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BacillusthuringiensisyelcontroldeTutaabsolutaBOOKAPRIL2012

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1

Bacillus thuringiensis y CONTROL DE Tuta absoluta

LORENA RAMREZ REYES

NATALIA RAMREZ HERNNDEZ

JAVIER HERNNDEZ FERNNDEZ

Universidad Jorge Tadeo Lozano, Facultad de Ciencias e Ingeniera,

Laboratorio de Biologa Molecular, Grupo de Investigacin, Gentica &

Biologa Molecular GENBIMOL, Carrera 4 No 22-61 Piso 6 Modulo 7,

Bogot Colombia, Suramerica

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3

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIN ................................................................................................. 14 2. MARCO TERICO .............................................................................................. 16

2.1. El cultivo del tomate en Colombia. ............................................................ 16

2.1.1. Generalidades del tomate .................................................................... 17

2.1.2. Clasificacin taxonmica del tomate .................................................. 18

2.1.3. Plagas del tomate .................................................................................. 18

2.2. El cogollero del tomate (Tuta absoluta) .................................................... 18

2.2.1. Clasificacin taxonmica de Tuta absoluta ....................................... 19

2.2.2. Descripcin y ciclo de vida de Tuta absoluta .................................... 20

2.2.3. Mtodos de control de Tuta absoluta ................................................. 23

2.2.4. Enemigos naturales de Tuta absoluta ............................................... 23

2.3 La bacteria entomopatgena Bacillus thuringiensis ................................. 23

2.3.1 Caractersticas generales de Bacillus thuringiensis (Bt) .................. 23

2.3.2. Clasificacin taxonmica de Bacillus thuringiensis.......................... 24

2.3.3. Bacillus thuringiensis en el medio ambiente .................................... 25

2.4. Intercambio gentico .................................................................................... 26

2.4.1. Conjugacin ........................................................................................... 27

2.4.2. Intercambio intra e interespecfico ...................................................... 27

2.5. Las Delta-endotoxinas ................................................................................. 28

2.5.1. Clasificacin de las -endotoxinas de B. thuringiensis ................... 28

2.5.2. Genes que codifican protenas con actividad insecticida ............... 34

2.5.3. Organizacin y estructura tridimensional de las protenas Cry ..... 36

2.5.4. Mecanismo de accin de las protenas insecticidas de cristal (ICPs) ................................................................................................................ 38

2.5.5. Aplicaciones biotecnolgicas .............................................................. 40

2.6. Tcnicas moleculares .................................................................................. 42

2.6.1. Electroforesis de protenas (SDS-PAGE): ........................................ 43

2.6.2. La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) ............................ 43

3. FORMULACIN DEL PROBLEMA .................................................................. 46 4. JUSTIFICACIN .................................................................................................. 47 4. OBJETIVOS .......................................................................................................... 50

4.1. Objetivo general ............................................................................................ 50

4

4.2. Objetivos especficos ................................................................................... 50

5. MATERIALES Y MTODOS ............................................................................. 51 5.1. Ubicacin del sitio de trabajo ...................................................................... 51

5.2. Cepas de referencia ..................................................................................... 51

5.3. Obtencin de muestras de suelos, rea de estudio................................ 51

5.5 Caracterizacin microscpica de aislamientos nativos ........................... 53

5.6. Caracterizacin bioqumica SDS-PAGE ................................................... 54

5.6.1. Obtencin de extractos crudos ........................................................... 54

5.6.1.1 Medio de cultivo LB 7 das ................................................................ 54

5.6.1.2 Medio de cultivo LB 20 das .............................................................. 55

5.6.1.3. Medio de cultivo LB y muestras con adicin de Urea, Na2CO3 y NaOH .................................................................................................................. 55

5.6.1.4. Medio de cultivo LB modificado con adicin de Sulfato de Amonio ............................................................................................................... 56

5.7. Caracterizacin molecular ........................................................................... 56

5.7.1. Extraccin de ADN ................................................................................ 56

5.7.2. Amplificacin por PCR de genes cry1. .............................................. 56

5.7.3. Estandarizacin de la amplificacin de genes cry1 ......................... 58

5.7.4. Estandarizacin de la amplificacin de genes cry1 especficos .... 58

5.7.5. Electroforesis de ADN en gel de agarosa ......................................... 59

5.8. Cuantificacin de Protenas de Extractos crudos.................................... 59

5.8.1. Obtencin de Extractos crudos ........................................................... 59

5.8.2. Cuantificacin de protenas totales en los extractos crudos por la tcnica de Bradford .......................................................................................... 60

5.9. Caracterizacin Biolgica ............................................................................ 60

5.9.1. Cra de Tuta absoluta .......................................................................... 60

5.9.2. Experimentos para la estandarizacin del sistema de bioensayo 62

5.9.3. Evaluacin de bacilos nativos preseleccionados ............................. 66

5.9.4. Determinacin de la concentracin letal 50 (CL50) .......................... 67

5.10. Conformacin de un Banco de Bacilos Nativos Esporulados ............. 68

6. RESULTADOS Y DISCUSIN .......................................................................... 69 6.1. Aislamiento de cepas a partir de muestras de suelo en 4 departamentos de Colombia .............................................................................. 69

6.2. Caracterizacin microscpica ..................................................................... 71

5

6.3. Caracterizacin bioqumica ......................................................................... 77

6.3.1. Estandarizacin de electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida .................................................................................................... 78

6.3.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida de los extractos crudos de los bacilos nativos esporulados ................................................................ 82

6.4. Caracterizacin Molecular ........................................................................... 86

6.4.1. Extraccin de ADN ................................................................................ 86

6.4.2. Estandarizacin de la amplificacin de genes cry1 ......................... 87

6.4.3. Amplificacin de genes cry1 en bacilos nativos esporulados ........ 89

6.4.4. Estandarizacin de la amplificacin de genes cry1 especficos .... 92

6.4.5. Amplificacin de genes cry1 especficos en bacilos nativos esporulados. ...................................................................................................... 97

6.5. Seleccin de bacilos nativos para el montaje de bioensayos contra Tuta absoluta ...................................................................................................... 103

6.6. Obtencin y Cuantificacin de Protenas totales de los extractos crudos en bacilos nativos esporulados ........................................................... 105

6.7. Caracterizacin Biolgica .......................................................................... 106

6.7.1 Cra de Tuta absoluta .......................................................................... 106

6.7.2. Estandarizacin del bioensayo ......................................................... 108

6.7.3. Bioensayos discriminatorios para la evaluacin de bacilos nativos esporulados preseleccionadas ..................................................................... 112

6.8. Conformacin de un Banco de bacilos nativos esporulados ............... 124

7. CONCLUSIONES .............................................................................................. 125 8. RECOMENDACIONES ..................................................................................... 128 9. REFERENCIAS .................................................................................................. 129

10. ANEXOS ............................................................. Error! Marcador no definido.

6

NDICE DE TABLAS

Tabla 1. Proteinas Cry y Cyt producidas por las diferentes variedades de B. thuringiensis. .......................................................................................................... 29 Tabla 2. Protenas Cry con actividad especfica contra un orden de insecto. ......... 35 Tabla 3. Superficie global de cultivos transgnicos en 2006: por pas (millones de hectreas)............................................................................................................... 42 Tabla 4. Condiciones empleadas en PCR y PCR mltiplex (Elnifro et al., 2000) .... 45 Tabla 5. Secuencia y posicin de los oligonucletidos universales que reconocen 25 genes de la familia cry1. (Bravo et al., 1998) .......................................................... 57 Tabla 6. Secuencia y posicin de los oligonucletidos especficos, diseados en secuencias conservadas para cada gen especfico, se presenta el tamao del producto amplificado (Cern et al., 1994). .............................................................. 58 Tabla 7. Departamento, municipio y nmero de aislamientos nativos, a partir de las muestras de suelo analizadas. ................................................................................ 70 Tabla 8. Municipio, nmero y grupo de cristales de bacilos esporulados aislados presentes en muestras de suelo analizadas. I) Am; II) Am, bp y rd; III) Am y cd; IV) Am y rd; V) Am, rd y cd; .......................................................................................... 75 Tabla 9. Relacin entre los pesos moleculares de las protenas reveladas en cada uno de los bacilos nativos esporulados y el/o los grupos de actividad biolgica establecidos. ........................................................................................................... 84 Tabla 10. Porcentaje de cepas con presencia del gen cry1 por municipio en cada departamento. ........................................................................................................ 92 Tabla 11. Variables utilizadas en los experimentos 4 y 5, para la estandarizacin de las condiciones de la M-PCR para la mezcla de oligonucletidos A y B ................. 97 Tabla 12. Perfil de genes cry1 especficos identificados en bacilos nativos esporulados en cada uno de los municipios muestreados. ................................... 101 Tabla 13. Caracterstica de las Cepas nativas de Bacillus thuringiensis aisladas de suelos colombianos seleccionados por sus caractersticas de presencia y numero de cristales, tamao de las protenas reveladas y presencia de genes cry1 especficos para bioensayos. .................................................................................................. 105 Tabla 14. Concentracin de protena total del extracto crudo de 10 cepas de B. thuringiensis escogidos para el bioensayo. .......................................................... 106 Tabla 15. Concentraciones letales 50 (CL50) de las cepas nativas y de referencia. Cepa 11, Cepa 39 y Bt var. kurstaki HD1, sobre larvas de 2do instar de Tuta absoluta, con lmites de confianza al 95% ............................................................ 120

7

NDICE DE FIGURAS

Figura 1. Dao causado por Tuta absoluta en hojas de tomate. .......................... 17 Figura 2. Ciclo biolgico de Tuta absoluta. ............................................................ 22 Figura 3. Micrografa de transmisin electrnica de B. thuringiensis. .................... 25 Figura 4. Estructura tridimensional de protena Cry1Aa. ....................................... 36 Figura 5. Alineamiento de las protenas Cry que revela la posicin de los 5 bloques conservados. .......................................................................................................... 38 Figura 6. Mecanismo de accin de las -endotoxinas. .......................................... 39 Figura 7. Zonas de recoleccin de muestras de suelo en Colombia. ..................... 52 Figura 8. Cmara de cra del insecto Tuta absoluta. ............................................. 61 Figura 9. Experimento 1: inmersin de hojas de plantas de tomate en diluciones de los productos comerciales Dipel, Xentari y Turilav. ................................................. 63 Figura 10. Experimento 2: aspersin con aergrafo de hojas de tomate, con las diluciones de los insecticidas biolgicos Dipel, Xentari y Turilav. ............................ 64 Figura 11. Experimento 3: Frascos con foliolos de plantas de hojas de tomate colocadas a maera de florero, con las diluciones de los insecticidas biolgicos Dipel, Xentari y Turilav. ..................................................................................................... 65 Figura 12. Experimento 4: Medio de cultivo extracto de hojas de tomate. ............. 65 Figura 13. Experimento 5: inmersin de hojas de plantas de tomate en dilucin de los productos comerciales Dipel, xentary y Turilav. ................................................. 66 Figura 14. Cultivo por aislamiento de un bacilo nativo esporulado. ....................... 69 Figura 15. Porcentaje de las diferentes formas de cristales observadas en los bacilos nativos esporulados. ................................................................................... 72 Figura 16. Grupo o perfiles de los bacilos nativos esporulados de acuerdo a la forma del cristal observado. .................................................................................... 73 Figura 17. Diferentes formas de cristal observadas en los bacilos nativos esporulados aislados. ............................................................................................. 76 Figura 18. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE. Bacilos nativos esporulados y cepa de referencia HD1 cultivados en medio LB 20 das. ................ 79 Figura 19. Electroforeis de protenas en gel de poliacrilamida SDS-PAGE, un bacilo nativo esporulado y una cepa de referencia HD1 cultivados en medio LB por triplicado con tres tramientos distintos Urea, Na2CO3 y NaOH. ............................... 80 Figura 20. Electroforeis de protenas en gel de poliacrilamida SDS-PAGE, medio de cultivo LB modificado. ............................................................................................. 81 Figura 21. Perfil electrofortico de protenas SDS-PAGE en cepas de referencia Bt var. kurstaki HD1, y algunos bacilos nativos esporulados. ...................................... 82 Figura 22. a) ADN general de bacilos nativos esporulados (1-11), con el mtodo Kit ULTRA CLEAMTMMicrobial isolation Kit b. ADN plasmdico. Bacilos nativos esporulados (1-11), con el mtodo Kit ULTRA CLEAMTMMicrobial isolation Kit. Gel de agarosa al 1% teida en bromuro de etdio. ....................................................... 87 Figura 23. Amplificacin de fragmentos por PCR de genes cry1 utilizando los oligonucletidos universales Bravo et al. (1998). .................................................... 90 Figura 24. Productos amplificacidos por PCR mltiple para identificar fragmentos de genes cry1Aa (246 pb), cry1Ab (216 pb), cry1Ac (180 pb) (Mezcla A) y cry1B (367 pb), cry1C (130pb), cry1D (290 pb) (Mezcla B). .............................................. 93

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Figura 25. Productos amplificados de ADN por PCR para genes cry1 especficos en cepas de referencia. .......................................................................................... 94 Figura 26. Productos de amplificacin por PCR de genes cry1 especficos en cepas de referencia y cepas nativas. ................................................................................ 96 Figura 27. Productos de la amplificacin por PCR de genes especficos cry1 en cepas de referencia y cepas nativas, utilizando la mezcla A de oligonucletidos. ... 98 Figura 28. Productos de la amplificacin por PCR de genes especficos cry1 en cepas de referencia y cepas nativas, utilizando la mezcla B de oligonucletidos. ... 99 Figura 29. Distribucin del nmero de bacilos nativos esporulados con presencia de genes cry1 especifcos en XIV grupos. ............................................................ 100 Figura 30. Instares larvales de Tuta absoluta. ..................................................... 108 Figura 31. Porcentaje de mortalidad de los productos comerciales Dipel, Turilav y Xentary, sobre larvas de 2do instar de Tuta absoluta. .......................................... 112 Figura 32. Mortalidad de las larvas de Tuta absoluta tratadas con los diferentes bacilos nativos esporulados. ................................................................................. 114 Figura 33. Mortalidad de las larvas de Tuta absoluta tratadas con los diferentes extractos crudos de los bacilos nativos esporulados, prueba de Tukey 95% de confianza. ............................................................................................................. 115 Figura 34. Mortalidades obtenidas en la evaluacin dosis- respuesta de los bacilos nativos esporulados sobre larvas de T. absoluta. a. bacilo nativo 11. b. bacilo nativo 39. c. Cepa de referencia HD1. .................................................................. 118 Figura 35. Mortalidad corregida de las cepas nativas 11 y 39 y la cepa de referencia HD1 a las diferentes dosis evaluadas. Tratamientos con la misma letra no son significativamente diferentes segn la prueba de comparacin de medios de Tukey (95%) ......................................................................................................... 121 Figura 36. Larva de Tuta absoluta muerta debido a intoxicacin con el complejo espora-cristal (extracto crudo). ............................................................................. 122 Figura 37. Prueba confirmatoria: bacilos nativos esporulados, aislada del insecto plaga Tuta absoluta. ............................................................................................. 123 Figura 38. Banco cepas de Bacilos Gram positivos esporulados. ....................... 124

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NDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Preparacin de geles y reactivos para electroforsis de SDS-page . Error! Marcador no definido. Anexo 2. ULTRA CLEANTM MICROBIAL ISOLATION KIT DE LA CASA COMERCIAL BIO-LINE ............................................. Error! Marcador no definido. Anexo 3. KIT, ULTRA CLEANTM 6 MINI PLASMID PREP KITTM DE LA CASA COMERCIAL BIOLINE ............................................. Error! Marcador no definido. Anexo 4. SOFTWARE VISION WORK AND ANALISYS VERSIN 6.4.3 UVP LSC. USA ........................................................................... Error! Marcador no definido. Anexo 5. Curva de calibracin para la determinacin de protenas por el mtodo de bradford ..................................................................... Error! Marcador no definido. Anexo 6. Caracterizacin macroscopca y microscpica de los aislamientos nativos .................................................................................. Error! Marcador no definido. Anexo 7. Cuantificacin microscpica y caracterizacin bioqumica y molcular de aislamientos nativos de bacilos esporulados ............. Error! Marcador no definido. Anexo 8. Estandarizacin Bioensayo ........................ Error! Marcador no definido. Anexo 9. Evaluacin de cepas .................................. Error! Marcador no definido. Anexo 10. Anlisis estadstico de cepas preseleccionas ........... Error! Marcador no definido. Anexo 11. Prueba de Probit para la cepas nativas 11, 39 y la cepa de referencia HD1. Biostat 2007. ..................................................... Error! Marcador no definido. Anexo 12. Anlisis estdistco de la eficacia de las cepas nativas 11 y 39 y la cepa de referencia HD1 a las diferentes dosis evaluadas. . Error! Marcador no definido.

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LISTA DE ABREVIACIONES

MIP: Manejo Integrado de Plagas

m.s.n.m : metros sobre el nivel del mar

ha: Hectreas

ton: Toneladas

T: Temperatura

ml: Mililitros

l: Microlitros

g/ml: microgramo por mililitro

aa: Aminocidos

C: grados centgrados

r.p.m: revoluciones por minuto

Agua dd: Agua destilada desionizada

h: Horas

nm: Nanmetros

L. esculentum: Lycopersicum esculentum

T. absoluta: Tuta absoluta

var: Variedad

LB: Agar Luria Bertani

Bt: Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis)

ICPs: Protenas Insecticidas de Cristal (del ingles Insecticidal Crystal

Proteins)

cry: Genes del cristal

Cyt: Protena Insecticida con actividad citoltica

Cry: Protenas del cristal

- endotoxina Delta endotoxinas

VIP:

Protenas insecticida que se forman en la fase vegetativa de

crecimiento

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SDS-PAGE: Electroforesis de Protenas en condiciones denaturantes

kDa: Kilodaltons

SDS: Lauril sulfato sdico

PCR: Reaccin en cadena de la Polimerasa

pb: Pares de bases

ADN: cido desoxirribonucleico

mM: Milimolar

M: Micromolar

dNTPs: Desoxirribonucletidos

U: Unidades

DTT: Ditiotreitol

PMSF: Fenil metil sulfanil floruro

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RESUMEN

En Colombia, gran diversidad de insectos plaga afectan el cultivo de tomate, entre los que se destaca la polilla del tomate (Tuta absoluta Meyrick). El dao es causado por las larvas que atacan el follaje formando minas y barrenan las nervaduras, las ramas y tallos, e inclusive producen la cada de flores y frutos. Para su control, los agricultores utilizan principalmente insecticidas qumicos, que ocasionan efectos nocivos al ambiente y a la salud humana. El control biolgico surge como alternativa, y dentro de los posibles controladores biolgicos se encuentra Bacillus thuringiensis (Bt) dominando el 90% del mercado mundial de bioplaguicidas. La investigacin en este controlador microbial avanza aceleradamente en el mundo y continuamente se estn buscando nuevos aislamientos en condiciones naturales. Se considera que Colombia por su gran biodiversidad, tiene enorme potencial para esta busqueda. En el presente estudio, se recolectaron 28 muestras de suelo en 14 municipios en Colombia. Se aislaron 99 bacilos nativos esporulados que presentaron diversidad morfolgica encontrando cristales con formas amorfas, bipiramidal, cuadradas, redondas y triangulares. Se observaron bacilos con 1, 2, 3 y 4 formas de cristal, establecindose 18 perfiles diferentes. Los aislamientos positivos para cristales se sometieron a una caracterizacin bioqumica por medio de electroforesis de protenas totales (SDS-PAGE). Para estandarizar la obtencin de extractos crudos de protenas totales de los bacilos nativos esporulados, se evaluaron 4 mtodos: 1) Medio de cultivo LB 7 das; 2) Medio de cultivo LB 20 das; 3) Medio LB con adicin de Urea, Na2CO3, NaOH y 4) Medio LB modificado. El cuarto mtodo present la mejor resolucin de las bandas de protenas en geles de poliacrilamida. Se evidenciaron bandas de protenas de 10 a 150 kDa, por SDS-PAGE, que se clasificaron en 7 grupos de acuerdo a la relacin entre peso molecular y posible actividad biolgica. Se encontraron bacilos nativos esporulados que revelaron con notoriedad y abundancia ms de una banda de protena en su patrn electrofortico, encontrando 28 perfiles diferentes. La caracterizacin molecular por PCR utilizando oligonucletidos generales amplific fragmentos para la presencia de genes cry1 en 35 cepas nativas de B. thuringiensis. El ADN de estos 35 bacilos fue sometido a dos rondas de PCR Mltiple con 2 mezclas de oligonucletidos especficos, reconociendo 6 genes especficos. En los bacilos nativos se amplificaron los genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1C y cry1D en el 76, 26, 21, 35, 32, y 8,8% respectivamente. De acuerdo a estas caracterizacion se seleccionaron 10 cepas nativas de B. thuringiensis como promisorios para el control de Tuta absoluta y se probaron contra larvas de 2do instar de este insecto plaga. Para estandarizar el sistema de bioensayo se evaluaron cinco mtodos con tres productos comerciales, (Bioinsecticidas basados en cristales y esporas de B. thuringiensis) Dipel, Turilav y Xentari: 1) Inmersin de la hoja; 2) Aspersin por aergrafo en hojas de tomate; 3) Frascos con foliolo de plantas de tomate; 4) Medio de cultivo extracto hojas de tomate y 5) Recipientes plsticos. La metodologa ptima para realizar los bioensayos con Tuta absoluta fue la nmero 1, sumergiendo las hojas en el producto a evaluar, con un 96% de supervivencia del testigo y 100% de mortalidad, a una concentracin de 2,5 g/L del producto comercial Dipel. Los bacilos nativos ZBUJTL39 y ZCUJTL11 presentaron mejor actividad biolgica que la cepa de referencia Bt var kurstaki HD1. El bacilo nativo ZCUJTL11 present una CL50 de 2,4 g/ml (P

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Tuta absoluta, es promisorio para posteriores investigaciones como la produccin de un biopesticida o en ingeniera gentica de tomate, para la obtencin de cultivares autorresistentes a Tuta absoluta.

ABSTRACT

In Colombia, among the great diversity of insect pests affecting the tomato crop stands up the tomato moth (Tuta absoluta Meyrick). Damage is caused by larvae which attack the foliage forming auger mines in veins, branches and stems, and even producing flowers and fruit dropping. For its control, farmers mainly use chemical insecticides, which cause adverse effects to the environment and human health. Biological control of pests comes up as alternative, and among many biological agents, Bacillus thuringiensis (Bt) dominate 90% of biopesticide global market. Research on this biocontrol agent is developing faster around the world and novel isolates are being scout continusly. In this study, 28 soil samples were collected in 14 Colombia municipalities and 99 strain native were isolated, which showed morphological diversiity in between their crystals, with, bipiramidal, square, round, triangular and amorphous forms. 1, 2, 3 and 4 forms of, bacilli crystals were observed which conform 18 different profiles. Isolates positive for crystals underwent a biochemical characterization by total protein electrophoresis (SDS-PAGE). To standardize the total protein of strain native collection of crude extracts, 4 methods were evaluated: 1) LB culture medium, 7 days, 2) LB culture medium, 20 days, 3) LB Medium with Urea, Na2CO3 and NaOH addition and 4) Middle LB amended. The fourth method presented the best resolution of protein bands in polyacrylamide gels. Protein bands of 10 to 150 kDa were evidenced by SDS-PAGE and classified into 7 groups according to the relationship between molecular weight and possible biological activity. Some strain native revealed notoriously more than one band of protein electrophoretic pattern with 28 different profiles PCR molecular characterization, using general primers, amplified fragments for cry1 genes presence in 35 strain native. ADN of these 35 bacteria was taken into two rounds of PCR with multiple 2-specific oligonucleotide mixtures, recognizing 6 specific genes. In strain native of Bt, genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1C and cry1D were amplified, in 76, 26, 21, 35, 32, and 8.8% respectively. According to these characterizations, 10 native isolates were selected as promising for Tuta absoluta control and challenged against 2nd instar larvae. To carry out this procedure five methods were evaluated with three commercial products (based on bioinsecticides crystals and spores of B. thuringiensis: Dipel Turilav and Xentari : 1) immersion of the leaves, 2) by spraying airbrush on tomato leaves, 3) Bottles with leaflets of tomato plants, 4) culture medium of tomato extract leaves and 5) plastic containers. The bioassays optimum methodology to try Bt on Tuta absoluta was method 1, with immersion of leaves into the evaluated product, (96% control survival and 100% mortality at a 2.5 g/L concentration of commercial product Dipel. The strain native ZBUJTL39 and ZCUJTL11, showed better biological activity that the reference strain: Bt var kurstaki HD1. Strain native ZCUJTL11 presented a LC50 of 2.4 mg/ml (P

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1. INTRODUCCIN

El tomate (Lycopersicon esculentum Millano) es uno de los cultivos ms importantes

en Colombia, esta hortaliza presenta gran demanda en la dieta alimenticia y genera

empleo e ingresos, no slo en el campo, sino tambin en la agroindustria. En

Colombia la superficie destinada a este cultivo fue aproximadamente de 15.881

hectreas (ha), con una produccin de 420.419 toneladas (ton) y un rendimiento de

26,5 ton/ha en el ao 2006 (Agronet, 2006).

Esta solancea es afectada por una gran cantidad de plagas y enfermedades dentro

de las cuales se destaca el dao causado por las larvas de Tuta absoluta

(Lepidoptera: Gelechiidae). El cogollero del tomate Tuta absoluta es considerado

una de las principales plagas de gran importancia econmica del tomate en

Colombia, ya que ocasiona prdidas que representan un 27- 43%, debido a que

afecta directamente la produccin del cultivo (Cely et al., 2006), Este dao es

causado por larvas de la plaga, que minan el follaje y los tallos de las plantas, y

atacan las hojas jvenes, ramas, perforando adems flores y frutos (Garca, 1993;

De Vis et al., 2001) lo que ocasiona un debilitamiento gradual en la planta

disminuyendo su potencial productivo (Corporacin Colombiana de Investigacin

Agropecuaria CORPOICA, 2008).

Para su control, los agricultores utilizan principalmente insecticidas qumicos, que

ocasionan efectos nocivos al ambiente, generacin de resistencia, aparicin de

residuos qumicos en los alimentos, contaminacin de las aguas, eliminacin de la

fauna benfica y problemas para la salud humana. El control biolgico surge como

alternativa, y dentro de los posibles controladores biolgicos se encuentra Bacillus

thuringiensis (Bt) que domina el 90% del mercado mundial de bioplaguicidas

(Feiltelson et al., 1992). Bt es una bacteria aerbica, Gram positiva, que se

caracteriza por la produccin de cristales paraesporales, compuestos por Protenas

Insecticidas de Cristal ICPs (del ingles, Insecticidal Crystal Proteins) (Schnepf et al.,

1998), que poseen alta especificidad sobre larvas de insectos de diferentes ordnes.

15

La investigacin en este controlador microbial avanza aceleradamente en el mundo

y continuamente se estn buscando nuevos aislamientos en condiciones naturales.

En este trabajo se aislaron y caracterizaron aislamientos nativos de bacilos

esporulados con genes especficos de la familia cry1, con actividad anti lepidptera

a partir de suelos en los que se cultiva tomate en cuatro departamentos de

Colombia: Cundinamarca, en los municipios de Susa y Cha; Boyac, en los

municipios de: Villa de Leyva, Sutamarchn, Raquir y Santa Sofa; Huila, en el

municipio de Garzn; y Santander, en los municipios de: Piedecuesta, Los Santos,

Lebrija, Betulia, Floridablanca, Rionegro y Girn. Se identificaron genes especficos

para poder seleccionar aislamientos nativos de B. thuringiensis y estimar su

potencial sobre larvas de 2do instar de T. absoluta, para de esta manera identificar

bacilos nativos potenciales para el control de esta plaga. Adicionalmente se

conform un banco de bacilos nativos esporulados caracterizados a nivel molecular

de acuerdo a la presencia de genes cry1 como un paso previo a la realizacin de

ensayos biolgicos, que permiten confirmar la efectividad de un aislamiento nativo

en el control de una determinada plaga.

Debido a la importancia que tiene el control de insectos plaga y la necesidad de

proponer alternativas para el control de T. absoluta, la bsqueda en Colombia de

nuevos genes cry que codifiquen para nuevas y novedosas delta-endotoxinas con

un espectro de accin ms amplio, contina siendo un proyecto de gran inters. Por

lo tanto, la variabilidad climtica y la biodiversidad presente en Colombia, aportan

los elementos necesarios para justificar el aislamiento y caracterizacin de bacilos

nativos esporulados que pueden ser la base para el desarrollo de insecticidas

microbiales.

Los resultados parciales de este trabajo de grado han sido presentados en tres

eventos cientficos, uno nacional: el LXIII Congreso Nacional De Ciencias

Biolgicas, Yopal, Casanare, Octubre de 2008; y dos internacionales: Congreso

Colombiano de Biotecnologa, II Seminario Internacional de Bionegocios, Bogot, 29

de Julio al 1 de Agosto de 2008 y XIX Congreso Latinoamericano de Microbiologa,

Quito, Ecuador, Octubre de 2008.

16

2. MARCO TERICO

2.1. El cultivo del tomate en Colombia.

El tomate es una hortaliza que pertenece a la familia Solanaceae y al gnero

Solanum (Peralta et al., 2005). Segn Vallejo (1999), el tomate constituye el 30% de

la produccin mundial de hortalizas, con alrededor de 2.9 millones de hectreas (ha)

sembradas. En Suramrica se cultivan aproximadamente 159.500 hectreas en

donde se destacan Brasil y Chile como los mayores productores. Por su parte, en

Colombia hasta el 2006, la superficie destinada a este cultivo fue aproximadamente

de 15.881 hectreas, con una produccin de 420.419 toneladas (ton) y un

rendimiento de 26,5 ton/ha (www.agronet.gov.co). Segn De Vis et al. (2001), en

Colombia la mayora de cultivos de tomate se producen al aire libre y un pequeo

porcentaje se cultiva bajo invernadero. El cultivo bajo invernadero reduce la

incidencia de plagas y enfermedades al permitir controlar las condiciones

ambientales y abre la posibilidad de utilizar con mayor facilidad el control biolgico

para mantener a las poblaciones plaga en niveles bajos.

Existe gran diversidad de enfermedades y plagas que afectan este cultivo y que

disminuyen su productividad al impedir el ptimo desarrollo del fruto. El gusano

cogollero del tomate, T. absoluta, es un lepidptero de la familia Gelechiidae que

ocupa el segundo lugar entre las plagas de importancia de esta solancea despus

de la mosca blanca (Trialeuroudes vaporariorum) (De Vis et al., 2001). El dao se

incrementa a medida que aumenta la temperatura ambiental (De Vis et al., 2001).

T. absoluta acta como: minador de las hojas, barrenador del tallo, perforador del

fruto, y puede tambin causar dao en las flores al hacer galeras dentro de ellas

(Vlez, 1997) (Figura 1). Segn Garca (2002) el dao se inicia en el semillero y

contina en todo el desarrollo de la planta. Las plantas ampliamente infestadas

presentan minas y perforaciones causadas por larvas, como tambin por la toxicidad

de los insecticidas utilizados.

17

Figura 1. Dao causado por Tuta absoluta en hojas de tomate.

Se observan larvas consumiendo el mesfilo de la hoja.

2.1.1. Generalidades del tomate

El tomate (Lycopersicum esculentum Mill) es una planta originaria de la planicie

costera occidental de Amrica del sur. Fue introducido por primera vez en Europa a

mediados del siglo XVI y a principios del siglo XIX se comenz a cultivar

comercialmente, luego se inici su industrializacin y la diferenciacin de las

variedades para mesa y para industria (Prez et al., 2002).

El tomate es una planta dicotilednea, perteneciente a la familia Solanaceae y al

gnero Lycopersicum. La especie L. esculentum es la especie ms cultivada y

posee nueve especies silvestres relacionadas. Esta planta es perenne y de porte

arbustivo, puede desarrollarse en forma rastrera, semi recta o erecta. La

temperatura ideal para el cultivo es de 25C. Este factor se considera limitante, al

igual que el exceso de lluvias porque favorece la incidencia de enfermedades en el

cultivo (Vallejo, 1999).

18

2.1.2. Clasificacin taxonmica del tomate

Reino: Plantae

Sub reino: Tracheobiota

Divisin: Magnoliopsida

Clase: Asteridae

Orden: Solanales

Familia: Solanaceae

Gnero: Solanum

Especie: S. lycopersicum

2.1.3. Plagas del tomate

El tomate es atacado por un nmero elevado de insectos plaga desde el semillero

hasta la cosecha de los frutos, aunque existen centenares de insectos y caros que

viven del consumo de esta planta, son pocos los que causan daos considerables, y

que en muchas regiones o pocas hacen difcil o casi imposible su cultivo. En

Colombia son cinco los insectos plaga que limitan la produccin y que han

conducido a los agricultores a utilizar deliberadamente insecticidas qumicos

(Vallejo, 1999). Se consideran como importantes, adems del cogollero del tomate

(Tuta absoluta): La Mosca Blanca (Trialeurodes vaporariorum), El Pasador del Fruto

(Neoleucinodes elegantalis Guene), El Minador de la hoja Liriomyza sp., y los

fidos: Aphis gossyppi, Macrosiphum euphorbiae, Myzus persicae.

2.2. El cogollero del tomate (Tuta absoluta)

El cogollero del tomate Tuta absoluta, fue descrito por primera vez por el

entomlogo E. Meyrick (1917) a partir de un ejemplar macho colectado en

Huancayo, Per, denominndolo Phthorimaea absoluta (Rojas, 1981).

Posteriormente, recibi otras cuatro denominaciones: Gnorimoschema absoluta,

Scrobipalpula absoluta, Scrobipalpuloides absoluta y finalmente se la ha ubicado en

el Gnero Tuta (Barrientos, 1997).

19

La polilla del tomate (Tuta absoluta Meyrick) est presente en toda Amrica del Sur,

donde se considera plaga clave para el tomate fresco e industrial. Se encuentra

principalmente en las zonas montaosas de los Andes y en Chile se distribuye entre

la Primera y Dcima Regin, en el Archipilago de Juan Fernndez y en la Isla de

Pascua (Uchoa-Fernandes et al., 1995; Artigas, 1994).

El cogollero del tomate T. absoluta es considerado una de las principales plagas del

tomate en Colombia (Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria

CORPOICA, 2008), el dao es causado por las larvas que atacan el follaje formando

minas; adems pegan las hojas del cogollo formando una telaraa y barrenan las

nervaduras, las ramas y tallos, e inclusive producen la cada de flores y frutos. Esta

plaga es de gran importancia econmica por que afecta directamente la produccin

del cultivo (Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria CORPOICA,

2008). En Colombia, se report la plaga en 1936 en el Valle del Cauca (Garca,

2002). Posteriormente, T. absoluta fue un grave problema para los cultivadores de

tomate en la misma regin entre 1970 y 1974 (Vlez, 1997). Actualmente la plaga

se encuentra presente en los principales departamentos productores de tomate que

son Cundinamarca, Santander, Valle, Caldas, Huila, Risaralda, Antioquia, Atlntico y

Guajira (Corporacin Colombia Internacional, 2006). Es importante anotar que esta

plaga no es exclusiva del tomate, se han reportado daos en plantas de papa,

tabaco y en algunas malezas de la familia Solanaceae (Vlez, 1997; De Vis et al.,

2001).

2.2.1. Clasificacin taxonmica de Tuta absoluta

Orden: Lepidptera

Suborden: Glossata

Familia: Gelechiidae

Gnero: Tuta

Especie: T. absoluta

20

2.2.2. Descripcin y ciclo de vida de Tuta absoluta

Durante el ciclo de vida, T. absoluta pasa por cinco estados: huevo, larva, pupa, pre

pupa y adulto. La duracin de estos estados est directamente relacionada con la

dieta a lo largo del desarrollo y factores ambientales como la temperatura (Figura 2).

Segn Vlez (1997) las principales caractersticas de los diferentes estados de T.

absoluta son:

Huevos: Son elpticos, miden en promedio 0.93 mm de largo y 0.23 mm de ancho.

La coloracin inicial es crema y a medida que avanza el desarrollo, se torna

amarillento, al final adquiere una coloracin amarillo naranja. Se encuentran

preferencialmente en el envs de las hojas, pero pueden encontrarse en cualquier

parte de la planta. Los huevos son depositados individualmente a corta distancia

entre ellos. La duracin en este estado es de a 4-8 das en promedio.

Larvas: Los dos primeros instar larvales corresponden a la fase crtica de la

especie, en donde la mortalidad presenta un alto porcentaje (79.8%), esta

mortalidad se debe principalmente a los depredadores y al control qumico. las

larvas tienen un ciclo de13-23 das.

La polilla del tomate presenta cuatro instares larvales bien definidos y diferentes en

tamao y color (Estay, 2000; Fernndez y Montagne, 1990). El primer instar

presenta color blanco y cabeza de color caf oscuro. La forma es cilndrica,

levemente aplastada dorsoventralmente con excepcin de su cabeza que es

prognata (mandbulas salientes), presenta cinco pares de pseudpodos (Vargas,

1970). Despus de la eclosin de los huevos, las larvas buscan un punto de entrada

en las hojas penetrando en la epidermis de la hoja, y en su avance, consumen el

mesfilo produciendo galeras (Fernndez y Montagne, 1990). El tamao de la

galera aumenta a medida que la larva crece y posteriormente, los tejidos se oxidan

y necrosan (Larran, 1992). La larva perfora brotes, flores y frutos, pero prefiere las

hojas en formacin y los racimos florales, pudiendo ocasionar la prdida de un

racimo completo (Lpez, 1991).

21

A medida que se alimenta, la larva se va tornando verde. En el momento de la

muda para pasar al segundo instar, la larva se torna nuevamente blanca. La longitud

mxima del primer instar es de aproximadamente 1,61 mm (Vargas, 1970). El

segundo instar mantiene la misma forma descrita anteriormente y cambia de color

verde a color blanco en el momento de la muda, el tamao promedio es de 2,80

mm. La larva de tercer instar presenta inicialmente un color gris blanquecino, luego

cambia a verde y luego a blanco, en el final del periodo, la longitud promedio es de

4,69 mm (Vargas, 1970). Al llegar al cuarto instar aparece una mancha rojiza dorsal

que se extiende desde los ocelos hasta el margen posterior (Gonzlez, 1989). La

larva sigue manteniendo su forma original y alcanza al final de este periodo una

longitud de 7,72 mm (Vargas, 1970). Los frutos son penetrados por las larvas en

estado inmaduro, preferentemente, por el extremo peduncular dejando tneles que

provocan deformaciones, facilitando as el ataque de agentes patgenos,

potenciando su pudricin y dejndolos inservibles comercialmente (Apablaza, 1992).

En ocasiones, la larva puede salir de un fruto para ingresar a otro dentro de un

mismo racimo (Lpez, 1991).

Pupas: La crislida o pupa es de tipo obtecta (se pueden diferenciar patas y alas),

tiene forma cilndrica, es ms ancha en el extremo anterior que el posterior. Su color

es verde en un comienzo y se va tornando a un color caf oscuro a medida que se

aproxima a la emergencia (Estay y Bruna, 2002). Presentan textura lisa y brillante

(Vlez, 1997). Sus dimensiones alcanzan 4,35 mm de largo y 1,10 mm de dimetro

horizontal (Vargas, 1970). La mayora de las veces, se encuentra cubierta de

capullos blancos y sedosos (Apablaza, 1992). En esta fase la larva deja de comer y

forma un capullo, dejndose caer al suelo por medio de un hilo de seda para

desarrollar el periodo de pupa (Vargas, 1970), tiene una duracin de 8-15 das

despus de lo cual emergen adultos completamente formados (Vlez, 1997).

Adultos: Son micro lepidpteros de alrededor de 6 mm de largo. Sus alas son

angostas y las antenas largas y filiformes. La coloracin es crptica con escamas

gris oscuro, caf claro y crema. Los adultos son de hbitos nocturnos pero

presentan una actividad diurna limitada. La cpula se produce en la noche despus

de la emergencia. El perodo de oviposicin dura en promedio 4 das. La longevidad

22

promedio de los adultos es de 8.6 das. La proporcin sexual de hembras y machos

es de 1 a 3, y el nmero promedio de huevos por hembra es 52, aunque el

dimorfismo sexual es escaso. Los machos tienen un abdomen gris claro y delgado

mientras que las hembras presentan un abdomen de color blanco crema y ms

ancho que el de los machos. La envergadura alar de las hembras es de 9,0 a 13,0

mm mientras que la de los machos es de 8,5 a 12,0 mm (Vlez, 1997) (Figura 2).

Figura 2. Ciclo biolgico de Tuta absoluta. 1. Los huevos son de forma elptica, de color blanco recin ovipositados, luego se tornan amarillo

o amarillo naranja al aproximarse su eclosin. Son depositados en forma individual sobre la planta. 2. La larva emerge del huevo y busca un punto de entrada, consume el mesfilo y deja reas

traslucidas conocidas como galeras; pasa por cuatro estadios larvales, cambiando de color blanco, verde, gris, rojo. 3. En estado de pre pupa la larva elabora un capullo, empupando en el

suelo. 4. Los adultos son mariposas que miden aproximadamente 6 mm de longitud, los machos

tienen un abdomen gris claro y delgado mientras que las hembras presentan un abdomen de color blanco crema y ms ancho que el de los machos.

23

2.2.3. Mtodos de control de Tuta absoluta

Uno de los mtodos ms empleados en Colombia para controlar a los insectos

plaga es el control qumico, en el que se requieren repetitivas aplicaciones de

insecticidas para poder evitar prdidas en la produccin y calidad de los frutos

(Salazar y Araya, 2001). En algunos cultivos del Brasil, se han utilizado mezclas de

insecticidas altamente txicos, como: Tiocyclam, Carbofuram, Metamidofos,

Cypermetrina, Metomil, Cihalotronina, Teflubenzuron, Imidacloprid y

Avermetina, en dosis y frecuencias elevadas (Souza y Reis, 1986), estos

insecticidas no son muy efectivos frente a esta plaga por el tipo de hbitos y biologa

que presenta, adems su uso inadecuado afecta al medio ambiente y provoca la

muerte de fauna natural (Guedes et al., 1994).

2.2.4. Enemigos naturales de Tuta absoluta

Existen tres especies de himenpteros que controlan diferentes estados de la

plaga: Trichogramma petiosum (Riley) y Trichogramma exiguum son parasitoides de

los huevos mientras que Apanteles gelechiidivoris (Marsh) parasita las larvas

presentndose una preferencia por el tercer instar (Escobar et al., 2004). El uso de

estos controladores ha sido muy efectivo. Sin embargo, el entomopatgeno ms

usado y conocido para el control de lepidpteros es la bacteria B. thuringiensis,

debido a que la mayora de sus cepas poseen actividad patgena contra larvas de

este orden, y entre otras cosas no presenta daos al medio ambiente.

2.3 La bacteria entomopatgena Bacillus thuringiensis

2.3.1 Caractersticas generales de Bacillus thuringiensis (Bt)

El inters por los insecticidas microbianos se remonta desde mediados del siglo XIX;

las investigaciones de la enfermedad del gusano de seda Bombix mori efectuadas

por Pasteur en 1849, enfocaron la atencin de los bacterilogos en insectos plagas

y en el descubrimiento de un sin nmero de enfermedades microbianas de insectos.

Ishiwata (1901) aisl una bacteria de un gusano de seda enfermo, denominndola

Bacillus sotto, este acontecimiento marca el comienzo del desarrollo del control

biolgico. En Thuringia, Alemania, Berliner (1911) aisl una bacteria aerbica

24

formadora de esporas de una larva enferma de la palomilla de la harina (Ephestia

Kuhniella Zell) y la identific como Bacillus thuringiensis (Ishiwata 1901, Berliner

1911; citado en: Whiteley y Schnepf, 1986; Hannay y Fitz-James, 1995).

Hacia 1936 se introdujo en el mercado el primer producto comercial bajo el nombre

de Sporine cuyo principio activo eran las esporas de B. thuringiensis. Angus (1954),

descubre el papel de la toxicidad de las inclusiones paraesporales o cristales de Bt

en larvas del gusano de seda. Un ao ms tarde, Hannay y Fitz (1955) encontraron

que este cuerpo es el resultado de la cristalizacin de la protena que representa

entre el 20 y el 30% de la protena total despus de la lisis celular y la liberacin de

la espora. (Angus 1954, Hannay y Fitz, 1955; citado en Hfte y Whiteley, 1989).

En 1967 Heimpel propuso la nomenclatura oficial de los cristales en donde se

designa las diferentes toxinas de B. thuringiensis y se da el nombre de -

endotoxina o protena insecticida de cristal (ICP's del ingles, Insecticidal Protein

Crystal). Actualmente se utiliza este trmino para designar el cristal proteico o la

toxina activada (Heimpel, 1967).

Actualmente existen otras designaciones para productos comerciales elaborados

con cepas de B. thuringiensis. Acrobe, Bactospeine, Berliner Dipel, Turilav (var.

Kurstaki), Certan, Xentari (var. aizawai), Javelin, Leptox, Novabac, Teknar, Thuricide

y Victory (var. israelensis) (Whiteley y Schnepf, 1986). Las tpicas formulaciones

agrcolas a base de B. thuringiensis incluyen: polvos, polvos humectables,

granulados y tabletas (Bravo y Cern, 2004).

2.3.2. Clasificacin taxonmica de Bacillus thuringiensis

B. thuringiensis pertenece al orden Eubacteriales, a la familia Bacillaceae, al

Phylum: Firmicutes, a la Clase: Bacilli y al Grupo I del Gnero: Bacillus. Es una

bacteria aerbica, Gram positiva, caracterizada por la produccin de inclusiones

paraesporales durante la fase de esporulacin. Esta inclusin contiene protenas

insecticidas de cristal (ICPSs) (Hofte y Whiteley, 1989), tambin denominadas -

endotoxinas, las cuales son codificadas por los genes cry (Schnepf et al., 1998). Es

25

el organismo entomopatgeno ms utilizado para el control de insectos plaga en

diversos cultivos comerciales (Lambert y Peferoen, 1992; Schnepf et al., 1998).

Las clulas vegetativas de B. thuringiensis tienen forma de bastn y oscilan entre 1

a 1,2 micras de ancho y de 3 a 5 micras de largo. Los cristales txicos oscilan entre

0,5 a 1 micra de dimetro (Claus y Berkeley, 1986) (Figura 3).

Figura 3. Micrografa de transmisin electrnica de B. thuringiensis. SP (Espora); PB (Cristal). (De Maagd et al., 2001)

2.3.3. Bacillus thuringiensis en el medio ambiente

B. thuringiensis es una bacteria cosmopolita que se encuentra en ambientes

naturales como suelo, invernaderos, superficies de hojas, conferas e insectos

muertos, pero tambin se encuentra con elevada frecuencia en muestras de agua y

polvo (Martin y Travers, 1989), en diferentes ecosistemas como desiertos, estepas,

bosque tropical hmedo, zona de alta montaa, playas y cuevas. La distribucin de

B. thuringiensis en la naturaleza no es homognea y por lo tanto depende de

condiciones ambientales determinadas. Como el nicho ecolgico de B. thuringiensis

no ha sido determinado, no esta claro si la diversidad del hbitat donde se puede

localizar responde a una amplia versatilidad ecolgica de esta bacteria, o

simplemente esta relacionado con el transporte de las esporas por factores

ambientales (Wasno et al., 1999). B. thuringiensis en diversos estudios ha sido

26

aislada de diferentes ambientes como: suelo (Dulmage y Aizawa, 1982; Martn y

Travers, 1989; Bernhard et al., 1997; Hossain et al., 1997; Bravo et al., 1998;

Arango et al., 2002; Uribe et al., 2003; Citado en Bravo y Cern, 2004); insectos

muertos y sus hbitats (Apoloyo et al., 1995; Bernhard et al., 1997; Chilcot y Wigley,

1993); hojas (Meadows et al., 1992); y otras fuentes naturales (Hegalson et al.,

1998). As mismo la dispersin por el hombre juega un papel importante en este

sentido especialmente por efecto del comercio de productos agrcolas de

almacenamiento (Bravo y Cern, 2004).

B. thuringiensis es un habitante ampliamente distribuido en un gran nmero de

ecosistemas, debido a la produccin de esporas, las cuales pueden permanecer por

periodos de tiempo muy largo en ausencia de humedad y nutrientes. A su vez,

cuando la espora se encuentra en un medio rico que contenga los nutrientes

necesarios puede comenzar nuevamente su crecimiento vegetativo (Martn y

Travers, 1989; Holt et al., 2000), las esporas pueden sobrevivir por algunos aos,

aunque la poblacin y la toxicidad declinen rpidamente (Addison, 1993).

2.4. Intercambio gentico

El intercambio de material gentico entre aislamientos de B. thuringiensis, puede

pensarse como una relacin benfica para la especie, en la medida que aumenta la

capacidad de supervivencia de B. thuringiensis en el ambiente, debido a que

permite incrementar la diversidad de alternativas de este, para acceder a los

recursos disponibles. Sin embargo, existen otras relaciones de antagonismo y

competencia que debe enfrentar B. thuringiensis, las cuales generan prdida de su

capacidad de supervivencia.

Otra consecuencia, de esta alta actividad gentica, es que muchas de las cepas de

B. thuringiensis al producirse intercambio de material gentico, pueden perder los

genes asociados a la formacin de cristales, generando as, gran cantidad de

aislamientos esporogenos acristalferos (Chilcott y Wigley, 1993; Theodoluz et al.,

1997; Bravo et al., 1998), los cuales comnmente son interpretados como

27

microorganismos diferentes y pueden estar llevando a subvalorar la riqueza de B.

thuringiensis en el ambiente (Bravo y Cern, 2004).

2.4.1. Conjugacin

El principal mecanismo de transferencia clula a clula es la conjugacin, que es

una funcin codificada por algunos plsmidos. La conjugacin es un proceso

replicativo y ambas clulas terminan con copias del plsmido.

Los plsmidos realizan su propia transferencia de una clula a otra por contacto y se

llaman conjugativos, pero no todos los plsmidos son conjugativos, debido a que la

transmisibilidad mediante conjugacin est controlada por un conjunto de genes

dentro del plsmido que constituye una regin tra. La presencia de una regin tra

en un plsmido puede tener otra importante consecuencia si el plsmido se integra

en el cromosoma. Entonces, el plsmido puede movilizar la transferencia de DNA

cromosmico de una clula a otra (Madigan et al., 2003).

2.4.2. Intercambio intra e interespecfico

La capacidad de B. thuringiensis de llevar a cabo intercambio intra e interespecfico

de informacin gentica, es realizado mediante un proceso a nivel bacteriano

conocido como conjugacin. El intercambio de material gentico intraespecfico

(entre las diferentes serovariedades de B. thuringiensis) e interespecfico (de B.

thuringiensis a B. cereus, y B. anthracis) ha sido demostrada desde hace casi 20

aos en condiciones artificiales (Battisti et al., 1985; Gonzlez et al., 1982; Reddy et

al., 1987), y ms recientemente en larvas de insectos hospederos.

- Intercambio intraespecfico: desde el punto de vista ambiental tiene varias

implicaciones, ya que aparentemente es posible realizar intercambio de los

genes codificantes para las protenas que conforman los cuerpos paraesporales,

portadores de las toxinas insecticidas (Bravo y Cern, 2004), lo cual conlleva a

que al menos potencialmente las diferentes cepas de B. thuringiensis estn

ganando o perdiendo las endotoxinas que confieren la capacidad biocida a cada

aislamiento, lo cual adems de modificar el rango de hospederos de una cepa

determinada, puede estar conduciendo hasta la creacin de nuevas -

28

endotoxinas (Aronson et al., 1986). Esto puede explicar de algn modo la

diversidad y la actividad de B. thuringiensis en la naturaleza.

- Intercambio interespecfico: podra ser la clave para entender aquellos

aislamientos de B. cereus que reaccionan con antgenos H de B. thuringiensis o

viceversa. De esta forma la transferencia de plsmidos interespecfica puede ser

un evento que tericamente se puede dar en la naturaleza, representando un

riesgo ambiental. Sin embargo, hay algunos reportes donde cepas nativas de B.

thuringiensis productoras de -endotoxinas, producen tambin -exotoxina y una

enterotoxina similar a la de Bacillus cereus (Perani et al., 1998). Lo cual sugiere

que es necesario confirmar la ausencia de estas toxinas al momento de

seleccionar una cepa de B. thuringiensis para uso agrcola (Bravo y Cern,

2004).

2.5. Las Delta-endotoxinas

2.5.1. Clasificacin de las -endotoxinas de B. thuringiensis

La importancia de B. thuringiensis como entomopatgeno se debe a que presenta

factores de virulencia que le permiten controlar diferentes organismos.

Estos factores de virulencia son: fosfolipasas, proteasas, quitinasas, -endotoxinas

o exotoxinas termolbiles, -exotoxinas, protenas VIP (Protenas insecticidas que

se forman en la fase vegetativa de crecimiento) y las -endotoxinas (Protenas que

se acumulan en la fase de esporulacin formando cristales paraesporales).

Las -endotoxinas se clasifican en dos grupos: las protenas Cry y Cyt. Una protena

Cry se define como cualquier protena paraesporal de B. thuringiensis que muestre

un efecto txico hacia algn organismo, demostrable por medio de bioensayos o

cualquier protena que muestre similitud de secuencia con las protenas Cry

descritas hasta el momento (Bravo, 1998; Crickmore et al., 1998); las protenas Cyt

se definen como protenas paraesporales de B. thuringiensis que muestran actividad

29

citoltica o que presentan similitud con la secuencia de algunas protenas Cyt

conocidas (Crickmore et al., 1998).

En la actualidad se conocen 424 protenas Cry, clasificadas en 55 familias y 121

subgrupos, lo que demuestra la gran diversidad de estos genes. Entre estos, los

genes cry1 son los ms frecuentes en todo el mundo, con variaciones entre

diferentes regiones (Wang et al., 2003). Existen 42 subgrupos que presentan

actividad txica frente a insectos lepidpteros. Adems 6 protenas a las que no se

le ha dado un nombre especfico debido a que no hay conocimiento suficiente de las

secuencias (Crickmore, 2008) (Tabla 1).

Tabla 1. Proteinas Cry y Cyt producidas por las diferentes variedades de B. thuringiensis.

(Crickmore, 2008).

Nombre

del gen

Nombre

anterior

N de

Acceso Autores Ao Cepa Fuente

Cry1Aa15 DQ062690 Sauka et al 2005 Bt INTA Mol-12

Cry1Ab22 ABW87320 Wu and Feng 2008 BtS2491Ab

Cry1Ab-

like DQ781309 Lin and Fang 2006 Bt ly4a3

Cry1Ac23 AM949588 Kashyap et al 2008 Bt

Cry1Ad2 A27531 1995 Bt PS81RR1

Cry1Ae1 CryIA(e) M65252 Lee & Aronson 1991 Bt alesti

Cry1Af1 U82003 Kang et al 1997 Bt NT0423

Cry1Ag1 AF081248 Mustafa 1999

Cry1Ah2 DQ269474 Qi et al 2005 Bt alesti

Cry1Ai1 AY174873 Wang et al 2002

Cry1A-like AF327927 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala nags3

Cry1Ba5 ABO20894 Song et al 2007 Bt sfw-12

Cry1Bb1 ET5 L32020 Donovan et al 1994 Bt EG5847

Cry1Bd2 AY138457 Isakova et al 2002 Bt 834

Cry1Be2 AAQ52387 Baum et al 2003

Cry1Bf2 AAQ52380 Baum et al 2003

Cry1Bg1 AY176063 Wang et al 2002

Cry1Ca11 AY955268 Cai et al 2005 Bt C-33

Cry1Cb3 EU679502 Huang et al 2008 Bt087

Cry1Cb-

like AAX63901 Thammasittirong et al 2005 Bt TA476-1

30

Cry1Da2 I76415 Payne & Sick 1997

Cry1Db2 AF358862 Li et al 2001 Bt B-Pr-88

Cry1Dc1 EF059913 Lertwiriyawong et al 2006

Cry1Ea8 ABX11258 Huang et al 2007 Bt HZM2

Cry1Eb1 CryIE(b) M73253 Payne & Sick 1993 Bt aizawai PS81A2

Cry1Fa2 M73254 Payne & Sick 1993 Bt aizawai PS81I

Cry1Fb7 EU679501 Huang et al 2008 Bt087

Cry1Ga2 Y09326 Shevelev et al 1997 Bt wuhanensis

Cry1Gb2 AF288683 Li et al 2000 Bt B-Pr-88

Cry1Gc AAQ52381 Baum et al 2003

Cry1Ha1 PrtC Z22513 Lambert 1993 Bt BTS02069AA

Cry1Hb1 U35780 Koo et al 1995 Bt morrisoni BF190

Cry1H-like AF182196 Srifah et al 1999 Bt JC291

Cry1Ia13 ABF83202 Martins et al 2006 Bt

Cry1Ib3 EU677422 Liu et al 2008 Bt GS8

Cry1Ic2 AAE71691 Osman et al 2001

Cry1Id1 AF047579 Choi 2000

Cry1Ie1 AF211190 Song et al 2000 Bt BTC007

Cry1If1 AAQ52382 Baum et al 2003

Cry1I-like DQ781310 Lin & Fang 2006 Bt ly4a3

Cry1Ja1 ET4 L32019 Donovan et al 1994 Bt EG5847

Cry1Jc1 AAQ52372 Baum et al 2003

Cry1Jd1 AX189651 Arnaut et al 2001

Cry1Ka1 U28801 Koo et al 1995 Bt morrisoni BF190

Cry1La1 AAS60191 Je et al 2004 Bt kurstaki K1

Cry1-like I90729 Payne et al 1998

Cry2Aa12 DQ977646 Tan et al 2006 Bt Rpp39

Cry2Ab12 ABM21764 Lin et al 2007 Bt LyD

Cry2Ac12 AM689532 Saleem & Shakoori 2007 Bt CMBL-BT3

Cry2Ad5 AM765844 Saleem et al 2007 Bt HD29

Cry2Ae1 AAQ52362 Baum et al 2003

Cry2Af1 EF439818 Beard et al 2007 Bt C81

Cry3Aa12 ABY49136 Sezen et al 2008 Bt tenebrionis

Cry3Ba2 A07234 Peferoen et al 1990 Bt PGSI208

Cry3Bb3 I15475 Peferoen et al 1995

Cry3Ca1 CryIIID X59797 Lambert et al 1992 Bt kurstaki BtI109P

Cry4Aa3 AL731825 Berry et al 2002 Bt israelensis

Cry4a-like DQ078744 Mahalakshmi et al 2005 Bt LDC-9

Cry4Ba5 AL731825 Berry et al 2002 Bt israelensis

31

cRY4Ba-

like ABC47686 Mahalakshmi et al 2005 Bt LDC-9

Cry4Ca1 EU646202 Shu et al 2008

Cry5Aa1 CryVAa L07025 Narva et al 1994 Bt darmstadiensis PS17

Cry5Ab1 CryVAb L07026 Narva et al 1991 Bt darmstadiensis PS17

Cry5Ac1 I34543 Payne et al 1997

Cry5Ad|1 EF219060 Lenane et al 2007 Bt L355

Cry5Ba2 EU121522 Sun et al 2008 YBT 1518

Cry6Aa3 DQ835612 Jia et al 2006 Bt 96418

Cry6Ba1 CryVIB L07024 Narva et al 1991 Bt PS69D1

Cry7Aa1 CryIIIC M64478 Lambert et al 1992 Bt galleriae PGSI245

Cry7Ab4 EU380678 Shu et al 2008 Bt

Cry7Ba1 ABB70817 Zhang et al 2006 Bt huazhongensis

Cry7Ca1 EF486523 Gao et al 2007 Bt BTH-13

Cry8Aa1 CryIIIE U04364 Narva & Fu 1992 Bt kumamotoensis

Cry8Ab1 EU044830 Cheng et al 2007 Bt B-JJX

Cry8Ba1 CryIIIG U04365 Narva & Fu 1993 Bt kumamotoensis

Cry8Bb1 AX543924 Abad et al 2002

Cry8Ca2 AAR98783 Song et al 2004 Bt HBF-1

Cry8Da3 BD133575 Asano et al 2002 Bt

Cry8Db1 AB303980 Yamaguchi and

Asano 2007 Bt BBT2-5

Cry8Ea2 EU047597 Liu et al 2007 Bt B-DLL

Cry8Ga2 DQ318860 Yan et al 2005 Bt 145

Cry8Ha1 EF465532 Fuping et al 2006 Bt 185

Cry8Ia1 EU381044 Yan et al 2008 Bt su4

Cry8 like ABS53003 Mangena et al 2007 Bt

Cry9Aa2 X58534 Gleave et al 1992 Bt DSIR517

Cry9Aa

like AAQ52376 Baum et al 2003

Cry9Ba1 CryIX X75019 Shevelev et al 1993 Bt galleriae

Cry9Bb1 AY758316 Silva-Werneck et al 2004 Bt japonensis

Cry9Ca2 AAQ52375 Baum et al 2003

Cry9Da2 AF042733 Wasano & Ohba 1998 Bt japonensis

Cry9Db1 AY971349 Flannagan et al 2005 Bt kurstaki DP1019

Cry9Ea3 EF157307 Lin et al 2006

Cry9Eb1 AX189653 Arnaut et al 2001

Cry9Ec1 AF093107 Wasano & Ohba 2003 Bt galleriae

Cry9Ed1 AY973867 Flannagan et al 2005 Bt kurstaki DP1019

32

Cry9 like AF093107 Wasano et al 1998 Bt galleriae

Cry10Aa3 AL731825 Berry et al 2002 Bt israelensis

Cry10A

like DQ167578 Mahalakshmi et al 2006 Bt LDC-9

Cry11Aa3 AL731825 Berry et al 2002 Bt israelensis

Cry11Aa-

like DQ166531 Mahalakshmi et al 2007 Bt LDC-9

Cry11Ba1 X86902 Delecluse et al 1995 Bt jegathesan 367

Cry11Bb1 AF017416 Orduz et al 1998 Bt medellin

Cry12Aa1 CryVB L07027 Narva et al 1991 Bt PS33F2

Cry13Aa1 CryVC L07023 Narva et al 1992 Bt PS63B

Cry14Aa1 CryVD U13955 Narva et al 1994 Bt sotto PS80JJ1

Cry15Aa1 M76442 Brown & Whiteley 1992 Bt thompsoni

Cry16Aa1 cbm71 X94146 Barloy et al 1996 Cb malaysia CH18

Cry17Aa1 cbm72 X99478 Barloy et al 1998 Cb malaysia CH18

Cry18Aa1 CryBP1 X99049 Zhang et al 1997 Paenibacillus popilliae

Cry18Ba1 AF169250 Patel et al 1999 Paenibacillus popilliae

Cry18Ca1 AF169251 Patel et al 1999 Paenibacillus popilliae

Cry19Aa1 Y07603 Rosso & Delecluse 1996 Bt jegathesan 367

Cry19Ba1 D88381 Hwang et al 1998 Bt higo

Cry20Aa1 U82518 Lee & Gill 1997 Bt fukuokaensis

Cry21Aa2 I66477 Feitelson 1997

Cry21Ba1 AB088406 Sato & Asano 2002 Bt roskildiensis

Cry22Aa2 AX472772 Isaac et al 2002 Bt

Cry22Ab2 AX472764 Isaac et al 2002 Bt

Cry22Ba1 AX472770 Isaac et al 2002 Bt

Cry23Aa1 AAF76375 Donovan et al 2000 Bt

Cry24Aa1 U88188 Kawalek and Gill 1998 Bt jegathesan

Cry24Ba1 BAD32657 Ohgushi et al 2004 Bt sotto

Cry24Ca1 AM158318 Beron & Salerno 2005 Bt FCC-41

Cry25Aa1 U88189 Kawalek and Gill 1998 Bt jegathesan

Cry26Aa1 AF122897 Wojciechowska et al 1999 Bt finitimus B-1166

Cry27Aa1 AB023293 Saitoh 1999 Bt higo

Cry28Aa2 AF285775 Moore and Debro 2000 Bt finitimus

Cry29Aa1 AJ251977 Delecluse et al 2000

Cry30Aa1 AJ251978 Delecluse et al 2000

Cry30Ba1 BAD00052 Ikeya et al 2003 Bt entomocidus

Cry30Ca1 BAD67157 Ohgushi et al 2004 Bt sotto

Cry30Da1 EF095955 Shu et al 2006 Bt Y41

33

Cry30Ea1 EU503140 Fang et al 2007

Cry31Ab2 AB274825 Yasutake et al 2006 Bt 31-5

Cry31Ac1 AB276125 Yasutake et al 2006 Bt 87-29

Cry32Aa1 AY008143 Balasubramanian et al 2001 Bt yunnanensis

Cry32Ba1 CryE6L BAB78601 Takebe et al 2001 Bt

Cry32Ca1 CryE6Q BAB78602 Takebe et al 2001 Bt

Cry32Da1 CryE6S BAB78603 Takebe et al 2001 Bt

Cry33Aa1 AAL26871 Kim et al 2001 Bt Dakota

Cry34Aa4 AY536897 Schnepf et al 2004 Bt PS185GG

Cry34Ab1 AAG41671 Moellenbeck et al 2001 Bt PS149B1

Cry34Ac3 AY536896 Schnepf et al 2004 Bt KR1369

Cry34Ba3 AY536898 Schnepf et al 2004 Bt PS201HH2

Cry35Aa4 AY536892 Schnepf et al 2004 Bt PS185GG

Cry35Ab3 AY536891 Schnepf et al 2004 Bt KR1369

Cry35Ac1 AAG50117 Ellis et al 2001 Bt PS167H2

Cry35Ba3 AY536893 Schnepf et al 2004 Bt PS201HH2

Cry36Aa1 AAK64558 Rupar et al 2001 Bt

Cry37Aa1 AAF76376 Donovan et al 2000 Bt

Cry38Aa1 AAK64559 Rupar et al 2000 Bt

Cry39Aa1 BAB72016 Ito et al 2001 Bt aizawai

Cry40Aa1 BAB72018 Ito et al 2001 Bt aizawai

Cry40Ba1 BAC77648 Ito et al 2003 Bun1-14

Cry40Ca1 EU381045 Shu et al 2008 Bt Y41

Cry40Da1 EU596478 Fang et al 2008 Bt

Cry41Aa1 AB116649 Yamashita et al 2003 Bt A1462

Cry41Ab1 AB116651 Yamashita et al 2003 Bt A1462

Cry42Aa1 AB116652 Yamashita et al 2003 Bt A1462

Cry43Aa2 AB176668 Nozawa 2004 P. popilliae popilliae

Cry43Ba1 AB115422 Yokoyama and

Tanaka 2003

P. lentimorbus

semadara

Cry43-like AB115422 Yokoyama and

Tanaka 2003

P. lentimorbus

semadara

Cry44Aa BAD08532 Ikeya et al 2004 Bt entomocidus INA288

Cry45Aa BAD22577 Okumura and Saitoh 2004 Bt 89-T-34-22

Cry46Aa BAC79010 Ito et al 2004 Bt Dakota

Cry46Ab BAD35170 Yamagiwa et al 2004 Bt

Cry47Aa AY950229 Kongsuwan et al 2005 Bt CAA890

Cry48Aa3 AM237206 Jones and Berry 2006 Bs NHA15b

Cry48Ab2 AM237208 Jones and Berry 2006 Bs 2173

34

Cry49Aa4 AM237204 Jones and Berry 2006 Bs 2173

Cry49Ab1 AM237202 Jones and Berry 2006 Bs LP1G

Cry50Aa1 AB253419 Ohgushi et al 2006 Bt sotto

Cry51Aa1 DQ836184 Meng et al 2006 Bt F14-1

Cry52Aa1 EF613489 Song et al 2007 Bt Y41

Cry53Aa1 EF633476 Song et al 2007 Bt Y41

Cry54Aa1 EU339367 Tan et al 2007 Bt MC28

Cry55Aa1 EU121521 Sun et al 2008 YBT 1518

Cyt1Aa6 ABC17640 Zhang et al 2005 Bt LLP29

Cyt1Aa-

like ABB01172 Mahalakshmi 2007 Bt LDC-9

Cyt1Ab1 X98793 Thiery et al 1997 Bt medellin

Cyt1Ba1 U37196 Payne et al 1995 Bt neoleoensis

Cyt1Ca1 AL731825 Berry et al 2002 Bt israelensis

Cyt2Aa2 AF472606 Promdonkoy &

Panyim 2001 Bt darmstadiensis73E10

Cyt2Ba9 AL731825 Berry et al 2002 Bt israelensis

Cyt2Ba-

like ABE99695 Mahalakshmi et al 2007 Bt LDC-9

Cyt2Bc1 CAC80987 Delecluse et al 1999 Bt medellin

Cyt2B-like DQ341380 Zhang et al 2005

Cyt2Ca1 AAK50455 Baum et al 2001 Bt

2.5.2. Genes que codifican protenas con actividad insecticida

Las protenas Cry son toxinas modulares que presentan actividades toxicas

altamente especficas para diferentes tipos de insectos. En la tabla 2 se presentan

31 protenas Cry con actividad especfica contra un orden de insecto susceptible.

35

Tabla 2. Protenas Cry con actividad especfica contra un orden de insecto. (Barloy et al., 1996; Zhang et al., 1997)

PROTENA ORGANISMOS SUSCEPTIBLES

Cry1 Lepidpteros, algunas presentan actividad dual

Cry2 Actividad dual frente a lepidpteros y dpteros

Cry3 Colepteros

Cry4 Dpteros

Cry5 Nematodos, caros himenpteros

Cry6 Nematodos, caros

Cry7 Colepteros

Cry8 Dual colepteros y fidos

Cry9 Lepidpteros

Cry10 Dpteros

Cry11 Dpteros

Cry12 Dual dpteros y colepteros

Cry13 Nematodos

Cry14 Dpteros y colepteros

Cry15 Lepidpteros

Cry16 Dpteros

Cry17 Dpteros

Cry18 Colepteros

Cry19 Dpteros

Cry20 Dpteros

Cry21 Nematodos

Cry22 Himenpteros

Cry23 Colepteros

Cry24 Dpteros

Cry25 Dpteros

Cry26 Dpteros

Cry27 Dpteros

Cry28 Dpteros

Cry29 Dpteros

Cry30 Dpteros

Cry31 Dpteros

36

2.5.3. Organizacin y estructura tridimensional de las protenas Cry

Existen algunas regiones altamente conservadas a nivel de secuencia primaria entre

las protenas Cry, denominadas los 5 bloques conservados, que se localizan en la

regin que codifica para la toxina. La mayora de las protenas Cry se producen

como protoxinas de un tamao de 130-140 kDa (Hfte y Whiteley, 1989). Sin

embargo, Schnepf et al. (1998), describieron otros tres bloques conservados

localizados en la regin de la protoxina.

Los 5 bloques conservados de la estructura primaria de las protoxinas estn

localizados en regiones muy importantes dentro de la estructura tridimensional, y

estas corresponden a las regiones internas de los Dominios (Figura 4).

Figura 4. Estructura tridimensional de protena Cry1Aa.

I: Dominio I; II Dominio II; III Dominio III (De Maagd et al., 2001)

Las toxinas Cry presentan una organizacin similar entre ellas, compuesta de tres

dominios estructuralmente conservados: dominio I, II y III. Con base en estos

dominios se han llevado a cabo diferentes estudios de relaciones filogenticas de

las toxinas Cry, indicando un porcentaje de identidad no muy alto y diferente

especificidad a insectos (De Maagd et al., 2001) (Figura 4).

37

El dominio I, consiste en 7 hlices, donde una hlice esta rodeada por otras seis,

las cuales son anfipticas, su funcin est relacionada con la formacin del poro en

la membrana del insecto susceptible. Est formada aproximadamente por los

primeros 250 aminocidos de la toxina (De Maagd et al., 2003; Li et al., 1991;

Schneph et al., 1998).

El Dominio II, tambin llamado prisma est formado por tres lminas de estructura

simtricos anti paralelos, el cual participa en la interaccin con el receptor siendo

un factor importante de la especificidad. Est formado por aproximadamente los 300

aminocidos siguientes al dominio I (De Maagd et al., 2003; Jurat-Fuentes y Adang,

2001; Schnepf et al., 1998).

El Dominio III, es similar a un sandwich, al parecer est involucrado con la

especificidad, y tambin participa en la proteccin ocasionada por proteasas

intestinales, adems reconoce al receptor y acta en la ligacin (Burton et al., 1999;

De Maagd et al., 2003; Flores et al., 1997; Masson et al., 1998).

Este anlisis ha permitido distinguir 3 subgrupos de protenas Cry. Un primer

subgrupo est integrado por las clases Cry1, Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10,

Cry16, Cry17, Cry19 y Cry20 que se caracterizan por tener los 5 bloques

conservados en la regin de la toxina. Un segundo grupo est formado por las

clases Cry5, Cry12, Cry13, Cry14 y Cry22. Ests toxinas se caracterizan por tener

regiones homlogas a los bloques 1,2,3,4 y 5, sin embargo, el bloque conservado 3

presenta una homologa muy baja. El tercer subgrupo est integrado por las clases

Cry2, Cry11, Cry18, estas toxinas poseen el bloque conservado 1 y presentan una

variante del bloque 2 pero carecen de los bloques 4 y 5. Nuevas investigaciones

agrupan a las protenas Cry1, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, Cry5, Cry12, Cry14 y Cry21

(Figura 5).

38

Figura 5. Alineamiento de las protenas Cry que revela la posicin de los 5 bloques conservados.

Dominio I involucrado en la formacin del poro en la membrana de las clulas del insecto susceptible; Dominio II participan en la interaccin con el receptor siendo un determinante importante de la

especificidad; Dominio III reconocimiento al receptor y ligacin (De Maagd et al., 2003).

2.5.4. Mecanismo de accin de las protenas insecticidas de cristal (ICPs)

Los estudios sobre el mecanismo de accin de las ICPs de B. thuringiensis, es

actualmente el rea donde se realiza mayor investigacin ya que se considera que

si este aspecto se llega a conocer en detalle, se podrn disear mejores

bioinsecticidas, ms txicos y de espectro de accin ms amplio (Figura 6).

39

Figura 6. Mecanismo de accin de las -endotoxinas. 1. Los insectos susceptibles consumen follaje tratado con B. thuringiensis. 2. Dentro de minutos la

toxina se liga al receptor especfico en la pared del intestino y el insecto detiene el alimento. 3. Dentro de horas, por los agujeros de la pared del intestino, las esporas y bacterias del intestino entran en la cavidad del cuerpo; la toxina se disuelve. 4. De 1-2 das, el insecto, muere de septicemia ya que las

esporas y las bacterias del intestino proliferan en su sangre. (Watkinson, 1994; De Maagd et al., 2001).

Las toxinas Cry difieren de las toxinas Cyt en su mecanismo de accin. Una vez el

insecto susceptible ingiere el cristal este se solubiliza en el ambiente alcalino y

reductor del intestino medio. Como la mayor parte de las protenas Cry se producen

como protoxinas, estas son activadas por accin de las proteasas (tripsina,

quimiotripsina, termolisina y catepsinas) del intestino medio de los insectos (Bravo et

al., 2002). Luego, las protenas activas se unen a sitios especficos localizados en

las microvellosidades apicales del intestino medio. (Rukmini et al., 2000; Aronson y

Shai, 2001). Una vez la toxina se encuentra activa, se inserta en la membrana como

consecuencia de un cambio conformacional drstico disparado por el receptor y

forma poros los cuales alteran el equilibrio de electrlitos y agua, interfiriendo en el

metabolismo celular normal. Diversos estudios han encontrado que las toxinas Cry

aumentan la permeabilidad de la microvellosidad apical tanto para cationes

40

monovalentes como para divalentes, aniones, agua y molculas de mayor tamao.

Esto causa tambin que colapse la diferencia de potencial y por tanto se pierda la

fuerza motriz que dirige la entrada de aminocidos al interior celular, as como la

redistribucin de los cationes entre el lmen y el citoplasma, obteniendo como

consecuencia la alcalinizacin del citoplasma y destruccin de las clulas

columnares y caliciformes (De Maagd et al., 2001). Al destruirse las clulas, las

esporas de B. thuringiensis tienen acceso a la hemolinfa del insecto y proliferan

dentro de esta (Van Rie et al., 1989; Knowles, 1993; De Maagd et al., 2001);

provocando en la larva parlisis del tracto digestivo, cese de la ingesta y por ltimo,

su muerte (Schnepf et al., 1998; Griffitts et al., 2005) (Figura 6).

Generalmente es asumido que los dems tipos de ICP`s emplean esencialmente la

misma ruta que las protenas Cry1. Por ejemplo muchos de los pasos anotados

arriba han sido observados en el caso de la toxina Cry3Aa. (Koller et al., 1992).

2.5.5. Aplicaciones biotecnolgicas

Entre las formulaciones biolgicas utilizadas para el control de insectos plaga en la

agricultura, se destaca B. thuringiensis (Hofte y Whiteley, 1989). La mayora de los

bioinsecticidas a base de B. thuringiensis son producidos utilizando aislamientos

nativos, y utilizan solo una pequea fraccin de las protenas Cry conocidas. La

manipulacin de los genes cry en B. thuringiensis ofrece un potencial en el

mejoramiento de la efectividad y la relacin costo beneficio de los productos a base

de B. thuringiensis.

B. thuringiensis es la bacteria entomopatgena ms ampliamente utilizada como

biopesticida, en la proteccin de especies vegetales, agricultura comercial y contra

dpteros vectores de enfermedades humanas (Clive, 2006). Desde que ocurri la

primera clonacin de un gen cry, que codifica para protenas insecticidas en Bt

(Schnepf y Whiteley, 1985) se han aislado muchos otros genes por lo cul se ha

establecido una clasificacin basada en la secuencia de la protena (Crickmore et

al., 1998).

41

Otra de las aplicaciones de B. thuringiensis es en cultivos biotecnolgicos. Hasta el

2006, de los 22 pases productores de transgnicos (Tabla 3), 11 constituyeron

pases industrializados, y 11 pases envas de desarrollo. Estos fueron, en orden de

hectreas de superficie: Estados Unidos, Argentina, Brasil, Canad, India, China,

Paraguay, Sudfrica, Uruguay, Filipinas, Australia, Rumania, Mxico, Espaa,

Colombia, Francia, Irn, Honduras, Repblica Checa, Portugal, Alemania y

Eslovaquia. Cabe notar que los primeros ocho pases de la lista cultivaron ms de

un milln de hectreas cada uno, lo que constituye una base amplia y estable para

la futura adopcin mundial de los cultivos biotecnolgicos.

En 2008, 13,3 millones de agricultores cultivaron 125 millones de hectreas con

variedades transgnicas. El aumento de hectreas cultivadas en 2008 supuso un

9,4% respecto a 2007.

Lo ms remarcable de 2008 es el comienzo de los cultivos biotecnolgicos en

pases africanos como Egipto y Burkina Faso. frica es considerada la barrera final

para los cultivos biotecnolgicos y quizs es el continente que puede verse ms

beneficiado por ellos. En 2008 se cultivaron en Egipto 700 hectreas de maz Bt y

en Burkina Faso se cultivaron 8.500 hectreas de algodn Bt. A estos dos pases se

une Sudfrica, donde se vienen cultivando desde 1998 algodn, maz y soja

genticamente modificados.

Las cosechas biotecnolgicas han hecho dos contribuciones importantes a la

seguridad global alimentaria. Primero han incrementado la productividad, lo que

aumenta asimismo la accesibilidad a los alimentos. Segundo, han reducido los

costos de produccin, lo que en ltima instancia ayuda a reducir los precios de los

alimentos. En 2050 9.200 millones de personas necesitarn comer. En este

escenario la biotecnologa juega un papel fundamental en satisfacer las

necesidades crecientes de alimentos.

Por esta razn, la adherencia a prcticas agrcolas adecuadas para los cultivos

transgnicos continuar a siendo tan importante como lo ha sido durante la primera

dcada, y una administracin responsable continuada tendr que ser ejercida, sobre

42

todo por los pases del Sur que sern los mayores productores de cultivos

transgnicos durante la prxima dcada (Clive, 2006).

Tabla 3. Superficie global de cultivos transgnicos en 2006: por pas (millones de hectreas)

2.6. Tcnicas moleculares

Dadas las caractersticas de B. thuringiensis como agente de control biolgico se ha

intensificado la bsqueda y establecimiento de colecciones de B. thuringiensis a

nivel mundial. El poder caracterizar dichas colecciones y encontrar nuevas -

endotoxinas ofrecen una alternativa para el control de insectos plaga en cultivos

econmicamente importantes. En este sentido es fundamental contar con un

sistema de anlisis que permita identificar cepas de B. thuringiensis que porten

genes ya conocidos o protenas conocidas, de aquellos que portan genes

completamente nuevos.

Entre los mtodos usados para la caracterizacin de B. thuringiensis se incluyen

electroforesis de protenas (SDS-PAGE) y caracterizacin molecular mediante PCR.

43

2.6.1. Electroforesis de protenas (SDS-PAGE):

La electroforesis en gel denaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE), es una

herramienta analtica y preparativa para la ciencia de las protenas, puede ser

utilizada para separar y comparar mezclas complejas de protenas, evaluar la

pureza de una protena durante el curso de su aislamiento, y proveer estimaciones

de caractersticas fsicas como la composicin de sus subunidades, punto

isoelctrico, peso molecular y carga. Por medio, del mtodo SDS-PAGE, las

protenas migran en respuesta a un campo elctrico a travs de poros en la matriz o

gel, la dimensin del poro, carga, forma y tamao, son factores que determinan la

migracin y la separacin de protena, que se basa en el peso molecular mientras

migran a travs del gel de poliacrilamida hacia el nodo.

Las protenas presentan una carga elctrica neta, si se encuentran en un medio que

tenga un pH diferente al de su punto isoelctrico y por eso tienen la propiedad de

desplazarse cuando se someten a un campo elctrico. La velocidad de migracin es

proporcional a la relacin entre las cargas de la protena y su masa. Cuanto mayor

carga por unidad de masa ms rpida ser la migracin. La migracin de las

protenas no solo es proporcional a la carga neta sino tambin al tamao y forma de

las protenas (Laemmli et al., 1970; Sambrook et al., 2001).

2.6.2. La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Los avances en Biologa molecular han permitido desarrollar mtodos basados en

estudios de ADN capaces de diferenciar entre cepas cercanas con capacidad de ser

empleadas en control biolgico de plagas. Estos mtodos pueden ser empleados

para identificar la presencia o ausencia de genes especficos de -endotoxinas

(Bravo y Cern, 2004).

Una de estas tcnicas es la Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), esta

tcnica fue descrita por Kary Mullis y colaboradores en 1980; la PCR es un mtodo

rpido y sencillo que puede amplificar fragmentos especficos de ADN a partir de

cantidades mnimas del ADN original. La PCR, es una tcnica que sirve para la

amplificacin in vitro de secuencias de ADN especficas, razn por la cual tambin

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se le denomina clonacin acelular. La amplificacin del ADN se logra mediante la

extensin de oligonucletidos que son complementarios a secuencias situadas

hacia los dos extremos 3 del segmento bicaternario que se pretende amplificar

(Puerta y Uruea, 2005).

Por otra parte, se encuentra la PCR mltiple (M-PCR), que es un tipo especial de

PCR, donde se amplifica ms de una secuencia blanco, esto se logra agregando en

la reaccin ms de un par de oligonucletidos. Tiene la ventaja de ahorrar tiempo y

esfuerzo sin comprometer la efectividad de la prueba. Las condiciones de M-PCR se

asocian a la compatibilidad entre los oligonucletidos dentro de la reaccin y la no

interferencia son de gran importancia en esta tcnica. La M-PCR, debe evitar el uso

de oligonucletidos anidados, es decir, que requieren una segunda ronda de

amplificacin, debido, a que se pueden presentar falsos positivos, consecuencia de

la contaminacin generada (Elnifro et al., 2000). En la identificacin de B.

thuringiensis, la M-PCR, utiliza una mezcla de oligonucletidos que amplifiquen

fragmentos especficos de cada gen, que codifican las -endotoxinas (Cern et al.,

1994; Cern et al., 1995). Con los oligonucletidos especficos y la M-PCR se

pueden detectar directamente los genes cry conocidos de B. thuringiensis (Song et

al., 2003).

Ambas, tcnicas involucran la preparacin de ADN, la mezcla de oligonucletidos y

la deteccin de los productos de reaccin por medio de la repeticin de un ciclo

formado por tres etapas:

1. Desnaturalizacin del ADN de doble cadena: La doble hlice de ADN se

separa en dos hebras, para ello se realiza una incubacin de la muestra a altas T

que oscilan entre 93-97C, de esta forma las cadenas se torna accesi