“Arrays de cDNA”Curso de Postgrado

Genómica, Proteómica y Bioinformática (Enero-05)

Carles J. Ciudad.

Grupo de Terapia anticancerosa. Departamento de Bioquímica I Biologia

Molecular. Fac Farmacia. UB.

(cciudad@ub.edu)

Una Vieja Ideacon una tecnología moderna

• Determinar la expresión génica a mRNA

• Un Array es un Multi-Northern

• Técnica basada en la hibridación

• Arrays (250-8000 genes), tamaño grande.

Marcaje radiactivo

• Microrarrays (hasta 40,000 genes) micro.

Marcaje fluorescente

APLICACIONES DE LOS ARRAYS

• DEFINIR PERFILES DE EXPRESIÓN GENICA (EN DIFERENTES TEJIDOS, ESTADOS DE

DESARROLLO, TRATAMIENTOS: complementar funcionalmente el proyecto genoma humano)

• ESCRUTINIO DE MUCHOS GENES SIMULTÁNEAMENTE (ventajas respecto RT-PCR, RNAse protection, Northern analysis)

• INVESTIGAR PROCESOS NORMALES Y PATOLÓGICOS (comparación de tejidos)

• DESCUBRIR DIANAS TERAPÉUTICAS

PLATAFORMA BD-CLONTECHDISPOSICIÓN GENES

NATURALEZA DE LOS ARRAYS• LO CONSTITUYEN CENTENARES DE cDNAs

INMOBILIZADOS SOBRE MEMBRANAS DE NILÓN (8X12cm) CARGADAS POSITIVAMENTE (dup o singli)

• CADA cDNA CONTIENE 200-600bp, (10ng) (AMPLIFICADAS DE REGIONES DE mRNA SIN COLA DE POLI-A, ELEMENTOS REPETITIVOS O ALTAMEN-TE HOMÓLOGOS, Y QUE NO HIBRIDEN CON OTRAS SECUENCIAS DE GENES PRESENTES EN EL ARRAY)

• SON ESPECÍFICO DE ESPECIE• CONTIENEN CONTROLES NEGATIVOS

(PLÁSMIDOS,BACTERIOFAGOS), Y POSITIVOS (HOUSEKEEPING GENES) QUE PUEDEN UTILIZARSE PARA NORMALIZAR

METODOLOGÍA DE UN ARRAY

• ATLAS HUMAN CANCER 1.2K• Membranas de Nilón (8X12cm):

1176 GENES

• Cada cDNA (10 ng, 200-600 bp)

• Específicos de Especie

• Sin secuencias repetitivas o de alta similaridad.

• MARCAJE cDNA

• -[32P]-dATP

• MMLV-RT

• Primers específicos

• Purificación G-50

• Hibridación

• ANALISIS• “Phosphorimaging”

• Normalización

• Interpretación resultados

POLI A+ o RNA TOTAL

32P o 33P

Arrays, solo 1000?No, 8000

Normal vs Diabético

NORMALIZACIÓN EN LOS ARRAYS

• LAS MEMBRANAS PUEDEN MOSTRAR DIFERENTES GRADOS DE HIBRIDACION

• DIFERENCIAS EN LA CALIDAD DEL RNA O EN LA SINTESIS DE LOS cDNAs

• NORMALIZACIÓN UTILIZANDO HOUSEKEEPING GENES

• NORMALIZACIÓN UTILIZANDO TODOS LOS GENES DEL ARRAY (GLOBAL NORMALIZATION)

CUANDO SE CONSIDERAN DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS ?

• GENERALMENTE CUANDO HAY DIFERENCIAS DE 2 o MAS VECES (INCLUSO MENOS DE 2 VECES EN EL CASO DE MENSAJES SOBRE-ABUNDANTES)

• EN EL CASO DE CAUSAR REDUCCIONES DE LA EXPRESIÓN (ALREDEDOR DE 0.5 VECES)

K562

(Leucemia mieloide crónica)

HT29

(Cáncer de colon)

I. Análisis genómico de los cambios de expresión

II. Identificación de posibles dianas para el diseño de quimiosensibilizadores en la terapia con Metotrexato

Genómica de la resistencia al MTX

Dosis respuesta al MTX en K562

CUANTIFICACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LOS EXPERIMENTOS CON ARRAYS

GeneSpring(Silicon Genetics)

ARRAY SCATTERING.CNT

ARRAY SCATTERING.MTX

FILTERING-OVER2

LIST-OVER 2

GRAPH-NUC-METABOLISM

CLUSTERING QUERY

TREE-DOSE RESPONSE MTX

COMPROBACION DE LOS RESULTADOS

• RT-PCR CUANTITATIVO (En genes con diferencias de 2-5 veces >70% positivos; en superiores a 5 veces >90% positivos)

• NORTHERN ANALYSIS

• RNAse PROTECTION

• WESTERN ANALYSIS

• ANALISIS DE PROTEINAS EN 2D

Validación de los resultadospor RT-PCR cuantitativa

IMPDH2

MTX (M)

CNT 3x10-8 M 3x10-7 M0

50

100

150

200

250

300

Niv

el e

s d

e m

RN

A

pa

ra

la I

MP

DH

(% r

es

pe

cto

el

co

ntr

ol)

Expresión de la IMPDH en células K562 tratadas con Mtx 24h

APRT

Sonda Taq-Man

SÍNTESIS DE NUCLEÓTIDOS PÚRICOS

INHIBIDORES DE LA IMPDH

IMP

ADENILSUCCINATO

XANTILATO

AMP

GMPIMPDH

ADENILSUCCINATO LIASA

ADENILSUCCINATO SINTETASA

O

O

O

CH3

HOHO

CH3

CH3O

ACIDO MICOFENÓLICO

O

OH

OH OH

S N

CONH2

TIAZOFURINA

O

OH

OH OH

CONH2

BENZAMIDA RIBÓSIDO

CÈL.LULES RESISTENTS A 10-7 M DE MTX

0

20

40

60

80

100

120

CONTROL 10-7M 3X10-7M 10-6M 3X10-6M 10-5M

BENZAMIDA RIBÒSID (M)

MTX+BR

BR

MTX

BENZAMIDA RIBÒSID

EXPERIMENTO HT29 RESISTENTES AL MTX

HT29 CONTROL HT29 RESISTENTES A 10-5 M

MEMBRANA HT29 CNT

MEMBRANA HT29 RESISTENTES AL MTX

9 genes sobreexpresados

15 9 38

1123

resistentestratamiento 24h

Genes sobreexpreados en tratamientos cortos y en células HT29 resistentes al Metotrexato

CELL CYCLE - cell division prote in kinase 5 (CDK5) - NEDD5 protein homologONCOGENES AND TUMOR SUPRESSORS - metastasis suppressor kangai 1; - shb proto-oncogene - c-myc purine-b inding tr anscription factor puf

DNA RECOMBINATION AND RE PAIR - proliferat ing cyclic nuclear ant igen (PCNA); INTRACE LLULAR TRANSDU CER - B-cell recepto r-associated p rotein (hBAP)TRANS LATION - elongation factor 1 alpha (EF1 alpha)POST-TRANSCR IPT IONAL MODIFICAT ION - progesterone receptor-associated P48 protein

SYNTHESIS

Genes infraexpreados en tratamientos cortos y en células resistentes al Mtx

27 genes infraexpresados

11 28 73

1073

resistentestratamiento 24h

APOPTOSIS ASSOCIATED PROTEINS - tumor necrosis factor receptor (TNFR) + TNFR2 - CD40 receptor-associated factor 1 (CRAF1)CELL SIGNALING - transforming growth factor-beta (TGF-beta; TGFB) - B-cell growth factor 1 precursor (BCGF1) - SCGF-beta - CXC chemokine precursor - chemokine LEC precursorCYTOSKELETON MOTILITY PROTEIN

- growth-arrest-specific protein 2 (GAS2)- vimentin (VIM)

ONCOGENES AND TUMOR SUPRESSORS - tre2 protein-oncogene - myelodysplasia/myeloid leukemia factor 2 (MLF2)TRANSCRIPTION - early growth response protein 1 (hEGR1)CELL RECEPTOR - muscarinic acetylcholine receptor M4 (CHRM4)INTRACELLULAR TRANSDUCERS - calvasculin; S100 calcium-binding protein A4 - serine/threonine-protein kinase PCTAIRE 3 (PCTK3) - casein kinase I gamma 2 (CKI-gamma 2) - HRSPROTEIN TURNOVER - placental plasminogen activator inhib2 (PAI-2; PLANH2) - endothelial plasminogen activ inhib1 prec (PAI1; PLANH1) - protein C inhibitor (PROCI; PCI) - matrix metalloproteinase 15 (MMP15) - matrix metalloproteinase 16 precursor (MMP16) - matrix metalloproteinase 9 (MMP9)EXTRACELLULAR MATRIX PROTEINS - netrin-2 - tenascin-RFUNCTIONALLY UNCLASSIFIED - septin 2 homolog; KIAA0128 - clones 23920 & 23921 - KIAA0022 GENE

0

20

40

60

80

100

120

0 0,1 0,3 1 3

VIMENTINA TRANSFECTADA (µg)

Efecto de la sobreexpresión de Vimentina sobre la resistencia al Mtx

CÉLULAS HT29 RESISTENTES A 10-5 M MTX

SU

PE

RV

IVE

NC

IA(%

RE

SP

EC

TO

CO

NT

RO

L)

MTX 10-5 M

MTX 10-5 M+ vimentina

TIPOS DE ARRAYS REALIZADOS

• ANÁLISIS GENÓMICO DE LOS CAMBIOS DE EXPRESIÓN QUE TIENEN LUGAR EN CÉLULAS TRATADAS O RESISTENTES AL METOTREXATO.

• ANÁLISIS GENÓMICO DE LOS PROCESOS APOPTÓTICO Y ANGIOGÉNICO (MERCK-FARMA)

• ANÁLISIS GENÓMICO DE DIFERENTES ESTADIOS DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (R.Franco)

• ANÁLISIS GENÓMICO DE DROGAS HIPOLIPEMIANTES (JC Laguna)

• IDENTIFICAR POSIBLES DIANAS PARA UN TRATAMIENTOS ESPECÍFICOS EN CADA CASO.

Plataforma ABI

ABI-Arrays

Equipo ABI

Plataforma Affymetrix

Arrays de Affymetrix

Arrays fotolitográficos

Activación fotolitográfica

Ampliación Array Affymetrix

DetallesTécnica

ArrayAffymetrix

cRNA synthesis

Overview Expression Arrays

Hibridación Array Affymetrix

Detección Array Affymetrix

Tipos de Arrays de Affymetrix

Types of Genome Microarrays by Affymetrix

GeneChips Human Genome Arrays

Detector Affymetrix

Microarray Affy HGU133A.2

Pathways - Translation Factors

NODOS

INTERACCIONES BIOLÓGICAS

PathwayAssist