Applicazioni biomolecolari e genomiche per il ... · Applicazioni biomolecolari e genomiche 13...

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Biomolecular and genomic ap-proaches to vegetable crop improve-ment

Abstract. Recently, biomolecular and genomic tech-niques have experienced a tremendous development,which has enormously accelerated genetic research.This progress has expanded the application ofgenomics to non-model species of agricultural andhorticultural importance. Thus, the recent increase invegetable production worldwide can be also ascribedto the application of innovative genetic and genomictools to plant breeding. Improvements of these toolsand integration of genomics, biotechnologies andbioinformatics with conventional methods of plantbreeding is expected to further contribute to increas-ing food quality and safety and crop yields whilereducing costs and protecting the environment. Thispaper gives an overview of the most recent advancesin the development of genetic and genomic resourcesand of technological platforms available for plantbreeding, giving examples of the latest results derivingfrom their application to vegetable crops. The use ofmodern genomic and molecular genetic tools hasallowed the combination of molecular and morphologi-cal data for the identification of accessions, the analy-sis of phylogenetic relationships and the study of evo-lutionary processes and speciation. The integration ofmolecular analysis with morphological evaluation ofaccessions has been especially successful in the clas-sification of complex genera with controversial taxono-my. In some cases, previously accepted phylogeneticrelationships were not confirmed by large-scale analy-sis of germplasm collections with highly informativemolecular markers. Molecular markers are alsoextremely useful for fingerprinting, allowing unambigu-ous identification of plant genotypes. Recent develop-ments of high-throughput technological platforms forDNA marker analysis has provided large automationand cost containment, making traceability and geneticidentity certification of vegetable genotypes feasiblethroughout the food chain. This application is espe-

cially relevant for the commercial valorisation of thesuperior quality of Italian vegetable crops and theirproducts and for addressing consumer concerns forfood safety and quality. Many high-density geneticand physical maps have been recently developed forvegetable species, together with other genomic plat-forms such as EST data bases, saturated or nearly-saturated mutant collections, microarrays and bioin-formatic tools. This wealth of resources for structuraland functional genomics finds its application in evolu-tionary studies, identification of genes responsible ofphenotypic variation, genomic sequencing etc. and ingeneral in genetic improvement of the species forwhich they were developed, but are also invaluablefor related species. The above genomic approachesare allowing the identif ication of genes andQuantitative Trait Loci responsible for relevant traitsand their localisation on high-density genetic maps.Hence, selection of improved genotypes is now possi-ble with an unprecedented efficiency through markerassisted breeding. The exploitation of the very largenumber of favourable alleles identified through genet-ics and genomics is often hindered by reproductivebarriers. Examples are given of modern biotechnologytools for overcoming these barriers, increasing geneticvariability and producing new improved varieties.Case studies are presented of the integration of con-ventional breeding with biomolecular technologies andgenomics for the improvement of vegetable crops forimportant traits. The tremendous progress of genomictechnologies holds premises for the large scale appli-cation of genomics-assisted breeding in a near future.

Key words: structural and functional genomics;genetic diversity; marker assisted selection; plantbreeding; genomic and genetic engineering.

Introduzione

Le specie ortive rivestono un ruolo fondamentalenella bilancia economica dell’agricoltura italiana,nonostante gli ultimi dati disponibili abbiano registra-to un calo delle produzioni di circa il 10% nel periodo

Review n. 11 - Italus Hortus 17 (1), 2010: 11-31

Applicazioni biomolecolari e genomiche per il miglioramento delle pianteortive

Marina Tucci1, Monica De Palma1 e Luigi Monti2*

1 CNR - Istituto di Genetica Vegetale, via Università 133, 80055 Portici (NA)2 Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta, dell’Ambiente e delle Produzioni Animali, Universitàdi Napoli “Federico II”, via Università 100, 80055 Portici (NA)

Ricezione: 7 novembre 2009; Accettazione: 8 gennaio 2010

* [email protected]

Tucci et al.

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2004-2007 (dati FAO, http://faostat.fao.org).Tuttavia, questo dato risulta in controtendenza rispet-to a quanto accade a livello mondiale, in cui la produ-zione orticola ha subito un costante incremento (datiFAO, http://faostat.fao.org), grazie anche ai progressidel miglioramento genetico, basato sia sulle metodo-logie classiche sia su innovative metodologie biomo-lecolari e genomiche.

La disponibilità di strumenti genetici e genomiciavanzati sta consentendo con sempre maggiore effica-cia il raggiungimento di ulteriori miglioramenti dellaproduzione orticola in termini di quantità e qualità(agronomica, organolettica, edonistica, salutistica,industriale, ecc.), di sicurezza alimentare e ambienta-le, nonché di resistenza ai patogeni ed alle avversitàambientali. Nell’ambito delle specie ortive, moltorecentemente è stato completato il sequenziamentodel genoma della patata da parte del Potato GenomeSequencing Consortium (PGSC) (http://www.potato-genome.net), mentre il progetto internazionale disequenziamento del pomodoro è in uno stadio moltoavanzato (Mueller et al., 2005; http://www.sgn.cor-nell.edu). Sono inoltre in corso progetti di sequenzia-mento di specie rappresentative di altre importantifamiglie, quali le Brassicacee (International Brassicarapa Genome Project, http://brassica.bbsrc.ac.uk/) e leAsteracee (http://compositdb.ucdavis.edu).

Lo sviluppo di strumenti e piattaforme genetiche egenomiche in specie non modello risulterà particolar-mente utile per quei caratteri che non trovano corri-spondenza nelle specie modello quali Arabidopsisthaliana, ma che sono di fondamentale importanzaper le specie agrarie (es. maturazione frutti carnosi,sviluppo di tessuti vegetativi quali i turioni di aspara-go, sviluppo di radici carnose, tipo carota e ravanello,o di bulbi, tuberi e rizomi, tipo aglio, cipolla, patata,ecc.).

Obiettivi finali sono: associare le informazionigenomiche al fenotipo; combinare, integrare, organiz-zare e rendere facilmente accessibili i dati provenientida diverse discipline e da diverse metodologie “omi-che” ed infine utilizzare le informazioni per il miglio-ramento genetico delle specie orticole e, più in gene-rale, delle specie agrarie.

Di seguito sono riportati i principali contributi chela biologia molecolare e la genomica stanno dandonei diversi settori della genetica e del miglioramentogenetico delle specie ortive.

Analisi della diversità genetica

Lo studio della diversità genetica è stato da semprecentrale al miglioramento genetico delle specie colti-

vate, in quanto consente: i) l’analisi della variabilitàgenetica intracultivar e l’identificazione in manieranon ambigua ai fini della protezione varietale; ii) l’i-dentificazione di combinazioni di parentali in grado ditrasmettere il massimo della variabilità genetica alleprogenie segreganti da sottoporre a successiva sele-zione; iii) l’introgressione di geni utili dal germopla-sma disponibile alle specie coltivate; iv) la ricostru-zione della storia evolutiva e del processo di domesti-cazione delle specie coltivate; v) la definizione delledistanze genetiche tra specie. Inoltre, permette la clas-sificazione affidabile delle accessioni presenti nellecollezioni di germoplasma e l’identificazione di sot-toinsiemi di core accessions, utili per specifici obietti-vi di miglioramento genetico.

I moderni strumenti della genetica molecolare edella genomica hanno grandemente contribuito aglistudi sulla diversità genetica, permettendo di affianca-re, alle tipologie di dati tradizionalmente usate, quali idati morfologici, biochimici (isoenzimi, proteine diriserva dei semi ecc.), di pedigree ecc., quelli dei mar-catori molecolari del DNA, estremamente informativiin quanto la variabilità a livello del DNA è moltomaggiore rispetto a quella presente nei prodotti geni-ci, poiché le variazioni di sequenza non sono ristrettealle zone codificanti ma possono essere localizzate inqualsiasi parte del genoma. I marcatori molecolaripermettono dunque di studiare la variabilità geneticadirettamente a livello del DNA, indipendentementedallo stadio di sviluppo della pianta e dall’ambiente dicoltivazione (Tanskley, 1983), e possono attualmenteessere prodotti in numero molto elevato ed a costirelativamente bassi, sfruttando i nuovi sistemi auto-matizzati per analisi ad alta processività. La combina-zione di dati morfologici e di dati molecolari consentedi identificare e classificare correttamente le accessio-ni, di chiarire le relazioni filogenetiche, di compren-dere i processi evolutivi e la speciazione e di indivi-duare le accessioni selvatiche più interessanti perintrogredire geni utili nelle specie coltivate (Monti,2008).

Lo studio della variazione genetica naturale a livel-lo molecolare ha permesso in molti casi di chiarire ideterminanti molecolari da cui dipende la variabilitàfenotipica osservata, consentendo inoltre, attraversoapprocci basati sulle mappe genetiche, l’isolamento dinuovi geni e QTL (Quantitative Trait Loci, geni checontrollano caratteri quantitativi) (Shindo et al., 2007)(fig. 1). La caratterizzazione molecolare della variabi-lità esistente permette di comprendere in che modo laselezione naturale operi sui geni che determinano lavariabilità fenotipica osservata. Analisi di questo tipohanno riguardato il significato evolutivo di varianti

Applicazioni biomolecolari e genomiche

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geniche responsabili di caratteri potenzialmenteimportanti per l’adattamento delle piante all’ambiente,quali la resistenza a malattie e l’epoca di fioritura.Studi basati sulla posizione nella mappa di pomodorodi un QTL per la dimensione del frutto hanno consen-tito di isolare fw2.2, un gene chiave nell’evoluzionedella dimensione del frutto durante la domesticazionedel pomodoro (Frary et al., 2000).

Anche le relazioni filogenetiche intra- ed inter-spe-cifiche possono essere studiate con metodi molecolari,a supporto delle classificazioni ottenute attraversoanalisi di altri tipi di dati, benché i marcatori moleco-lari possano rivelarsi talvolta poco affidabili nello sta-bilire le relazioni interspecifiche, a causa del fenome-no dell’omoplasmia.

In pomodoro, l’utilizzo di dati molecolari e morfo-logici ha permesso di caratterizzare una collezione digermoplasma di S. lycopersicum, S. lycopersicum varcerasiforme e S. pimpinellifolium, arricchita conaccessioni di altre specie selvatiche (S. chesmaniae, S.habrochaites, S. pennelli e S. chmielewskii), e di iden-tificare, al suo interno, diverse core collections cheinglobano gran parte della variabilità genetica emorfologica presente (Ranc et al., 2008). Tali corecollections possono essere utilizzate come popolazionistandardizzate per identificare nuovi geni o SNPs(Single Nucleotide Polymorphisms, variazioni disequenza relative ad un singolo nucleotide) ed eviden-ziare associazioni dirette tra fenotipo e frequenze alle-

liche; per il sequenziamento rapido; per studi di geno-mica evolutiva ecc.

I marcatori molecolari risultano particolarmenteutili per la classificazione di generi molto complessie la cui tassonomia è controversa. Ad esempio, ilgenere Allium mostra una notevole variabilità perdiversi caratteri morfologici (es. tipo di organo diriserva e di propagazione) e citogenetici (numerocromosomico, livello di ploidia, dimensione delgenoma), che ne complica la classificazione.Tuttavia, l’impiego dei marcatori molecolari ha per-messo una corretta definizione delle distanze filoge-netiche in un’ampia collezione di Allium, rappresen-tativa dei tre sottogeneri maggiori (Allium,Amerallium e Rhizirideum) (Ricroch et al., 2005),sostanzialmente confermando precedenti analisi diquesto genere (Mes et al., 1999; Friesen et al., 1999e 2000; Fritsch e Friesen, 2002) e dimostrando inol-tre che, nel corso dell’evoluzione, la dimensione delgenoma all’interno del genere tende a diminuire eche il bulbo ha un’origine ancestrale come organo diriserva, mentre le specie rizomatose si sono evolutesuccessivamente (Ricroch et al., 2005).

Anche il genere Solanum presenta una notevolecomplessità tassonomica, anche a causa della suagrande capacità di speciazione, tanto che le specie chelo compongono rappresentano circa l’1% delleAngiosperme. La melanzana è una delle pocheSolanaceae coltivate endemiche del Vecchio Mondo,

Fig. 1 - Schematizzazione delle metodologie per l’analisi della variazione naturale. Oltre all’analisi genetica convenzionale con le lineestandard di laboratorio, si prevede che analisi genetiche di accessioni naturali permetteranno la valutazione del significato evolutivo di un

certo gene (modificata da Shindo et al., 2007).Fig. 1 - Schematic methodologies for analysing natural variation. Besides conventional genetic analysis with laboratory standard lines,

genetic analyses of natural accessions are expected to allow the evaluation of the evolutionary significance of a given gene (adapted fromShindo et al., 2007).

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derivando probabilmente dalla specie africana S.incanum, anche se il centro di domesticazione e didiversità genetica si trova nella regione dell’Indo-Burma e le linee indiane di S. incanum sono diverseda quelle Africane e Mediorientali (Lester e Hasan,1991). La filogenesi del “complesso melanzana”basata su differenze morfologiche, incrociabilità efertilità degli ibridi (Baksh, 1979; Lester e Hasan,1991) presenta alcuni aspetti poco chiari, complicatidall’ampia variabilità morfologica esistente e dal fattoche S. melongena può essere incrociata anche conspecie imparentate alla lontana (Daunay et al., 1991).La combinazione dei dati disponibili con dati di mar-catori molecolari basati sull’amplificazione di poli-morfismi di lunghezza, come gli AFLP (AmplifiedFragment Length Polymorphisms), confermando inparte la variabilità morfologica osservata, si è rivelatain grado di chiarire molti dubbi sulla filogenesi del“complesso melanzana”, stabilendo distanze geneti-che tra accessioni, rettificando alcuni casi di mancatao erronea classificazione e distinguendo tra formedomesticate e selvatiche di S. melongena (Furini eWunder, 2004), mentre i marcatori isoenzimatici e iRAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), basatisull’amplificazione casuale di frammenti di DNA,sono risultati meno informativi (Karihaloo e Gottlieb,1995; Karihaloo et al., 1995). Inoltre, le analisi mole-colari hanno permesso di confermare che la diversitàgenetica all’interno della specie coltivata S. melonge-na è abbastanza ridotta, come nelle altre Solanacee(Furini e Wunder, 2004; Stàgel et al., 2008), maanche di evidenziare una certa flessibilità genomicaall’interno del “complesso melanzana” (Furini eWunder, 2004; Stàgel et al., 2008), che potrebbe esse-re sfruttata come fonte di geni utili per il migliora-mento genetico della melanzana coltivata.

In altri casi, i dati di marcatori molecolari hannoconfutato precedenti classificazioni basate su datimorfologici e di pedigree. Ad esempio, sempre per ilgenere Solanum, una recente analisi filogeneticamediante marcatori AFLP di un’ampia collezione digermoplasma della sezione Petota, rappresentativa dipiù di 190 tra specie, sottospecie e ibridi, ha dimo-strato che la maggior parte delle 21 serie in cui lasezione Petota è suddivisa in base alla tassonomiaclassica (Hawkes, 1990) non sono confermate daidati molecolari (Jacobs et al., 2008). Inoltre, ancheuna precedente classificazione in solo 4 raggruppa-menti, basata sull’analisi molecolare di una collezio-ne di dimensioni più ridotte (Spooner e Castillo,1997), non è confermata da analisi di più vasto respi-ro, che invece suggeriscono una classificazione in 10gruppi “informali” di specie (Jacobs et al., 2008), in

considerazione della difficoltà a riconoscere unastruttura genetica all’interno della sezione Petota.Ciò dipenderebbe dal fatto che la larga maggioranzadelle specie, e particolarmente quelle sudamericane,sono ugualmente imparentate tra loro (Jacobs et al.,2008), probabilmente a causa della rapida diffusionedelle specie tuberizzanti di Solanum in tutto il SudAmerica e dell’elevato tasso di ibridazione interspe-cifica.

In effetti, le specie vegetali possono contribuire inmaniera determinante alla comprensione delle basigenetiche ed ecologiche della speciazione, che in que-sti organismi è molto elevata ed è avvenuta in granparte in tempi relativamente recenti, tanto che ladiversità delle specie vegetali è seconda solo a quelladegli insetti. Inoltre, la possibilità di condurre studi digenomica anche su specie vegetali non modello stacontribuendo fortemente al chiarimento dei meccani-smi attraverso i quali opera la selezione, facilitandoinoltre l’identificazione di geni responsabili delle bar-riere riproduttive (Zhang e Ge, 2007; Städler et al.,2005; Ramos-Onsins et al., 2004).

Le specie selvatiche di pomodoro rappresentanoun modello adatto allo studio della speciazione, consi-derando che anche per il genere Solanum sezioneLycopersicon numerosi studi hanno rivelato bassilivelli di differenziazione tra le specie e quindi unarecente divergenza all’interno della sezione (Miller eTanskley, 1990; Baudry et al., 2001; Peralta eSpooner, 2001). Infatti, uno studio multilocus su vastascala di accessioni di S. peruvianum e S. chilense, rac-colte in diverse aree del Cile e del Perù, ha dimostratoche la separazione tra le due specie è avvenuta intempi relativamente recenti (0,55 milioni di anni fa)attraverso un meccanismo di speciazione non peripa-trico (Städler et al., 2008). La speciazione è stataaccompagnata da un rafforzamento delle barriereriproduttive, tanto che la maggior parte delle accessio-ni di S. peruvianum sono isolate da S. chilense da bar-riere post-zigotiche molto forti (Rick 1986).

C’è comunque da sottolineare che i frequenti casidi ibridazione interspecifica (Arnold, 1997) e la diffi-coltà ad assortire in maniera chiara in categoriediscrete la variazione fenotipica in alcuni gruppi vege-tali (Mishler e Donoghue, 1982) hanno portato alcunibotanici ad esprimere addirittura dubbi che esistanospecie vegetali in senso propriamente detto.

Sempre in pomodoro, l’analisi molecolare median-te marcatori SSR (Simple Sequence Repeats, basatisull’amplificazione di brevi sequenze ripetute) ha con-sentito di dimostrare che il processo di domesticazio-ne è passato attraverso una serie di ibridazioni tra S.lycopersicum e S. pimpinellifolium, da cui si è evoluta


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S. lycopersicum var cerasiforme, una sottospecie afrutto rosso considerata il progenitore delle forme col-tivate (Ranc et al., 2008). I risultati suggeriscono inol-tre una selezione in due tempi per la dimensione delfrutto durante la domesticazione del pomodoro da S.pimpinellifolium a S. lycopersicum. Il primo passo hariguardato la selezione per una dimensione media delfrutto, accompagnata probabilmente dalla fissazionedell’autogamia, seguita dalla selezione per frutti piùgrandi, avvenuta successivamente alla diffusione delpomodoro coltivato dalle Ande all’America Centrale aseguito delle migrazioni umane (Ranc et al., 2008).

La caratterizzazione molecolare di una collezionedi accessioni della specie Cynara cardunculus L., cheinclude il carciofo (var. scolymus L.), il cardo coltiva-to (var. altilis D.C.) ed il cardo selvatico [var. sylve-stris (Lamk) Fiori], ha permesso di evidenziare che ilcarciofo è geneticamente più vicino al cardo selvaticoche al cardo coltivato, e di concludere che la domesti-cazione del carciofo è avvenuta ai tempi dei Romaniforse in Sicilia, mentre quella del cardo si è avuta solosuccessivamente, nel nord del Mediterraneo(Sonnante et al., 2008). Tale ipotesi è stata conferma-ta da uno studio su landraces reperite in orti sicilianimediante caratterizzazione con marcatori AFLP emicrosatelliti, che ha evidenziato come questi mate-riali rappresentino forme di transizione nel processodi domesticazione del carciofo (Mauro et al., 2009).

Identificazione e caratterizzazione varietale a livel-lo molecolare

Il crescente interesse dei consumatori per prodotticon elevati standard qualitativi, con particolare riferi-mento alle caratteristiche organolettiche ed alla pre-senza di componenti con attività nutrizionale (macro emicronutrienti) e funzionale (es. carotenoidi, glucosi-nolati, fitoestrogeni, polifenoli, oligosaccaridi ecc.), equindi la necessità di differenziare l’offerta e miglio-rare la qualità globale dei prodotti, hanno rinnovatol’attenzione verso prodotti tipici e varietà vegetalilocali, generalmente dotati di caratteristiche organo-lettiche intense e peculiari e spesso più ricchi disostanze utili per la salute ed il benessere dei consu-matori rispetto ai prodotti ed alle varietà commerciali.

Ciò ha anche stimolato un’intensa attività di ricer-ca, volta soprattutto alla valorizzazione ed alla salva-guardia dei prodotti tipici e delle varietà vegetali loca-li impiegate nella loro produzione. Tra le applicazionidelle moderne tecnologie biomolecolari e genomiche,molto utile a questo scopo risulta essere il fingerprin-ting molecolare, che consente di identificare univoca-mente un genotipo attraverso l’uso di marcatori del

DNA, in maniera indipendente dallo stadio di svilup-po della pianta e dai fattori ambientali. Inoltre, il poli-morfismo dei marcatori molecolari può essere rilevatoanche a partire da matrici alimentari complesse e checontengono spesso DNA frammentato o danneggiatoa causa dei processi produttivi industriali a cui sonosottoposte (Martinez et al., 2003). Il fingerprintingmolecolare, anche grazie allo sviluppo di piattaformetecnologiche ad alta processività per l’analisi di mar-catori del DNA, che lo sta rendendo altamente auto-matizzabile e pertanto applicabile su scala sempre piùampia ed a costi relativamente accessibili, trova utiliz-zo nel supporto tecnologico innovativo offerto aicostitutori varietali, alle industrie sementiere ed alleistituzioni preposte alla conservazione e caratterizza-zione del germoplasma, nonché nella tracciabilità ecertificazione dell’identità genetica di varietà ortivenell’intera filiera agro-alimentare, dalle materie primein entrata agli alimenti in uscita, a garanzia della pro-venienza, qualità e salubrità dei prodotti. Quest’ultimaapplicazione, in particolare, è di notevole utilità per lavalorizzazione dell’estrema ricchezza di prodotti tipiciad alta qualità che caratterizza l’orticoltura italiana(Caramante et al., 2008).

Recentemente, su queste tematiche sono stati svi-luppati in Italia due progetti di ricerca di ampio respi-ro, di cui uno finanziato dal MIUR (Sviluppo eCaratterizzazione delle RIsorse Genetiche Native inOrtoflorofrutticoltura, SCRIGNO) ed uno finanziatocongiuntamente dal MiPAF e dal MIUR(Valorizzazione di germoplasma orticolo italiano).Nell’ambito di tali progetti sono state collezionate ecaratterizzate dal punto di vista morfologico, produtti-vo, biochimico e genetico-molecolare circa 500 acces-sioni di specie orticole (aglio, asparago, cavolfiore,cipolla, fagiolo, melanzana, melone d’inverno, pepe-rone, pomodoro e radicchio). Inoltre, è stata studiataapprofonditamente l’entità e la distribuzione dellavariabilità genetica esistente, l’origine varietale, larintracciabilità ed inoltre i meccanismi biochimici emolecolari responsabili della tipicità e della qualitàorganolettica e funzionale dei prodotti, partendo dallericche collezioni di germoplasma di varie specie(agrumi, carciofo, ciliegio, fagiolo, nocciolo, pescoecc.) che molte delle maggiori istituzioni di ricercaitaliane mantengono sia in situ che ex situ. In partico-lare, nell’ambito del progetto SCRIGNO, sono statimessi a punto marcatori molecolari in grado di identi-ficare univocamente quasi 240 varietà locali o acces-sioni e sono stati caratterizzati i principali parametribiochimici di alcune specie orticole (http://www.pnra-grobio.unina.it/SCRIGNO.html) (tab.1).

Relativamente alla tracciabilità genetica dei mate-

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riali vegetali nelle filiere agro-alimentari, dal prodottofresco al prodotto finito, i marcatori che si sono dimo-strati più adatti sono gli SSR e gli SNP, che sono ingrado di rilevare polimorfismi anche in presenza di unelevato grado di degradazione, quale quello che siriscontra nel DNA che si estrae dal prodotto lavorato,danneggiato dai processi produttivi. Infatti, prove diamplificazione di alleli SSR di piccole dimensioni apartire da DNA estratto da foglia, bacca e prodottoprocessato di una filiera mono-varietale di pomodoropelato hanno evidenziato una completa corrisponden-za (Rao et al., 2009), confermando che i marcatoriSSR rappresentano una metodica sicura e rapida perl’accertamento dell’identità genetica dei materialipresenti nei vari segmenti della filiera agro-alimentaree, conseguentemente, per la tutela sia dei consumatorisia dei produttori attraverso la protezione dei marchidi qualità. Gli strumenti di genetica e genomica vege-tale potrebbero addirittura evolversi a tal punto daoffrire, in un futuro non troppo lontano, la possibilitàdi seguire, nei diversi segmenti della filiera, diretta-mente i geni che determinano la qualità di un prodot-to, ad esempio quelli responsabili delle qualità orga-nolettiche o della produzione di metaboliti beneficiper l’uomo (Rao et al., 2009).

Costruzione di mappe ad alta definizione e geno-mica comparativa

I recenti notevoli progressi della genetica moleco-lare e della genomica stanno contribuendo in manierasostanziale all’identificazione di geni, alla loro carat-terizzazione dal punto di vista strutturale ed alla com-prensione della loro funzione (genomica funzionale),rendendo così disponibili per il miglioramento geneti-

co un numero prima inimmaginabile di alleli favore-voli di geni fondamentali per la crescita, lo sviluppo,le caratteristiche di interesse agronomico ecc., dellepiante coltivate. Tali progressi hanno aperto la stradaall’utilizzo di specie più lontane come fonte di geniutili per ampliare la variabilità genetica utilizzabiledal miglioramento genetico, oltre a identificare genifavorevoli in organismi diversi ed a rendere più effi-cace la progettazione e la creazione di geni artificialicon caratteristiche ottimali (Monti, 2008). Ciò appor-terà notevoli contributi al miglioramento geneticodelle specie coltivate, grazie allo sfruttamento delleresistenze genetiche alle avversità ambientali di tipobiotico ed abiotico e dei caratteri di interesse agrono-mico e qualitativo, anche non manifesti, disponibilinei loro gene pools secondari.

La definizione di mappe di associazione risulta diestrema utilità per la comprensione della struttura edella funzione dei genomi, oltre ad accelerare lo svi-luppo della genomica comparativa, ovvero dello stu-dio della relazioni tra specie o genotipi differenti intermini di struttura e funzione del genoma. Inoltre,rappresenta un contributo fondamentale per i progettidi sequenziamento genomico, facilitando la scelta deicloni BAC (Bacterial Artificial Chromosome, vettoriidonei per il clonaggio di lunghe sequenze di DNA),contenenti le porzioni di genoma da sequenziare, el’assemblaggio delle sequenze genomiche.

Anche nelle piante da orto l’analisi genomica dispecie selvatiche ha consentito l’identificazione diregioni genomiche contenenti alleli favorevoli di QTLper importanti caratteri agronomici (Grandillo et al.,2008; Zamir, 2008) e, conseguentemente, il clonaggioposizionale dei primi geni rilevanti per caratteri quan-titativi (Frary et al., 2000; Fridman et al., 2000) e l’ot-

Asparagus acutifolius,A. officinalisCynara scolymus

Phaseolus coccineusPhaseolus vulgarisSolanum lycopersicum

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42

545078

Specie Marcatori molecolari Parametri biochimici

Proteine solubili; proteine dei semi

Proteine del seme; fattori antinutrizionaliProteine del seme (faseoline)Carotenoidi, tocoferoli, flavonoidi; attivitàantiossidante; saponine steroidali

RAPDISSR*, SSRAFLP, ISSR

AFLPAFLP, RAPD, ISSRSSR, AFLP, TBP**

TBP; SSR

N. varietà locali/accessioni

Metodo di caratterizzazione

Tab. 1 - Risultati della caratterizzazione genetico-molecolare e biochimica effettuata su varietà locali di diverse specie ortofrutticoleitaliane, ottenuti nell’ambito del progetto SCRIGNO (MIUR).

Tab. 1 - Results of the molecular and biochemical characterisation of several Italian local varieties and accessions of vegetable cropscarried out in the framework of the SCRIGNO Research Project (MIUR).

* ISSR (Inter Simple Sequence Repeats, marcatori basati sull’amplificazione di regioni genomiche comprese tra sequenze microsatelliteripetute e invertite);**TBP (Tubulin-Based Polymorphism, marcatori basati sul polimorfismo degli introni dei geni della β-tubulina).


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tenimento delle prime varietà migliorate (Zamir,2008).

In melone, la creazione di una mappa genetica adalta risoluzione ha permesso l’identificazione e l’an-coraggio alla mappa di un clone BAC contenente l’al-lele recessivo g, responsabile dello sviluppo di fiorifemminili anziché maschili sull’asse primario in lineemonoiche. Il sequenziamento di tale BAC e l’analisidi una popolazione segregante molto ampia ha evi-denziato che la transizione da fiori maschili a fiorifemminili è determinata da un controllo epigeneticodell’espressione del gene CmWIP1, che codifica perun fattore di trascrizione, che risulta essere ipermetila-to a causa della presenza di un trasposone (Martin etal., 2009). Il ruolo del gene CmWIP1 è stato ancheconfermato attraverso un approccio TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes), unametodologia di genetica inversa basata sulla costitu-zione di popolazioni di mutanti attraverso mutagenesichimica su larga scala con EMS (Ethylmethanesulfo-nate). Lo screening della popolazione di mutanti otte-nuta ha dimostrato che tutte le linee che presentavanofiori femminili sull’asse primario erano mutate nellaporzione codificante del gene CmWIP1, dimostrandoche questo gene è responsabile della determinazionedel sesso in melone (Martin et al., 2009).Analogamente, la definizione di due mappe di asso-ciazione di carciofo (Cynara cardunculus var. scoly-mus L. 2n=2x=34), basate sull’impiego di diversimarcatori molecolari come AFLP, S-SAP (Sequence-Specific Amplification Polymorphism, basati sul poli-morfismo di retrasposoni), M-AFLP (Microsaltellite-AFLP, basati sui microsatelliti) e microsatelliti rap-presenta il primo gradino per l’identificazione di QTLdi interesse agronomico per tale ortiva e per il loroimpiego nel miglioramento genetico assistito per que-sta specie (Portis et al., 2009; Lanteri et al., 2006).

Come parte del progetto internazionale di sequenzia-mento della Brassica rapa (http://brassica.bbsrc.ac.uk/),selezionata come specie modello in rappresentanza delgenoma “A” di Brassica, è stata recentemente sviluppa-ta la prima mappa fisica completa dell’intero genoma“A”, che è stata poi ancorata a loci cromosomici attra-verso marcatori genetici (Mun et al., 2008).L’integrazione della mappa fisica con una preesistentemappa genetica ha permesso di posizionare 242 contig(cloni contigui e sovrapposti), ricchi di sequenze codifi-canti, in 10 gruppi di linkage, fornendo degli utilissimipunti di partenza (seeds) per il progetto di sequenzia-mento. La disponibilità di una mappa fisica potrà ancheaccelerare lo sviluppo della genomica comparativa inBrassica attraverso i dati che si stanno ottenendo per B.oleracea, specie modello per il genoma “C”

(Kaczmarek et al., 2009).In realtà, la genomica comparativa sta sperimen-

tando in questi anni un tumultuoso sviluppo, grazieanche alle nuove tecniche di sequenziamento, all’au-tomazione ed allo sviluppo di sistemi bioinformaticidi analisi dei dati sempre più sofisticati ed efficienti,che promettono di accelerare fortemente la compren-sione dell’evoluzione dei genomi. I progressi ottenutisono da considerare estremamente promettenti perl’ampliamento delle conoscenze in specie attualmentemeno studiate attraverso approcci “omici”, ma chetuttavia possono, attraverso la genomica comparativa,beneficiare delle risorse genetiche e genomiche messea punto per altre specie affini, quali quelle derivantidal sequenziamento genomico di varie specie vegetalie dalle vaste banche dati di sequenze disponibili, chepossono così rappresentare una piattaforma per laricerca genetica di base ed applicata in specie menocaratterizzate. Studi di sintenia e microsintenia con-sentono anche di ottenere indicazioni circa le speciemodello più idonee a fare da riferimento per unadeterminata specie coltivata. Ad esempio, studi digenomica comparativa hanno dimostrato che pomodo-ro e patata posseggono un basso livello di microsinte-nia con la specie modello A. thaliana, mentre lamicrosintenia è maggiore con un’altra specie modello,Populus trichocarpa, una differenza che non sembradipendere dall’effettiva distanza evolutiva, dato chequeste ultime appartengono entrambe alla sottoclassedelle Rosidae, mentre pomodoro e patata appartengo-no alle Asteridae (Datema et al., 2008).

Tra le ortive, il pomodoro è senz’altro la specie perla quale sono disponibili le maggiori risorse e piattafor-me genetiche e genomiche. Oltre ai poderosi sforziinternazionali per i progetti di sequenziamento del geno-ma (Mueller et al., 2005; http://www.potatoge-nome.net), molte ricerche si sono concentrate negli annisu questa specie, portando allo sviluppo di ampie colle-zioni di marcatori molecolari, di mappe genetiche e fisi-che ad alta densità, di mappe di associazione, di mappecitologiche e citogenetiche e di ampie collezioni disequenze geniche espresse (EST, Expressed SequenceTag) (Barone et al., 2008). Inoltre, sono disponibilinumerose collezioni, di cui alcune probabilmente sature,di mutanti naturali (http://tgrc.ucdavis.edu/) e indotti tra-mite mutagenesi inserzionale (Lozano Ruiz et al., 2008)e chimica (http: //zamr.sgn.cornell.edu/mutants), oltread ampie popolazioni di TILLING (http://www.agro-bios.it/tilling/). Infine, sono state sviluppate piattaformemicroarray con diverse tecnologie (TOM1 e TOM2,http://bti.cornell. edu/CGEP/CGEP.html; GeneChipTomato Genome Array, http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/tomato.affxspecific/tomato.aff;

Tucci et al.

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Custom Tomato Gene Expression Microarray, Agilenthttp://www. chem.agilent.com/en-US/Products/Instruments/dnamicroarrays/tomatooligomicroarraykit/;Tomato Array 1.0, COMBIMATRIX, http://ddlab.sci.univr.it/Functional Genomics/datasheets/toma-to1.0.html) e piattaforme bioinformatiche per la consul-tazione e l’elaborazione dei dati (Chiusano et al., 2008;Barone et al., 2008).

Anche grazie alle informazioni disponibili per ilpomodoro, la ricerca genomica sta progredendo velo-cemente pure in altre Solanacee. In melanzana, sonostate recentemente sviluppate ampie collezioni dimarcatori SSR sulla base di sequenze sia genomicheche espresse (marcatori funzionali EST-SSR), validatiper analisi di mappa e studi di filogenesi e per la lorotrasferibilità ad altre Solanacee (Stàgel et al., 2008;Nunome et al., 2009), che hanno permesso la costru-zione di una mappa di associazione (Nunome et al.,2009). Sempre in melanzana, utilizzando marcatorimolecolari mappati sia direttamente sia grazie allasintenia tra questa specie e il pomodoro, è stata svi-luppata una mappa genetica, arricchendone una pre-cedente, basata su marcatori derivati da pomodoro(Doganlar et al., 2002), con marcatori mappati siadirettamente sia indirettamente in base alla loro posi-zione sulla mappa di pomodoro (Wu et al., 2009b).Lo stesso gruppo di ricerca, utilizzando un approccioanalogo, ha recentemente sviluppato la prima mappagenetica completa di peperone (Wu et al., 2009a), cheper la prima volta ha reso possibile l’assemblaggio di12 gruppi di associazione, corrispondenti ai 12 cro-mosomi della specie, al contrario delle mappe geneti-che precedentemente disponibili (Barchi et al., 2007;Minamiyama et al., 2006, Paran et al., 2004; Kang etal., 2001; Livingstone et al., 1999). Le analisi detta-gliate di sintenia rese possibili dalla disponibilità dimappe genetiche hanno consentito di sviluppare unnuovo modello per spiegare il peculiare cariotipodelle forme coltivate di Capsicum annuum rispetto aquello comune alle forme selvatiche della stessa spe-cie ed alle altre specie del genere Capsicum (Wu etal., 2009a), e di concludere, dal confronto tra melan-zana, peperone, pomodoro e patata, che il genomaancestrale era probabilmente strutturato come quellodi melanzana e peperone, mentre le maggiori ristrut-turazioni hanno riguardato il lineage di pomodoro epatata e, più recentemente, solo quello di pomodoro(Wu et al., 2009b).

La ricchezza di risorse genomiche comparativeche si stanno accumulando per le Solanacee dovrebbeulteriormente facilitare l’utilizzazione delle risorsegenetiche e genomiche disponibili non solo per studievoluzionistici, per l’identificazione di geni che deter-

minano variazioni fenotipiche e, in definitiva, per ilmiglioramento genetico di queste stesse specie, maanche per altre specie meno studiate, tanto che unodegli scopi del International Solanaceae GenomeInitiative (http://sgn.cornell.edu/solanaceae-project) èproprio quello di utilizzare le Solanacee come sistemamodello per altre specie più o meno affini.

Lo sviluppo delle conoscenze e degli strumentigenomici è stato invece molto più lento per altre spe-cie ortive, in particolare per specie con genomi moltograndi e molto complessi, come ad esempio quellidelle Monocotiledoni. Per queste ultime, il sistemamodello è rappresentato dal riso, appartenente all’or-dine delle Poales, il cui genoma è stato completamen-te sequenziato, ma che spesso non si è rivelato utileper specie monocotiledoni filogeneticamente piùdistanti, ma di grande importanza economica, qualidiverse specie ortive dell’ordine delle Asparagales(es. aglio, cipolla, asparago ecc.). Per tali specie, èstato proposto come sistema modello l’asparago, cheha un genoma relativamente più piccolo e una posi-zione filogenetica intermedia tra il riso e altre speciemonocotiledoni di interesse agronomico. Tuttavia,studi recenti hanno dimostrato un basso livello dimicrosintenia tra asparago, riso e cipolla, indicandoche l’asparago potrebbe non essere la specie modelloappropriata per altre piante delle Asparagales congenomi estremamente grandi (Jakse et al., 2006).

Miglioramento genetico mediante tecniche moleco-lari

La localizzazione di un numero sempre maggioredi geni di rilevanza economica sulle mappe geneticheattraverso la loro associazione a marcatori molecolariha fornito il miglioramento genetico di uno strumentoestremamente potente ed efficace per la rapida edaccurata selezione dei genotipi di interesse all’internodi popolazioni segreganti. Infatti, la selezione puòessere fatta direttamente a livello del DNA, attraversola determinazione della presenza di marcatori associa-ti ad alleli favorevoli, senza ricorrere a procedure diselezione basate sul fenotipo, spesso elaborate, lunghee soggette ad errori di classificazione dei genotipi. Intal modo la selezione può anche essere realizzata inuno stadio molto precoce, permettendo così di effet-tuare più cicli nel corso dell’anno, ed anche per piùcaratteri simultaneamente, accelerando grandemente ilprocesso di selezione. I vantaggi della selezione assi-stita da marcatori molecolari sono ancora più evidentiper i caratteri quantitativi, quali sono molte compo-nenti della produttività e della qualità, per i quali laselezione richiede l’analisi di un gran numero di


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genotipi. Alcuni risultati conseguiti per la mappaturadi QTL sono stati riportati in diverse specie e sono giàstate ottenute le prime varietà migliorate (Zamir,2008).

Uno dei campi in cui la selezione assistita da mar-catori molecolari (MAS) ha trovato più ampia applica-zione è il miglioramento genetico per tolleranza aipatogeni. Nel corso degli anni, numerosi geni di resi-stenza a patogeni sono stati clonati e mappati condiversi approcci. In tabella 2 sono riportate solo alcu-ne delle più recenti acquisizioni, limitatamente allepiante ortive.

In melone (Cucumis melo L.) sono stati mappati eclonati molti geni di resistenza a diverse malattie qualifusariosi, maculatura anulata (PRSV), mosaico giallo(ZYMV), maculatura necrotica (MNSV) (tab. 2). Inquesta specie, un’analisi QTL ha permesso di identifi-care due loci per la resistenza ad oidio, localizzati suigruppi di linkage II e XII, ed è stato dimostrato che glieffetti di questi QTLs dipendono dal ceppo e dallo sta-dio di sviluppo della pianta (Fukino et al., 2008).

L’analisi QTL è stata applicata anche in B. rapa(genoma A) per individuare QTLs di resistenza a duerazze di Xanthomonas campestris pv. campestris(Pammel) Dowson (Xcc) agente causale del marciume

nero, malattia molto dannosa che colpisce quasi tuttele crucifere. L’identificazione di marcatori strettamen-te legati a questi QTLs di resistenza permetterà di tra-sferire la resistenza a questa malattia in altreBrassicaceae attraverso la MAS (Soengas et al.,2007).

Per le Solanaceae, esempi recenti di identificazio-ne di marcatori molecolari associati a geni di resisten-za si possono ritrovare in melanzana (S. melongenaL.), per la quale è stato dimostrato che la resistenza alfungo Fusarium oxysporum Schlecht. f. sp. melonge-nae, che causa seri danni al sistema vascolare, è,anche in questa specie, di tipo monogenico e sonostati altresì identificati marcatori molecolari stretta-mente legati al locus del putativo gene di resistenzaFom, che potranno essere utilizzati per la MAS divarietà resistenti (Mutlu et al., 2008). Molti studi sisono poi concentrati su pomodoro (S. lycopersicum),in cui sono stati largamente identificati geni maggioridominanti o parzialmente dominanti che conferisconoresistenza specifica o verticale (Acciarri et al., 2007;Foolad, 2007; Bai et al., 2005; Langella et al., 2004;Parrella et al., 2004), utili per la MAS, mentre geniminori recessivi o complessi genici (resistenza oriz-zontale o poligenica) (Pavan et al., 2008; Parrella et

marciume nero/Xanthomonas campestris pv.campestris

fusariosi/Fusarium spp.maculatura anulata/Papaya Ring Spot Virusmosaico giallo/ZucchiniYellow Mosaic Virusmaculatura necrotica/MelonNecrotic Spot Virusoidio/Podosphaera xanthii

cancrena pedale/Phytophthora capsici

peronospora/Bremia lactucaeantracnosi/Microdochium panattoniana

radice suberosa/Rhizomonas suberifaciens

Peronospora/Peronospora farinosa f. sp. spi-naciae

Malattia/agente causale Geni / QTL Referenze

Soengas et al., 2007

Brotman et al., 2005; Joobeur et al., 2004Brotman et al., 2005Danin-Poleg et al., 2002Ling et al., 2008Morales et al., 2005

Périn et al., 2002, Perchepied et al., 2005

Thabuis et al., 2003

Zhang et al., 2009McHale et al., 2009

Moreno-Vazquez et al., 2003

Irish et al., 2008

XccR1d-1, XccR1i-1, XccR4d-1,XccR4i-1 (QTLs)

Fom-1, Fom-2PrvZymeIF4Ensv

Pm-y, PmV.1 e PmXII.1 (QTLs)

Phyt. 1, Phyt. 5.1, Phyt. 5.2, Phyt. 11.1(QTLs)

rbq4, rbq5, rbq6+11, rbq7 (QTLs)ANT2, ANT3 (QTLs)

cor

Pfs-1

B. rapa

Cucumis melo L.

Capsicum annuum

Lactuca saligna

Lactuca sativa

Spinacia oleracea

Tab. 2 - Principali geni di resistenza/QTLs a malattie identificati in diverse specie ortive.Tab. 2 - Main genes/QTLs for disease resistance identified in several vegetable crop species.

Tucci et al.

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al., 2002) sono stati utilizzati con minore successo esolo in mancanza di geni dominanti. In questa specie,la selezione assistita è ampiamente utilizzata dalleaziende sementiere per l’ottenimento di genotipi resi-stenti a stress biotici. In tabella 3 sono riportati i prin-cipali geni/QTLs identificati in diverse specie dipomodoro e trasferiti mediante MAS per la produzio-ne di linee di pomodoro più resistenti alle diversemalattie.

Tra i risultati del progetto internazionale disequenziamento su larga scala del genoma delleComposite (“The Compositae Genome Project”,http://compositdb.ucdavis.edu), sono state depositatecirca 42.000 sequenze di unigenes da Lactuca sativacv Salinas e da L. serriola (accessione n.UC96US23). Tra questi, circa 735 sono stati identifi-cati come geni candidati nelle diverse fasi di resisten-za, di cui, utilizzando un approccio basato sui marca-tori molecolari, circa 294 sono stati posizionati su unamappa di riferimento, costruita a partire da lineericombinanti derivate da incrocio interspecifico tra lacv Salinas e UC96US23. Inoltre, mediante lo stessoapproccio, sono stati mappati 36 loci di resistenza,che includono anche 2 nuovi loci per la resistenza aperonospora e due QTLs per la resistenza ad antrac-nosi (McHale et al., 2009). Sempre in lattuga, l’utiliz-zo di marcatori co-dominanti (SNPs) ha reso possibile

identificare il gene recessivo cor, in grado di conferireresistenza al patogeno Rhizomonas suberifaciens, unodei maggiori agenti responsabili della radice suberosain lattuga (Moreno-Vázquez et al., 2003).

Il costante accumulo di nuovi EST depositati nellebanche dati e la disponibilità sempre maggiore disequenze geniche note per le specie di interesse orti-colo (Riccardi et al., 2009; Dauchot et al., 2009; Kimet al., 2008; Gonzalez-Ibeas et al., 2007) consentiran-no con sempre migliore efficienza lo sviluppo dinuovi marcatori associati a geni per caratteristicheutili e soprattutto permetteranno di identificare marca-tori localizzati all’interno delle sequenze codificantiper caratteri d’interesse (marcatori “genici”). Lamessa a punto di programmi bioinformatici in gradodi identificare marcatori all’interno delle sequenzegeniche che si stanno rendendo disponibili grazie aigrandi progetti di sequenziamento migliorerà ulterior-mente l’efficienza dei programmi di selezione assisti-ta, permettendo lo sviluppo del miglioramento geneti-co assistito dalla genomica.

Oltre alla selezione positiva, i marcatori molecolarirendono anche possibile la realizzazione della selezio-ne negativa, che consente di eliminare i caratteri nondesiderati. In un programma di reincrocio, quandonon sono noti marcatori associati a caratteri utili pro-venienti da una specie selvatica, la progenie segregan-

Rcm 1.0 - Rcm 10 (QTLs)

Pto

Rx (QTLs), Bs4, Xv4

Rrs (QTLs)Blackmold (QTLs)Py-1I-2, I-3Frl

Ph-3 Lv, Ol-1, Ol-2MiSw-5Ty 1, Ty 2, Ty3, (QTLs)

Tm-2Ve1 e Ve2

Cancro batterico/Clavibacter michiganensisssp. michiganensisMacchiettatura batterica/Pseudomonas syringae pv.tomatoMaculatura batterica/Xanthomonas euvesicatoria, X.vesicatora, X. perorans, X. gardneriAvvizzimento batterico/Ralstonia solanacearumMarciume nero/Alternaria alternataRadice tuberosa/Pyrenochaeta lycopersiciFusariosi/Fusarium oxysporum f. sp. lycopersiciMarciume basale/Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersiciPeronospora/Phytophthora infestansOidio/Leveillula taurica, Oidium lycopersicumNematodi galligeni/Meloidogyne spp.Avvizzimento maculato/Tomato Spotted Wilt VirusAccartocciamento fogliare giallo/Tomato Yellow LeafCurl VirusMosaico/Tobacco Mosaic VirusVerticillosi/Verticillium dahliae

Geni / QTL Malattia/ agente causale Origine

S. peruvianum, S. habrochaites

S. pimpinellifolium

S. lycopersicum

S. lycopersicumS. cheesmaniaeS. peruvianumS. pimpinellifoliumS. peruvianum

S. pimpinellifoliumS. chilense, S. habrochaitesS. peruvianumS. peruvianumS. pimpinellifolium, S. chilense,S. habrochaitesS. peruvianumS. lycopersicum

1, 2, 5, 6, 7, 8,9, 105

1, 3, 4, 5

3, 4, 6, 7, 102, 3, 9, 12311, 79

1012, 4, 6, 1269

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Posizione cromo-somica

Tab. 3 - Principali geni di resistenza trasferiti in programmi di selezione assistita in pomodoro mediante l’ausilio di marcatori genetici(modificata da Foolad et al., 2007).

Tab. 3 - Main disease resistance genes transferred through marker assisted breeding in tomato (adapted from Foolad et al., 2007).


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te può essere selezionata negativamente sulla basedella presenza di marcatori specie-specifici per ilgenoma della specie selvatica, facilitando ed accele-rando la ricostituzione del genoma del genitore ricor-rente, e positivamente per il/i caratteri che siintende/dono trasferire. E’ noto infatti che nei materia-li derivanti da ibridazione interspecifica sono spessopresenti caratteri indesiderati. Questo fenomeno, notocome linkage drug, é essenzialmente dovuto all’asso-ciazione tra i loci che controllano i caratteri positivicon quelli che controllano caratteri negativi. A titoloesemplificativo, in patata, marcatori RAPD ed AFLPspecifici per la specie S. commersonii sono stati utiliz-zati per aumentare l’efficienza di selezione negativa inun programma di reincrocio finalizzato a trasferiregeni utili dalla specie selvatica S. commersonii a geno-tipi coltivati di S. tuberosum (Barone et al., 2001),valutando il contenuto di genoma selvatico dei genoti-pi analizzati ed eliminando i genotipi con il maggiorevalore in genoma selvatico (selezione assistita negati-va). Per aumentare l’efficienza di selezione, lo stessogruppo di ricerca ha proposto di combinare la selezio-ne negativa basata sui marcatori molecolari con laselezione positiva basata sulla determinazione di unEvaluation Index (E.I.), risultante dalla sommatoriadei punteggi attribuiti ad ogni carattere fenotipicovalutato. Gli ibridi con contenuto di genoma selvaticopiù basso del valore medio ed E.I. più alto del valoremedio sono quindi selezionati per proseguire il pro-gramma di reincrocio (Iovene et al., 2004).

Superamento delle barriere all’incrocio interspeci-fico e ingegneria genetica

Come sopra ricordato, gli enormi progressi dellagenetica, della genomica e della genomica comparati-va stanno consentendo l’identificazione di un grannumero di alleli favorevoli per l’ampliamento dellavariabilità ed il miglioramento genetico delle speciecoltivate. Tuttavia, l’utilizzazione di questo ricchissi-mo patrimonio è spesso limitata dalla presenza di bar-riere all’incrocio, che ostacolano l’impiego delle risor-se genetiche disponibili, ma che possono essere spessosuperate attraverso le moderne biotecnologie. In parti-colare, molto utili a questo riguardo risultano esserel’ibridazione somatica, l’ingegneria genomica e l’in-gegneria genetica.

La fusione somatica realizzata per la prima voltada Carlson et al. (1972), consente di ottenere ibridi alivello intraspecifico, interspecifico, intergenerico eoltre (Waara e Glimelius, 1995), attraverso la fusionedi cellule somatiche prive di parete. Gli ibridi ottenutisono quindi caratterizzati e inseriti in programmi di

reincrocio, per i quali è però necessario che ci siaricombinazione genetica tra i cromosomi dei dueparentali e che gli ibridi siano fertili.

La fusione somatica, comporta anche ristruttura-zioni e ricombinazioni del DNA tra gli organelli cellu-lari, creando nuove combinazioni nucleo-citoplasma-tiche e quindi nuova variabilità, anche se è frequente-mente accompagnata da fenomeni di instabilità geno-mica, con anomalie meiotiche e sterilità degli ibridi.La fusione somatica è risultata particolarmente effica-ce per il miglioramento genetico di specie delleSolanaceae, delle Brassicaceae e delle Rutaceae(Johnson e Veilleux, 2001). Ad esempio, la specie sel-vatica di patata S. commersonii presenta numerosicaratteri (resistenza a virus, batteri, funghi, insetti, tol-leranza al freddo e capacità di acclimatare alle bassetemperature, tolleranza al caldo, elevato peso specifi-co dei tuberi ecc.) di potenziale interesse per il miglio-ramento genetico della patata coltivata, ma è riprodut-tivamente isolata da S. tuberosum. Attraverso la fusio-ne somatica, è possibile superare le barriere all’incro-cio, ottenendo inoltre l’introgressione contemporaneadi più geni utili da S. commersonii in S. tuberosum, icui ibridi somatici, a seconda dei genotipi utilizzatiper la fusione, si sono rivelati resistenti al freddo,capaci di acclimatare alle basse temperature, tollerantigli stress ossidativi, e resistenti a malattie quali gambanera, marciume molle, marciume bruno, verticillosi,scabbia e PVX (Cardi, 2001). Ibridi somatici sonostati anche ottenuti tra la melanzana coltivata S.melongena e la specie selvatica S. aethiopicum.L’analisi genetica di una popolazione diaploide deri-vata dalla coltura di antere degli ibridi somatici tetra-ploidi ha dimostrato che i due genomi ricombinanofacilmente e che è quindi possibile avviare programmidi reincrocio degli ibridi somatici diaploidi con ilparentale coltivato per l’introgressione di geni utili daS. aethiopicum, quali la resistenza a F. oxysporum f.sp. melongenae (Toppino et al., 2008).

Uno dei maggiori problemi nell’applicazione ditale tecnica è legato alla difficoltà di selezionare pre-cocemente, già nella fase di coltura in vitro, i prodottidi eterofusione. Per superare tale problema, risultamolto utile il ricorso ai marcatori molecolari, che con-sentono l’identificazione immediata degli ibridi.Recentemente, sono stati ottenuti ibridi somatici tra lespecie di patata incongruenti S. bulbocastanum e S.tuberosum, la cui composizione genomica e citopla-smatica è stata caratterizzata attraverso tecniche mole-colari e mediante GISH (Genomic In SituHybridisation, tecnica di citogenetica molecolare chepermette di distinguere i cromosomi derivanti dadiversi parentali o progenitori), che hanno permesso

Tucci et al.

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di effettuare un dosaggio della presenza dei due geno-mi parentali negli ibridi (Iovene et al., 2007).

Attraverso l’ibridazione somatica è anche possibi-le ottenere ibridi “asimmetrici”, che portano l’interogenoma di uno dei partner e solo una porzione diquello dell’altro. L’asimmetrizzazione può avvenirespontaneamente, per l’eliminazione di cromosomi inibridi tra specie tassonomicamente distanti, oppurepuò essere ottenuta mediante trattamento dei proto-plasti con alte dosi di radiazioni ionizzanti prima dellafusione. Inoltre, è possibile produrre ibridi “asimme-trici” a livello citoplasmatico, i “cibridi”, con ilnucleo di uno dei partner di fusione ed il citoplasmaderivante dalla fusione dei citoplasmi di entrambi(Perl et al., l991). La fusione somatica per la produ-zione di cibridi è stata utilizzata con successo inBrassica per ottenere nuova variabilità dei genomiorganellari e quindi nuovi sistemi di maschiosterilitàcitoplasmatica per la produzione di ibridi F1, riducen-do al contempo i rischi di malattie epidemiche dovutead un’eccessiva uniformità dei genomi citoplasmaticidegli ibridi diffusi in coltivazione (Cardi e Earle,1997).

L’ingegneria genomica, attraverso la manipolazio-ne di interi set cromosomici, permette di superare bar-riere all’incrocio determinate da un diverso grado diploidia tra i due parentali, nonché da altri fenomeni diincompatibilità quali quelli, identificati ad esempionel genere Solanum, derivanti da un diverso numerodi EBN (Endosperm Balance Number, valore stabilitosperimentalmente che controlla un sistema d’incom-patibilità che garantisce il normale sviluppo dell’en-dosperma solo nel caso in cui i gameti maschili efemminili hanno lo stesso numero di EBN). Una dellebarriere all’incrocio più frequenti tra le specie coltiva-te e il loro germoplasma selvatico è rappresentata daldiverso livello di ploidia, poiché diverse specie colti-vate sono polipoidi, mentre i loro parenti selvaticisono diploidi. Per superare questo tipo di incompati-bilità, molto utile è il ricorso alla tecnica di ingegneriagenomica basata sull’uso di gameti non ridotti (2n,con il corredo cromosomico dello sporofito). La pro-duzione di gameti 2n è, ad esempio, molto comune trale specie di Solanum coltivate e selvatiche, a causa dianomalie meiotiche a carico del gametofito maschilee/o del gametofito femminile, con conseguente for-mazione di polline e/o ovocellule 2n. In assenza dialtre barriere all’incrocio, è possibile incrociare diret-tamente tali specie selvatiche con la specie coltivata,producendo direttamente una generazione tetraploideche reca caratteri utili introgrediti dalla specie selvati-ca. Quando invece esistono altre barriere all’incrocio,ad esempio un diverso numero di EBN, è possibile

ricorrere alla produzione di ploidie ponte che consen-tono di unire pool genetici incompatibili. La strategiadelle ploidie ponte si basa sulla manipolazione dei setcromosomici in modo da ottenere, attraverso ibrida-zione sessuale, ploidie F1 triploidi e BC1 pentaploidi.Queste ultime sono reincrociate con il parentale colti-vato tuberosum per ripristinarne la condizione tetra-ploide (fig. 2) (Carputo et al., 1997, 2007).

Tra le tecniche di ingegneria genomica vannoanche annoverate quelle utilizzate per l’ottenimento dilinee omozigoti mediante la produzione di aploidi e lasuccessiva diploidizzazione, quando forti barriere diautoincompatibilità e la depressione da inincrocioimpediscono la loro costituzione attraverso più cicli diautoimpollinazione. Il raddoppiamento cromosomicodi aploidi prodotti mediante coltura di antere o dimicrospore consente di ottenere individui omozigoti atutti i loci, DH (Double Haploid), che trovano largaapplicazione come parentali per la produzione di ibri-di nel miglioramento genetico di molte specie ortico-le, oltre a risultare molto utili per la costituzione dipopolazioni per la produzione di mappe di associazio-ne e per l’analisi genetica di caratteri quantitativi. Uncaso molto noto di impiego di diplo-aploidi in orticul-

Fig. 2 - Utilizzo delle ploidie ponte per introgredire genomiselvatici incompatibili in genomi coltivati. Lo schema di incroci

riportato prevede l’ibridazione tra un clone tetraploide di S.commersonii (CMM) e un clone diploide di S. tuberosum (TBR).Gli ibridi triploidi ottenuti, selezionati per caratteri d’interesse eper la produzione di ovocellule 2n, sono sottoposti a successivicicli di reincrocio con S. tuberosum tetraploide fino ad ottenereprogenie tetraploidi recanti caratteri utili da S. commersonii. Siricorda che l’incrocio interspecifico ha successo solo quando igameti dei due parentali hanno lo stesso EBN (modificata da

Carputo et al., 1997).Fig. 2 - Use of “bridge” ploidies to introgress incompatible wild

genomes into cultivated gene pools. The reported breedingscheme includes the hybridisation of tetraploid S. commersonii(CMM) with diploid S. tuberosum (TBR). The produced triploid

hybrids, after selection for useful characters and production of 2neggs, are subjected to backcross cycles with tetraploid S.

tuberosum until tetraploid progenies carrying useful charactersfrom S. commersonii are obtained. Interspecific crosses in potato

are successful only when parental gametes have the same EBN(adapted from Carputo et al., 1997).


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tura è quello dell’asparago, una specie dioica in cui ladeterminazione del sesso dipende dalla presenza dicromosomi “sessuali”, essendo le piante femminiliomogametiche (XX) e quelle maschili eterogametiche(XY). Per la produzione dei turioni sono preferite lepiante maschili, più produttive, più longeve, più tolle-ranti le malattie e con una produzione di turioni piùuniforme, in particolare per quanto riguarda il calibro.Attraverso l’androgenesi in vitro è possibile ottenerecloni diplo-aploidi maschili che possono essere incro-ciati con piante femminili, dando origine ad ibridi F1interamente maschili con caratteristiche agronomichesuperiori (Falavigna et al., 2002). Recentemente, sonostati clonati diversi geni MADS box di asparago la cuiespressione risulta correlata con la funzione riprodutti-va degli apici, in cui i fiori sono inizialmente ermafro-diti, per poi seguire un modello di sviluppo alternativoper i fiori femminili o i fiori maschili (Losa et al.,2004).

L’ingegneria genetica permette di trasferire inpianta singoli geni utili, senza modificare in altromodo il genoma della pianta e quindi senza la neces-sità di lunghi programmi di reincrocio per ricostituireil genoma d’origine. Attraverso la trasformazionegenetica è possibile superare le barriere all’incrocio,consentendo l’inserimento in un genoma coltivato digeni di qualsiasi provenienza, ampliando così teorica-mente il gene pool di una specie a tutti gli organismiviventi, nonché di geni sintetici, ottimizzati per unaspecifica funzione. Attualmente per alcune ortive sonocommercializzate all’estero piante transgeniche perdiversi caratteri legati alla resistenza a virus (patata ezucca) e alla maschiosterilità (radicchio), mentre pian-te transgeniche di melanzana resistenti ad insetti sonoin attesa di approvazione per la commercializzazionein India.

La variabilità genetica esistente nelle specie vege-tali selvatiche come fonte di geni utili da trasferirenelle specie coltivate mediante tecniche innovative ditrasformazione genetica è stata ampiamente esploratarelativamente a caratteri d’interesse agronomico qualila produttività e la tolleranza a stress diversi (abiotici ebiotici). Ad esempio, con questa tecnica, sono stateottenute piante di S. tuberosum migliorate per la resi-stenza al freddo attraverso la sovraespressione di ungene codificante per una ∆9 stearoyl-ACP desaturasi(des9) di S. commersonii. Tale enzima, catalizzando lareazione iniziale di desaturazione degli acidi grassi,svolge un ruolo determinante nel regolare il loro livel-lo d’insaturazione e conseguentemente la fluidità dellemembrane cellulari. Le piante sovraesprimenti il genedes9 mostravano un maggiore contenuto in acidi gras-si insaturi, il cui incremento si è dimostrato essere

strettamente correlato all’aumento della tolleranza allebasse temperature (De Palma et al., 2008). Sempre inpatata, la sovraespressione del gene di resistenza aperonospora RB clonato dalla specie selvatica S. bul-bocastanum ha determinato un significativo incre-mento della tolleranza delle piante transgeniche aPhytophthora infestans (Bradeen et al., 2009).

Attraverso l’ingegneria genetica è anche possibiledefinire la funzione di un gene e la sua implicazionenella risposta di difesa, consentendo l’individuazionedi geni chiave nelle risposte di difesa delle piante aidiversi patogeni. Utilizzando la trasformazione geneti-ca mediata da A. tumefaciens è stato possibile dimo-strare in carota che l’azione sinergica di due genicodificanti per proteine PR (Pathogenesis Related) adattività diversa isolate, rispettivamente da frumento(lipid transfer protein, ltp) e da orzo (chitinasi, chi-2),incrementa la resistenza a patogeni fungini (Javaraj ePunja, 2007). Analogamente, le proprietà antifunginedimostrate in vitro da una PR4 di frumento sono stateconfermate in vivo attraverso la sovraespressione delrelativo gene in piante transgeniche di tabacco(Fiocchetti et al., 2008). Sempre utilizzando la trasfor-mazione genetica, è stata dimostrata l’attività insetti-cida espletata da proteine codificanti per due aggluti-nine isolate da foglie (ASAL) e bulbi (ASAII) di aglio(Allium sativum L.). I biosaggi sull’attività insetticidacontro l’insetto Spodoptera littoralis Boisd.(Lepidoptera: Noctuidae) in piante transgeniche ditabacco hanno dimostrato che l’espressione delle dueagglutinine riduce significativamente la crescita dellelarve di S. littoralis e ne aumenta la mortalità fin daiprimi stadi di sviluppo (Sadeghi et al., 2008).

La combinazione di metodologie basate sulla tra-sformazione genetica di geni associati con le diversevie di difesa (Makandar et al., 2006; Zhang et al.,2007) e sul silenziamento genico, ottenuto attraversol’impiego di sistemi virali VIGS (Virus-Induced GeneSilencing, basati sul silenziamento genico temporaneoattraverso l’interferenza dell’RNA) (Chung et al.,2007; Robertson, 2004; Senthil-Kumar et al., 2007), èstata adottata per definire la funzione nella difesa con-tro patogeni diversi di un gene codificante per unaproteina ad azione antimicrobica (CaAMP1) isolatoda foglie di peperone (C. annuum) infettate con ilceppo Bv5-4a di Xanthomonas campestris pv vesica-toria (Xcv). In particolare, il silenziamento VIGS delgene CaAMP1, ottenuto attraverso inoculo di giovanipiantine di peperone con il vettore ricombinante TRV(Tobacco Rattle Virus), ha evidenziato una maggioresuscettibilità a X. campestris pv vesicatoria e aColletotrichum coccodes, mentre la sua sovraespres-sione in A. thaliana mediante trasformazione genetica

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ha dimostrato il suo coinvolgimento nella resistenzaad un ampio spettro di patogeni (Lee et al., 2008).

La trasformazione genetica può essere utilizzataanche per ottenere piante migliorate per caratteri d’in-teresse nutrizionale, attraverso approcci di ingegneriametabolica. E’ noto che la carenza di minerali (es.calcio e ferro) nella dieta alimentare è spesso causa dinumerose malattie (Brady, 2007; Kin et al., 2007).Piante ortive con un incrementato contenuto disostanze nutrizionali attraverso la biofortificazionecon importanti minerali quali il calcio sono state otte-nute mediante la sovraespressione in pomodoro tran-sgenico di un gene di Arabidopsis che codifica peruna proteina che media il trasporto del calcio(sCAX1). Le piante transgeniche accumulavano cal-cio e mostravano una prolungata conservabilità post-raccolta (Park et al., 2005). Con la medesima strate-gia sono state ottenute piante transgeniche di carotacon un contenuto in calcio doppio rispetto al controllonon trasformato, che si è dimostrato essere adsorbitoefficientemente in prove effettuate su topi e su uomini(Morris et al., 2008). L’identificazione del geneBoSMT di broccolo (Brassica oleracea var. italicacodificante la selenocisteina metiltransferasi), princi-pale responsabile della formazione di Se-metilseleno-cisteina, con una dimostrata attività anticancerogena,potrà portare alla massimizzazione della proprietàbenefiche di questa specie (Lyi et al., 2005).

Similmente, promettenti contributi alla risoluzionedel problema della carenza di folati, soprattutto senti-to nei Paesi meno sviluppati, che determina un incre-mento dell’incidenza di spina bifida, anencefalia,malattie cardiovascolari e cancro, potranno venire daun maggiore apporto alimentare di folati medianteprodotti vegetali con un incrementato contenuto inquesti composti, ottenuti attraverso l’ingegneria meta-bolica (Bekaert et al., 2008). L’incremento di unaclasse di composti d’interesse salutistico appartenential metabolismo dei fenilpropanoidi (ac. clorogenico,flavonoidi, antocianine) è stato ottenuto in diversespecie vegetali di notevole rilevanza economica qualiil pomodoro attraverso la sovraespressione di genistrutturali e regolatori che hanno un ruolo chiave nellabiosintesi di tali composti (Muir et al. 2001;Niggeweg et al., 2004; Butelli et al., 2008; Luo et al.,2008; Gonzali et al., 2009).

Esempi di applicazione di approcci integrati per ilmiglioramento genetico delle specie ortive

Oltre a quelli già riportati nei paragrafi precedenti,di seguito si riportano alcuni esempi dei risultati, pre-cedentemente impensabili, raggiunti attraverso l’ap-

plicazione integrata delle metodologie e degli stru-menti di genomica e biotecnologie nei diversi campidella genetica vegetale ed in particolare nel migliora-mento della tolleranza a stress biotici e delle proprietàfunzionali delle specie ortive e dei loro prodotti.

La combinazione di approcci di miglioramentogenetico tradizionale con le tecnologie biomolecolarie la genomica è risultata particolarmente utile per laselezione di nuovi genotipi di piante ortive con unamigliore tolleranza/resistenza ai patogeni e parassiti,oppure capaci di interagire più efficacemente conmicrorganismi simbionti e/o antagonisti, in grado diesercitare un controllo biologico sui patogeni. Inpomodoro è stato condotto uno studio sulla variabilitàgenetica di genotipi selvatici e varietà coltivate nellarisposta all’interazione con diversi isolati del fungoantagonista Trichoderma harzianum per selezionaregenotipi di pomodoro che sono stati utilizzati,mediante un approccio integrato di tecnologie mole-colari, per la comprensione delle basi molecolari del-l’interazione con il fungo (Ruocco et al., 2008).L’identificazione di geni regolati durante l’interazionecon Trichoderma e di marcatori ad essi associati con-sentirà la selezione mediante MAS di genotipi dipomodoro in grado di avvantaggiarsi al massimo del-l’interazione con Trichoderma e quindi in grado digarantire buoni livelli produttivi con un ridotto appor-to di fertilizzanti e fitofarmaci di sintesi.

Differenti approcci integrati rendono anche possi-bile una più efficace utilizzazione della biodiversitàesistente nelle diverse specie ortive per l’ottenimentodi linee di introgressione, anche multiple (i.e approc-cio del pyramiding di QTL). Ad esempio, l’impiegodi popolazioni di breeding opportunamente costituite,quali popolazioni stabili di linee isogeniche (NILs) ed’introgressione (ILs), rappresenta uno strumentoestremamente utile sia per l’identificazione digeni/QTLs di resistenza a patogeni sia per la selezionedi genotipi che hanno introgredito caratteri positiviper la resistenza. Lo sviluppo di linee isogeniche dispinacio (Spinacia oleracea L.) ha permesso di dimo-strare che la resistenza alla malattia causata dal fungoPeronospora farinosa f. sp. spinaciae è controllata dalgene dominante Pfs-1 e di identificare un marcatoremolecolare strettamente associato a Pfs-1, che potràrisultare utile per la selezione di genotipi di spinacioresistenti a peronospora (Irish et al., 2008).

Analogamente, linee NILs di pomodoro, contenen-ti differenti geni dominanti Ol per la resistenza a oidiocausato da Oidium neolycopersici, sono state utilizza-te in test di resistenza con diversi isolati di O. neoly-copersici in differenti località geografiche per dimo-strare che la resistenza conferita dai geni Ol è isolato-


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dipendente (Bai et al., 2005).Gli alimenti funzionali sono definiti come alimenti

caratterizzati da effetti addizionali dovuti alla presen-za di componenti, naturalmente presenti o aggiunti,che interagiscono più o meno selettivamente con unao più funzioni fisiologiche dell’organismo (biomodu-lazione), contribuendo al mantenimento della salutee/o alla prevenzione delle malattie. Essi rappresentanodunque la nuova frontiera dell’alimentazione e leapplicazioni biotecnologiche avanzate si sono dimo-strate uno strumento fondamentale a sostegno dei tra-dizionali metodi di selezione per lo sviluppo di piantecon caratteristiche nutrizionali migliorate.

Le sostanze funzionali presenti negli alimenti diorigine vegetale appartengono a diverse categorie dicomposti e sono spesso caratteristiche di una specie(es. cinarina per il carciofo, allicina per l’aglio e lacipolla, glucosinolati per le crucifere). Nonostantesiano numerose le specie coltivate in cui è nota la pre-senza di questi composti, essi vi si trovano spesso inquantità subottimali e pertanto gli interventi di miglio-ramento genetico sono protesi ad incrementare il con-tenuto di tali composti o a ridurre quelli che spessosono definiti composti “indesiderati”, perché poten-zialmente allergenici o tossici per l’uomo.

Attraverso approcci di genomica funzionale, sonostati individuati numerosi geni sia strutturali sia rego-latori coinvolti nelle vie biosintetiche di una grandevarietà di composti (carotenoidi, flavonoidi, ecc.) adattività salutistica (Muir et al., 2001; Niggeweg et al.,2004; Seitz et al., 2006; Giuliano et al., 2008) e que-sto ha permesso di incrementare le conoscenze sullediverse vie metaboliche e di selezionare geni e funzio-ni geniche chiave per il miglioramento della qualitàattraverso le diverse applicazioni biotecnologiche.Inoltre le informazioni ottenute sulle sequenze di genisono state raccolte in appositi database, liberamenteconsultabili, in cui è possibile reperire informazionisulla sequenza di un gene, sull’attività della proteinacodificata e sulla sua posizione nella via biosintetica(Kanehisa et al., 2008; http://www.genome.jp/kegg/plant).

Grazie all’analisi bioinformatica delle banche datidelle vie biosintetiche e delle sequenze genichedisponibili in rete sono stati isolati geni chiave per lasintesi di importanti composti. Ad esempio, taleapproccio ha permesso il clonaggio del gene di angu-ria codificante la licopene ß ciclasi (LCY-B), respon-sabile del colore rosso del frutto, e l’identificazione dimarcatori molecolari ad esso associati, utili per laselezione assistita di questo carattere (Bang et al.,2007). Analogamente, in carciofo, è stato possibileavviare l’isolamento di geni implicati nella biosintesi

della luteolina (Fratianni et al., 2005), un flavonoidepresente principalmente nella parte edule (capolino)(Fratiannni et al., 2007), tra i maggiori responsabilidella comprovata attività coleretica, epatoprotettiva eanticolesterolemica posseduta da questa specie(Brown e Rice-Evans, 1998; Gebhardt, 1997; Kraft,1997).

Strategie alternative basate sull’impiego di geniregolatori, quali i fattori di trascrizione, in combina-zione con tecniche di trasformazione genetica, sonostate sviluppate per incrementare l’accumulo di altricomposti della via biosintetica dei flavonoidi, digrande interesse salutistico. Infatti, l’espressione delfattore di trascrizione AtMYB12 di A. thaliana hapermesso di ottenere pomodori con un elevato conte-nuto in flavonoli (rutina) e acidi caffeoilchinici(acido clorogenico) (Luo et al., 2008). Applicando lastessa strategia, ma utilizzando i fattori di trascrizio-ne Del1 e Ros1 da Anthirrinum majus L. sotto il con-trollo di un promotore frutto specifico (E8), è statoincrementato anche il contenuto di antocianine intutto il frutto di pomodoro, compresa la buccia, incui tali composti sono normalmente assenti (Butelliet al., 2008).

In carota, il sequenziamento e il mappaggio genicohanno permesso di identificare numerosi geni struttu-rali fondamentali per la biosintesi dei carotenoidi (Justet al., 2007), importanti componenti della dieta ali-mentare, di cui le carote rappresentano una delle prin-cipali fonti alimentari, in particolare per quantoriguarda i precursori della vitamina A (α e β-carote-ne). I 24 geni identificati sono distribuiti in 8 dei 9gruppi di linkage del genoma di carota e due di essico-localizzano con uno dei QTL maggiori per l’accu-mulo dei carotenoidi. Con il medesimo approcciosono stati identificati anche in pomodoro numerosigeni implicati nella biosintesi dei carotenoidi (β-cicla-si, LCY-B; non-eme carotene idrossilasi, CHY1 e 2;fitoene sintasi, PSY; ecc.). La modulazione dell’e-spressione di tali geni attraverso sovraespressione osilenziamento in pomodoro indirizza la via biosinteti-ca dei carotenoidi verso l’accumulo di β-carotene o dilicopene, rispettivamente (Giuliano et al., 2008). Leconoscenze sui geni coinvolti hanno anche permessodi ottenere, attraverso l’ingegneria metabolica, piantedi patata che accumulano carotenoidi nei tuberi(Giuliano et al., 2008). In melone (Cucumis melo L.)un set di linee omozigoti ricombinanti (RIL) derivateda un varietà di Cantalupo (US Western) è stato valu-tato per più anni e in più località per identificareQTLs associati al contenuto di β-carotene (QßC-QTL)nel frutto maturo. Questi studi rappresentano il primopasso nella comprensione del controllo genetico della

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quantità di β-carotene in melone e nell’ottenimento dinuove varietà con un incrementato accumulo di talecomposto (Cuevas et al., 2008).

Recentemente, Barone et al. (2009) hanno propo-sto una strategia innovativa per il miglioramentogenetico di caratteri complessi, basata sulla combina-zione dell’analisi trascrittomica ad alta processività(i.e. analisi microarray) con l’utilizzo di appropriaterisorse genetiche, quali le linee d’introgressione (fig.3). Attraverso l’analisi comparativa del trascrittomadel frutto di una linea d’introgressione di S. pennelliinel background genomico di S. lycopersicum conquello del parentale coltivato, sono state identificateun elevato numero di sequenze differenzialmenteespresse, putativamente implicate nel metabolismodell’acido ascorbico nel frutto di pomodoro (DiMatteo et al., 2008). Ulteriori studi potranno condurrealla dissezione di tale carattere complesso ed all’iden-tificazione di geni candidati responsabili dell’accu-mulo di acido ascorbico nei frutti di pomodoro e

quindi di marcatori funzionali ad essi associati. Talimarcatori potranno poi essere utilizzati per identifica-re combinazioni alleliche favorevoli in programmi diselezione assistita dalla genomica (Barone et al.,2009).

Conclusioni

L’incremento della produzione agricola nei paesiin via di sviluppo, l’attuazione di un’agricoltura piùecosostenibile così come l’introduzione di nuovevarietà in grado di fornire prodotti con migliori carat-teristiche organolettiche e nutrizionali rappresentanogli obbiettivi in cui si fa sempre più evidente il contri-buto dell’impiego integrato della genomica e delletecniche di biologia molecolare. Gli esempi riportatiin questo lavoro dimostrano chiaramente come siapossibile sfruttare i moderni strumenti offerti dallebiotecnologie nei diversi campi della genetica e delmiglioramento genetico vegetale.

Fig. 3 - Strategia di miglioramento genetico basata sulla genomica ed in particolare sull’impiego integrato di diverse metodologie ad altaprocessività con appropriate risorse genetiche (da Barone et al., 2009).

Fig. 3 - Genomics-based breeding strategy: integrated use of high-throughput genomic methodologies with appropriate genetic resources(from Barone et al., 2009).


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C’è da sottolineare come la possibilità di confron-tare tra loro i genomi abbia permesso di identificaresequenze conservate nelle diverse specie e quindi dicomprendere le relazioni filogenetiche e i percorsievolutivi di importanti gruppi tassonomici, oltre aconsentire il trasferimento delle conoscenze sviluppatesu una specie ad altre specie affini.

Il massiccio ricorso all’analisi con marcatori mole-colari a costi contenuti ha contribuito in maniera rile-vante alla valorizzazione e alla tracciabilità di prodottidi qualità, alla certificazione dell’identità genetica divarietà ortive nell’intera filiera agro-alimentare eall’accelerazione dei programmi di miglioramentogenetico per importanti caratteri agronomici (MAS).La possibilità di identificare e clonare geni ha amplia-to enormemente le fonti di variabilità genetica utiliz-zabili ed ha aperto la strada all’utilizzo di specie sel-vatiche come fonte di geni utili per il miglioramentogenetico, anche grazie agli approcci biotecnologici peril superamento delle barriere all’incrocio, la produzio-ne di nuove varietà migliorate.

Le tecnologie genetiche e genomiche innovativehanno già avuto un notevole impatto sulle specie cuisono state applicate. La disponibilità di piattaformetecnologiche già messe a punto permetterà in tempibrevi successi analoghi anche per le specie attualmen-te meno studiate ma di grande importanza per l’orti-coltura italiana.

Riassunto

L’integrazione dei metodi convenzionali di miglio-ramento genetico con la genomica, le biotecnologie ela bioinformatica sta contribuendo in maniera sostan-ziale a rispondere alle esigenze di aumentare la qua-lità, la sicurezza alimentare e la produzione agricolanel rispetto dell’ambiente, consentendo allo stessotempo di garantire il reddito degli agricoltori attraver-so la protezione dei marchi di qualità, la tracciabilità ela rintracciabilità. Scopo di questo lavoro è di illustra-re i progressi delle applicazioni biomolecolari e geno-miche nell’analisi ed utilizzazione della diversitàgenetica, nel fingerprinting molecolare, nella genomi-ca comparativa e funzionale, fornendo esempi dellaloro applicazione integrata al miglioramento di specieortive.

Parole chiave: Genomica strutturale e funzionale,diversità genetica, selezione assistita, miglioramentogenetico, ingegneria genomica e genetica.

Bibliografia

ACCIARRI N., ROTINO G.L., TAMIETTI D., VALENTINO D.,VOLTATTORNI S., SABATINI E., 2007. Molecular markers forVe1 and Ve2 Verticillium resistance genes from Italian tomatogermplasm. Plant Breed. 126: 617-621.

ARNOLD M.L. 1997. Natural hybridization and evolution. OxfordUniversity Press (Oxford).

BAI Y., VAN DER HULST R., BONNEMA G., MARCEL T.C., MEIJER-DEKENS F., NIKS R.E., LINDHOUT P., 2005. Tomato defense toOidium neolycopersici: Dominant Ol genes confer isolate-dependent resistance via a different mechanism than recessiveol-2. Mol. Plant-Microbe Interact. 18:354-362.

BAKSH S., 1979. Cytogenetic studies of the F1 hybrid of Solanumincanum L. x S. melongena L. variety “Giant of Benares”.Euphytica 28:793-800.

BANG H., KIM S., LESKOVAR D., KING S., 2007. Development of acodominant CAPS marker for allelic selection between canaryyellow and red watermelon based on SNP in lycopene b-cyclase (LCYB) gene. Mol. Breeding 20:63-72.

BARCHI L., BONNET J., BOUDET C., SIGNORET P., NAGY I., LANTERIS., PALLOIX A., LEFEBVRE V., 2007. A high-resolution, intra-specific linkage map of pepper (Capsicum annuum L.) andselection of reduced recombinant inbred line subsets for fastmapping. Genome. 50:51-60.

BARONE A., CHIUSANO M.L., ERCOLANO M.R., GIULIANO G.,GRANDILLO S., FRUSCIANTE L., 2008. Structural and functionalgenomics of tomato. Int. J. Plant Genomics doi:10.1155/2008/820274.

BARONE A., DI MATTEO A., CARPUTO D., FRUSCIANTE L., 2009.High-throughput genomics enhances tomato breeding effi-ciency. Current Genomics 10:1-19.

BARONE A., SEBASTIANO A., CARPUTO D., DELLA ROCCA F.,FRUSCIANTE L., 2001. Molecular marker-assisted introgres-sion of the wild Solanum commersonii genome into the culti-vated gene pool. Theor. Appl. Genet. 102:900-907.

BAUDRY E., KERDELHUE’ C., INNAN H., STEPHAN W., 2001.Species and recombination effects on DNA variability in thetomato genus. Genetics 158:1725-1735.

BEKAERT S., STOROZHENKO S., MEHRSHAHI P., BENNETT M.J.,LAMBERT W., GREGORY J.F. 3RD, SCHUBERT K., HUGENHOLTZJ., VAN DER STRAETEN D., HANSON A.D. 2008. Folate biofor-tification in food plants. Trends Plant Sci. 13:28-35.

BRADEEN J.M., IORIZZO M., MOLLOV D.S., RAASCH J., COLTONKRAMER L., MILLETT B.P., AUSTIN-PHILLIPS S., JIANG J.,CARPUTO D., 2009. Higher copy numbers of the potato RBtransgene correspond to enhanced transcript and late blightresistance levels. Mol. Plant-Microbe Interact. 22:437-446.

BRADY P.G., 2007. Iron deficiency anemia: a call for aggressivediagnostic evaluation. South. Med. J. 100 (10):966-967.

BROTMAN Y., KOVALSKI I., DOGIMONT C., PITRAT M., PORTNOYV., KATZIR N., PERL-TREVES R., 2005. Molecular markerslinked to papaya ring spot virus resistance and Fusarium race2 resistance in melon. Theor. Appl. Genet. 110:337-345.

BROWN J.E., RICE-EVANS C.A., 1998. Luteolin-rich artichokeextract protects low density lipoprotein from oxidation invitro. Free Radicals Research 29(3):247-255.

BUTELLI E., TITTA L., GIORGIO M., MOCK H.P., MATROS A.,PETEREK S., SCHIJLEN E.G.W.M., HALL R.D., BOVY A.G., LUOJ.I.E., MARTIN C., 2008. Enrichment of tomato fruit withhealth-promoting anthocyanins by expression of select tran-scription factors. Nat. Biotechnol. 26 (11):1301-1308.

CARAMANTE M., RAO R., MONTI L., CORRADO G., 2008.Discrimination of “San Marzano” accessions: a comparisonof minisatellite, CAPS and SSR markers in relation to mor-phological traits. Sci. Hort. DOI 10.1016/j.scien-tia.2008.12.004.

CARDI T., 2001. Somatic hibridization between Solanum commer-Contributo n° 343 del CNR - IGV, Portici (NA)

Tucci et al.

28

sonii Dun and S. tuberosum L. (potato). In: Biotechnology inagriculture and forestry, vol 49. Nagata T., Bajaj Y.P.S. eds..Springer (Berlin, Heidelberg, New York):245-263.

CARDI T., EARLE E.D., 1997. Production of new CMS Brassicaoleracea by transfer of “Anand” cytoplasm from B. rapathrough protoplast fusion. Theor. Appl. Genet. 94: 204-212.

CARLSON P.S., SMITH H.H., DEARING R.D., 1972. Parasexualinterspecific plant hybridization. Proceed. Natl. Acad. Sci.USA 69:2292-2294.

CARPUTO D,, BARONE A., CARDI T., SEBASTIANO S., FRUSCIANTEL., PELOQUIN S.J., 1997. Endosperm balance number manipu-lation for direct in vivo germplasm introgression to potatofrom a sexually isolated relative (Solanum commersoniiDun.). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12013-12017.

CARPUTO D., CASTALDI L., CARUSO I., AVERSANO R., MONTI L.,FRUSCIANTE L., 2007. Selection for resistance traits of (near)pentaploid Solanum tuberosum - S. commersonii hybrids foruse as bridge ploidies. Breeding Sci. 57:145-151.

CHIUSANO M.L., D’AGOSTINO N., TRAINI A., LICCIARDELLO C.,RAIMONDO E., AVERSANO M., FRUSCIANTE L., MONTI L. 2008.ISOL@: an Italian SOLAnaceae genomics resource. BMCBioinformatics. 9 Suppl 2:S7.

CHUNG E., OH S.K., PARK J.M., CHOI D., 2007. Expression andpromoter analyses of pepper CaCDPK4 (Capsicum annuumcalcium dependent protein kinase 4) during plant defenseresponse to incompatible pathogen. Plant Pathol. J. 23:76-89.

CUEVAS H.E., STAUB J.E., SIMON P.W., ZALAPA J.E., MCCREIGHTJ.D., 2008. Mapping of genetic loci that regulate quantity ofbeta-carotene in fruit of US Western Shipping melon(Cucumis melo L.). Theor. Appl. Genet. 117(8):1345-1359.

DANIN-POLEG Y., TADMOR Y., TZURI G., REIS N., HIRSCHBERG J.,KATZIR N., 2002. Construction of a genetic map of melon withmolecular markers and horticultural traits, and localizationof genes associated with ZYMV resistance. Euphytica125:373-384.

DATEMA E., MUELLER L.A. BUELS R., GIOVANNONI J.J., VISSERR.F.G., STIEKEMA W.J., VAN HAM R.C.H.J., 2008.Comparative BAC end sequence analysis of tomato and pota-to reveals over representation of specific gene families inpotato. BMC Plant Biol. 8:34.

DAUCHOT N., MINGEOT D., PURNELLE B., MUYS C., WATILLON B.,BOUTRY M., VAN CUTSEM P., 2009. Construction of 12 ESTlibraries and characterization of a 12,226 EST dataset forchicory (Cichorium intybus) root, leaves and nodules in thecontext of carbohydrate metabolism investigation. BMC PlantBiol. 28:9.

DAUNAY M.C., LESTER R.N., LATERROT H., 1991. The use of wildspecies for the genetic improvement of Brinjal egg-plant(Solanum melongena) and tomato (Lycopersiconesculentum). In: Solanaceae III: taxonomy-chemistry-evolu-tion. Hawkes J.G., Lester R.N., Nee M., Estrada N. eds..Royal Botanical Gardens Kew (London):389-412.

DE PALMA M., GRILLO S., MASSARELLI I., COSTA A., BALOGH G.,VIGH L., LEONE A., 2008. Regulation of desaturase geneexpression, changes in membrane lipid composition and free-zing tolerance in potato plants. Mol. Breeding 21:15-26.

DI MATTEO A., SACCO A., PEZZOTTI M., DELLEDONNE M.,FERRARINI A., FRUSCIANTE L., BARONE A., 2008.Transcriptomic comparative analysis for tomato fruit qualitytraits through the Combimatrix technology. Proc. 5thSolanaceae Genome Workshop 2008, October 12-16,Cologne (Germany) Abs. 315.

DOGANLAR S., FRARY A., DAUNAY M.C., LESTER R.N., TANKSLEYS.D., 2002. A comparative genetic linkage map of eggplant(Solanum melongena) and its implication for genome evolu-tion in the Solanaceae. Genetics 161:1697-1711.

FALAVIGNA A., CASALI P.E., BARBAGLIO E., 2002. Miglioramentogenetico dell’asparago in Italia attraverso coltura in vitro diantere. Atti III Workshop gruppo di lavoro SOI:

Miglioramento genetico 25-26 Giugno 2002 Valenzano(BA):105-113.

FIOCCHETTI F., D’AMORE R., DE PALMA M., BERTINI L., CARUSOC., CAPORALE C., TESTA A., CRISTINZIO G., SACCARDO F.,TUCCI M., 2008. Constitutive over-expression of two wheatpathogenesis-related genes enhances resistance of tobaccoplants to Phytophthora nicotianae. Plant Cell Tiss. Organ Cult.92:73-84.

FOOLAD M.R., 2007. Genome mapping and molecular breeding oftomato. Int. J. Plant Genomics doi:10.1155/2007/64358.

FRARY A., NESBITT T.C., FRARY A., GRANDILLO S., VAN DERKNAPP E., CONG B., LIU J., MELLER J., ELBER R., ALPERTK.B., TANKSLEY S.D., 2000. fw2.2: A Quantitative TraitLocus Key to the Evolution of Tomato Fruit Size. Science289:85-88.

FRATIANNI F., DE PALMA M., TUCCI M., NAZZARO F., 2005.Analisi del profilo polifenolico di varietà locali di carciofo(Cynara scolymus). In: Ricerche e Innovazioni nell’industriaalimentare. Chiriotti Editori (Pinerolo-Italia):652-656.

FRATIANNI F., TUCCI M., DE PALMA M., PEPE R., NAZZARO F.,2007. Polyphenolic composition in different parts of some cul-tivars of globe artichoke (Cynara cardunculus L. var. scoly-mus (L.) Fiori). Food Chemistry 104:1282-1286.

FRIDMAN E., PLEBAN T., ZAMIR D., 2000. A recombinant hotspotdelimits a wild-species quantitative locus for tomato sugarcontent to 484 bp within an invertase gene. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 97:4718-4723.

FRIESEN N., FRITSCH R.M., POLLNER S., BLATTNER F.R. 2000.Molecular and morphological evidence for an origin of theaberrant genus Milula within himalayan species of Allium(Alliacae). Mol. Phylogenet. Evol. 17:209-218.

FRIESEN N., POLLNER S., BACHMANN K., BLATTNER F.R., 1999.RAPDs and noncoding chloroplast DNA reveal a single originof the cultivated Allium fistulosum from A. altaicum(Alliaceae). Am. J. Bot. 86:554-562.

FRITSCH R.M., FRIESEN N., 2002. Evolution, domestication andtaxonomy. In: Allium crop science: recent advances.Rabinovitch H.D., Currah L. eds.. CAB International(Wallingford, U.K.):5-27.

FUKINO N., OHARA T., MONFORTE A.J., SUGIYAMA M., SAKATA Y.,KUNIHISA M., MATSUMOTO S., 2008. Identification of QTLsfor resistance to powdery mildew and SSR markers diagnosticfor powdery mildew resistance genes in melon (Cucumis meloL.). Theor. Appl. Genet. 118:165-175.

FURINI A., WUNDER J., 2004. Analysis of eggplant (Solanum mel-ongena)-related germplasm: morphological and AFLP datacontribute to phylogenetic interpretations and germplasm uti-lization Theor. Appl. Genet. 108:197-208.

GEBHARDT R., 1997. Antioxidative and protective properties ofextracts from leaves of the artichoke against hydroperoxide-induced oxidative stress in cultured rat hepatocytes.Toxicology and Applied Pharmacology 144:279–286.

GIULIANO G., TAVAZZA R., DIRETTO G., BEYER P., TAYLOR M.A.,2008. Metabolic engineering of carotenoid biosynthesis inplants. Trends Biotechnol. 26(3):139-145.

GONZALEZ-IBEAS D., BLANCA J., ROIG C., GONZÁLEZ-TO M., PICÓB, TRUNIGER V., GÓMEZ P, DELEU W., CAÑO-DELGADO A.,ARÚS P., NUEZ F., GARCIA-MAS J., PUIGDOMÈNECH P.,ARANDA M.A., 2007. MELOGEN: an EST database for melonfunctional genomics. BMC Genomics 8:306.

GONZALI S., MAZZUCATO A., PERATA P., 2009. Purple as a toma-to: towards high anthocyanin tomatoes. Trends Plant Sci.14:237-241.

GRANDILLO S., TANKSLEY S.D., ZAMIR D., 2008. Exploitation ofnatural biodiversity through genomics. In: Genomics assistedcrop improvement: vol I Genomics Approaches andPlatforms. Varshney R.K., Tuberosa R. eds.. Springer (TheNetherlands):121-150.

HAWKES J.G., 1990. The Potato, Evolution, Biodiversity and


29

Genetic Resources. Belhaven Press, (London).IOVENE M., BARONE A., FRUSCIANTE L., MONTI L., CARPUTO D.,

2004. Selection for aneuploid Solanum commersonii-S. tube-rosum hybrids combining low wild genome content and resi-stance traits. Theor. Appl. Genet. 119:1139-1146.

IOVENE M., SAVARESE S., CARDI T., FRUSCIANTE L., SCOTTI N.,SIMON P.W., CARPUTO D., 2007. Nuclear and cytoplasmicgenome composition of Solanum bulbocastanum (+) S. tubero-sum somatic hybrids. Genome 50:443-450.

IRISH B.M., CORRELL J.C., FENG C., BENTLEY T., DE LOS REYESB.G. 2008. Characterization of a resistance locus (Pfs-1) tothe spinach downy mildew pathogen (Peronospora farinosa f.sp. spinaciae) and development of a molecular marker linkedto Pfs-1. Phytopathology 98:894-900.

JACKSE J., TELGMANN A., JUNG C., KHAR A., MELGAR S., CHEUNGF., TOWN C.D., HAVEY M.J., 2006. Comparative sequence andgenetic analyses of asparagus BACs reveal no microsyntenywith onion or rice. Theor. Appl. Genet. 114(1):31-39.

JACOBS M.M.J., VAN DEN BERG R.G., VLEESHOUWERS V.G.A.A.,VISSER M., MANK R., SENGERS M., HOEKSTRA R., VOSMAN B.,2008. AFLP analysis reveals a lack of phylogenetic structurewithin Solanum section Petota. BMC Evolutionary Biology8:145.

JAYARAJ J., PUNJA Z.K., 2007. Combined expression of chitinaseand lipid transfer protein genes in transgenic carrot plantsenhances resistance to foliar fungal pathogens. Plant CellRep. 9:1539-1546.

JOHNSON A.A.T., VEILLEUX R.E., 2001. Somatic hybridization andapplications in plant breeding. In: Plant Breeding Reviewsvol. 20. Janick J. ed.. John Wiley & Sons:167-226.

JOOBEUR T., KING J.J., NOLIN S.J., THOMAS C.E., DEAN R.A.,2004. The Fusarium wilt resistance locus Fom-2 of meloncontains a single resistance gene with complex features. PlantJ. 39:283-297.

JUST B.J., SANTOS C.A., FONSECA M.E., BOITEUX L.S., OLOIZIAB.B., SIMON P.W., 2007. Carotenoid biosynthesis structuralgenes in carrot (Daucus carota): isolation, sequence-charac-terization, single nucleotide polymorphism (SNP) markers andgenome mapping. Theor. Appl. Genet. 114(4):693-704.

KACZMAREK M., KOCZYK G., ZIOLKOWSKI P.A., BABULA-SKOWRONSKA D., SADOWSKI J., 2009. Comparative analysis ofthe Brassica oleracea genetic map and the Arabidopsisthaliana genome. Genome. 52:620-633.

KANEHISA M., ARAKI M., GOTO S., HATTORI M., HIRAKAWA M.,ITOH M., KATAYAMA T., KAWASHIMA S., OKUDA S.,TOKIMATSU T., YAMANISHI Y., 2008. KEGG for linkinggenomes to life and the environment. Nucleic Acids Res.36:480-484.

KANG B.C., NAHM S.H., HUH J.H., YOO H.S., YU J.W., LEE M.H.,KIM B.D., 2001. An interspecific (Capsicum annuum x C. chi-nese) F2 linkage map in pepper using RFLP and AFLP mark-ers. Theor. Appl. Genet. 102: 531-539.

KARIHALOO J.K., BRAUNER S., GOTTLIEB L.D., 1995. Randomamplified polymorphic DNA variation in the eggplant,Solanum melongena L. (Solanaceae). Theor. Appl. Genet.90:767-770.

KARIHALOO J.L., GOTTLIEB L.D., 1995. Allozyme variation in theeggplant, Solanum melongena L. (Solanaceae). Theor. Appl.Genet. 90:578-583.

KIM H.J., BAEK K.H., LEE S.W., KIM J., LEE B.W., CHO H.S., KIMW.T., CHOI D., HUR C.G., 2008. Pepper EST database: com-prehensive in silico tool for analyzing the chili pepper(Capsicum annuum) transcriptome. BMC Plant Biology8:101.

KIN C.F., SHAN W.S., SHUN L.J., CHUNG L.P., JEAN W., 2007.Experience of famine and bone health in post-menopausalwomen. Int. J. Epidemiol. 36:1143-1150.

KRAFT K., 1997. Artichoke leaf extracts. Recent findings reflectingeffects on lipids metabolism, liver and gastrointestinal tracts.

Phytomedicine 4:369-378.LANGELLA R., ERCOLANO M.R., MONTI L., FRUSCIANTE L.,

BARONE A., 2004. Molecular marker assisted transfer of resi-stance to TSWV in tomato elite lines. J. Hortic. Sci. Biotech.79:806-810.

LANTERI S., ACQUADRO A., COMINO C., MAURO R., MAUROMICALEG., PORTIS E., 2006. A first linkage map of globe artichoke(Cynara cardunculus var. scolymus L.) based on AFLP, S-SAP, M-AFLP and microsatellite markers. Theor. Appl.Genet. 112:1532-1542.

LEE S.C., HWANG I.S., CHOI H.W., HWANG B.K., 2008.Involvement of the pepper antimicrobial protein CaAMP1gene in broad spectrum disease resistance. Plant Physiol. 148:1004-1020.

LESTER R.N., HASAN S.M.Z., 1991. Origin and domestication ofthe brinjal eggplant, Solanum melongena, from Solanumincanum, in Africa and Asia. In: Solanaceae III: taxonomy-chemistry-evolution. Hawkes J.G., Lester R.N., Nee M.,Estrada N. eds.. Royal Botanical Gardens Kew (London):369-387.

LING K.S., HARRIS K., MEYER J.D.F., LEVI A., GUNER N., WEHNERT.C., HAVEY M.J., 2008. Identification of a CAPS marker inan eIF4E gene linked to Zucchini yellow mosaic virus resis-tance in watermelon. Proc. 9th EUCARPIA meeting on genet-ics and breeding of Cucurbitaceae. Pitrat M. ed.. May 21-24,Avignon (France):213-218.

LIVINGSTONE K.D., LACKNEY V.K., BLAUTH J.R., VAN WIJK R.,JAHN M.K., 1999. Genome mapping in Capsicum and the evo-lution of genome structure in the Solanaceae. Genetics 152:1183-1202.

LOSA A., CAPORALI E., SPADA A., MARTINELLI S., MARZIANI G.,2004. AOM3 and AOM4: two MADS box genes expressed inreproductive structures of Asparagus officinalis. Sex. PlantReprod. 16:215-221.

LOZANO RUIZ R., ANGOSTO T., CAPEL J., PINEDA B., ANTON T.,ANGARITA P., PEREZ-MARTIN F., ATARES A., GARCIA-SOGO B.,GIMENEZ E., MORENO V., 2008. Generating a T-DNA inser-tional mutagenesis collection in tomato. Proc. 5th SolanaceaeGenome Workshop, October 12-16, Cologne (Germany) Abs.376.

LUO J., BUTELLI E., HILL L., PARR A., NIGGEWEG R., BAILEY P.,WEISSHAAR B., MARTIN C., 2008. AtMYB12 regulates caffeoylquinic acid and flavonol synthesis in tomato: expression infruit results in very high levels of both types of polyphenol.Plant J. 56:316-326.

LYI S.M., HELLER L.I., RUTZKE M., WELCH R.M., KOCHIAN L.V.,LI L., 2005. Molecular and biochemical characterization ofthe selenocysteine Semethyltransferase gene and Se-methylse-lenocysteine synthesis in broccoli. Plant Physiol. 2005138(1):409-420.

MAKANDAR R., ESSIG J.S., SCHAPAUGH M.A., TRICK H.N., SHAHJ., 2006. Genetically engineered resistance to Fusarium headblight in wheat by expression of Arabidopsis NPR1. Mol.Plant-Microbe Interact. 19:123-129.

MARTIN A., TROADEC C., BOUALEM A., RAJAB M., FERNANDEZ R.,MORIN H., PITRAT M., DOGIMONT C., BENDAHMANE A., 2009.A transposon-induced epigenetic change leads to sex determi-nation in melon. Nature 461:1135-1138.

MARTINEZ I., AURSAND M., ERIKSON U., SINGSTAD T.E.,VELLYULIN E., VAN DER ZWAAG C., 2003. Destructive andnon destructive analytical techniques for authentication andcomposition analyses of foodstuffs. Trends Food Sci. Technol.14:489-498.

MAURO R., PORTIS E., ACQUADRO A., LOMBARDO S.,MAUROMICALE G., LANTERI S., 2009. Genetic diversity ofglobe artichoke landraces from Sicilian small-holdings: impli-cations for evolution and domestication of the species.Conserv. Genet. 10:431-440.

MCHALE L.K., TRUCO M.J., KOZIK A., WROBLEWSKI T., OCHOA

Tucci et al.

30

O.E., LAHRE K.A., KNAPP S.J., MICHELMORE R.W. 2009. Thegenomic architecture of disease resistance in lettuce. Theor.Appl. Genet. 118:565-580.

MES T.H.M., FRITSCH R.M., POLLNER S., BACHMANN S.K., 1999.Evolution of the chloroplast genome and polymorphic ITSregions in Allium subg. Melanocrommyum. Genome 42:237-247.

MILLER J.C., TANKSLEY S.D., 1990. RFLP analysis of phylogenet-ic relationships and genetic variation in the genusLycopersicon. Theor. Appl. Genet. 80:437-448.

MINAMIYAMA Y., TSURO M., HIRAI M., 2006. An SSR-based link-age map of Capsicum annuum. Mol. Breed. 18:157-169.

MISHLER B.D., DONOGHUE M.J., 1982. Species concepts: A casefor pluralism. Syst. Zool. 31: 491-503.

MONTI L., 2008. La genomica per la valorizzazione dell’agrobio-diversità. Accademia Nazionale delle Scienze, detta dei XL.Memorie di Scienze Fisiche e Naturali 126°, vol. XXXII, P.II:7-30.

MORALES M., ORJEDA G., NIETO C., VAN LEEUWEN H., MONFORTA., CHARPENTIER M., CABOCHE M., ARÚS P., PUIGDOMENECHP., ARANDA M.A., 2005. A physical map covering the nsvlocus that confers resistance to melon necrotic spot virus inmelon (Cucumis melo L.). Theor. Appl. Genet. 111:914-922.

MORENO-VÁZQUEZ S., OCHOA O.E., FABER N., CHAO S., JACOBSJ.M., MAISONNEUVE B., KESSELI R.V., MICHELMORE R.W.,2003. SNP-based codominant markers for a recessive geneconferring resistance to corky root rot (Rhizomonas suberifa-ciens) in lettuce (Lactuca sativa). Genome 46:1059-1069.

MORRIS J., HAWTHORNE K.M., HOTZE T., ABRAMS S.A., HIRSCHIK.D., 2008. Nutritional impact of elevated calcium transportactivity in carrots. Proc. Natl .Acad. Sci. USA 105:1431-1435.

MUELLER L.A., TANKSLEY S.D., GIOVANNONI J.J., VAN ECK J.,STACK S., CHOI D., KIM B.D., CHEN M., CHENG Z., LI C.,LING H., XUE Y., SEYMOUR G., BISHOP G., BRYAN G.,SHARMA R., KHURANA J., TYAGI A., CHATTOPADHYAY D.,SINGH N.K., STIEKEMA W., LINDHOUT P., JESSE T., KLEINLANKHORST R., BOUZAYEN M., SHIBATA D., TABATA S.,GRANELL A., BOTELLA M.A., GIULIANO G., FRUSCIANTE L.,CAUSSE M., ZAMIR D., 2005. The Tomato Sequencing Project,the first cornerstone of the International Solanaceae Project(SOL). Comparative and Functional Genomics 6(3):153-158.

MUIR S.R., COLLINS G.J., ROBINSON S., HUGHES S., BOVY A., RICDE VOS C.H., VAN TUNEN A.J., VERHOEYEN M.E., 2001.Overexpression of petunia chalcone isomerase in tomatoresults in fruit containing increased levels of flavonols. Nat.Biotechnol. 19:470-474.

MUN J.H., KWON S.J., YANG T.J., KIM H.S., CHOI B.S., BAEK S.,KIM J.S., JIN M., KIM J.A., LIM M.H., LEE S.I., KIM H.I., KIMH., LIM Y.P., PARK B.S., 2008. The first generation of a BAC-based physical map of Brassica rapa. BMC Genomics 9:280.

MUTLU N., BOYACI F.H., GÖÇMEN M., ABAK K., 2008.Development of SRAP, SRAP-RGA, RAPD and SCAR markerslinked with a Fusarium wilt resistance gene in eggplant.Theor. Appl. Genet. 117:1303-1312.

NIGGEWEG R., MICHAEL A.J., MARTIN C., 2004. Engineeringplants with increased levels of the antioxidant chlorogenicacid. Nat. Biotechnol. 22:746-754.

NUNOME T., NEGORO S., KONO I., KANAMORI H., MIYATAKE K.,YAMAGUCHI H., OHYAMA A., FUKUOKA H., 2009.Development of SSR markers derived from SSR-enrichedgenomic library of eggplant (Solanum melongena L.). Theor.Appl. Genet. 119:1143-1153.

PARAN I., VAN DER VOORT J.R., LEFEBVRE V., JAHN M., LANDRYL., VAN SCHRIEK M., TANYOLAC B., CARANTA C., BEN CHAIMA., LIVINGSTONE K., PALLOIX A., PELEMAN J., 2004. An inte-grated genetic linkage map of pepper (Capsicum spp.). Mol.Breed. 13:251-261.

PARK S., CHENG N.H., PITTMAN J.K., YOO K.S., PARK J., SMITH

R.H., HIRSCHI K.D., 2005. Increased calcium levels and pro-longed shelf life in tomatoes expressing ArabidopsisH+/Ca2+ transporters. Plant Physiol. 139:1194-1206.

PARRELLA G., MORETTI A., GOGNALONS P., LESAGE M.L.,MARCHOUX G., GEBRE-SELASSIE K., CARANTA C., 2004. Theam gene controlling resistance to alfalfa mosaic virus intomato is located in the cluster of dominant resistance geneson chromosome 6. Phytopathology 94:345-350.

PARRELLA G., RUFFEL S., MORETTI A., MOREL C., PALLOIX A.,CARANTA C., 2002. Recessive resistance genes against potyvi-ruses are localized in colinear genomic regions of the tomato(Lycopersicon spp.) and pepper (Capsicum spp.) genomes.Theor. Appl. Genet. 105:855-861.

PAVAN S., ZHENG Z., VAN DEN BERG P., LOTTI C., DE GIOVANNIC., BORISOVA M., LINDHOUT P., DE JONG H., RICCIARDI L.,VISSER R., BAI Y., 2008. Map vs. homology-based cloning forthe recessive gene ol-2 conferring resistance to tomato pow-dery mildew. Euphytica 162:91-98.

PERCHEPIED L., BARDIN M., DOGIMONT C., PITRAT M., 2005.Relationship between loci conferring downy mildew and pow-dery mildew resistance in melon assessed by quantitative traitloci mapping. Phytopathology 95:556-565.

PÉRIN C., HAGEN S., DE CONTO V., KATZIR N., DANIN-POLEG Y.,PORTNOY V., BAUDRACCO-ARNAS S., CHADOEUF J., DOGIMONTC., PITRAT M., 2002. A reference map of Cucumis melo basedon two recombinant inbred line populations. Theor. Appl.Genet. 104:1017-1034.

PERL A., AVIV D., GALUN E., 1991. Protoplast-fusion-derivedSolanum cybrids: application and phylogenetic limitations.Theor. Appl. Genet. 79:632-640.

PORTIS E., MAUROMICALE G., MAURO R., ACQUADRO A.,SCAGLIONE D., LANTERI S., 2009. Construction of a referencemolecular linkage map of globe artichoke (Cynara carduncu-lus var. scolymus). Theor. Appl. Genet. DOI 10.1007/s00122-009-1159-1152.

RAMOS-ONSINS S.E., STRANGER B.E., MITCHELL-OLDS T., AGUADÈM., 2004. Multilocus analysis of variation and speciation inthe closely related species Arabidopsis thaliana and A. lyrata.Genetics 166:373-388.

RANC N., MUÑOS S., SANTONI S., CAUSSE M., 2008. A clarifiedposition for S. lycopersicum var. cerasiforme in the evolutio-nary history of tomatoes (Solanaceae). BMC Plant Biology8:130.

RAO R., CARAMANTE M., BLANCO A., LANTERI S., LUCCHIN M.,MAZZUCATO A., 2009. Innovazioni genetiche per l’identifica-zione e la protezione di prodotti tipici italiani. Ital. J. Agron. 3suppl.:95-101.

RICCARDI P., LEEBENS MACK J., CIFARELLI R., FALAVIGNA A.,SUNSERI F., 2009. Pyrosequencing based EST libraries devel-opment for SNPs discovery in Asparagus officinalis. Proc.53th Italian Society of Agricultural Genetics AnnualCongress, September 16-19, Torino (Italy) Abs. 1.06.

RICK C.M., 1986. Reproductive isolation in the Lycopersicumperuvianum complex. In: Solanaceae: Biology andSystematics. D’Arcy W.G. ed.. Columbia University Press(New York):477-495.

RICROCH A., YOCKTENG R, BROWN S., NADOT S., 2005. Evolutionof the genome size across some cultivated Allium species.Genome 48:511-520.

ROBERTSON D., 2004. VIGS vectors for gene silencing: many tar-gets, many tools. Annu. Rev. Plant Biol. 55:495-519.

RUOCCO M., DE MASI L., DE PALMA M., TURRÀ D. LORITO M.,TUCCI M., 2008. Tomato genotypes specifically modulate theinteractions with beneficial fungi of the genus Trichoderma.Proc. 4th EPSO Conference “Plants for life”, June 22-26,Toulon (France). Abs. P051.

SADEGHI A., SMAGGHE G., BROEDERS S., HERNALSTEENS J.P., DEGREVE H., PEUMANS W.J., VAN DAMME E.J., 2008.Ectopically expressed leaf and bulb lectins from garlic


31

(Allium sativum L.) protect transgenic tobacco plants againstcotton leafworm (Spodoptera littoralis). Transgenic Res. 17:9-18.

SEITZ C., EDER C., DEIML B., KELLNER S., MARTENS S.,FORKMANN G., 2006. Cloning, functional identification andsequence analysis of flavonoid 3’-hydroxylase and flavonoid3’,5’-hydroxylase cDNAs reveals independent evolution offlavonoid 3’,5’-hydroxylase in the Asteraceae family. PlantMol Biol. 61:365-381.

SENTHIL-KUMAR M., HEMA R., ANAND A., KANG L.,UDAYAKUMAR M., MYSORE K.S., 2007. A systemic study todetermine the extent of gene silencing in Nicotiana benthami-ana and other Solanaceae species when heterologous genesequences are used for virus-induced gene silencing. NewPhytol. 176:782-791.

SHINDO C., BERNASCONI G., HARDTKE C.S., 2007. Natural GeneticVariation in Arabidopsis: Tools, Traits and Prospects forEvolutionary Ecology. Annals of Botany 99:1043-1054.

SOENGAS P., HAND P., VICENTE J.G., POLE J.M., PINK D.A., 2007.Identification of quantitative trait loci for resistance toXanthomonas campestris pv. campestris in Brassica rapa.Theor. Appl. Genet. 114:637-645.

SONNANTE G., CARLUCCIO A.V., DE PAOLIS A., PIGNONE D., 2008.Identification of artichoke SSR markers: molecular variationand patterns of diversity in genetically cohesive taxa and wildallies. Genet. Resour. Crop Evol. DOI 10.1007/s1072-008-9310-5.

SPOONER D.M., CASTILLO R.T., 1997. Reexamination of seriesrelationships of South American wild potatoes (Solanaceae:Solanum Sect. Petota): evidence from chloroplast DNArestriction variation. Am J. B., 84:671-685.

STÄDLER T., ARUNYAWAT U., STEPHAN W., 2008. Populationgenetics of speciation in two closely related wild tomatoes(Solanum section Lycopersicon). Genetics 118:339-350.

STÄDLER T., ROSELIUS K., STEPHAN W., 2005. Genealogic foot-prints of speciation processes in wild tomatoes: demographyand evidence of historical gene flow. Evolution 59:1268-1279.

STÀGEL A., PORTIS E., TOPPINO A., ROTINO G.L., LANTERI S.,2008. Gene-based microsatellite development for mapping

and phylogeny studies in eggplant. BMC Genomics 9:357.TANSKLEY S.D., 1983. Molecular markers in plant breeding. Plant

Mol. Biol. Rep. 1:3-8.THABUIS A., PALLOIX A., PFLIEGER S., DAUBÈZE A.M., CARANTA

C., LEFEBVRE V., 2003. Comparative mapping ofPhytophthora resistance loci in pepper germplasm: evidencefor conserved resistance loci across Solanaceae and for alarge genetic diversity. Theor. Appl. Genet. 106:1473-1485.

TOPPINO L., MENNELLA G., RIZZA F., D’ALESSANDRO A.,SIHACHAKR D., ROTINO G.L., 2008. ISSR and isozyme charac-terization of androgenetic dihaploids reveals tetrasomicinheritance in tetraploid somatic hybrids between Solanummelongena and Solanum aethiopicum Group Gilo. Journal ofHeredity 99(3):304-315.

WAARA S., GLIMELIUS K., 1995. The potential of somatichybridization in crop breeding. Euphytica 85:217-233.

WU F., EANNETTA N.T., XU Y., DURRETT R., MAZOUREK M., JAHNM.M., TANKSLEY S.D., 2009a. A COSII genetic map of thepepper genome provides a detailed picture of synteny withtomato and new insights into recent chromosome evolution inthe genus Capsicum. Theor. Appl. Genet. 118:1279-1293.

WU F., EANNETTA N.T., XU Y., TANKSLEY S.D., 2009b. A detailedsynteny map of the eggplant genome based on conservedortholog set II (COSII) markers. Theor. Appl. Genet. 118:927-935.

ZAMIR D., 2008. Plant breeders go back to nature. NatureGenetics 40:269-270.

ZHANG L.B., GE S., 2007. Multilocus analysis of nucleotide varia-tion and speciation in Oryza officinalis and its close relatives.Mol. Biol. Evo. 24:769-783.

ZHANG N.W., PELGROM K., NIKS R.E., VISSER R.G.F., JEUKENM.J.W., 2009. Three combined quantitative trait loci fromnonhost Lactuca saligna are sufficient to provide completeresistance of lettuce against Bremia lactucae. MPMI 22:1160-1168.

ZHANG X., DAI Y., XIONG Y., DEFRAIA C., LI J., DONG X., MOUZ., 2007. Overexpression of Arabidopsis MAP kinase kinase 7leads to activation of plant basal and systemic acquired resi-stance. Plant J. 52:1066-1079.

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