AISLAMIENTO DE Clostridium sporogenes A PARTIR DE MUESTRA DE TIERRA

ISOLATION OF Clostridium sporogenes FROM A SAMPLE OF LAND Mara Carolina Betancur DAmbrosio Tatiana Paola Soto BorjaRESUMENCon el propsito de emplear los conocimientos obtenidos a lo largo del curso de Microbiologa General, se trabaj en el aislamiento de la bacteria Clostridium sporogenes, todos los procedimientos requeridos se llevaron a cabo en el laboratorio de Microbiologa de la Universidad de Crdoba, ubicado en la va que conduce de Montera a Cinaga de Oro en el corregimiento de Berstegui. Para la obtencin de la muestra utilizada en el aislamiento se tom una porcin de tierra adquirida a profundidad y se fij en la parte central de una papa, posterior a esto se cubri la papa para lograr condicin de anaerobiosis, durante 5 das, se implement otro tipo de procedimientos para una mayor seguridad al momento de adquirir la muestra, como el uso de carne de res cocida con el fin de abastecer los nutrientes del microorganismo, lo producido en la papa se diluy en agua peptonada a 35C por 24 horas en anaerobiosis a igual que la carne, se realizaron diluciones a partir de la solucin de la papa, con el objetivo de aislar la muestra ms pura. El inoculo obtenido, fue sembrado en agar SPS e incubado a 35C por 24 horas. Se present crecimiento en la muestra sembrada a partir de la carne lo cual se evidenci a travs de colonias de color blancuzco, cuya presencia se logro confirmar por la aplicacin de la tincin de Shaeffer Fulton. Palabras claves: Clostridium sporogenes, agua peptonada, agar SPS, tincin de Shaeffer Fulton. ABSTRACTWith the purpose to use the knowledge that we got throughout the course of General Microbiology, we worked on the isolation of the bacterium Clostridium sporogenes, all the procedures required were conducted in the laboratory of Microbiology of the University of Cordoba, located in the road of Monteria until Cinaga de Oro in the village of Berstegui. To obtain the sample used in the isolation we took a portion of land obtain to profundity and it was fixed in the middle of a potato, then the potato was covered to achieve anaerobic conditions for 5 days, we implemented another kind of procedures for we have extra security at the moment to obtain the sample, as the use of cooked meat with the purpose to supply the nutrients of the microorganism, the product of the potato was diluted in peptone water at 35 C for 24 hours in anaerobic conditions the same happen with the meat, we did dilutions, they were made from solution of potato, with the intention of isolating the purest sample. The inoculum obtained was planted in SPS agar and incubated at 35 C for 24 hours. It grew up in the sample from cultivated of meat which was evidenced by whitish colonies, it can be confirming with the application of stain of Shaeffer - Fulton.Keywords: Clostridium sporogenes, peptone water, SPS agar, stain of Shaeffer - Fulton.

7 Microbiologa general Nov. 2010

INTRODUCCINLa papa (Solanum tuberosum) es un tubrculo que posee hidratos de carbono en concentraciones que equivalen aproximadamente a un 50% del total de los componentes nutricionales de la papa, que en condiciones normales pueden ser rica fuente de carbohidratos para muchas bacterias, al igual que los microorganismos que son capaces de degradar protenas encontradas en la carne. De igual forma a pocos centmetros de profundidad del suelo podemos tropezar con miles de microorganismos que pueden hallarse de forma natural sin presencia de oxigeno, entre estos encontramos muchas especies de Clostridium, como el Clostridium sporogenes, encontrado comnmente en el suelo e intestinos de muchos animales y en los alimentos con baja acidez y algunas carnes en descomposicin.Clostridium sporogenes es una bacteria Gram-positiva, en forma de mazo, en la tincin de Gram se observan filamentoso en cultivos viejos, presentan esporas ovales subterminales, son mviles, sus colonias se observan con bordes rizoides se adhieren firmemente al agar produciendo velo.

Existen algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas, que mediante tinciones se pueden observar en el microscopio de color verde mientras que las formas vegetativas se observan de color rosado utilizando la tincin de esporas llamada Shaeffer - Fulton.Las pruebas bioqumicas utilizas para la identificacin de Clostridium sporogenes son: hidrlisis de la esculina, lectinasa en donde la mayora de las cepas son negativos y algunas cepas positivas ocasionales, la prueba de la lipasa y derivados de indol, la prueba para identificacin de la fermentacin de la glucosa, protelisis de la leche y la hidrlisis de la gelatina, son las pruebas utilizadas frecuentemente para el aislamiento e identificacin del microorganismo en cuestin, pero teniendo en cuenta que las pruebas bioqumicas para la identificacin de especies de Clostridium, requiere de cultivos en condiciones de anaerobiosis estrictas, algunas especies no se pueden identificar bioqumicamente, pues se comportan de manera similar; esto obliga a realizar otras pruebas, por ejemplo, inoculacin de ratones para detectar toxigenicidad.

Su temperatura ptima de crecimiento es de 37C pero puede variar hasta 35C, son anaerobios facultativos pertenecientes a la familia de Clostridiaceae capaz de fermentar la glucosa e hidrolizar la gelatina, se deduce con eso, que Clostridium sporogenes es una bacteria proteoltica y sacaroltica.

MATERIALES Y MTODOSEl presente aislamiento se desarroll en el Laboratorio de Microbiologa de la Universidad de Crdoba, sede Berstegui, usando los siguientes materiales:Balanza analtica, agua de peptona 250 ml, asas (punta y redonda), mechero, frasco tapa rosca, pipeta, jarra de Gaspack incubadora, microscopio, agar SPS.Para pruebas bioqumicas: Medio KIA, caldo BHI, medio gelatina, medio SIM. Para tinciones: portaobjetos, cubreobjetos, cristal violeta, lugol, alcohol acetona, safranina de Gram, agua destilada, verde malaquita, safranina al 0.5%Preparacin para la obtencin de la muestraEn el primer procedimiento realizado, se tom una muestra aproximadamente de 10g de tierra adquirida a profundidad y se distribuyeron en 3 papas (Solanum tuberosum) previamente perforadas con un sacabocados, se introdujo una porcin de tierra justo en el centro de la papa de manera equitativa en cada tubrculo, posterior a esto se repuso la pieza extrada anteriormente de este y se recubri con la parafina de vela para garantizar la anaerobiosis, luego se sujeto la parafina con cinta transparente adhesiva, se sumergi en agua estril y agregndole glicerina se asegur el contacto directo con el aire, otros microorganismos ajenos al aislamiento y acelerar el proceso de descomposicin, (ver figura 1) posterior a esto se cerr hermticamente, dejndose en dichas condiciones durante 5 das. Luego de esto se extrajo la parte descompuesta de las tres papas (ver figura 2) y se sumergieron en 90 ml de agua de peptona por 24 horas a 35C, la solucin obtenida se denomino solucin 10-1. Se realizaron dos diluciones a partir del primer procedimiento (ver figura 3) con el objetivo de obtener un cultivo puro, esto se llevo a cabo tomando 9ml de agua de peptona con 1ml de la solucin obtenida de la papa (solucin 10-1), se nombr solucin 10-2, posteriormente, de la solucin anterior se adicionaron 1ml a 9 ml de agua de peptona consiguiendo as la solucin 10-3, seguido a esto se incubo por 24h a 35C. Este procedimiento se hizo con el fin de aislar Clostridium sporogenes, el cual segn bibliografa es un microorganismo sacaroltico y teniendo en cuenta esta condicin se realiz el procedimiento en mencin.En el segundo procedimiento se tom una muestra de tierra de aproximadamente 10g y se inocul en agua de peptona por 24 horas a 35 C en la jarra de Gaspack, al igual que en el procedimiento anterior se realizaron diluciones, pero esta vez en 9 tubos, que contenan cada uno 9ml de agua de peptona con carne cocida (ver figura 4). Estas diluciones se efectuaron de la siguiente manera: de la muestra de la tierra con agua de peptona se extrajo 1ml y se adiciono en un tubo (1), previamente preparado con 9 ml de agua de peptona y carne, a partir del tubo 1 se preparo el tubo 2 y de este el tubo 3; seguidamente se realizaron dos diluciones del tubo 1 pero esta vez con 0.5ml de la solucin para as obtener 11 y de esta 12 de igual forma se diluyeron los tubos 2 y 3 para un total de 9 tubos, que posteriormente fueron sometidos a incubacin en jarra de Gaspack durante 24h a 35C.Este procedimiento se hizo con el fin de aislar Clostridium sporogenes, el cual segn bibliografa es un microorganismo sacaroltico y proteoltico teniendo en cuenta esta condicin se realiz el procedimiento anterior.Siembra Del el primer procedimiento se seleccionaron las muestras que presentaron mayor turbidez, la solucin 10-1 y la solucin10-2, posterior a esto se sembr en agar SPS por mtodo clsico durante 24 horas en la jarra de Gaspack a 35C, de igual forma en el segundo procedimiento se tomaron los tubos 1, 2, 3, 11y 12, los cuales presentaron mayor turbidez con respecto a los dems y as sembrarlos en agar SPS por 24 horas incubado en condiciones de anaerobiosis, para completar un total de 7 cajas de petri.Pruebas bioqumicasSe realizaron pruebas bioqumicas (fermentacin de carbohidratos en medio KIA, hidrolisis de le esculina en caldo BHI para anaerobios, prueba de gelatinasa, prueba de sulfuro, indol y motilidad en medio SIM), con las cepas que presentaron crecimiento en los dos procedimientos llevados a cabo.RESULTADOS Y DISCUSINTeniendo en cuenta el agar y el mtodo de siembra donde crecen los Clostridium, las colonias se apreciaron macroscpicamente con borde rizoide, pero muy difcil de determinar y observar, es decir muy pequeas por lo cual se seleccionaron las cajas de petri donde hubo mayor crecimiento de colonias y similitud con respecto las descritas segn bibliografa. Las cajas de petri del primer procedimiento fueron descartadas debido a que sus colonias no se podan apreciar en su totalidad y no coincida con lo consultado (ver figura 5). Sin embargo se realizaron tincin de Gram y tincin de Shaeffer Fulton pero estas no contena bacilos Gram positivos ni presencia de esporas (ver figura 6).Las cajas seleccionadas fueron dos, provenientes de los tubos 1 y 2 en el segundo procedimiento (ver figura 7), las cuales presentaron crecimiento de colonias de color negro debido a la fermentacin del sulfuro que contena el agar SPS (sulfunato sdico de polianetol). Las cajas de petri restantes fueron descartadas debido a la escasez de presencia de colonias, aunque estas tambin presentaron fermentacin del H2S.Se realiz tincin de Gram a las cajas de petri seleccionadas dando como resultados bacilos Gram positivo (ver figura 8), seguidamente se realiz tincin de Shaeffer Fulton para lo cual se pudieron observar las esporas de color verde y algunas clulas vegetativas de color fucsia (ver figura 9), la localizacin de las esporas fueron subterminales lo cual es un dato que concuerda con los datos tericos del microorganismo, siguiendo con el procedimiento se realizaron las pruebas bioqumicas necesarias para la identificacin de Clostridium sporogenes dando como resultado que en la prueba de fermentacin de carbohidratos en medio KIA produjo acido/acido con rompimiento del medio es decir formacin de gas en anaerobiosis y produccin de cido sulfhdrico (ver figura 10), de la prueba anterior se puede decir que la mayora son reacciones propias de la Clostridium sporogenes, excepto la fermentacin de la lactosa.Por otro lado, se logr observar que el microorganismo aislado produce enzimas de tipo proteolticas capaces de licuar la enzima gelatinasa, es decir, que en esta prueba el resultado es positivo (ver figura 11), adems con el medio SIM se determin motilidad, indol y produccin de sulfuro, donde la primera arroj resultado positivo ya que hubo movilidad fuera de la lnea de siembra por la presencia de flagelos en su estructura, as mismo la prueba de sulfuro result ser positiva presentando ennegrecimiento del medio, el cual impeda un poco la observacin de la movilidad, para el indol el resultado fue negativo, lo que quiere decir que el microorganismo no es capaz de desdoblar el indol de la molcula de triptfano, (ver figura 12).La prueba de hidrlisis de esculina en caldo BHI permite determinarla capacidad que posee el microorganismo de hidrolizar el glucsido esculina a esculinata, que en este caso fue positivo observndose el tubo totalmente negro, (ver figura 13).Las anteriores pruebas corresponden cada vez mas al tipo de microorganismo que se desea identificar, debido a que las pruebas realizadas son reacciones que presenta el Clostridium sporogenes, razn por la cual existe la posibilidad que el microorganismo aislado sea esta especie de Clostridium. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONESConsiderando el resultado obtenido de las pruebas bioqumicas y las tinciones se puede inferir que posiblemente se aisl Clostridium sporogenes a partir de la muestra de tierra adquirida a profundidad e inoculada en agua peptonada con carne cocida y proporcionndole al microorganismo las condiciones que necesit para su ptimo desarrollo, esto se pudo deducir debido que el microorganismo arrojo resultados positivos para todas las pruebas excepto la prueba de fermentacin de carbohidratos (+-) ya que el resultado fue acido/acido, es decir que se ferment la glucosa en anaerobiosis y la lactosa en aerobiosis, teniendo en cuenta que el microorganismo en cuestin vive sin presencia de oxigeno, por lo cual se esperaba que solo fermentara la glucosa, se presume entonces la existencia de otra bacteria capaz de fermentar la lactosa, se conjetura tambin que el tiempo de incubacin de la prueba se prolongo de lo requerido.Segn lo realizado en el primer procedimiento, no se obtuvieron las caractersticas que se aproximaran a los resultados tericos del microorganismo, se cree que se debe a que la muestra de tierra no fue la ms adecuada ya que esta se extrajo a pocos centmetros de profundidad de la superficie terrestre. De manera general todas pruebas propuestas cumplieron con los requerimientos establecidos para la bacteria Clostridium sporogenes.Se recomienda para mejores resultados futuros, adquirir la muestra a una profundidad de aproximadamente 20 centmetros del suelo, en una zona no transitable y poblada de arboles, de igual forma se aconseja una siembra a profundidad para as garantizar un buen desarrollo de Clostridium sporogenes. No es irrelevante sugerir un apropiado manejo de los implementos del laboratorio, las muestras de microorganismos y advertir el cuidado que estos requieren.A manera de anexo es importante resaltar que el porcentaje de identificacin correcta que se obtiene del gnero Clostridium oscila entre 60-80%, donde casi el 100% de las cepas que corresponden a C. perfringens son identificadas correctamente mientras que los mayores fallos se producen con cepas de C. inocuum, C. difficile, C. sporogenes, C. tetani y C. clostridioforme. BIBLIOGRAFAPARS, R; JUREZ, A.1999. 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ANEXOS