__________________________________________________________Revista Cientfica, FCV-LUZ / Vol. XIII, N 3, 187-192, 2003

PROTELISIS DE LA LECHE CRUDA ALMACENADA EN FRO.EFECTO DE LAS ENZIMAS PROTEOLTICAS SOBRE

LA INTEGRIDAD DE LAS CASENASProteolysis During Cold Storage of Refrigerated Raw Milk. Effect of Proteolytic

Enzymes on Casein Integrity

Lourdes Guerrero, Sol Romn y Lidis Pacheco

Laboratorio de Productos Lcteos, Ncleo Universitario Rafael Rangel, Universidad de Los Andes. Trujillo, Venezuela.

RESUMEN

Con la finalidad de evaluar el efecto de las enzimas proteolticassobre la integridad de las casenas, se midi la protelisis cuali-tativa y cuantitativamente. Para ello se seleccionaron cuatro in-dustrias lcteas ubicadas en los estados Zulia, Trujillo y Mrida.Se tomaron un total de 107 muestras de leche cruda almacena-da en silos a temperatura de refrigeracin, las mismas fueronprocesadas para realizar anlisis qumicos y microbiolgicos.Se discuten los resultados a la luz de los anlisis de los perfileselectroforticos, mtodo de Hull, recuentos de bacterias psicr-trofas y proteolticas. Los datos fueron procesados medianteanlisis de varianza con procedimientos del SAS. Los resulta-dos mostraron que la leche cruda presentaba una buena cali-dad qumica, no as su calidad higinica. En general, no se ob-serv protelisis de las casenas por la tcnica de la electrofore-sis a pesar de encontrarse recuentos de bacterias psicrtrofasentre 106 y 107 UFC/mL. Sin embargo, los resultados de laprueba de Hull revelaron que las leches crudas almacenadas enfro por ms de dos das presentaron una moderada actividadproteoltica. Por lo tanto, se recomienda que aquellas lechescon alto contenido de bacterias psicrtrofas no deberan ser al-macenadas en fro por ms de dos das, cuando las mismasvan a ser utilizadas para la elaboracin de queso.

Palabras clave: Leche, protelisis, bacterias psicrtrofas, en-zimas proteolticas, casenas.

ABSTRACT

In order to evaluate the effect of proteolytic enzymes on caseinintegrity, qualitative and quantitative proteolysis were meas-ured. Four dairy industries located at Zulia, Trujillo and Mridastates were selected. A total of 107 samples of raw milk, stored

under refrigeration in bulk tanks, were collected and processedby chemical and microbiological analysis. On the basis of elec-trophoretic profiles, the Hull method, psychrotrophic bacteriaand proteolytic psychrotrophic bacteria count analysis, resultsare discussed. Data were processed by analysis of variancewith SAS procedure. Results showed a good chemical quality,but not hygienic quality in raw milk. No proteolysis of caseinswas observed with the electrophoresis method, in spite of thefact that psychrotrophicic bacteria counts were found to be be-tween 106- 107 UFC/mL. However, results of the Hull methodshowed that refrigerated raw milk stored for two days or moreproduced moderate proteolytic activity. It is suggested that rawmilk with high numbers of psychrotrophics bacterias should notbe stored under refrigeration more than two days, before proc-essing it for cheese.

Key words: Milk, proteolysis, psychrotrophic bacteria, proto-lytic enzymes, caseins.

INTRODUCCIN

La Protelisis en la leche tiene dos orgenes: el primeromediante los microorganismos que pueden secretar proteasasexgenas resistentes al calor y muchas de ellas se desarrollandurante el almacenamiento en fro de la leche [10]; el segundoest relacionado con el deterioro de la ubre enferma lo que in-crementa la cantidad de proteasas endgenas, especialmenteaquellas del sistema plasmina-plasmingeno [21].

Gebre-Egziabher y col. [13] sealan que las proteasasde la leche cruda (enzimas exgenas) son producidas por bac-terias psicrtrofas, en especial del gnero Pseudomonas. Es-tos microorganismos pueden crecer con facilidad a temperatu-ra de refrigeracin y son eliminados con temperatura de pas-teurizacin, pero muchas especies producen enzimas extrace-lulares termoresistentes hacia el final del crecimiento exponen-

187

Recibido: 07 / 03 / 02. Aceptado: 08 / 02 / 03.

cial o en fase de crecimiento estacionaria. Martin-Hern-

dez [22] seala que la influencia que tienen estas enzimas so-

bre las caractersticas organolpticas de la leche y productoslcteos, es muy superior en muchos casos a la que puedenejercer las enzimas nativas de la leche. Las casenas de la le

-

che estn sometidas a la accin de estas enzimas proteolti-

cas, las cuales causan desestabilizacin de las micelas de ca-

senas, hidrolizando ms rpidamente a la k-casena (k-CN)en una accin similar a la quimosina del cuajo de ternera. Lab-casena (b-CN) es degradad en menor proporcin que lak-CN y las as1-casena (as1-CN) y las as2-casena (as2-CN)prcticamente no sufren alteracin, segn lo refieren algunosautores [1, 13].

Respecto a las enzimas endgenas, Martin-Herndez[22] , Barbano [6] y Ballou y col. [5] reportan que en la lechecruda la ms importante es la proteasa alcalina anloga a laplasmina del suero sanguneo. La plasmina presente en la le-che est como plasmingeno precursor inactivo y la presenciade las clulas somticas en una concentracin 500.000 cel/mLresulta en la conversin de cantidades significativas de plasmi-ngeno en plasmina, incrementndose la protelisis de las ca-senas. La plasmina acta fundamentalmente sobre la b-CN,las as2-CN y as1-CN siendo ste el orden de susceptibilidad,mientras que la k-CN es resistente. La accin sobre la b-CNconduce a la formacin de las g1, g2 y g3 casena.

La protelisis puede causar en la leche principalmentedos problemas: un decrecimiento en el rendimiento quesero[21] y un deterioro en la composicin y calidad del queso, sa-bor amargo en los productos lcteos procesados, tales comoquesos, leche procesada a ultra alta temperatura (UAT) y le-che pasteurizada [14, 21].

Con la finalidad de estudiar el efecto entre las proteasasexgenas y endgenas presentes en la leche cruda y la pro-telisis de las casenas, se analizaron muestras de leche cru-da almacenada a temperatura de refrigeracin en silos de 4 In-dustrias Lcteas ubicadas en la zona baja del estado Trujillo.La leche fue procesada para realizar anlisis qumicos, micro-biolgicos y actividad proteoltica.

MATERIALES Y MTODOS

MuestreoSe recolectaron un total de 107 muestras de leche cruda

refrigerada de cuatro industrias localizadas en los municipiosSucre, Candelaria y Tulio Febres correspondientes a los esta-dos Zulia, Trujillo y Mrida, respectivamente. La frecuencia demuestreo fue quincenal, durante un ao. Las muestras de le-che fueron recolectadas los das Lunes antes de iniciarse elprocesamiento de la misma, transportadas bajo condicionesde refrigeracin hasta el laboratorio de Productos Lcteos delNcleo Universitario Rafael Rangel. Las caractersticas msimportantes de las industrias se sealan en la TABLA I.

Anlisis QumicoPorcentaje de Casena (CN): La CN se determin por

doble titulacin con formaldehdo (acidimetra) de acuerdo almtodo de Sorensen, recomendado por Boscn [7].

Actividad proteoltica Total (APT) : La APT fue medidade acuerdo al mtodo de Hull, utilizando el reactivo de FollinCiocalteau. Se prepar una curva estndar con tirosina y la acti-vidad fue expresada como miligramos de Tirosina por mililitro(mg Tir/mL) [17]. Nez y Nez [24] sealan que este mtodocuantifica la accin acumulada de las proteasas de los psicr-trofos y de las otras bacterias.

Anlisis MicrobiolgicoRecuento de Bacterias Psicrtrofas Totales (RPT): El

RPT se realiz siguiendo la tcnica de la Norma FIL- IDF 101A: [11]. Las diluciones de las muestras se sembraron en AgarEstndar y se incubaron a 7C 1C por 10 das. El resultadose expres en UFC/mL.

Recuento de Bacterias Psicrtrofas Proteolticas(RPP): El recuento de bacterias psicrtrofas proteolticas serealiz siguiendo el procedimiento de APHA [4]. Las dilucionesse sembraron en Agar Leche y se incubaron a 7C 1C por10 das. El resultado se expreso en UFC/mL.

188

Protelisis de la leche cruda almacenada en fro / Guerrero, L. y col._________________________________________________________

TABLA ICARACTERSTICAS DE LAS INDUSTRIAS LCTEAS*

Industria Municipio/Estado

Volumen de lecherecibida L/da

Nmero de silosy temperaturade almacen.

Volumen de lechepara queso

Tipo de queso Tiempo de Almace.(das)

1 Sucre/Zulia 170.000 5 / 4-6 C 170.000 Madurado 2-32 Candelaria/Trujillo 138.000 7 / 4 C 138.000 Madurado y

Fresco2-3

3 Sucre/Zulia 49.000 1 / 4 C 28.000 Fresco

Recuento de clulas somticas ( RCST): El RCST serealiz de acuerdo a la tcnica descrita Norma FIL-IDF 148A: [12]. Los extendidos de leche se colorearon con el coloranteBroadhurst-Paley recomendado por Shalm y col. [26]. Para lacuantificacin del contaje celular al microscopio se utiliz un fac

-

tor de correccin para el equipo. Los resultados se expresaroncomo recuento de clulas somticas totales por ml (RCST/mL).

Electroforesis Vertical de las Casenas: Para separarlas casenas se precipit la leche a pH 4,4 con cido Acticoconcentrado mediante goteo lento, se agit por 30 min y secentrifug a 1200 rpm durante 5 min. El precipitado se resus-pendi en una solucin de rea 9M+ b-mercaptoetanol 1% yse llev a pH 7,0 con NaOH 1N. La dilucin de las muestras seefectu con agua bidestilada y solucin desnaturalizante(rea-tris-bmercaptoetanol-azul de bromofenol), se sembraron15 mL de las mismas en los geles verticales [15].

La electroforesis vertical (UREA-PAGE) se realiz en unequipo Bio-Rad Miniprotean. La migracin se efectu sobre ge-les discontinuos con 5% poliacrilamida-0,3% bisacrilamida-4,5Mrea. Se utiliz tris-glicina como buffer de migracin ajustado apH 8,9. La migracin dur aproximadamente 45 min. A 30mA/gel. Las protenas se fijaron con cido tricloroactico 12%,se colorearon con azul de Coomasie R250 y decoloraron conuna mezcla de metanol-cido-actico-glicerol (20:5:3) [3].

Anlisis estadsticoLos datos obtenidos fueron sometidos a un anlisis de

varianza utilizando el procedimiento del Modelo Lineal Generaldel paquete estadstico SAS [27], bajo el ambiente UNIX parared, para IBM RS6000, instalada en CECALCULA (Centro Na

-

cional de Clculo) ULA. Cuando se apreciaron diferencias sig-

nificativas entre las medias, stas fueron separadas mediantela prueba de comparacin mltiple de Duncan (P 400x103, umbral indicativo deinfeccin masttica. Segn la clasificacin de Philpot citado porContreras [9], las leches almacenadas en los silos estn en lacategora de leches mezcla sin infeccin masttica, con unabuena calidad sanitaria. Las muestras analizadas abarcan un

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TABLA IIPROMEDIOS Y DESVIACIONES ESTNDAR DE PARMETROS DE CALIDAD DE LA LECHE CRUDA REFRIGERADA

IndustriaParmetro 1 2 3 4 Promedio

Casena (%) 2,610,16 2,630,19 2,450,27 2,480,20 2,540,09APT(mg Tirosina/mL) 0,1770,02a 0,1910,02a 0,1400,03b 0,1680,05a 0,170,02RPT(log UFC/mL 7,300,21 7,230,23 6,950,23 6,780,22 7,060,24RPP(log UFC/mL) 5,790,26 5,860,27 5,410,32 5,160,31 5,560,31RCST(log cel/mL) 5,420,22 5,520,24 5,560,22 5,590,22 5,520,22APT= actividad proteoltica total. RPT= recuento de psicrtofos totales. RPP= recuento de psicrtrofos proteolticos. RCST= recuento de clulassomticas. a,b: medias con diferentes superndices y en una fila difieren significativamente (P

amplio rango que va desde 82x103 hasta 882x103 cel/mL, conuna media de 331x103cel/mL (5,52 log cel/mL) superior al de5,43 log cel/mL reportado por Ballou y col. [5].

La FIG. 1 (a, b, c) muestran los perfiles electroforticosseleccionados como representativos del resto. Se determin elorigen de las bandas por comparacin de su movilidad con lasfracciones de casenas nativas purificadas segn bibliografa[8, 23]. De las cuatro casenas principales de la leche (as1-CN,as2-CN, -bCN, -kCN), tres son fcilmente identificables, lasbandas se observan desde la siembra hasta el nodo y en or-den de aparicin la k-CN, -bCN y as1-CN.

Para facilitar la interpretacin de los resultados y orientarla discusin de los hallazgos obtenidos por otros autores se re-visa, por una parte la actividad de las enzimas exgenas y porotra la actividad de las endgenas sobre las casenas de la le-che cruda almacenada en fro.

En relacin con el efecto de las enzimas exgenas, nose observ protelisis principalmente de la k-CN a pesar deencontrarse el RPT entre 106 y 107 UFC /mL (FIG. 1 a, b, c).

Punch y col., citado por Shah [25] y Guinot-Thomas y col. [16]sealan que son necesarios niveles >5x106 y 107 UFC/mL debacterias psicrtrofas para que ocurra protelisis y cambios or

-

ganolpticos, respectivamente. Sin embargo, Law [20] encon-

tr muy poca hidrlisis de la k y b-casena en PAGE a pesarde crecer psicrtrofos proteolticos en el orden de 107UFC/mL, en leches almacenadas por 72 horas a 7,5C. Otroscomo, Shelly y Deeth; Griffiths; Rowe citados por Guinot-Tho

-

mas y col. [16] sealan que la no protelisis puede ser debidaa lo no excrecin de las proteinasas por encontrarse las bacte

-

rias todava en fase exponencial de crecimiento, a niveles de106 UFC/mL, o que solamente una pequea proporcin de es

-

tos psicrtrofos son caseinolticos [20]. Investigadores citadospor McKellar y revisados por Allocati [2] sugieren que el nme

-

ro de bacterias no es tan importante como el gnero de lasmismas y las especies dentro del gnero. Tomando en consi

-

deracin las opiniones referida por otros autores se sugiereque los resultados obtenidos en este trabajo puedan ser expli

-

cados si se considera que la cepa y su fenotipo metablicopueden influir en la actividad enzimtica.

Respecto a la actividad de la enzimas endgenas sobrelas casenas, no fue posible observar diferencias en intensidadde las bandas principales de la b-CN (FIG. 1 a, b, c), probable-mente debido al bajo nmero de clulas somticas encontra-das (3,3 x 105 cel/mL), el cual no fue suficiente para producirprotelisis. Resultados similares fueron reportados por Alloca

-

ti [2] en leche crudas almacenadas en fro con valores de re-

cuento de clulas somticas entre 4,7 x104 y 1,7 x106 cel/mL.Klei, y col. [19] consideran que valores de RCST de 870 x 103,estn asociados con una elevada actividad proteoltica cau

-

sando una elevada prdida de las protenas en el suero y aguade lavado.

Para determinar el grado de hidrlisis de las protenasde la leche se utiliz la tcnica de Hull. En la TABLA II yFIG. 2, se puede observar que la industria 3 que reporta no al-macenamiento de la leche cruda, present los valores ms ba-jos de APT medida como mg tirosina/ml, en comparacin conlas industrias 1, 2 y 4 que almacenan en fro por dos o ms

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Protelisis de la leche cruda almacenada en fro / Guerrero, L. y col._________________________________________________________

Origen

+

S1

a)

b)

c)

S1

S1

FIGURA 1. ELECTROFORESIS VERTICAL DE MUESTRASDE LECHE CRUDA ALMACENADAS EN FRO. a) INDUS-TRIAS 3 y 4, b) INDUSTRIA 2, c) INDUSTRIA 1.

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

1 2 3 4

INDUSTRIA

Lo

gu

fc/m

ly

cel/m

l

0,100

0,150

0,200

0,250

mg

Tir

osin

a/m

l

RPT

RPP

HULL

RCST

FIGURA 2. VALORES PROMEDIOS DE BACTERIAS PSI-CRTROFAS TOTALES (RPT), PSICRTROFAS PROTEO-LTICAS (RPP), CLULAS SOMTICAS (RCST) Y ACTIVI-DAD PROTEOLTICA (HULL).

das. Es importante sealar que en las muestras de leche ana-

lizadas el 93% de las bacterias presentes fueron del tipo psi-

crtrofas. Por lo tanto, se puede inferir que la degradacinpuesta en evidencia por sta tcnica se debi principalmente ala presencia de las enzimas producidas por estas bacterias.Jaspe y San Jos [18] reportan actividad proteasa medidacomo mmol de tirosina/ml de muestra /hora cuando los valoresde Pseudomonas alcanzan valores de 108 UFC/mL con 70 ho

-

ras de incubacin. Senyk y col. [28] muestran que la protelisismedida a travs de niveles de tirosina aumenta con el incre

-

mento de clulas somticas. Se puede sealar que leches cru-

das almacenadas en fro por ms de dos das, presentaronuna moderada actividad proteoltica, segn lo refieren los valo

-

res de mgTir./mL de la TABLA II.

Anlisis MultivarianteCon la finalidad de obtener ms informacin sobre la re

-

laciones existentes entre los diferentes parmetros utilizados,se realiz un anlisis de correlacin. Los resultados se mues

-

tran en la TABLA III.

El RPT result altamente correlacionado con RPP yRCST. Villar y col. [29] sealan que cuando existe una alta co

-

rrelacin entre estos dos parmetros, la vida til de ste tipode leches y sus productos puede ser muy corta, estos mismosautores muestran una correlacin menor (r=0,81) a la reporta

-

da en este trabajo. Ballou y col. [5] encontraron una asociacinsignificativa entre RPT y RCST y sugieren el estudio de la aso

-

ciacin entre estos dos parmetros para el aseguramiento dela calidad de la leche y consideran que debera ser incluida enlos programas de HACCP de las haciendas. La protelisis me

-

dida como APT arroj una baja correlacin entre las bacteriasy las clulas somticas, lo cual confirma lo sealado anterior

-

mente respecto a composicin de la flora psicrtrofa presenciade bacterias no muy caseinolticas RCST muy bajos y/o quelas bacterias se encontraban todava en fase exponencial decrecimiento y por tal motivo no tuvieron el tiempo suficientepara la excrecin de las enzimas. Por otro lado, se encontruna alta correlacin entre la CN con RPT, RCST y la APT indi

-

cando probablemente la asociacin entre estos parmetros yla degradacin de las casenas.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIN

La calidad higinica de la leche cruda almacenada enfro fue deficiente, lo cual las hace inadecuadas para ser utili-zadas en le elaboracin de quesos y leches procesadas UAT.

La calidad sanitaria es aceptable y se pueden considerarcomo leches mezclas sin infeccin masttica.

No se observ protelisis de las casenas, por la tcnicade la electroforesis, a pesar de que las leches almacenadas enlos silos de las industrias presentaron elevados RPT, RPP.

Se observ que la leche almacenada por 2-3 das en fropresentaron una moderada actividad proteoltica.

Se recomienda hacer un estudio que permita identificarlas especies dentro del gnero de las bacterias psicrotrfasproteolticas encontradas en las leches almacenadas en fro,as como sus condiciones metablicas.

AGRADECIMIENTO

Al Consejo de Desarrollo Cientfico, Humanstico y Tec-nolgico de la Universidad de los Andes (CDCHT) por el apor-te financiero otorgado al proyecto C-232-98-03-A.

Al Centro Nacional de Clculo de la Universidad de los An-des (CECALCULA) por el tratamiento estadstico de los datos.

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TABLA IIICOEFICIENTE DE CORRELACIN DE PEARSON

ENTRE EL CONTAJE MICROBIOLGICO,ACTIVIDAD PRTOEOLTICA TOTAL Y CASENA

RPT RPP RCST APT CNRPT 1,0RPP 0,99 1,0RCST 0,89 0,82 1,0APT 0,57 0,59 -0,45 1,0CN 0,88 0,90 -0,73 0,88 1,0RPT= recuento de psicrtofos totales. RPP= recuento de psicrtrofosproteolticos. RCST= recuento de clulas somticas. APT= actividadproteoltica total. CN= casena.

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