TO DOWNLOAD A COPY OF THIS POSTER, VISIT WWW.WATERS.COM/POSTERS ©2016 Waters Corporation

INTRODUCTION Typically with  imaging mass spectrometry,  the overnight period  is  reserved for a single  large acquisition or a  few  regions on a single slide, maximising the amount of  information obtained at a  time when  the  instrument would be otherwise be unused. An improved approach to maximising the amount of information and system utilisation  during  this  period  would  be  to  analyse  multiple  samples  on multiple slides. With advances  in sprayer design, acquisition software, data directed methodologies and robotics, the overnight period can now be used to collect a full 3D imaging dataset or a large cohort of patient samples. Here we  introduce a DESI system which combines DESI‐MS  imaging with an automated  slide  loader  (figure  1)  and  prototype  software  for  high throughput mass spectrometry imaging. 

Automated high throughput 3D imaging using desorption electrospray ionisation mass spectrometry

Emrys Jones1; Lukasz Migas2, Emmy Hoyes1, Richard Chapman1, Emmanuelle Claude1; James Langridge1; Steve Pringle1,Zoltan Takats3; Mike Morris1 1: Waters Corporation, Wilmslow, UK; 2: University of Manchester, Manchester, UK; 3: Imperial College London South Kensington Campus, London, UK.

METHODS All experiments were carried out on a Xevo G2‐XS Q‐ToF  (Waters) equipped with a Prosolia  (Indianapolis) 2D DESI stage. The automated slide  loader and modified plate holder were provided by Prior Scientific (Cambridge, UK). Mouse  brain  and  kidney were  sectioned  onto  conventional  glass  slides;  no further sample preparation was required. For the 3D imaging tissue sectioning was performed such as the voxels created were cubic, e.g. for 100 x 100 µm DESI images, sections at 100 µm distances from each other are included.  Once optimised, the DESI parameters were unchanged for the duration of the studies. The current combination of sprayer and   Xevo‐XS mass spectrometer allows for high intensity signal at accelerated scan rates, the example in figure 2  is data  collected with  a MS  scan  time of 0.186  s  and  stage movement of 200µm per second allowing five 40µm pixels to be collected per second. Faster rates will be described.  The  glass  slides were  scanned  and  regions  of  interest  defined  in  HDI  v1.4 

(Waters) creating a MassLynx experiment file to be imported into a sample list

–  a  fully  automated  approach  based  on  a  rapid  initial  scan  using  Waters 

Research  Enabled  Software  (Wrens)  is  also  introduced. Data  visualisation  is 

performed  in  HDI  v1.4 with  the  3D  reconstruction,  processing  and  viewing 

using custom written software and MATLAB (Mathworks). 

CONCLUSION No requirement for a sample preparation step makes DESI

ideal for high throughput, automated imaging Single section tissue imaging at 10 minute time frames at

100 x 100 µm pixel size Automated slide loading and region of interest detection Full 3D image in <20 hours acquisition, suitable for

overnight data collection and processing Workflow for automated 3D reconstruction in place

Figure 4. Manual  experiment  set up/ automated data  collection. All  slides are  scanned and 

experiments defined by user before running multi slide experiment  

Survey scan approach As  previously  shown  the  gentle  sampling  of  DESI  makes  repeat  analysis 

possible,  thus multiple  experiments  can be  conducted  in  series.  In  order  to 

have a fully automated system  it  is possible to first carry out a coarse survey 

scan  to detect  the  tissue  section,  then  image at  the desired  resolution only 

over this area. In figure 5 this is demonstrated where a 90 second scan of the 

full slide is used to  direct the full analysis.  Using this method provides a fully 

automated method of analysing multiple sample slides.  

Control and processing software

Imaging mass spectrometry experiments are typically carried out on regions of 

a  surface determined by  the user.  For  an  automated process, minimal user  

interaction is desired,  in an idealized situation the slides would be loaded into 

the system and the experiment defined and run with no further input (fig 3).  

There  are  many  documented  approaches  to  region  identification  for 

microscopy, with DESI  there  is  the ability  to use  a  rapid mass  spectrometry 

mapping to find the location of the tissue.  

RESULTS Speed of acquisition and tissue stability

In order to maximise the benefit of automatic slide  loading the acquisition time 

per sample should be in the region of minutes, not hours, and developments with 

hardware  and  software  has  made  this  a  realistic  proposition.  Figure  6 

demonstrates the results of imaging the same tissue section at different MS scan 

rates. Although  total  spectral  intensity  is  lower,  the data and  image quality are 

preserved, allowing a full image  (14mm x 8mm at 100µm) in 12 minutes.  

 

 

 

Figure 8: Individual acquisition time of 40 sections used to create 3D lipid map of mouse kid‐

ney, three  colour overlay of selected ions.  

Figure 2. Results from DESI imaging studies demonstrate the ability to obtain high quality data at higher scan rates than previous studies. Data shown collected at 5 pixels per second.

Total acquisition time

The 40 sections, cut at 100µm distances through the kidney were imaged at 100 x 100, at 10 scans per second. The largest section was approximately 12mm x 10mm. The total acquisition time was 16 hours including the post acquisition data processing.  

Figure 12: 3D visualisation of four separate lipid species within mouse kidney. The known biology of the sample is 

well represented.  

Figure 1. Schematic of the modified top plate for the Prosolia 2D stage to allow coupling to the Prior Scientific slide loader

View the above 3D dataset at Skfb.ly/NXnK or scan the QR

m/z 762.53 m/z 772.53

m/z 764.52

m/z 890.63

Figure 5. Use of survey scan to automatically define the region to be imaged at the desired analytical experimental conditions.

Figure 11. Isosurface output from auto-aligned data. Once the x-y offset and rotation is calculated for the first mass (typically the TIC) all others are processed using these transformation constants

Semi automatic approach For  the  minimal  deviation  from  a  standard  work  flow,  each  slide  in  the 

proposed  slide  loader  run  is  defined  by  the  user  creating  an  experiment 

worksheet which can be added to a sequence  list. A modification to the DESI 

source  control  software  controls  the  loading/unloading of  slides  in between 

each acquisition (fig 4).  

Figure 3: Different methods of multiple slide analysis, including optical region definition 

example where edge and feature analysis algorithms are employed.  

Figure 6. Comparison of DESI‐MS imaging of the same tissue section at varying mass spectrometry 

scan rates. DESI stage speed was adjusted to ensure the same pixel dimensions, which are 100µm 

x  100µm  

Figure 7. Investigation into the stability of lipid signal from tissue on timescale of auto slide loader 

experiment. The upper portion of a mouse kidney section was imaged and left on the DESI stage 

for 14 hours. The lower portion was then imaged, the results demonstrate that without 

normalisation the results are comparable.  

Data processing

It  is not only the acquisition of 3D  imaging MS data that requires automation and 

simplification  if  it  is  to  become  routine,  the  reconstruction  and  visualisation has 

also in the past been very labour intensive.  

For the data presented here, a number of automated steps have been developed 

to  go  from  a  large  amount  of  imaging  MS  data  to  easily  visualised  three 

dimensional representations. Firstly, as shown in figure 9, a script runs through all 

raw data extracting co‐ordinate and selected m/z integration ranges.  

These  can  now  be  imported  into  a  software  package  such  as  MATLAB  to  be 

combined  into a data cube  for each m/z range. Previous 3D  imaging experiments 

have used  fiducial markers  incorporated  into an embedding material  to allow  for 

the  alignment  of  subsequent  sections.  This  requires  a  carefully  designed 

experiment and has proven problematic.   

By using  the data harvesting  routine  to create a  total  ion  (or  total  lipid) map  for 

each  section,  object  definition  approaches  can  be  used  to  find  the  centre  of  a 

section  and  then  run  iterative  rotations  around  this  centre  to  maximise  the 

correlation with the previous (or a selected) section.   The need for this correction 

step, and an outline of the processes involved are shown in figure 10.  

Figure 9. Data harvesting method for multiple samples. A C# script is 

utilised to extract the co‐ordinates and intensities integrated between 

selected mass windows.  

Figure 10. a) The requirement for correction of data position and rotation. Error in sectioning and  region of interest drawing  means that images from subsequent sections will not 

align when stacked. B) A MATLAB algorithm that automatically positions, aligns and rotates each z plane based on correlation with previous section during a rotation around the 

object centre.  

With rapid scanning, the degradation of lipid signal over a single section will not 

be significant. However, while future systems may incorporate a cold cabinet for 

the queued slides, the stability of such samples at ambient conditions over 10+ 

hours needs to be demonstrated for the current approach. This is investigated in 

figure 7, where the two halves of a section were imaged 14 hours apart.  

 

The  effect  of  the  alignment  and  rotational 

correction  can  be  seen  in  figure  11.  The  top  two 

isosurfaces  have  had  the  z  axis  stretched  to 

emphasise  the extent of misalignment of  the    raw 

data  and  the  improvement  made  by  this  quick 

optimisation process.  

Once aligned a number of processes can be carried 

out to enhance the clarity of the surfaces created, 

such  as  smoothing  and  thresholding.  These  can 

then be output as a common 3D model object to be 

visualised by any means suitable. The examples  in 

figure 12 are combinations of isosurfaces that have 

been  imported  into Blender  (open source, Blender 

Foundation)  to  be  viewed with  different material 

properties such as colour and transparency.  These 

can  then  be  shared  by  a  number  of  viewing 

platforms.