Articulo_liebermann Buchard Reaction_det de Colesterol

8/4/2019 Articulo_liebermann Buchard Reaction_det de Colesterol

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VO. 5 2 SUGAR PHOSPHATES O F MILK 6 1 1t i o n o f t h e f r e e s u g a r . Both t h e s e i n t e r p r e t a t i o n s ,h o w e v e r , g i v e o n l y a m i n o r s i g n i f i c a n c e t o t h ea p p e a r a n c e o f t h i s e s t e r i n t h e m i l k .Th e d e m o n s t r a t i o n o f a l a c t o s e p h o s p h a t e o n t h eo t h e r h a n d , d o e s b r i n g more c e r t a i n e v i d e n c e f o r t h ev i e w , h i t h e r t o h e l d w i t h v e r y s l e n d e r e x p e r i m e n t a ls u p p o r t , t h a t p h o s p h o r y l a t i o n i s o f f u n d a m e n t a li m p o r t a n c e i n l a c t o s e s y n t h e s i s . An i s o l a t e di n s t a n c e o f t h e o c c u r r e n c e o f s u c h an e s t e r i n at r i c h l o r o a c e t i c a c i d e x t r a c t o f c o w - u d d e r t i s s u e h a sa l r e a d y b e e n r e p o r t e d ( M a l p r e s s , 1 9 5 0 ) , and i ts e e m s p r o b a b l e t h a t t h i s compound m a y p r o v e t o b et h e i m m e d i a t e p r e c u r s o r o f l a c t o s e i n t h e mammayg l a n d .

SUMMARY1 . Barium f r a c t i o n a t i o n p r o c e d u r e s , s u p p l e -mented by c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s i s , h a v e shownt h a t a x - g a l a c t o s e - 1 - p h o s p h a t e , c ( ? ) - g l u c o s e - 1 - p h o s -p h a t e , g l u c o s e - 6 ( ? ) - p h o s p h a t e , a l a c t o s e p h o s p h a t eand p h o s p h o p y r u v i c a c i d a r e p r e s e n t i n t r a c e

amounts i n n o r m a l m i l k .2 . The p o m s i b l e s i g n i f i c a n c e o f t h e s e f i n d i n g s i nr e l a t i o n t o l a c t o s e s y n t h e s i s i s d i s c u # s e d .

O u r t h a n k s a r e d u e t o Mr J . G . M u r r a y ( D e p a r t m e n t o fA g r i c u l t u r a l B a c t e r i o l o g y ) f o r a s s i s t a n c e i n o b t a i n i n g m i l ks a m p l e s , a n d f o r b a c t e r i o l o g i c a l e x a m i n a t i o n s ; a n d t o P r o f .D . C . H a r r i s o n f o r many v a l u a b l e d i s c u s s i o n s .REFERENCES

B r y s o n , J . L . & M i t c h e l l , T . J . ( 1 9 5 1 ) . N a t u r e , L o n d . , 1 6 7 ,8 6 4 .C a p u t t o , R . , L e l o i r , L . F . , C a r d i n i , C . E . & P a l a d i n i , A . C .( 1 9 5 0 ) . J . b i o l . C h e m . 1 8 4 , 3 3 3 .C o l o w i c k , S . P . ( 1 9 3 8 ) . J . b i d . C h e m . 1 2 4 , 5 5 7 .C o r i , C . F . , C o l o w i c k , S . P . & C o r i , G . T . ( 1 9 3 7 ) . J . b i o l . C h e m .1 2 1 , 4 6 5 .D u r s c h , H . R . & R e i t h e l , F . J . ( 1 9 5 2 ) . J . A m e r . c h e m . S o c .7 4 , 8 3 0 .F i s k e , C . H . & S u b b a r o w , Y . ( 1 9 2 5 ) . J . b i o . C h e m . 6 8 ,3 7 5 .F r e n c h , T . H . , P o p j A k , G . & M a l p r e s s , F . H . ( 1 9 5 2 ) . N a t u r e ,L o n d . , 1 6 9 , 7 1 .F r i e d e m a n n , T . E . & H a u g e n , G . E . ( 1 9 4 3 ) . J . b i o l . C h e m .1 4 7 , 4 1 5 .G r a h a m , W. R . & K a y , H . D . ( 1 9 3 3 ) . J . d a i r y B e 8 . 5 , 5 4 .G r a n t , G . A . ( 1 9 3 6 ) . B i o c h e m . J . 8 0 , 2 0 2 7 .

K a y , H . D . & M a r s h a l l , P . G . ( 1 9 2 8 ) . B i o c h e m . J . 2 2 , 4 1 6 .K o s t e r l i t z , H . W. ( 1 9 3 9 ) . B i o c h e m . J . 8 3 , 1 0 8 7 .K o s t e r l i t z , H . W. ( 1 9 4 3 ) . B i o c h e m . J . 8 7 , 3 1 8 .K o s t e r l i t z , H . W. & R i t c h i e , C . M . ( 1 9 4 3 ) . B i o c h e m . J . 3 7 ,1 8 1 .L a s z t , L . & S u i l l m a n n , H . ( 1 9 3 5 ) . B i o c h e m . Z . 2 7 8 , 4 0 1 .

L o h m a n n , K . & M e y e r h o f , 0 . ( 1 9 3 4 ) . B i o c h e m . Z . 2 7 3 , 6 0 .M a l p r e s s , F . H . ( 1 9 5 0 ) . C . R . d u C o l l o q u e I n t e r n a t i o n a l s u rl e m k a n i e m e p h y s i o l o g i q u e d e l a , 8 c r e t i o n l a c t 4 , e . S t r a s -b o u r g ( i n t h e P r e s s ) .M a l p r e s s , F . H . & M o r r i s o n , A . B . ( 1 9 4 9 ) . N a t u r e , L o n d . ,1 6 4 , 9 6 3 .M a n d e l , P . & B i e t h , R . ( 1 9 4 8 ) . C . B . S o c . B i o l . , P a r i s , 1 4 2 ,2 3 4 .M e j b a u m , W. ( 1 9 3 9 ) . H o p p e - S e y l . Z . 2 6 8 , 1 1 7 .P a r t r i d g e , S . M . ( 1 9 4 8 ) . B i o c h e m . J . 4 i R , 2 3 8 .R e i t h e l , F . J . ( 1 9 4 5 ) . J . A m e r . c h e m . S o c . 6 7 , 1 0 5 6 .R e i t h e l , F . J . & Y o u n g R . G . ( 1 9 5 2 ) . J . A m e r . c h e m . S o c .( i n t h e P r e s s ) .R i c h a r d s o n , K . C . ( 1 9 4 7 ) . B r i t . m e d . B u l l . 5 , 1 2 3 .S c h m i d t , G . & T h a n n h a u s e r , S . J . ( 1 9 4 3 ) . J . b i o l . C h e m . 1 4 9 ,3 6 9 .S o m o g y i , M . ( 1 9 4 5 ) . J . b i o l . C h e m . 1 6 0 , 6 1 .

T r e v e l y a n , W. E . , P r o c t e r , D . P . & H a r r i s o n , J . S . ( 1 9 5 0 ) .N a t u r e , L o n d. , 1 6 6 , 4 4 4 .T r u c c o , R . E . , C a p u t t o , R . , L e l o i r , L . F . & M i t t e l m a n , N .( 1 9 4 8 ) . A r c h . B i o c h e m. 1 8 , 1 3 7 .V e r z a r , F . & S u l l m a n n , H . ( 1 9 3 7 ) . B i o c h e m . Z . 2 8 9 , 3 2 3 .W i l k i n s o n , J . F . ( 1 9 4 9 ) . B i o c h e m . J . 4 4 , 4 6 0 .

The D e t e r m i n a t i o n o f C h o l e s t e r o l by t h eL i e b e r m a n n - B u r c h a r d R e a c t i o nB Y A . P . KENNYC l i n i c a l L a b o r a t o r i e 8 , T h e V i c t o r i a I n f i r m a r y o f Glagow

( R e c e i v e d 1 5 A p r i l 1 9 5 2 )Th e m e t h o d s a d o p t e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o fc h o l e s t e r o l i n b l o o d c a n b e d i v i d e d i n t o two maing r o u p s . T h o s e i n t h e f i r s t g r o u p , i n w h i c h t h ep r i n c i p a l v a r i a t i o n i s i n t h e manner o f e x t r a c t i o n , a l lc o n c l u d e w i t h t h e a p p l i c a t i o n o f t h e L i e b e r m a n n -B u r c h a r d r e a c t i o n ( L i e b e r m a n n , 1 8 8 5 ; B u r c h a r d ,1 8 8 9 ) t o t h e f i n a l e x t r a c t and c o m p a r i s o n o f t h ec o l o u r d e v e l c o p e d a g a i n s t a s t a n d a r d c h o l e s t e r o l

s o l u t i o n s i m i l a r l y t r e a t e d . I n c l u d e d i n t h i s a r e t h em e t h o d s o f M y e r s & W a r d e l l ( 1 9 1 8 ) , L e i b o f f ( 1 9 2 4 )a n d S h e f t e l ( 1 9 4 4 ) . I n t h e s e m e t h o d s t h e s p e c i m e ni s a b s o r b e d o n a s u i t a b l e a b s o r b e n t and t h e c h o l e -s t e r o l i s e x t r a c t e d by means o f a c o n t i n u o u s e x -t r a c t o r . With t h e m e t h o d s o f S a c k e t t ( 1 9 2 5 ) andB l o o r ( 1 9 2 8 ) t h e b l o o d i s e x t r a c t e d d i r e c t l y i n ag i v e n v o l u m e o f m i x e d s o l v e n t . A t t e m p t s h a v e a l s o3 9 - 2


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A . P . KENNYb e e n m a d e t o e s t i m a t e c h o l e s t e r o l d i r e c t l y i n a c i dc h l o r o f o r m i n t h e m e t h o d s o f S o l s ( 1 9 4 7 ) andZuckerman & N a t e l s o n ( 1 9 4 8 ) .I n t o t h e s e c o n d g r o u p c a n b e g a t h e r e d a l l t h em e t h o d s w h i c h e n t a i l p r e c i p i t a t i o n o f t h e e x t r a c t e dc h o l e s t e r o l a s d i g i t o n i d e , w h i c h m a y e i t h e r b ew e i g h e d , a s i n t h e m e t h o d s o f G a r d n e r & G a i n s -b o r o u g h ( 1 9 2 7 ) , Boyd ( 1 9 3 3 ) o r Ma n & G i l d e a ( 1 9 3 3 ) ,d e t e r m i n e d g a s o m e t r i c a l l y a s i n t h a t o f K i r k , P a g e& V a n S l y k e ( 1 9 3 4 ) o r by o x i d a t i o n a s i n t h e method; o f Okey ( 1 9 2 8 ) . The d i s a d v a n t a g e o f t h e w e i g h i n gp r o c e d u r e l i e s i n t h e r e l a t i v e l y l a r g e v o l u m e s o f b l o o dr e q u i r e d , and o f t h e g a s o m e t r i c and o x i d a t i o np r o c e d u r e s i n t h a t s p e c i a l e q u i p m e n t and t e c h n i c a ls k i l l a r e e s s e n t i a l . S c h o e n h e i m e r & S p e r r y ( 1 9 3 4 )s u c c e e d e d i n a p p l y i n g t h e L i e b e r m a n n - B u r c h a r dr e a c t i o n t o c h o le s t e r o l i s o l a t e d a s d i g i t o n i d e f r o m0 - 2 m l . o f b l o o d .

I t h a s b e e n f o u n d t h a t t e c h n i q u e s i n v o l v i n g t h eL i e b e r m a n n - B u r c h a r d r e a c t i o n , l i k e many o f t h eo l d e r c o l o r i m e t r i c m e t h o d s , r e q u i r e a more s p e c i f i cs e t o f c o n d i t i o n s t h a n w a s f o r m e r l y r e c o g n i z e d i ft h e y a r e t o b e a d a p t e d t o a f i n a l a b s o r p t i o m e t r i cd e t e r m i n a t i o n . The o b j e c t o f t h i s i n v e s t i g a t i o n h a sb e e n t o s t u d y t h e f a c t o r s w h i c h i n f l u e n c e c o l o u rd e v e l o p m e n t i n c h l o r o f o r m s o l u t i o n s o f c h o l e s t e r o land i t s e s t e r s , w i t h p a r t i c u l a r r e f e r e n c e t o t h e u s e o fs e l e c t i v e f i l t e r s , t h e e f f e c t o f t i m e , t e m p e r a t u r e ,e x p o s u r e t o l i g h t a n d t h e p r o p o r t i o n s o f r e a g e n t s ,and t o e x p l a i n o r e l i m i n a t e t h e s o - c a l l e d s p u r i o u sc o l o u r s w h i c h s o o f t e n d e v e l o p and i n t e r f e r e w i t hf i n a l e v a l u a t i o n . O n t h e b a s i s o f t h e s e r e s u l t s i t w ash o p e d t o e v o l v e a method s u i t a b l e f o r r o u t i n e u s e i nc l i n i c a l l a b o r a t o r i e s a n d e s t a b l i s h n o r m a l l i m i t s f o rs u c h a m e t h o d . A p r e l i m i n a r y c o m m u n i c a t i o n onp a r t o f t h i s work h a s a l r e a d y b e e n m a d e ( K e n n y ,1 9 4 8 ) .

EXPERIMENTAL AND RESULTST h e i n s t r u m e n t e m p l o y e d t h r o u g h o u t t h i s w o r k w a s aH i l g e r S p e k k e r a b s o r p t i o m e t e r , u s i n g s p e c t r a l f i l t e r s o f t h es e r i e s H 5 5 8 a n d c e l l s o f 1 c m . t h i c k n e s s .

E f f e c t o f s e l e c t i v e f i l t e r sT h e s c h e m e a d o p t e d t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f s e l e c t i v ei f i t e r s u p o n t h e e x t i n c t i o n v a l u e c o n s i s t e d o f s e t t i n g u p as e r i e s o f i d e n t i c a l t u b e s , e a c h c o n t a i n i n g 1 m g . o f c h o l e s t e r o li n 1 0 m l . C H C 1 3 . T h e t u b e s w e r e l i g h t l y s t o p p e r e d a n dp l a c e d i n t h e d a r k i n a t h e r m o s t a t i c a l l y c o n t r o l l e d w a t e rb a t h a t t h e t e m p e r a t u r e b e i n g i n v e s t i g a t e d . A f t e r t h ec o n t e n t s o f t he t u b e h a d a t t a i n e d t h e t e m p e r a t u r e o f t h eb a t h , 2 m l . a c e t i c a n h y d r i d e w e r e a d d e d a n d t h e t u b e ss h a k e n , t h e n 0 - 2 m l . c o n c . H 2 S O 4 w a s m e a s u r e d i n , a n d t h et u b e s f i n a l l y i n v e r t e d a n d r e t u r n e d t o t h e w a t e r b a t h . A tp r e a r r a n g e d i n t e r v a l s , t h e t u b e s w e r e r e m o v e d f r o m t h eb a t h , a n d t h e e x t i n c t i o n v a l u e s o f t h e c o n t e n t s d e t e r m i n e don t h e a b s o r p t i o m e t e r , a d i f f e r e n t p a i r o f f i l t e r s b e i n g u s e df o r e a c h s u c c e s s i v e t u b e . F i g . 1 s h o w s t h e a b s o r p t i o n c u r v e

f o r t h e e i g h t f i l t e r s o f t h e s e r i e s , t h e c o l o u r h a v i n g b e e nd e v e l o p e d a t 2 0 a n d 4 0 0 f o r 1 0 a n d 3 0 m i n . i n e a c h c a s e .T h e c u r v e s s h o w t w o m a i n m a x i m a , o n e a t a b o u t 4 3 0 m p .a n d t h e o t h e r b e t w e e n 6 0 0 a n d 6 9 0 m y .U s i n g a s p e c t r o p h o t o m e t e r , M o r g a r e i d g e ( 1 9 3 5 ) w a s a b l et o d e m o n s t r a t e t h r e e a b s o r p t i o n b a n d s i n t h e c o l o u r g i v e ni n t h e L i e b e r m a n n - B u r c h a r d r e a c t i o n b y c h o l e s t e r o l a n dc e r t a i n r e l a t e d s t e r o l s , o n e a t 4 5 0 m , u . , a s e c o n d a t 6 2 0 m I A .a n d a t h i r d a t 6 7 5 m p . T h e 6 0 0 - 6 9 0 . m ax i m u m s h o w n i nt h e a b s o r p t i o m e t r i c m e a s u r e m e n t s p r e s u m a b l y r e p r e s e n t st h e s e c o n d a n d t h i r d p e a k s .

0 60 * 5

. t' 0 * 4- 0 3

v 6 0 2v _ -0 1 _

4 44 4 4 4 4 +o , , . 1 , , . 1 ,; ,4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0S p e c t r a l f i l t e r s maximum t r a n s m i s s i o n ( m . L . )F i g . 1 . A b s o r p t i o n c u r v e s f o r a s o l u t i o n o f 1 m g . c h o l e s t e r o li n 1 0 m l . C H C 1 8 +2 m l . a c e t i c a n h y d r i d e + 0 - 2 m l . c o n c .H 2 S O 4 , f o r t h e e i g h t f l f o r d f i l t e r s o f t h e s e r i e s , H 5 5 8 .S o l u t i o n s w e r e d e v e l o p e d i n t h e d a r k a t 2 0 a n d 4 0 0 f o r1 0 a n d 3 0 m i n . a s i n d i c a t e d .

A t 4 0 t h e d e v e l o p m e n t o f c o l o u r w a s f o u n d t o b e m o r er a p i d t h a n a t 2 0 0 , a n d t h e a b s o r p t i o n a t 4 3 0 m f k . h a d c o n -s i d e r a b l y i n c r e a s e d , w h i l e t h e 6 0 0 a n d 6 9 0 m l i . r e a d i n g s h a df a l l e n . T h e r e i s , t h e r e f o r e , e v i d e n ce o f a s h i f t i n t h e i n t e n s i t yo f t h e a b s o r p t i o n b a n d s . T h e e x p l a n a t i o n m a y b e t h a t t h ec o l o u r i s d u e n o t t o a s i n g l e s u b s t a n c e o r , m o r e p r o b a b l y ,t h a t t h i s s u b s t a n ce c a n b e t r a n s f o r m e d f r o m o n e f o r m t oa n o t h e r , s i n c e t h e l o s s i n t h e b l u e - g r e e n c o l o r a t i o n , a b -s o r b i n g a t 6 9 0 m n i . , i s n o t p a r a l l e l e d b y a l o s s i n t h e y e l l o w ,a b s o r b i n g a t 4 3 0 m n & .T h e f i n d i n g s w o u l d i n d i c a t e t h a t i n a n e s t i m a t i o n t h ec h o i c e o f f i l t e r l i e s b e t w e e n a r e d w h i c h e s t i m a t e s a t h e r m o -l a b i l e c o m p o n e n t o f t h e c o l o u r o r a b l u e w h i c h i s n o t i n -f l u e n c e d b y t h i s c o m p o n e n t . F u r t h e r d a t a o n t h i s p o i n t a r ep r o v i d e d i n t h e n e x t s e c t i o n .

E f f e c t o f t e m p e r a t u r eT h e i m p o r t a n c e o f t h e c o n t r o l o f t e m p e r a t u r e h a s b e e ng e n e r a l l y r e c o g n i z e d , b u t t h e m e t h o d s s u g g e s t e d b y d i f f e r e n ti n v e s t i g a t o r s h a v e s h o w n c o n s i d e r a b l e v a r i a t i o n , a l t h o u g hl a t e r w o r k e r s h a v e b e e n more p r e c i s e i n t h i s c o n n e x i o n . T h ef o l l o w i n g r e s u l t s s h o w t h a t s u c h c a r e i s i n d e e d w a r r a n t e d ,e s p e c i a l l y w i t h p h o t o m e t r i c m e a s u r e m e n t s .W i t h t h e e f f e c t o f i f i t e r s i n m i n d , a more d e t a i l e d s t u d y o ft h e i n f l u e n c e o f t e m p e r a t u r e w a s m a d e . S e r i e s o f t u b e s w e r es e t u p a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d a n d i n c u b a t e d a t s p e c i f i e dt e m p e r a t u r e s , o n e s a m p l e t u b e b e i n g r e m o v e d a t e a c h t i m ei n t e r v a l . T h e g r a d e d e f f e c t o f t e m p e r a t u r e u p o n c o l o u r

6 1 2 I 9 5 2


3/9

DETERMINATION O F CHOLESTEROLd e v e l o p m e n t , u s i n g a f i l t e r w i t h maximum t r a n s m i s s i o n a t4 3 0 m 1 A . , a n d a l s o t h e s a m e t u b e s r e a d a g a i n s t a 6 9 0 m i .f i l t e r i s i l l u s t r a t e d i n F i g . 2 .T h e s e r e s u l t s h a v e b e e n f o u n d t o c o n f i r m a n d e x t e n d t h ew o r k o f H o f f m a n ( 1 9 4 0 ) . I t w i l l b e s e e n t h a t a d d i n g t h er e a g e n t s a n d m a i n t a i n i n g a t 0 0 ' f r e e z e s ' t h e s y s t e m, a n do v e r a p e r i o d o f 3 0 m i n . o n l y a t r a c e o f c o l o u r d e v e l o p s .T r a n s f e r r i n g t h e t u b e , e v e n a f t e r 3 0 m i n . , t o a h i g h e rt e m p e r a t u r e , r e s u l t s i n t h e d e v e l o p m e n t o f a c o l o u r a l o n g ,b u t s l i g h t l y b e l o w , t h e c u r v e o b t a i n e d i f t h e w h o l e r e a c t i o nw e r e a t t h e ne w t e m p e r a t u r e c o n d i t i o n s .

u l t i m a t e v a l u e o f t h e 4 3 0 m , . r e a d i n g when c o m p l e t ec o n v e r s i o n t o t h e y e l l o w c o m p o n e n t h a d t a k e n p l a c e , a n da p p e a r s t o b e a c h a r a c t e r i s t i c o f t h e c o n c e n t r a t i o n . T h i sp o i n t i s f u r t h e r i l l u s t r a t e d i n T a b l e 1 w h e r e r e a d i n g s a r es h o w n f o r b o t h f i l t e r s , t h e c o l o u r h a v i n g b e e n d e v e l o p e d a t2 0 a n d 4 0 0 f o r p e r i o d s u p t o 3 h r . T h e c o n t i n u i n g r i s e i n t h er e a d i n g s w i t h t h e 4 3 0 m , u . f i l t e r , a n d t h e c o r r e s p o n d i n g f a li n t h e 6 9 0 m p . f i l t e r a r e c l e a r l y i n d i c a t e d . An a n a l y s i s o f t h er e s u l t s p l o t t e d i n F i g . 3 a l s o s u p p o r t s t h i s c o n t e n t i o n b u tr e v e a l s m i n o r d i s c r e p a n c i e s a t t r i b u t a b l e t o d e v i a t i o n f r o mB e e r ' s l a w .

c v 0 - 4 E ' - 0 - 4 L r n p e r a r i i X c/ K 3 0 0 ~ ~ ~ ~ ~ 1 0

0 2 100 400-~~~~~~~~~~~~~~~~~-xII ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~0 0

1 0 2 0 3 0 1 0 2 0 3 0T i m e f o r c o l o u r d e v e l o p m e n t ( m i n . ) T i m e f o r c o l o u r d e v e l o p m e n t ( m i n . )F i g . 2 . A b s o r p t i o n c u r v e s f o r 1 m g . c h o l e s t e r o l i n 1 0 m l . C H C 1 3 + 2 m l . a c e t i c a n h y d r i d e + 0 - 2 m l . c o n c . H 2 S O 4 , d e v e l o p e da t t e m p e r a t u r e s f r o m 0 t o 5 0 a n d p l o t t e d f o r a p e r i o d o f 3 0 m i n . w i t h f i l t e r s h a v i n g maximum t r a n s m i s s i o n s a t( a ) 4 3 0 m , u . a n d ( b ) 6 9 0 m j . A ' r o o m t e m p e r a t u r e ' d e v e l o p m e n t c u r v e i s a l s o s h o w n .

T h e g e n e r a l e f f e c t o f i n c r e a s i n g t h e r e a c t i o n t e m p e r a t u r ew i t h t h e 4 3 0 m , u . f i l t e r was t o g i v e a more r a p i d c o l o u rd e v e l o p m e n t a n d a g r e a t e r s e n s i t i v i t y . W i t h t h e 6 9 0 m , u .f i l t e r , o n t h e o t h e r h a n d , t h e m a x i m u m a b s o r p t i o n wa sf o u n d t o r e a c h t h e same c r i t i c a l l e v e l f o r a l l t e m p e r a t u r e s o f2 0 0 a n d o v e r . A f t e r t h i s p o i n t t h e a b s o r p t i o n a t 6 9 0 m I A .d i m i n i s h e d w h i l e , a s s t a t e d a b o v e , t h a t a t 4 3 0 m , u . c o n -t i n u e d t o i n c r e a s e .T h e a r e a e n c l o s e d b e t w e e n t h e t e m p e r a t u r e c u r v e , t h e0 - 4 6 a b s c i s s a a n d t h e 3 0 m i n . o r d i n a t e b e y o n d t h e m ax i m u mp o i n t w i t h f i l t e r 6 9 0 m p . , w as f o u n d t o b e a p p r o x i m a t e l y1 - 5 t i m e s t h e c o r r e s p o n d i n g a r e a w h e n u s i n g t h e 4 3 0 m i A .f i l t e r . I n t h e f i r s t c a s e t h e e x t i n c t i o n i s o n t h e d e c l i n e a n dt h e a r e a i s b e l o w t h e 0 - 4 6 a b s c i s s a , w h i l s t i n t h e s e c o n d , w i t ht h e i n c r e a s i n g e x t i n c t i o n , i t i s a b o v e t h i s l i n e . T h i s w o u l di n d i c a t e a c o n s t a n t c o n v e r s i o n o f t h e g r e e n t o t h e y e l l o wc o m p o n e n t , b e y o n d t h e p o i n t w h e r e t h e e x t i n c t i o n - t i m ec u r v e h a s r e a c h e d i t s m ax i m u m w i t h f i l t e r 6 9 0 m , u . T h e r a t eo f d e v e l o p m e n t o f t h e g r e e n c o m p o n e n t a n d o f i t s c o n -v e r s i o n t o t h e y e l l o w i s d e p e n d e n t p r i n c i p a l l y u p o n t e m p e r -a t u r e . A s a c o n s e q u e n c e , a n y r e a d i n g t a k e n on a 4 3 0 m , u .t e m p e r a t u r e c u r v e a t o r b e y o n d 0 - 4 6 a d d e d t o 0 - 6 7 o f t h er e a d i n g o n t h e c o r r e s p o n d i n g 6 9 0 m p . c u r v e g i v e s a c o n s t a n tr e a d i n g o f a p p r o x i m a t e l y 0 - 7 5 , w h i c h w o u l d r e p r e s e n t t h e

V a r i a t i o n s i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f c h o l e s t e r o l r e s u l t e d i nc u r v e s w h i c h a l l s h o w e d t h e s a m e g e n e r a l c h a r a c t e r , b u tw e r e s e t a t h i g h e r o r l o w e r l e v e l s a s t h e c a s e may b e . I t i si n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t i f c o l o u r b e d e v e l o p e d a t r o o mt e m p e r a t u r e , a r o u n d 2 0 0 , i t f o l l o w s c l o s e l y t h e 3 0 0 c u r v e .T a b l e 1 . E f f e c t o f t i m e o n c o l o u r d e v e l o p m e n t( A c o n t i n u a t i o n o f t h e r e s u l t s p l o t t e d i n F i g . 2 . )

T ea

Maximum, m p e r - t r a n s m i s s i o n6 t u r e o f f i l t e r( 0 ) ( m P . )2 0 4 3 06 9 04 0 4 3 06 9 0

S p e k k e r r e a d i n g s3 0 m i n .

0 - 4 80 - 4 30 - 6 20 - 1 8

1 h r .0 - 5 30 - 4 00 - 6 40 - 1 2

2 h r .0 - 5 60 - 3 10 - 6 90 - 0 7

3 h r .0 - 5 80 - 2 80 - 7 20 - 0 5

W hen t h e 1 0 m l . o f C H C 0 1 s o l u t i o n a r e p l a c e d i n a t e s t t u b ei n a n o p e n r a c k a n d t r e a t e d w i t h 2 m l . a c e t i c a n h y d r i d e ,t h e r e i s a r i s e i n t e m p e r a t u r e o f 4 0 a n d o n t h e a d d i t i o n o f0 - 2 m l . c o n c . H 2 S O a f u r t h e r r i s e o f 8 0 o c c u r s , a f t e r w h i c ht h e n o r m a l c o o l i n g c u r v e s e t s i n a n d t h e c o n t e n t s o f t h e

V o l . 5 2 6 1 3


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A . P . KENNYt u b e r e t u r n t o w i t h i n 1 0 o f r o o m t e m p e r a t u r e i n a b o u t3 0 m i n .From t h e r e s u l t s i t w o u l d a p p e a r t h a t 3 0 m i n . d e v e l o p -m e n t a t 3 7 0 w o u l d b e a s a t i s f a c t o r y a r r a n g e m e n t when u s i n ga f i l t e r o f m ax i m u m t r a n s m i s s i o n a t 4 3 0 m I A . , s i n c e m o s tl a b o r a t o r i e s p o s s e s s a n i n c u b a t o r o r t h e r m o s t a t n o r m a l l ym a i n t a i n e d a t t h i s t e m p e r a t u r e .

R e a c t i o n o f e s t e r sC h o l e s t e r o l o l e a t e a n d s t e a r a t e w e r e e x a m i n e d u n d e r t h esame c o n d i t i o n s a s o u t l i n e d a b o v e a n d w e r e f o u n d t o g i v e t h esame g e n e r a l p a t t e r n a s d i d c h o l e s t e r o l . S e v e r a l a u t h o r s( G a r d n e r & W i l l i a m s , 1 9 2 1 ; R e i n h o l d , 1 9 3 6 ; Y a s u d a , 1 9 3 6 ;K e l s a y , 1 9 3 9 ) h a v e r e p o r t e d t h a t i n c r e a s e d c o l o u r v a l u e s a r eo b t a i n e d f r o m e q u i v a l e n t amounts o f t h e e s t e r s a s c o m p a r e dw i t h t h e f r e e s t e r o l , a n d t h e s e e n h a n c e m e n t s h a v e b e e nr e p o r t e d a s r a n g i n g f r o m B t o 3 0 % . I n t h e p r e s e n t e x p e r i -m e n t s t h e s e e s t e r s w e r e f o u n d t o g i v e a v a l u e 1 3 % h i g h e rt h a n c h o l e s t e r o l i t s e l f w h e n c a l c u l a t e d o n a n e q u i v a l e n tb a s i s . T h i s i s a p o i n t w h i c h must b e b o r n e i n m i n d w h e nd e a l i n g w i t h a m i x t u r e o f f r e e a n d e s t e r i f i e d c h o l e s t e r o l

s u c h a s e x i s t s i n a B l o o r e x t r a c t .T h e s a m e maximum i n t h e e x t i n c t i o n - t i m e c u r v e w a sf o u n d w i t h f i l t e r 6 9 0 m p . b u t o c c u r r e d a t a n e x t i n c t i o nv a l u e o f 0 - 5 2 i n t h e c a s e o f t h e e s t e r s w h e n e s t i m a t e d a g a i n s ta 1 m g . l e v e l . T h e r a t e o f c o l o u r d e v e l o p m e n t o v e r t h e r a n g e0 - 4 0 w a s n o t s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r t h a n f o r c h o l e s t e r o l i t s e l fa n d c o u l d n o t b e t a k e n a s a b a s i s f o r d i f f e r e n t i a t i n g b e t w e e nf r e e a n d c o m b i n e d c h o l e s t e r o l a s i n t h e m e t h o d o f R e i n h o l d( 1 9 3 5 ) . E f f e c t o f t i m e o f d e v e l o p m e n tT h e t i m e r e c o m m e n d e d i n c e r t a i n o f t h e e a r l i e r m e t h o d swas 1 5 m i n . a n d , a s s e e n f r o m F i g . 2 , c o u l d b e a p p l i e d w i t h af a i r d e g r e e o f a c c u r a c y t o a ' r o o m t e m p e r a t u r e ' d e v e l o p -

m e n t , o r t o t e m p e r a t u r e s c l o s e t o 2 5 0 . W i t h m o r e p r e c i s et e m p e r a t u r e c o n t r o l , n o n e o f t h e c u r v e s r e a c h e s a m ax i m u mw i t h t h e 4 3 0 m , u . f i l t e r e v e n a f t e r 3 0 m i n . , a l t h o u g h t h eg r a d i e n t o f t h e c u r v e i s v e r y s m a l l a t t h i s p o i n t w i t ht e m p e r a t u r e s a b o v e 3 0 0 . W i t h f i l t e r 6 9 0 m g . t h e maximumd e p e n d s u p o n t h e t e m p e r a t u r e , b e i n g 2 - 5 m i n . f o r 4 0 a n d1 9 m i n . f o r 2 0 .T a b l e 1 s h o w s r e a d i n g s o b t a i n e d a t i n t e r v a l s u p t o 3 h r .a f t e r t h e a d d i t i o n o f t h e H , S 0 4 , a n d r e p r e s e n t s a n e x t e n s i o no f t h e 2 0 a n d 4 0 0 r e s u l t s p l o t t e d i n F i g . 2 .

T h e e f f e c t o f e x p o s u r e t o l i g h tT h e d e l e t e r i o u s e f f e c t o f l i g h t u p o n t h e c o l o u r e d p r o d u c tw a s a l s o e a r l y r e c o g n i z e d , b u t a g a i n t he m e a s u r e s t a k e nv a r i e d f r o m d e v e l o p i n g i n c o m p l e t e d a r k n e s s t o d e v e l o p i n gi n t h e i l l u l m i n a t i o n e x i s t i n g i n t h a t p a r t o f t h e l a b o r a t o r yw h e r e t h e c o m p a r i s o n w a s m a d e .T h e g r o s s e f f e c t o f l i g h t i s d e m o n s t r a t e d i n t h e f o l l o w i n g

e x p e r i m e n t . I n t o t h r e e o r d i n a r y s o f t - g l a s s t u b e s w e r ep i p e t t e d 1 0 m l . C H C l 8 c o n t a i n i n g 1 m g . c h o l e s t e r o l . T h et u b e s w e r e p l a c e d i n a t h e r m o s t a t a n d b r o u g h t t o a t e m p e r -a t u r e o f 4 0 0 . A c e t i c a n h y d r i d e a n d H , S 0 4 w e r e a d d e d a sp r e v i o u s l y d e s c r i b e d , a n d when t h e t e m p e r a t u r e o f t h ec o n t e n t s h a d f a l l e n t o 4 0 0 , t w o t u b e s w e r e r e m o v e d , o n eb e i n g c l a m p e d a t a n a n g l e o f 4 5 0 t o h o r i z o n t a l a b o v e a1 2 5 W. O s i r a H . P . m e r c u r y - v a p o u r l a m p , a n d t h e o t h e r2 0 c m . a b o v e a n o r d i n a r y 1 0 0 W. f r o s t e d f i l a m e n t l a m p , i ns u c h a p o s i t i o n a s t o m a i n t a i n t h e i r t e m p e r a t u r e s e x a c t l ya t 4 0 0 . T h e t h i r d t u b e w a s l e f t i n t h e t h e r m o s t a t ( a t 4 0 0 ) .A l l t h r e e t u b e s w e r e a l l o w e d t o d e v e l o p f o r 3 0 m i n . , a f t e rw h i c h t h e e x t i n c t i o n v a l u e w a s m e a s u r e d .A s i m i l a r s e t o f e x p e r i m e n t s w a s c o n d u c t e d u s i n g s i l i c at e s t t u b e s ; t h e r e s u l t s a r e s h o w n i n T a b l e 2 . I t i s c l e a r t h a to n l y t h e y e l l o w c o m p o n e n t a b s o r b i n g a t 4 3 0 m i . i s a f f e c t e d ,a n d t h a t u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f t h e t e s t t h e w h i t e l i g h t w a sm o r e e f f e c t i v e t h a n t h e u l t r a v i o l e t .I n o r d e r t o d e m o n s t r a t e t h a t t h i s e f f e c t w a s n o t d u e t os t r u c t u r a l a l t e r a t i o n w i t h i n t h e c h o l e s t e r o l m o l e c u l e b e c a u s eo f i r r a d i a t i o n , a s i m i l a r s e r i e s o f t e s t s w a s p e r f o r m e de x p o s i n g t h e C H C l 5 s o l u t i o n s a l o n e f o r 3 0 m i n . , u n d e r t h es a m e c o n d i t i o n s , t h e n a d d i n g t h e o t h e r r e a g e n t s a n d d e -v e l o p i n g t h e c o l o u r i n t h e d a r k t h e r m o s t a t f o r a f u r t h e r3 0 m i n . T h e a b o v e a s s u m p t i o n was s h o w n t o b e c o r r e c ts i n c e t h e r e was n o a p p r e c i a b l e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h er e a d i n g s o f t h e s e c h o l e s t e r o l s o l u t i o n s a n d t h e c o n t r o ls o l u t i o n w h i c h h a d n o t b e e n e x p o s e d . I t t h e r e f o r e f o l l o w st h a t t h e e f f e c t o f w h i t e l i g h t i s u p o n t h e y e l l o w - c o l o u r e dp r o d u c t i t s e l f , a n d a l t h o u g h e x a g g e r a t e d i n t h i s e x p e r i m e n t ,i t e m p h a s i z e s t h e a d v i s a b i l i t y o f d e v e l o p i n g t h e r e a c t i o n i nt h e d a r k , o r a t l e a s t i n a u n i f o r m s u b d u e d l i g h t .

E f f e c t o f p r o p o r t i o n s o f r e a g e n t sV a r i a t i o n s i n t h e p r o p o r t i o n s o f r e a g e n t s m a t e r i a l l y i n -f l u e n c e d t h e f i n a l c o l o u r . W i t h m o r e t h a n 0 - 3 m l . H g S 0 4 t w ol a y e r s s e p a r a t e d a n d n o m e a s u r e m e n t c o u l d b e m a d e . W i t h

T a b l e 2 . E f f e c t o f i l l u m i n a t i o n u p o n c o l o u r d e v e l o p m e n t( R e a g e n t s : 2 m l . a c e t i c a n h y d r i d e f o l l o w e d b y 0 - 2 m l . c o n c . H 2 S O S - . )

S p e k k e r r e a d i n g sI l l u m i n a t i o n

G e n e r a l e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s( a ) 1 0 m l . C H C I . c o n t a i n i n g 1 m g. c h o l e s t e r o l i n t h i n -w a l l e d s o f t - g l a s s t e s t t u b e . R e a g e n t s added andm a i n t a i n e d a t 4 0 f o r 3 0 m i n .( b ) As a b o v e , b u t maintained f i r s t a t 4 0 0 f o r 3 0 m i n . ,t h e n r e a g e n t s a d d ed and d e v e l o p e d f o r a f u r t h e r3 0 m i n . a t 4 0 i n dark t h e r m o s t a t( c ) As i n ( a ) , b u t e m p l o y i n g s i l i c a t e s t t u b e s( d ) As i n ( b ) , b u t e m p l o y i n g s i l i c a t e s t t u b e s

F i l t e r( m I . )4 3 06 9 0U l t r a v i o l e tl a m p

0 - 3 4 20 * 1 7 44 3 0 0 - 6 3 06 9 0 0 - 1 7 74 3 06 9 04 3 06 9 0

0 - 4 5 20 - 1 7 90 - 6 1 10 - 1 8 0

1 O O W .l a m p0 - 2 6 10 - 1 7 00 * 6 3 20 - 1 7 50 - 3 9 50 - 1 7 20 - 6 2 80 - 1 6 8

D a r kt h e r m o s t a t0 - 6 2 10 - 1 7 80 - 6 3 00 - 1 7 00 - 6 2 00 - 1 7 80 - 6 1 80 - 1 7 8

6 1 4 1 9 5 2


5/9

DETERMINATION O F CHOLESTEROL0 3 a n d 0 - 2 m l . a l m o s t i d e n t i c a l r e s u l t s w e r e o b t a i n e d , b u t0 . 1 m l . a n d s m a l l e r a m o u n t s g a v e c u r v e s w h i c h w e r ed i s t i n c t l y l o w e r a n d t h e p o i n t s o f w h i c h s h o w e d a w i d ed e g r e e o f s c a t t e r a n d w e r e v e r y v a r i a b l e . T h i s l a t t e r e f f e c tm a y i n p a r t b e d u e t o d i f f i c u l t y i n m e a s u r i n g s u c h s m a l lv o l u m e s o f c o n c e n t r a t e d a c i d .T h e c o l o u r i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g a m o u n t s o f a c e t i ca n h y d r i d e u p t o 4 m l . , b u t t h e d i l u t i o n c a u s e d b y t h e l a r g e rf i n a l v o l u m e a l m o s t c o m p e n s a t e d f o r t h e i m p r o v e d c o l o u rv a l u e s .P r e v i o u s m i x i n g o f t h e a c e t i c a n h y d r i d e a n d H 2 S 0 4 g a v ea l m o s t i d e n t i c a l s e n s i t i v i t y b u t a s o m e w h a t s l o w e r r a t e o fc o l o u r d e v e l o p m e n t , w h i c h c o u l d b e e x p l a i n e d o n t h e b a s i so f t h e t e m p o r a r y i n c r e a s e i n t e m p e r a t u r e f o l l o w i n g t h ee x o t h e r m i c r e a c t i o n c a u s e d b y t h e s e p a r a t e a d d i t i o n o ft h e s e r e a g e n t s .

C o m p l i a n c e w i t h B e e r ' s l a wU s i n g 2 m l . a c e t i c a n h y d r i d e f o l l o w e d b y 0 - 2 m l . H 2 S 0 4 ,s i n c e t h e s e p r o p o r t i o n s o n l y h a d b e e n s t u d i e d i n d e t a i l ,e x t i n c t i o n v a l u e s o b t a i n e d w i t h c h o l e s t e r o l u p t o 3 X 2 m g . i n

1 0 m l . C H C l s s h o w e d a n a l m o s t l i n e a r r e l a t i o n s h i p w i t h f i l t e r4 3 0 m g . , a n d o n l y s l i g h t d e v i a t i o n f r o m l i n e a r i t y w i t h f i l t e r6 9 0 m & . , u p t o t h e l i m i t o f t h e i n s t r u m e n t .F i g . 3 s h o w s c a l i b r a t i o n c u r v e s f o r 3 0 m i n . c o l o u r d e v e l o p -m e n t a t 2 0 a n d 4 0 w i t h b o t h f i l t e r s a n d a l s o f o r 5 h r .d e v e l o p m e n t a t 4 0 . T h i s l a t t e r r e s u l t g a v e e v i d e n c e o f t h es t a b i l i t y o f t h e y e l l o w c o m p o n e n t a n d i t s s u i t a b i l i t y f o rc o l o r i m e t r i c o r a b s o r p t i o m e t r i c e s t i m a t i o n o f c h o l e s t e r o l .D i f f e r e n c e s b e t w e e n c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n i ns e r u m a n d o x a l a t e d p l a s m a

S c h m i d t ( 1 9 3 5 ) f i r s t s h o w e d d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e t o t a lc h o l e s t e r o l c o n t e n t o f h e p a r i n i z e d b l o o d p l a s m a a n d o x a -l a t e d p l a s m a . He f o u n d t h e f o r m e r t o g i v e v a l u e s w h i c hw e r e 1 0 - 1 5 % h i g h e r . S p e r r y & S c h o e n h e i m e r ( 1 9 3 5 ) f o u n dd i f f e r e n c e s up t o 15% b e t w e e n s e r u m a n d p l a s m a a n ds h o w e d t h a t t h e s e d i f f e r e n c e s a f f e c t e d t h e f r e e a n d c o mb i n e dc h o l e s t e r o l t o t h e s a m e e x t e n t .B e c a u s e o f t h e h y p e r t o n i c i t y d u e t o t h e a d d e d p o t a s s i u m

o x a l a t e , o n e w o u l d e x p e c t d i f f e r e n c e s o f t h e o r d e r o f 2%b e t w e e n s e r u m a n d o x a l a t e d p l a s m a , s i n c e t h e r e i s as h r i n k a g e o f a b o u t 3 - 5 % i n c e l l v o l u m e when 2 0 m g .p o t a s s i u m o x a l a t e a r e a d d e d t o 1 0 m l . o f b l o o d o f n o r m a lr e d - c e l l c o n t e n t , a c c o r d i n g t o O s g o o d ( 1 9 2 6 ) .2 S 5 h r . a t 4 0 0

_2-0 -2 . 3 0 m i n . a t 4 0 0n - 1 n 5 _ /. ' S/ 3 0 m i n . a t 2 0 0

' I 1 . 0 / , , o 3 0 m i n . a t 2 0 01 . 0 -

O . 0 - 5 _ , . Q 3 0 m i n . a t 4 0 0- - - - - - o S h r . a t 4 0 .

0 . 8 1 F 6 2 - 4 3 - 2C h o l e s t e r o l ( m g . i n f i n a l v o l u m e o f 1 2 - 2 m l . )F i g . 3 . C a l i b r a t i o n c u r v e s f o r t h e e s t i m a t i o n o f c h o l e s t e r o lb y t h e L i e b e r m a n n - B u r c h a r d r e a c t i o n . T h e c h o l e s t e r o lw a s d i s s o l v e d i n 1 0 m l . C H C 1 3 a n d 2 m l . a c e t i c a n h y d r i d ea d d e d , f o l l o w e d b y 0 - 2 m l . c o n c . H 2 5 0 4 . C o l o u r s w e r ed e v e l o p e d a t 2 0 a n d 4 0 0 f o r e i t h e r 3 0 m i n . o r 5 h r . a si n d i c a t e d . -, f i l t e r 4 3 0 m p . ; - -, f i l t e r 6 9 0 m , u .

T h e r e s u l t s i n T a b l e 3 , a a n d b , w e r e o b t a i n e d i n e x p e r i .m e n t s t o c o m p a r e t h e c h o l e s t e r o l c o n t e n t o f s e r u m a n dh e p a r i n i z e d a n d o x a l a t e d p l a s m a s b y t h e m e t h o d o u t l i n e di n t h e n e x t s e c t i o n . A s s e e n f r o m T a b l e 3 a t h e s e r u mc h o l e s t e r o l r e m a i n e d c o n s t a n t f o r 2 4 h r . , w h i l s t t h e h e p a r i n .i z e d p l a s m a w a s i n i t i a l l y t h e same a s t h e s e r u m , b u t f e l l o v e rt h e s a m e p e r i o d . T h e o x a l a t e d p l a s m a s h o w e d a n i n i t i a l v a l u e7 % b e l o w t h a t o f t h e s e r u m , b u t t e n d e d t o r i s e s o m e w h a to v e r t h e n e x t 2 4 h r .

T a b l e 3 . D i f f e r e n c e s b e t w e e n t o t a c h o l e s t e r o l l e v e l s i n s e r u m , h e p a r i n i z e d a n d o x a l a t e d b l o o d p l a s m a s( C h o l e s t e r o l e x p r e s s e d a s m g . / 1 0 0 m l . )

( a ) T i m e a f t e r w i t h d r a w a l1 0 m i n .

P a c k e dc e l l v o l .( % )S p e c i m e nS e r u mH e p a r i n i z e d p l a s m aO x a l a t e d p l a s m aT o t a l c h o l e s t e r o l

Cae r _Ano . S e r u m P l a s m a1 1 5 8 1 4 72 1 7 2 1 6 03 1 8 2 1 5 64 1 8 5 1 7 05 2 2 0 2 0 1

1 h r .C h o l e s t e r o l C h o l e s t e r o l

1 7 24 5 1 7 34 3 1 6 0 ( b )S e r u m / p l a s m a1 - 0 71 - 0 71 - 1 71 . 0 91 . 0 9

1 6 81 6 2

C a s eno .67891 0

4 h r .P a c k e dC h o l e s t e r o l c e l l v o l .( % )

4 51 6 2 4 3T o t a l c h o l e s t e r o l

S e r u m P l a s m a2 5 5 2 3 22 6 3 2 3 42 9 6 2 5 33 1 7 2 7 91 2 6 0 1 1 3 0

A v e r a g e 1 . 1 1

2 4 h r .C h o l e s t e r o l

1 7 11 6 41 6 4

S e r u m / p l a s m a1 - 1 01 * 1 21 - 1 71 - 1 31 - 1 2

V o I . 5 2 6 1 5


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T h e r a t i o o f s e r u m t o o x a l a t e d p l a s m a c h o l e s t e r o l i n t h et e n s a m p l e s a n a l y s e d , a n d s h o w n i n T a b l e 3 b , g a v e a na v e r a g e v a l u e o f 1 - 1 1 .On t h e r e s u l t s o f S p e r r y & S c h o e n h e i m e r ( 1 9 3 5 ) , t h ed i f f e r e n c e s c a n n o t b e a t t r i b u t e d t o h yd r o l y s i s o f t h e e s t e r sb y l i p a s e , n o r c a n i t b e e x p l a i n e d a s b e i n g d u e t o a b s o r p t i o no f c h o l e s t e r o l o n t h e c a l c i u m o x a l a t e p r e c i p i t a t e . S i n c e t h eh e p a r i n i z e d s a m p l e w a s i n i t i a l l y a l m o s t i d e n t i c a l w i t h t h es e r u m i t c a n n o t b e r e l a t e d t o c l o t f o r m a t i o n . T h e e x p l a n a t i o nmay l i e i n a s u r f a c e p h e n o m e n o n r e s u l t i n g i n t h e a b s o r p t i o no f c h o l e s t e r o l o n t h e r e d c e l l s a s a c o n s e q u e n c e o f t h e i n -c r e a s e d p o t a s s i u m i o n c o n c e n t r a t i o n o f t h e p l a s m a , a n di n v e s t i g a t i o n s a r e p r o c e e d i n g i n t h i s d i r e c t i o n t o e x a m i n et h i s p o s s i b i l i t y .METHOD FOR THE DETERMINATION O FCHOLESTEROL IN PLASMA OR SERUMOn t h e b a s i s o f t h e e x p e r i m e n t a l f i n d i n g s o f t h ee a r l i e r s e c t i o n s , t h e f o l l o w i n g m o d i f i c a t i o n o f t h emethod o f B l o o r ( 1 9 2 8 ) i s recommended f o r t h er o u t i n e c l i n i c a l e s t i m a t i o n o f c h o l e s t e r o l i n p l a s m ao r s e r u m . R e a g e n t s

( 1 ) E t h a n o l - e t h e r m i x t u r e : 3 v o l . 9 5 % e t h a n o la r e mixed w i t h 1 v o l . e t h e r .( 2 ) A n h y d r o u s c h l o r o f o r m .( 3 ) A c e t i c a n h y d r i d e ( A n a l a r ) .( 4 ) S u l p h u r i c a c i d ( A n a l a r ) .( 5 ) C h o l e s t e r o l s t a n d a r d .( a ) S t o c k s o l u t i o n : d i s s o l v e 0 - 5 4 7 g . a n -h y d r o u s c h o l e s t e r o l i n 1 0 0 m l . c h l o r o f o r m .( b ) S i n g l e w o r k i n g s t a n d a r d : p r e p a r e a 1 i n 5 0d i l u t i o n o f ( a ) i n c h l o r o f o r m .( 1 0 m l . = 2 5 0 m g . t o t a l c h o l e s t e r o l / 1 0 0 m l . )N o t e on c o r r e c t i o n f o r e s t e r s . I t h a s b e e n s h o w n i n ane a r l i e r s e c t i o n t h a t c h o l e s t e r y l e s t e r s g i v e a c o lo u r e q u i v a l e n tt o 1 3 % m o r e i n t e r m s o f c h o l e s t e r o l , t h a n d o e s t h e f r e e s t e r o li t s e l f . I f o n e a c c e p t s 2 8 % a s t h e mean v a l u e f o r t h e f r e ec h o l e s t e r o l f r a c t i o n ( P e t e r s & M a n , 1 9 4 3 ) , t h e n a t o t a lc h o l e s t e r o l o f s a y 2 0 0 m g . / 1 0 0 m l . w o u l d g i v e a r e a d i n ge q u i v a l e n t t o 2 1 9 m g . i n t e r m s o f f r e e c h o l e s t e r o l . Ana d j u s t m e n t h a s b e e n made f o r t h i s i n t h e p r e p a r a t i o n o f t h es t a n d a r d .B a s i n g a c a l i b r a t i o n o n t h i s a s s u m p t i o n i t c a n b e s h o w n

t h a t v a r i a t i o n s i n t h e f r e e c h o l e s t e r o l f r a c t i o n b e t w e e n 2 0a n d 4 0 % o f t h e t o t a l w o u l d n o t c a u s e a n e r r o r o f g r e a t e rt h a n 2 % i n t h e t o t a l s o d e t e r m i n e d .M e t h o d

A b o u t 1 5 m l . e t h a n o l - e t h e r m i x t u r e a r e m e a s u r e di n t o a 2 5 m l . s t o p p e r e d v o l u m e t r i c f l a s k , and 1 m l .o f t h e s a m p l e i s p i p e t t e d I n , s l o w l y a n d w i t h c o n s t a n ts t i r r i n g . The c o n t e n t s o f t h e f l a s k a r e t h e n c a r e f u l l yb r o u g h t t o b o i l i n g p o i n t by i m m e r s i n g i n a b o i l i n g -w a t e r b a t h f o r a f e w s e c o n d s a t a t i m e . The m i x t u r ei s m a i n t a i n e d a t t h e b o i l i n g p o i n t o f t h e s o l v e n t f o ra b o u t 2 m i n . a n d i s t h e n c o o l e d t h o r o u g h l y andd i l u t e d t o 2 5 m l . w i t h t h e mixed s o l v e n t .

The e x t r a c t i s f i l t e r e d t h r o u g h a n o . 4 , 9 c m .W h a t m a n i f i t e r p a p e r , t h e f u n n e l b e i n g c o v e r e d bya w a t c h g l a s t o r e d u c e e v a p o r a t i o n . A 5 cm.l e n g t h o f c a p i l l a r y t u b i n g , s e a l e d a t i t s u p p e r e n d , i sp l a c e d i n a 6 x 1 i n . b o i l i n g t u b e and 2 0 m l . o f t h ef i l t r a t e a r e a d d e d and t h e c o n t e n t s o f t h e t u b e a r et a k e n t o d r y n e s s i n a b o i l i n g - w a t e r b a t h .The l a s t t r a c e s o f s o l v e n t and m o i s t u r e a r eremoved by h e a t i n g t h e t u b e i n a d r y i n g o v e n a t1 0 0 0 f o r a f e w m i n u t e s . The c a p i l l a r y i s b r o k e n andt h e r e s i d u e i n t h e t u b e i s e x t r a c t e d w i t h 2 0 m l .c h l o r o f o r m , t h e w a l l s o f t h e t u b e b e i n g s c r a p e d w i t ha g l a s s r o d t o l o o s e n t h e p a r t i c l e s a d h e r i n g t o t h es i d e s and t h e e x t r a c t i o n i s c o m p l e t e d by h e a t i n g j u s tt o b o i l i n g p o i n t .Th e c h l o r o f o r m e x t r a c t i s f i l t e r e d h o t t h r o u g h an o . 1 , 1 1 c m . W h a t m a n f i l t e r p a p e r , w i t h p r e -c a u t i o n s a s d e s c r i b e d a b o v e , and c o o l e d . The r e s i d u ew h i c h r e m a i n s i n t h e t u b e h a s b e e n f o u n d t o g i v e noc o l o u r w i t h t h e r e a g e n t s . I n t o a 2 5 m l . g l a s ss t o p p e r e d t e s t t u b e a r e p i p e t t e d 1 0 m l . o f t h e f i n a lc h l o r o f o r m f i l t r a t e and t h e t u b e and i t s c o n t e n t s a r ei m m e r s e d i n a t h e r m o s t a t a t 3 7 0 , w h e n 2 m l . a c e t i ca n h y d r i d e a r e a d d e d , mixed w i t h t h e c o n t e n t s o f t h et u b e , and a l l o w e d t o s t a n d f o r 3 m i n . t o a t t a i n t h et e m p e r a t u r e o f t h e b a t h . Then 0 - 2 m l . o f c o n c .s u l p h u r i c a c i d i s a d d e d f r o m a m i c r o b u r e t t e and t h et u b e i n v e r t e d and r e t u r n e d t o t h e t h e r m o s t a t f o r3 0 m i n . , b e i n g p r o t e c t e d f r o m d i r e c t l i g h t .As a b l a n k , 7 m l . o f t h e r e s i d u a l c h l o r o f o r m e x -

t r a c t a r e t r e a t e d w i t h 1 4 m l . o f a c e t i c a n h y d r i d e a n di n c u b a t e d f o r 3 0 m i n . T h i s b l a n k h a s b e e n f o u n d t og i v e a f a i r l y c o n s t a n t r e a d i n g , e v e n w i t h d i s t i n c t l yp i g m e n t e d p l a s m a s , and i s u s u a ll y e q u i v a l e n t t oa b o u t 1 2 m g . c h o l e s t e r o l / 1 0 0 m l .An i n t e r v a l t i m e r i s s e t g o i n g w h en t h e t u b e s a r ep l a c e d i n t h e b a t h , and i f a number o f t e s t s a r e t o b em a d e s u f f i c i e n t t i m e i s a l l o w e d b e t w e e n t h e a d d i -t i o n s o f a c i d t o e n a b l e a l l t h e t u b e s t o b e r e a d a t30 + 2 m i n . The e x t i n c t i o n v a l u e i s d e t e r m i n e du s i n g a f i l t e r w i t h a m a x i m u m t r a n s m i s s i o n a t4 3 0 m , t . and i n t e r p o l a t e d on a c a l i b r a t i o n c u r v e . I ti s s u g g e s t e d t h a t a q u a n t i t y c o n t r o l c h a r t , s u c h a s i su s e d f o r sodium by W o o t t o n , K i n g & M a c l e a n S m i t h( 1 9 5 1 ) s h o u l d b e m a d e i n o r d e r t o e s t a b l i s h t h er e l i a b i l i t y o f t h e m e t h o d .D i s t r i b u t i o n c u r v e f o r n o r m a l p l a s m a t o t a l c h o l e s t e r o l

F o r s p e e d o f s e p a r a t i o n and economy i n m a t e r i a l ,p l a s m a c h o l e s t e r o l v a l u e s h a v e b e e n d e t e r m i n e d i nt h i s l a b o r a t o r y b y t h e a b o v e method f o r a number o fy e a r s , a n d t h e d i s t r i b u t i o n curve shown i n F i g . 4 h a sb e e n o b t a i n e d .T h e r e s u l t s h a v e b e e n drawn f r o m 1 0 0 c o n s e c u t i v es a m p l e s o b t a i n e d f r o m v o l u n t a r y d o n o r s , and 1 0 0s a m p l e s f r o m i n d i v i d u a l p a t i e n t s i n t h i s h o s p i t a l ,w h o , i n t h e c o u r s e o f r o u t i n e e x a m i n a t i o n showed onan i n i t i a l d e t e r m i n a t i o n a b a s a l m e t a b o l i c r a t e

6 1 6 A . P . ECENNY


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DETERMINATION O F CHOLESTEROLf a l l i n g w i t h i n t h e r a n g e o f -7 t o + 1 4% o f s t a n d a r da n d w e r e n o t known t o s u f f e r f r o m o t h e r c o n d i t i o n sa s s o c i a t e d w i t h a b n o r m a l b l o o d c h o l e s t e r o l v a l u e s .A l l t h e s u b j e c t s w e r e i n t h e p o s t - a b s o r p t i v e s t a g e .Th e a g e s o f t h e i n d i v i d u a l s , w h i c h c o n t a i n e d e q u a ln u m b e r s o f m e n and women, r a n g e d f r o m 1 7 t o7 0 y e a r s . Th e i r r e g u l a r i t i e s i n t h e c u r v e m u s t b ea t t r i b u t e d t o t h e r e l a t i v e s m a l l n e s s o f t h e s a m p l e .T h e r e i s a s l i g h t s k e w n e s s i n t h e d i s t r i b u t i o n w h i c hi s n o t a l t o g e t h e r u n e x p e c t e d , b u t f o r s i m p l i c i t y i nc a l c u l a t i o n a G a u s s i a n d i s t r i b u t i o n h a s b e e na s s u m e d .

y= 7 e 0 0 0 3 3 S .

o - 2 c r 3 o1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0

C h o l e s t e r o l ( m g . / 1 0 0 m l . )F i g . 4 . D i s t r i b u t i o n curve f o r n o r m a l p l a s m a t o t a l c h o .

l e s t e r o l s . 1 0 0 m a l e s and 1 0 0 f e m a l e s , w h o s e a g e s r a n g e df r o m 1 7 t o 7 0 years, a r e r e p r e s e n t e d . The t h e o r e t i c a lc u r v e , y = 2 0 . 7 e - 0 0 0 0 3 3 5 z , w h i c h a s s u m e s a G a u s s i a n d i s -t r i b u t i o n , i s i n d i c a t e d . Mean p l a s m a t o t a l c h o l e s t e r o l ,1 9 7 - 0 4 - 1 m g . / 1 0 0 m l . ; s t a n d a r d d e v i a t i o n , 3 8 - 7 m g .Th e mean v a l u e o f t h e s e r i e s was 1 9 7 m g . / 1 0 0 m l .and t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n was 3 8 - 7 m g . I t t h e r e -

f o r e f o l l o w s t h a t h a l f t h e normal p l a s m a c h o l e s t e r o l ss h o u l d f a l l w i t h i n t h e l i m i t s 171-223 m g . / 1 0 0 m l . ,o r 0 - 6 7 a, w i t h a 1 i n 2 0 c h a n c e o f a normal f a l l i n go u t s i d e t h e l i m i t s o f 120-274 m g . / 1 0 0 m l . , o r+ 2 a . Twenty r e p l i c a t e d e t e r m i n a t i o n s on p o o l e dn o r m a l p l a s m a g a v e a r e s u l t o f 2 1 7 + 4 - 3 m g . / 1 0 0 m l .

DISCUSSIONA c o m p a r i s o n o f t h e r e c o v e ry o f c h o l e s t e r o l u s i n gv a r i o u s m et h o ds o f e x t r a c t i o n wasm a d e by R e i n h o l d( 1 9 3 6 ) , and he c o n c l u d e d t h a t t h e m e t h o d o f B l o o r( 1 9 2 8 ) g a v e c o m p l e t e e x t r a c t i o n . Methods whi c hi n v o l v e d d r y i n g o f t h e s a m p l e f o l l o w e d by e x-t r a c t i o n g e n e r a l l y g a v e lower r e c o v e r i e s . Th e w o r ko f D r e k t e r , Bernhard & L e o p o l d ( 1 9 3 5 ) may g i v e ane x p l a n a t i o n . They s h o w e d t h a t c h o l e s t e r o l wasp r e s e n t i n t w o d i s t i n ct f r a c t i o n s : onep a r t was e t h e r -s o l u b l e , and t h e o t h e r a p p e a r e d t o be i n combination

w i t h p r o t e i n and r e q u i r e d d e n a t u r a t i o n by a l c o h o lf o r i t s r e l e a s e . Th e m et ho d o f B l o o r h a s t h e r e f o r eb e e n u s e d t h r o u g h o u t t h i s w o r k .G a r d n e r & W i l l i a m s ( 1 9 2 1 ) f o u n d t h a t , o f t h etwo r e a g e n t s e m p l o y e d i n t h e d e v e l o p m e n t o f t h ef i n a l c o l o u r , t h e q u a n t i t y o f s u l p h u r i c a c i d was t h emore i m p o r t a n t ; c o n s i d e r a b l e l a t i t u d e c o u l d b ea l l o w e d i n t h e v o l u m e o f a c e t i c a n h y d r i d e . S h a p i r o ,L e r n e r & P o s e n ( 1 9 3 5 ) s u g g e s t e d t h e u s e o f a m i x e dr e a g e n t . As s t a t e d e a r l i e r , t h e main e f f e c t o f t h i ss c h e m e o f a d d i t i o n i s t o s l o w t h e i n i t i a l s t a g e s o fc o l o u r d e v e l o p m e n t , w i t h o u t g r e a t l y i n f l u e n c i n g t h ef i n a l r e s u l t . W here s m a l l n u m b e r s o f t e s t s a r e b e i n gc a r r i e d t h r o u g h , t h e mixed r e a g e n t h o l d s no a d -v a n t a g e , and m a y i n f a c t b e an i n c o n v e n i e n c e .With t h e e x c e p t i o n o f S c h u b e ( 1 9 3 2 ) a l l a u t h o r sa p p e a r t o h a v e recommended t h e m e a s u r e m e n t o ft h e g r e e n c o l o u r , a n d w h e r e a f i l t e r i s s u g g e s t e d i t i so n e w i t h a m a x i m u m t r a n s m i s s i o n i n t h e r e g i o n o f6 5 0 m,. S c h u b e f o u n d t h a t 1 5 m i n . d e v e l o p m e n ta t 2 0 0 g a v e m a x i m u m c o l o u r f o r t h e g r e e n c o m -p o n e n t , b u t h e o b t a i n e d more c o n s i s t e n t r e s u l t s bymaking a s e c o n d c o m p a r i s o n b e t w e e n h i s s t a n d a r da n d unknown a f t e r t h e y had s t o o d f o r 1 2 - 2 4 h r . i na d a r k c u p b o a r d , s o t h a t t h e y e l l o w component wasb e i n g m e a s u r e d .The main d i s a d v a n t a g e o f m e a s u r i n g t h e y e l l o wc o m p o n e n t , e s p e c i a l l y w i t h a b l u e f i l t e r , w o u l da p p e a r t o b e t h a t any y e l l o w p i g m e n t a t i o n o f t h ef i n a l c h l o r o f o r m e x t r a c t w o u l d r e s u l t i n an i n c r e a s e db l a n k . A c o r r e c t i o n c a n b e a p p l i e d by u s i n g p a r t o ft h e c h l o r o f o r m f i l t r a t e and a d d i n g o n l y t h e a c e t i ca n h y d r i d e , b u t i t h a s b e e n f o u n d i n p r a c t i c e t h a t byf a r t h e g r e a t e r p a r t o f any b i l e p i g m e n t s p r e s e n t i na s a m p l e i s a b s o r b e d on t h e p r o t e i n p r e c i p i t a t ed u r i n g t h e e x t r a c t i o n p r o c e s s . As an e x a m p l e , i tw as f o u n d i n o n e i n s t a n c e w h e r e a p l a s m a c o n t a i n e d1 7 - 3 m g . b i l i r u b i n / I 0 0 m l . , t h a t t h e b l a n k , a sd e s c r i b e d i n t h e m e t h o d , amounted t o o n l y 1 5 mg.c h o l e s t e r o l / 1 0 0 m l .The i n s t a b i l i t y o f t h e g r e e n c o l o u r h a s b e e n t h ec a u s e o f m u c h c r i t i c i s m b e i n g l e v e l l e d a t t h eL i e b e r m a n n - B u r c h a r d r e a c t i o n f o r t h e d e t e r m i n a -t i o n o f c h o l e s t e r o l and h a s b e e n r e s p o n s i b l e f o r t h ei n t r o d u c t i o n o f s u c h a r t i f i c i a l s t a n d a r d s a s n a p h t h o lg r e e n B by R e i n h o l d ( 1 9 3 5 ) , and C a r t e r ' s i n k byS h a p i r o e t a l . ( 1 9 3 5 ) , a n d a l s o c e r t a i n s c h e m e s o fw a s h i n g s u c h a s t h a t o f M u e l l e r ( 1 9 1 6 ) , i n ana t t e m p t t o e l i m i n a t e t h e s p u r i o u s y e l l o w s w h i c h a r ea t t r i b u t e d t o a f a d i n g s t a n d a r d . S h e f t e l ( 1 9 4 4 ) wasa b l e t o s t a b i l i z e t h e g r e e n c o l o u r t o some e x t e n t byt h e a d d i t i o n o f g l a c i a l a c e t i c a c i d .Th e work o f Hoffman ( 1 9 4 0 ) , a s e x t e n d e d andd i s c u s s e d h e r e , h a s c l a r i f i e d t h i s p o s i t i o n , andS p e r r y & Brand ( 1 9 4 3 ) , r e v i e w i n g work on t h i sr e a c t i o n , s t a t e d t h a t i n t h e i r o p i n i o n t h e g r e e n c o l o u rw as e n t i r e l y e m p i r i c a l , no d o u b t i m p l y i n g t h a t i twas most v a r i a b l e , a n d t h a t i t was d e p e n d e n t

6 1 7o l . . 5 2


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6 1 8 A . P . KENNY I 9 5 2p r i n c i p a l l y upon t h e f a c t o r s o f t i m e and t e m p e r -a t u r e , w h e r e a s t h e brown c o l o u r ( d e s c r i b e d h e r e a st h e y e l l o w c o l o u r ) , a p p e a r e d t o b e t h e e n d p r o d u c tand m i g h t b e p r o p o r t i o n a l t o t h e amount o fc h o l e s t e r o l . Th e p r e s e n t work h a s c o n f i r m e d t h i sv i e w , b e c a u s e i t h a s b e e n shown t h a t a r e l a t i o n s h i pe x i s t s b e t w e e n t h e a b s o r p t i o n s i n t h e r e d and b l u er e g i o n s o f t h e s p e c t r u m s u c h t h a t a c o n s t a n t c a n b eo b t a i n e d w h i c h i s p r o p o r t i o n a l t o t h e amount o fc h o l e s t e r o l p r e s e n t .Sundeman & Razek ( 1 9 3 7 ) , u s i n g a R a z e k - M u l d e rc o l o u r a n a l y s e r , s h o w e d t h a t a f t e r 1 0 m i n . t h er e a d i n g a t 5 3 0 m , u . a l o n e r e m a i n e d c o n s t a n t , b u tt h e s e n s i t i v i t y was s o l o w a s t o p r e c l u d e i t s u s e f o rq u a n t i t a t i v e w o r k . They f o u n d t h a t i n t h e 5 5 0 -7 0 0 m , u . r e g i o n t h e a b s o r p t i o n i n c r e a s e d w i t ht e m p e r a t u r e , b u t was t h e r m o l a b i l e . I n t h e d a r k ,i n c r e a s i n g a b s o r p t i o n t o o k p l a c e i n t h e b l u e - v i o l e tr e g i o n , b u t t h e c o m p o n e n t m e a s u r e d a t t h a t w a v e -l e n g t h was l i g h t - s e n s i t i v e .A d e c i s i o n h a s t h e r e f o r e t o b e t a k e n on w h e t h e rt o m e a s u r e t h e g r e e n c o m p o n e n t , m a k i n g r e a d i n g sw i t h i n a c l o s e l y s p e c i f i e d t i m e , a f t e r d e v e l o p i n g a ta t e m p e r a t u r e b e l o w 3 0 0 , o r t o m e a s u r e t h e y e l l o wc o m p o n e n t w h i c h i s t h e r m o s t a b l e a f t e r a l o n g e ri n t e r v a l o f t i m e , a n d d e v e l o p e d a t a h i g h e r t e m p e r -a t u r e i n t h e d a r k , o r i n r e a s o n a b l e s u b d u e d l i g h t .Th e l a t t e r s y s t e m h a s b e e n a d o p t e d h e r e .Noyons ( 1 9 3 8 ) f o u n d r e s u l t s 17% l o w e r by t h ed i g i t o n i d e - p r e c i p i t a t i o n method a s c o m p a r e d w i t hc o l o r i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n , and R e i n h o l d ( 1 9 3 6 )f o u n d d i f f e r e n c e s a v e r a g i n g 10% i n t h e samed i r e c t i o n . T h e s e d i f f e r e n c e s c a n b e e x p l a i n e dr e a d i l y by t h e g r e a t e r s e n s i t i v i t y shown by c h o l e -s t e r y l e s t e r s , and an a l l o w a n c e o f 9 % h a s b e e nm a d e f o r t h i s i n t h e p r e p a r a t i o n o f t h e s t a n d a r dc h o l e s t e r o l s o l u t i o n .E s t i m a t i n g n o r m a l s e r u m c h o l e s t e r o l s by t h e i rd i g i t o n i d e - p r e c i p i t a t i o n m e t h o d , Ma n & G i l d e a( 1 9 3 3 ) f o u n d a m e a n v a l u e o f 2 0 8 m g . / 1 0 0 m l . w i t ha n e x p e r i m e n t a l e r r o r o f + 5 - 5 0 / L a t e r , P e t e r s &Ma n ( 1 9 4 3 ) , u s i n g t h e s a m e t e c h n i q u e w i t h 1 7 4 c a s e s ,f o u n d a m e a n v a l u e o f 1 9 4 m g . / 1 0 0 m l . w i t h as t a n d a r d d e v i a t i o n o f 3 5 - 6 m g . K o r n e r u p ( 1 9 5 0 ) ,u s i n g t h e t e c h n i q u e o f S p e r r y ( 1 9 3 6 ) , f o u n d a means e r u m t o t a l c h o l e s t e r o l o f 2 1 8 - 8 4 - 4 mg. ( s . E . m . ) /1 0 0 m l . , S . D . 4 7 m g . , i n a s e r i e s o f a d u l t s .

Th e p l a s m a . c h o l e s t e r o l s f o u n d i n t h e p r e s e n ts e r i e s o f 2 0 0 n o r m a l s , m e an 1 9 7 + 4 - 1 m g . ( s . E . M . ) /1 0 0 m l . , S . D . 3 9 m g . , c o m p a r e f a v o u r a b l y w i t h t h e s ef i g u r e s f r o m t h e p o i n t o f v i e w o f a c c u r a c y and a g r e ea l s o i n t e r m s o f d i s t r i b u t i o n , b u t , s i n c e p l a s m ah a s b e e n e m p l o y e d , t e n d r e l a t i v e l y t o b e s l i g h t l yh i g h e r t h a n t h e f i r s t two s e t s o f f i g u r e s q u o t e da b o v e .Th e e v i d e n c e p r o d u c e d i n e a r l i e r s e c t i o n s i s o fg e n e r a l a p p l i c a t i o n , and s t r e s s e s t h e i n p o r t a n c e o ft h e s t r i c t e s t c o n t r o l o f c o n d i t i o n s i f r e p r o d u c i b l er e s u l t s a r e t o b e o b t a i n e d by any method o f c h o l e -s t e r o l d e t e r m i n a t i o n e m p l o y i n g t h e L i e b e r m a n n -B u r c h a r d r e a c t i o n .A l t h o u g h p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s h a v e b e e ne s t i m a t e d i n t h e s e r i e s q u o t e d h e r e , t h e a u t h o r i s o ft h e o p i n i o n t h a t u n t i l a s a t i s f a c t o r y e x p l a n a t i o n i so b t a i n e d f o r t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n serum a n dp l a s m a v a l u e s t h e - f o r m e r s h o u l d b e e s t i m a t e d i np r e f e r e n c e t o t h e l a t t e r , s i n c e t h e serum v a l u e s h a v eh e r e b e e n f o u n d t o r e m a i n t h e more c o n s t a n t o v e ra p e r i o d o f 2 4 h r .

SUMMARY1 . F a c t o r s i n f l u e n c i n g t h e c o l o u r d e v e l o p m e n t i nt h e L i e b e r m a n n - B u r c h a r d r e a c t i o n f o r t h e d e t e r -m i n a t i o n o f c h o l e s t e r o l h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d .The a l t e r a t i o n i n t h e d e n s i t i e s o f t h e a b s o r p t i o nb a n d s w i t h t e m p e r a t u r e h a v e b e e n s t u d i e d , anda s i m p l e r e l a t i o n s h i p e s t a b l i s h e d f o r t h e c o n d i t i o n sd e s c r i b e d .2 . A method f o r t h e e s t i m a t i o n o f serum o rp l a s m a t o t a l c h o l e s t e r o l s u i t a b l e f o r r o u t i n e c l i n i c a lw o r k h a s b e e n e v o l v e d on t h e b a s i s o f t h e a b o v ef i n d i n g s , m e a s u r i n g t h e y e l l o w c o m p o n e n t o f t h ec o l o u r and e m p l o y i n g a f i l t e r h a v i n g a m a x i m u mt r a n s m i s s i o n a t 4 3 0 m,.3 . From a s e r i e s o f 2 0 0 n o r m a l s a m e an p l a s m at o t a l c h o l e s t e r o l o f 1 9 7 4 m g . ( s . E . M . ) / 1 0 0 m l . , S . D .3 9 m g . , h a s b e e n f o u n d .T h e a u t h o r w i s h e s t o a c k n o w l e d g e t h e v a l u a b l e a s s i s t a n c eg i v e n b y Dr J . W a l l a c e , D i r e c t o r o f t h e R e g i o n a l B l o o dT r a n s f u s i o n S e r v i c e , i n t h e c o l l e c t i o n o f s m a l l s a m p l e s o fn o r m a l b l o o d a n d a l s o t h e e n c o u r a g e m e n t a n d a d v i ce g i v e nb y Dr J . C . E a t o n a n d Dr I . A . A n d e r s o n a t d i f f e r e n t s t a g e so f t h i s w o r k .

REFERENCESB l o o r , W. R . ( 1 9 2 8 ) . J . b i o l . C h e m . 7 7 , 5 3 .B o y d , E . M . ( 1 9 3 3 ) . J . b i o l . C h e m . 1 0 1 , 3 2 3 .B u r c h a r d ( 1 8 8 9 ) . D i s e r t a t i o n , R o s t o c k , f r o m C h e m . Z b l .1 8 9 0 , 1 , 2 5 .D r e k t e r , I . J . , B e m a r d , A . & L e o p o l d , J . S . ( 1 9 3 5 ) . J . b i o l .C h e m . 1 1 0 , 5 4 1 .G a r d n e r , J . A . & G a i n s b o r o u g h , H . ( 1 9 2 7 ) . B i o c h e m . J . 2 1 ,1 3 0 .

G a r d n e r , J . A . & W i l l i a m s , M . ( 1 9 2 1 ) . B i o c h e m . J . 1 5 , 3 7 1 .H o f f m a n , W. S . ( 1 9 4 0 ) . P r o c . S o c . e x p . B i o d . , N . Y . , 4 3 , 3 8 .K e l s a y , F . E . ( 1 9 3 9 ) . J . b i o l . C h e m . 1 2 7 , 1 5 .K e n n y , A . P . ( 1 9 4 8 ) . B i o c h e m . J . 4 3 , x x x .K i r k , E . , P a g e , I . H . & V a n S l y k e , D . D . ( 1 9 3 4 ) . J . b i o l .C h e m . 1 0 6 , 2 0 3 .K o r n e r u p , V . ( 1 9 5 0 ) . A r c h . i n t e n . M e d . 8 5 , 3 9 8 .L e i b o f f , S . L . ( 1 9 2 4 ) . J . b i o l . C h e m . 6 1 , 1 7 7 .


9/9

V o l . 5 2 DETERMINATION O F CHOLESTEROL 6 1 9L i e b e r m a n n , C . ( 1 8 8 5 ) . B e r . d t ch . c he m. G e 8 . 1 8 , 1 8 0 3 .M a n , E . B . & G i l d e a , E . F . ( 1 9 3 3 ) . J . b i o l . C h e m . 1 0 1 , 6 8 5 .M o r g a r e i d g e , K . ( 1 9 3 5 ) . J . b i o l . C h e m . 1 0 9 , l x v i i .M u e l l e r , J . H . ( 1 9 1 6 ) . J . b i o l . C h e m . 2 5 , 5 4 9 .M y e r s , V . C . & W a r d e l l , E . L . ( 1 9 1 8 ) . J . b i o l . C h e m . 3 8 6 , 1 4 7 .N o y o n s , E . C . ( 1 9 3 8 ) . B i o c h e m . Z . 2 9 8 , 3 9 1 .O k e y , R . ( 1 9 2 8 ) . P r o c . S o c . e x p . B i o l . , N . Y . , 2 6 , 5 1 8 .O s g o o d , E . E . ( 1 9 2 6 ) . A r c h . i n t e r n . M e d . 3 7 , 6 8 5 .P e t e r s , J . P . & M a n , E . B . ( 1 9 4 3 ) . J . d i n . I n v e s t . 2 2 , 7 1 5 .R e i n h o l d , J . G . ( 1 9 3 4 - 3 5 ) . P r o c . S o c . e x p . B i o l . , N . Y . , 3 2 ,6 1 4 .R e i n h o l d , J . G . ( 1 9 3 6 ) . A m e r . J . c l i n . P a t h . 6 , 3 1 .S a c k e t t , G . E . ( 1 9 2 5 ) . J . b i o l . C h e m . 6 4 , 2 0 3 .S c h m i d t , L . H . ( 1 9 3 5 ) . J . b i o l . C h e m . 1 0 9 , 4 4 9 .S c h o e n h e i m e r , R . & S p e r r y , W. M . ( 1 9 3 4 ) . J . b i o l . C h e m .1 0 6 , 7 4 5 .

S c h u b e , P . G . ( 1 9 3 2 ) . J . L a b . c l i n . M e d . 1 8 , 3 0 6 .S h a p i r o , A . , L e r n e r , H . & P o s e n , E . ( 1 9 3 4 - 3 5 ) . P r o c . S o c .e x p . B i o l . , N . Y . , 3 2 , 1 3 0 0 .S h e f t e l , A . G . ( 1 9 4 4 ) . J . L a b . d i n . M e d . 2 9 , 8 7 5 .S o l s , A . ( 1 9 4 7 ) . R e v . e 8 p . F i 8 i o l . 3 , 2 2 5 .S p e r r y , W. M . ( 1 9 3 6 ) . J . b i o l . C h e m . 1 2 5 , 1 1 4 9 .S p e r r y , W. M . & B r a n d , F . C . ( 1 9 4 3 ) . J . b i o l . C h e m . 1 5 0 ,3 1 5 .S p e r r y , W. M . & . S ch o en h ei m e r , R . ( 1 9 3 5 ) . J . b i o l . C h e m .1 1 0 , 6 5 6 .S u n d e m a n , F . W. & R a z e k , J . ( 1 9 3 7 ) . J . b i o l . C h e m . 1 1 8 , 3 9 7 .W o o t t o n , I . D . P . , K i n g , E . J . & S m i t h , J . M a c l e a n ( 1 9 5 1 ) .B r i t . m e d . B u Z Z . 7 , 3 0 7 .Y a s u d a , M . ( 1 9 3 6 ) . J . B i o c h e m . , T o k y o , 2 4 , 4 4 3 .Z u c k e r m a n , J . L . & N a t e l s o n , S . ( 1 9 4 8 ) . J . L a b . d i n . M e d .3 3 , 1 3 2 2 .

A Micro G l a s s E l e c t r o d eB Y E . F . HARTREEM o l t e n o I n 8 t i t u t e , U n i v e r 8 i t y o f C a m b r i d g e( R e c e i v e d 3 Ma y 1 9 5 2 )

G l a s s e l e c t r o d e a s s e m b l i e s a s n o r m a l l y s u p p l i e d bym a n u f a c t u r e r s r e q u i r e t h a t t h e g l a s s e l e c t r o d e , a sa s m a l l b u l b , t o g e t h e r w i t h e i t h e r t h e s t a n d a r dc a l o m e l e l e c t r o d e o r a p o t a s s i u m c h l o r i d e - a g a rb r i d g e , s h a l l d i p i n t o t h e l i q u i d u n d e r e x a m i n a t i o n .Under t h e s e c o n d i t i o n s a r e d u c t i o n i n t h e v o l u m e o fl i q u i d b e l o w 5 - 1 0 m l . means t h a t t h e c o n t a i n i n gv e s s e l b e c o m e s s o s m a l l t h a t t h e r i s k o f s c r a t c h i n gt h e t h i n g l a s s b u l b b e c o m e s c o n s i d e r a b l e . R a t h e rs m a l l e r v o l u m e s c a n s a f e l y b e u s e d i n t h e M o r t o n( 1 9 3 0 ) e l e c t r o d e s i n c e o n l y t h e g l a s s e l e c t r o d e d i p si n t o t h e l i q u i d ; c o n t a c t w i t h t h e c a l o m e l e l e c t r o d eb e i n g t h r o u g h a s t o p c o c k a t t h e b a s e o f t h e e l e c t r o d ev e s s e l .M o s t a d a p t a t i o n s o f t h e g l a s s e l e c t r o d e t o v e r ys m a l l v o l u m e s h a v e i n v o l v e d a r e d u c t i o n i n t h e a r e ao f t h e g l a s s m e m b r a n e . Thus P a l c ( 1 9 3 8 ) f u s e d at h i n s e p t u m o f g l a s s a t a s h o r t d i s t a n c e f r o m o n ee n d o f a n a r r o w U - t u b e s o f o r m i n g a v e r y s m a l l c u pi n w h i c h 0 . 1 m l . f l u i d was s u f f i c i e n t t o c o v e r t h em e m b r a n e . C h i n o y ( 1 9 4 7 ) m a d e u s e o f an e c c e n t r i c -a l l y b l o w n b u l b w i t h a d e p r e s s i o n a t i t s u p p e r m o s tp o i n t i n w h i c h 0 ' 0 5 m l . w as p l a c e d . I n b o t h c a s e s ab r i d g e was u s e d t o m a k e c o n t a c t w i t h t h e c a l o m e le l e c t r o d e . S u c h e l e c t r o d e s n a t u r a l l y h a v e a m u c hg r e a t e r e l e c t r i c a l r e s i s t a n c e t h a n a f u l l y i m m e r s e ds t a n d a r d t y p e o f b u l b , and t h e r e i s a g a i n r i s k o fd a m a g i n g t h e membrane w i t h t h e b r i d g e w h e n t h ed e p t h o f f l u i d i s v e r y s m a l l .O t h e r w o r k e r s , f o r e x a m p l e D i e t z ( 1 9 4 8 ) , h a v eu s e d a b l o c k o f i n s u l a t i n g m a t e r i a l i n w h i c h a r e two

d e p r e s s i o n s c o n n e c t e d by a s m a l l c h a n n e l . Thed e p r e s s i o n s a r e d e s i g n e d t o f i t t h e t w o e l e c t r o d e s s ot h a t e a c h i s s u r r o u n d e d by a f i l m o f l i q u i d . Thes m a l l e r t h e v o l u m e o f l i q u i d a v a i l a b l e f o r s u c h a s e tup t h e g r e a t e r a r e t h e c h a n c e s o f d a m a g e t o t h e g l a s sb u l b a s i t i s l o w e r e d i n t o i t s c a v i t y . B y f i t t i n g ac o n v e n t i o n a l b u l b t y p e e l e c t r o d e c o n c e n t r i c a l l yw i t h i n a w i d e r t u b e t o a l l o w a b o u t 1 m m . c l e a r a n c eHanes ( 1 9 5 1 ) c o u l d m e a s u r e t h e pH o f 1 d r o p o ff l u i d w h i c h was r e t a i n e d i n t h e a n n u l a r s p a c e byc a p i l l a r i t y . S u c h an e l e c t r o d e w o u l d b e s a f e f r o md a m a g e a s l o n g a s i t r e m a i n e d r i g i d l y f i x e d w i t h i n t h eo u t e r t u b e . B r i t t o n ( 1 9 4 2 ) h a s r e v i e w e d v a r i o u st y p e s o f g l a s s e l e c t r o d e .M i c h a e l i s ( 1 9 3 6 ) d e s i g n e d an e l e c t r o d e i n w h i c ht h e g l a s s membrane t o o k t h e f o r m o f a t h i n - w a l l e dt u b e f u s e d w i t h i n a w i d e r v e r t i c a l t u b e . S u c h ad e s i g n e n s u r e s c o m p l e t e p r o t e c t i o n o f t h e g l a s smembrane f r o m m e c h a n i c a l d a m a g e . Th e c e n t r et u b e h e l d 3 - 5 m l . o f t h e l i q u i d u n d e r e x a m i n a t i o n ,w h i l e t h e a n n u l a r s p a c e c o n t a i n e d d i l u t e h y d r o -c h l o r i c a c i d i n t o w h i c h d i p p e d t h e s i l v e r - s i l v e rc h l o r i d e e l e c t r o d e . At t h e l o w e r e n d o f t h e t u b e wasf i t t e d a 5 - w a y s t o p c o c k t o a l l o w c o n n e x i o n v i a ap o t a s s i u m c h l o r i d e b r i d g e t o t h e c a l o m e l e l e c t r o d e .P i c k f o r d ( 1 9 3 7 ) h a s d e s c r i b e d a m o d i f i c a t i o n o fM i c h a e l i s ' s d e s i g n , f o r m u c h s m a l l e r v o l u m e s( a p p r o x . 0 - 1 m l . ) . The p r e s e n t d e s i g n i s b a s e d u p ont h a t o f M i c h a e l i s b u t i s s i m p l e r t h a n t h e tw oj u s t m e n t i o n e d and can b e u s e d w i t h 0 3 m l .l i q u i d . M e a s u r e m e n t s c a n b e made v e r y r a p i d l y

Articulo_liebermann Buchard Reaction_det de Colesterol

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