h e s t r a i n i n medium A s u p p l e -m e n t e d w i t h D BT a t 0 . 1 2 5 mM a s a s o l e s o u r c e o f s u l f u r . T h es t r a i n s h o w e d maximum g r o w t h ( a b o u t 7 u n i t s o f o p t i c a ld e n s i t y a t 6 6 0 n m ) a t 4 2 h o f c u l t i v a t i o n , c o n c u r r e n t w i t h t h ed e p l e t i o n o f DBT. A m et a bo l i t e d et e ct e d i n e t h y l a c e t a t ee x t r a c t s o f t h e c u l t u r e s was i d e n t i f i e d a s 2-HBP b y c o c h r o -m a t o g r a p h y w i t h a u t h e n t i c 2 - H B P , b y g a s c h r o m a t o g r a p h y ,a n d b y HPLC. 2-HBP a c c u m u l a t i o n was a l m o s t e q u i m o l a r t oDBT d e p l e t i o n i n t h e c u l t u r e a n d d i d n o t d e c r e a s e d u r i n gs t a t i o n a r y - p h a s e c u l t i v a t i o n u p t o 7 5 h ( F i g . 2 ) . T h i s f a c ti n d i c a t e d t h a t 2-HBP i s a d e a d - e n d m e t a b o l i t e o f D BTd e g r a d a t i o n b y t h i s s t r a i n . I n a d d i t i o n t o 2 - H B P , a m e t a b o -l i t e d e t e c t e d i n t r a c e a m o u n t s b y g a s c h r o m a t o g r a p h y a n dHPLC wa s i d e n t i f i e d a s D BT s u l f o n e . T h e r e wa s a t r a n s i e n ta p p e a r a n c e o f DBT s u l f o n e i n c u l t u r e s g r o w n o n D BTb e t w e e n t h e e a r l y e x p o n e n t i a l a n d l a t e l o g p h a s e s o f g r o w t h .T h e pH d e c r e a s e d d u r i n g t h e c u l t i v a t i o n .G r o w t h s p e c i f i c i t y o f a l t e r n a t e s u l f u r s o u r c e s . T h e s t r a i nwa s c u l t i v a t e d i n medium A w i t h 2 5 m g o f v a r i o u s s u l f u rc o m p o u n d s p e r l i t e r a s a s o l e s o u r c e o f s u l f u r f o r 7 d a y s( T a b l e 1 ) . T h e s t r a i n g r e w w e l l o n DBT, D BT s u l f o n e ,

Q7;7cYHOHOH

f-l, A l o

V I IV i I

2 2 4 IZUMI ET AL.

8/3/2019 BDS Selectiva de DBt Con Rcccoccud

3/4

SELECTIVE MICROBIAL DIBENZOTHIOPHENE DESULFURIZATION 2 2 5TABLE 1 . S u l f u r compound s p e c i f i c i t y o f R . e r y t h r o p o l i s a

R e s u l t a f t e r t h e f o l l o w i n gc u l t i v a t i o n t i m e :S u l f u r c o m p o u n d 3 d a y s 7 d a y s

G r o w t h pH G r o w t h pH( O D 6 6 ) p H ( O D 6 w ) pNone 0 . 1 7 . 2 0 . 1 7 . 1D BT 6 . 4 4 . 9 6 . 6 4 . 5D BT s u l f o n e 3 . 0 6 . 5 5 . 0 6 . 0T h i o p h e n e 0 . 3 7 . 1 0 . 6 6 . 92 - M e t h y l t h i o p h e n e 0 . 1 7 . 2 0 . 2 7 . 13 - M e t h y l t h i o p h e n e 0 . 1 7 . 2 0 . 1 7 . 22 - E t h y l t h i o p h e n e 0 . 2 7 . 2 0 . 3 7 . 1B e n z o t h i o p h e n e 0 . 1 7 . 1 0 . 2 7 . 1T h i o p h e n e 2 - c a r b o x y l i c a c i d 0 . 1 7 . 2 0 . 1 7 . 2T h i o p h e n e 2 - a c e t i c a c i d 0 . 1 7 . 2 0 . 1 7 . 2T h i a n t h r e n e 0 . 2 6 . 9 0 . 5 6 . 7T h i o x a n t h e n - 9 - o n e 1 . 1 6 . 6 4 . 1 6 . 4B e n z e n e s u l f o n i c a c i d 0 . 1 7 . 2 0 . 1 7 . 2B e n z e n e s u l f i n i c a c i d 0 . 1 7 . 2 0 . 1 7 . 2p - T o l u e n e s u l f o n i c a c i d 0 . 1 7 . 2 0 . 1 7 . 2D i m e t h y l s u l f a t e 0 . 1 7 . 2 0 . 2 7 . 2D i m e t h y l s u l f o n e 5 . 8 5 . 2 6 . 8 4 . 1D i m e t h y l s u l f o x i d e 0 . 1 7 . 2 0 . 1 7 . 2D i m e t h y l s u l f i d e 0 . 2 7 . 2 0 . 1 7 . 2M e t h a n e s u l f o n i c a c i d 5 . 3 4 . 2 6 . 1 4 . 12 - M e r c a p t o e t h a n o l 4 . 1 5 . 4 4 . 8 4 . 7A m m o n i u m s u l f a t e 4 . 3 6 . 1 5 . 1 5 . 8S u l f u r 4 . 8 6 . 1 5 . 8 5 . 8

a E a c h s u l f u r c o m p o u n d w a s a d d e d t o med i um A a t a n i n i t i a l c o n c e n t r a t i o no f 2 5 m g / l i t e r . V o l a t i l e c o m p o u n d s , t h i o p h e n e , 2 - m e t h y l t h i o p h e n e , 3 - m e t h -y l t h i o p h e n e , 2 - e t h y l t h i o p h e n e , a n d b e n z o t h i o p h e n e , w e r e f e d t o t h e c u l t u r e sa t a c o n c e n t r a t i o n o f 2 5 m g / l i t e r a g a i n a f t e r 3 d a y s o f c u l t i v a t i o n . ODW,o p t i c a l d e n s i t y a t 6 6 0 n m .

t h i o x a n t h e n - 9 - o n e , d i m e t h y l s u l f o n e , m e t h a n e s u l f o n i c a c i d ,2 - m e r c a p t o e t h a n o l , e l e m e n t a l s u l f u r , a n d amm on iu m s u l -f a t e , a l l y i e l d i n g a d e c r e a s e i n t h e pH o f t h e m e d i u m .H o w e v e r , t h e g r o w t h o f t h e s t r a i n o n t h e t h i o p h e n e d e r i v a -t i v e s t e s t e d was n e g l i g i b l e .DBT d e g r a d a t i o n b y r e s t i n g c e l l s . T h e d e s u l f u r i z a t i o n o fDBT was i n v e s t i g a t e d w i t h v a r i o u s a m o u n t s o f r e s t i n g c e l l s( F i g . 3 ) . T h e c o n v e r s i o n o f DBT t o 2-HBP a p p e a r e d t h e m o s te f f i c i e n t i n r e a c t i o n m i x t u r e s c o n t a i n i n g 2 1 m g o f c e l l s . I t wasa l m o s t s t o i c h i o m e t r i c i n t h e r e s t i n g - c e l l r e a c t i o n m i x t u r e( d a t a n o t s h o w n ) . H o w e v e r , i n r e a c t i o n m i x t u r e s w i t h am u ch h i g h e r c e l l d e n s i t y , D BT d e g r a d a t i o n was o b s e r v e d t ob e s i g n i f i c a n t l y r e t a r d e d . T h i s f a c t m ay i n d i c a t e t h a t o x y g e ni s a l i m i t i n g f a c t o r f o r DBT d e g r a d a t i o n b y t h e c e l l s . T h ea v a i l a b i l i t y o f a w a t e r - i n s o l u b l e s u b s t r a t e ( D B T ) t o t h er e s t i n g c e l l p o p u l a t i o n m ay h a v e c a u s e d t h e s c a t t e r i n g o fd a t u m p o i n t s i n F i g . 3 . S u l f a t e was d e t e c t e d i n r e a c t i o nm i x t u r e s w i t h r e s t i n g c e l l s , b u t t h e amount o f s u l f a t e d e -t e c t e d was s m a l l a n d n o t s t o i c h i o m e t r i c t o t h e amount o fDBT c o n v e r t e d t o 2-HBP ( d a t a n o t s h o w n ) . DBT d e g r a d a -t i o n i n r e a c t i o n m i x t u r e s c o n t a i n i n g v a r i o u s amounts o f D BTwas e x a m i n e d . D BT a t u p t o 2 . 2 mM ( a p p r o x i m a t e l y 4 0 0m g / l i t e r ) was c o m p l e t e l y d e g r a d e d w i t h i n 1 5 0 m i n ( d a t a n o ts h o w n ) . A l m o s t t h e same d e g r a d a t i o n r a t e was o b s e r v e d i nr e a c t i o n m i x t u r e s c o n t a i n i n g u p t o a b o u t 3 mM DBT ( d a t an o t s h o w n ) , i n d i c a t i n g no s u b s t r a t e i n h i b i t i o n b y DBT.

DISCUSSIONA n e w D B T - d e g r a d i n g b a c t e r i u m , t e n t a t i v e l y i d e n t i f i e d a sR . e r y t h r o p o l i s D - 1 , u t i l i z e s DBT a s a s o l e s o u r c e o f s u l f u r .

1 . . 0

0 . 80 O . 6

0 0 . 40 . 20 . 0 0 3 0 6 0 9 0 1 2 0 1 5 0

R e a c t i o n t i m e ( m i n )F I G . 3 . E f f e c t o f c e l l d e n s i t y o n D BT d e g r a d a t i o n b y r e s t i n g c e l l so f R . e r y t h r o p o l i s D - 1 . T h e r e a c t i o n m i x t u r e c o n t a i n e d DBT a t a ni n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 8 m M . S y m b o l s ( i n d i c a t i n g c e l l d e n s i t y , i nm g [ d r y w e i g h t ] p e r m l ) : 0 , 4 . 2 ; * , 1 1 ; A , 2 1 ; A , 4 2 ; E l , 8 4 .

T h e s t r a i n s h o w e d e f f i c i e n t D B T - d e s u l f u r i z i n g a b i l i t y . D BTa t a n i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 1 2 5 mM wa s c o m p l e t e l yd e g r a d e d w i t h i n 2 d a y s b y g r o w i n g c e l l s , w h e r e a s 2 . 2 mMDBT was c o n v e r t e d t o 2-HBP w i t h i n 1 5 0 m i n b y r e s t i n gc e l l s . S u c h a n e f f i c i e n t c o n v e r s i o n o f D BT h a s n o t b e e nr e p o r t e d f o r o t h e r D B T - o x i d i z i n g m i c r o o r g a n i s m s . F o r e x -a m p l e , i t t o o k 4 8 h f o r 5 . 4 mM D BT t o b e r e du c e d t o 10% b yr e s t i n g c e l l s o f R . r h o d o c h r o u s I G T S 8 ( 2 ) , b u t r e a c t i o nc o n d i t i o n s w e r e n o t i d e n t i c a l .The m e t a b o l i s m o f D BT b y a e r o b i c m i c r o o r g a n i s m s c a nb e g e n e r a l l y c l a s s i f i e d i n t o t h r e e t y p e s . I n t y p e 1 m e t a b o -l i s m , t h e c a r b o n s k e l e t o n o f D BT i s p a r t i a l l y o x i d i z e d , w i t ht h e C - S b o n d r e m a i n i n g i n t a c t ( 3 ) . I n t y p e 2 m e t a b o l i s m ,D BT s e r v e s a s t h e s o l e s o u r c e o f c a r b o n , s u l f u r , a n d e n e r g y ,w i t h m i n e r a l i z a t i o n p r o c e e d i n g t h r o u g h b e n z o a t e ( 1 0 ) . I nt y p e 3 m e t a b o l i s m , D BT s e r v e s a s t h e s o l e s o u r c e o f s u l f u r .D BT i s d e s u l f u r i z e d b y t h e s e l e c t i v e c l e a v a g e o f t h e C - Sb o n d , r e s u l t i n g i n t h e a c c u m u l a t i o n o f 2-HBP ( 2 , 7 , 8 ) . T h i ss t u d y s h o w s t h a t D BT d e g r a d a t i o n b y s t r a i n D - 1 b e l o n g s t ot y p e 3 m e t a b o l i s m . D BT wa s s t o i c h i o m e t r i c a l l y c o n v e r t e d t o2-HBP b y t h i s s t r a i n , i n d i c a t i n g t h a t 2-HBP r e p r e s e n t s ad e a d - e n d m e t a b o l i t e o f D BT m e t a b o l i s m . S u l f a t e p r o d u c t i o nd u r i n g t h e d e g r a d a t i o n o f D BT b y r e s t i n g c e l l s wa s n o ts t o i c h i o m e t r i c t o t h e a m o u n t o f D BT c o n v e r t e d t o 2 - H B P ,p r o b a b l y b e c a u s e s u l f a t e was i n c o r p o r a t e d by t h e c e l l s . T h i ss t r a i n d i d n o t g r o w o n D BT a s a s o l e s o u r c e o f c a r b o n ( d a t an o t s h o w n ) . I n a d d i t i o n t o 2 - H B P , a t r a c e a m o u n t o f D BTs u l f o n e wa s d e t e c t e d i n c u l t u r e s g r o w n o n DBT. T h i s s t r a i nu t i l i z e d D BT s u l f o n e a s a s o l e s o u r c e o f s u l f u r . In t h er e s t i n g - c e l l r e a c t i o n , a d d e d 1 mM D BT s u l f o n e wa s c o n -v e r t e d t o 0 . 3 mM 2-HBP a f t e r 1 2 0 m i n, a n d n o DBT wa sd e t e c t e d a s a b y - p r o d u c t ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e r e f o r e , DBTd e g r a d a t i o n b y t h i s s t r a i n wa s a s s u m e d t o p r o c e e d a s D BT- - DBT s u l f o n e - - 2 - H B P . T h e m e t a b o l i c p a t h w a y i s s i m i l a rt o t h a t p r o p o s e d f o r DBT d e g r a d a t i o n b y C o r y n e b a c t e n u ms p . s t r a i n SY1 ( 8 ) a n d R . r h o d o c h r o u s IGTS8 ( 2 , 7 ) . W i t h t h i st y p e o f D BT d e g r a d a t i o n , t h e r e i s n o l o s s o f t h e c a r b o na t o m s o f DBT, a n d o n l y t h e DBT s u l f u r atom i s e l i m i n a t e d .T h i s t y p e o f D BT d e g r a d a t i o n m ay b e o f p o t e n t i a l a d v a n t a g ef o r t h e m i c r o b i a l d e s u l f u r i z a t i o n o f f o s s i l f u e l s a n d c a n b ee x t e n d e d t o o t h e r DBT d e r i v a t i v e s , s u c h a s 4 , 6 - d i a l k y l -DBT, w h i c h a r e a c t u a l f o r m s o f DBT p r e s e n t i n s u c h f u e l s .

V O L . 6 0 , 1 9 9 4

8/3/2019 BDS Selectiva de DBt Con Rcccoccud

4/4

2 2 6 IZUMI ET AL . A P P L . E N v I R O N . M I C R O B I O L .REFERENC ES

1 . D o d g s o n , K . S . 1 9 6 1 . D e t e r m i n a t i o n o f i n o r g a n i c s u l f a t e i ns t u d i e s on t h e e n z y m i c a n d n o n - e n z y m i c h y d r o l y s i s o f c a r b o -h y d r a t e a n d o t h e r s u l p h a t e e s t e r s . B i o c h e m . J . 7 8 : 3 1 2 - 3 1 9 .2 . G a l l a g h e r , J . R . , E . S . O l s o n , a n d D . C . S t a n l e y . 1 9 9 3 . M i c r o b i a ld e s u l f u r i z a t i o n o f d i b e n z o t h i o p h e n e : a s u l f u r - s p e c i f i c p a t h w a y .FEMS M i c r o b i o l . L e t t . 1 0 7 : 3 1 - 3 6 .3 . Kodama, K . , S . N a k a t a n i , K . U m e h a r a , K . S h i m i z u , Y . M i n o d a ,a n d K . Yamada. 1 9 7 0 . M i c r o b i a l c o n v e r s i o n o f p e t r o - s u l f u rc o m p o u n d s . P a r t I I I . I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f p r o d u c t sf r o m d i b e n z o t h i o p h e n e . A g r i c . B i o l . Chem. 3 4 : 1 3 2 0 - 1 3 2 4 .4 . L a b o r d e , A . L . , a n d D . T . G i b s o n . 1 9 7 7 . M e t a b o l i s m o f d i b e n -z o t h i o p h e n e b y B e i j e n i n c k i a s p e c i e s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l .3 4 : 7 8 3 - 7 9 0 .5 . M o n t i c e l l o , D . J . , D . B a k k e r , a n d W. R . F i n n e r t y . 1 9 8 5 . P l a s m i d -m e d i a t e d d e g r a d a t i o n o f d i b e n z o t h i o p h e n e b y P s e u d o m o n a ss p e c i e s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 9 : 7 5 6 - 7 6 0 .6 . M o r m i l e , M. R . , a n d R . M . A t l a s . 1 9 8 8 . M i n e r a l i z a t i o n o f t h ed i b e n z o t h i o p h e n e b i o de g r ad at i o n p r o d u ct s 3 - h y d r o x y - 2 - f o r m y l

b e n z o t h i o p h e n e a n d d i b e n z o t h i o p h e n e s u l f o n e . A p p l . E n v i r o n .M i c r o b i o l . 5 4 : 3 1 8 3 - 3 1 8 4 .7 . O l s o n , E . S . , D . C . S t a n l e y , a n d J . R . G a l l a g h e r . 1 9 9 3 . C h a r a c -t e r i z a t i o n o f i n t e r m e d i a t e s i n t h e m i c r o b i a l d e s u l f u r i z a t i o n o fd i b e n z o t h i o p h e n e . E n e r g y F u e l s 7 : 1 5 9 - 1 6 4 .8 . O m o r i , T . , L . M o n n a , Y . S a i k i , a n d T . Kodama. 1 9 9 2 . D e s u l -f u r i z a t i o n o f d i b e n z o t h i o p h e n e b y C o r y n e b a c t e n u m s p . s t r a i nS Y L . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 8 : 9 1 1 - 9 1 5 .

9 . S a k a z a w a , C . , M. S h i m a o , Y . T a n i g u c h i , a n d N . K a t o . 1 9 8 1 .S y m b i o t i c u t i l i z a t i o n o f p o l y v i n y l a l c o h o l b y m i x e d c u l t u r e s .A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 1 : 2 6 1 - 2 6 7 .1 0 . v a n A f f e r d e n , M . , S . S c h a c h t , J . K l e i n , a n d H . G . T r u p e r . 1 9 9 0 .D e g r a d a t i o n o f d i b e n z o t h i o p h e n e b y B r e v i b a c t e r i u m s p . DO.A r c h . M i c r o b i o l . 1 5 3 : 3 2 4 - 3 2 8 .1 1 . Y e o n g , K . H . , T . S . K i m , a n d B . H . K i m . 1 9 9 0 . D e g r a d a t i o n o fo r g a n i c s u l f u r c o m p o u n d s a n d t h e r e d u c t i o n o f d i b e n -z o t h i o p h e n e t o b i p h e n y l a n d h y d r o g e n s u l f i d e . B i o t e c h n o l . L e t t .1 2 : 7 6 1 - 7 6 4 .