Apostila tradescantia

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Bioensaios de toxicidade gentica com Tradescantia

Separata preparada a partir de RODRIGUES, G. S.; MA, T. S.; PIMENTEL, D. & WEINSTEIN, L. H. 1996. Tradescantia bioassays as monitoring systems for environmental mutagenesis. A review. Critical Reviews in Plant Sciences. 16(4):325-359. RODRIGUES, G. S. Assessment of the Abatement of Pesticide Mutagenesis in Situ by a Corn/Soybean Integrated Pest Management Program. 1995. Tese (Ph.D.) - Cornell University. Ithaca, NY. 141 p. RODRIGUES, G. S.; PIMENTEL, D.; WEINSTEIN, L. H. In situ assessment of pesticide mutagenicity in an integrated pest management program I - Tradescantia micronucleus assay. Mutation Research. in press, 1998.

Geraldo Stachetti RodriguesCentro Nacional de Pesquisa de Monitoramento e Avaliao de Impacto Ambiental Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria - EMBRAPA

1. Tradescantia e o bioensaio do microncleo na clula me do plen.Desde os primrdios dos estudos da atividade gentica de compostos qumicos e agentes fsicos, vrias espcies e clones do gnero Tradescantia tm sido utilizados como organismos experimentais, em virtude de uma srie de caractersticas genticas favorveis. Apresentando apenas seis pares de cromossomos grandes e facilmente observveis, clulas de quase todas as partes da planta, da ponta da raiz ao tubo polnico em desenvolvimento, fornecem material excelente para estudos citogenticos (Ma & Grant, 1982). Como consequncia do uso intenso de Tradescantia em estudos genticos, encontrou-se uma srie de caractersticas que permitem a deteco de agentes que afetam a estabilidade do genoma. Pelo menos quatro dessas caractersticas foram selecionadas como indicadores em bioensaios de avaliao de toxicidade gentica. Dois desses ensaios, o da mitose em ponta de raiz e o do tubo polnico, so ensaios de aberrao cromossmica nos quais se observa deformaes morfolgicas visveis nos cromossomos (Ma, 1982). Um terceiro, o ensaio da mutao para clula cor-de-rosa em plo estaminal (Trad-SHM) (Underbrink et al., 1973b) um teste de mutao mittica pontual que se baseia na expresso de um gene recessivo para cor da flor em plantas heterozigotas. O quarto ensaio um teste citogentico que se baseia na formao de microncleos (Trad-MCN) que resultam da quebra cromossmica nas clulas meiticas geradoras do plen (Ma, 1979b). Este ensaio foi aqui escolhido para uma anlise completa (in situ, de estratos de solo, e de formulaes comerciais) da genotoxicidade dos pesticidas aplicados em um programa de manejo integrado de pragas (MIP). A presente escolha deste sistema para esta anlise detalhada da toxicidade gentica de pesticidas se deveu no somente versatilidade e propriedade do ensaio para testes in situ em campo e in vivo em laboratrio, como tambm sua extraordinria sensibilidade (Ma et al., 1982). No presente texto examinam-se as caractersticas e fundamentos dos ensaios Trad-MCN e TradSHM e revisam-se os resultados at hoje obtidos com estes sistemas na avaliao de genotoxicantes ambientais. Adicionalmente, apresenta-se uma anlise dos experimentos conduzidos para a avaliao dos possveis efeitos que um programa de MIP poderia apresentar no sentido de abater a genotoxicidade de pesticidas visando diretamente um incremento na qualidade da agricultura atual.

1.1 Trad-MCN: Fundamentos e desenvolvimento do bioensaioEstudos sobre o genoma de Tradescantia iniciaram-se com os trabalhos pioneiros de Sax & Edmonds (1933) sobre o gametfito masculino de T. reflexa Raf., quando foram descritas as vrias fases do desenvolvimento do micrsporo e a determinados os perodos e o ritmo dos eventos meiticos. Observaes importantes foram feitas sobre os efeitos de raios-X nos micrsporos dessa espcie (Sax & Edmonds, 1933). Primeiramente, determinou-se que cromossomos meiticos eram mais suscetveis a quebra (breakage) que cromossomos mitticos; e mais importante, cromossomos em diviso eram ao menos dez vezes mais susceptveis que aqueles em repouso. Em segundo lugar, quebras (breaks) no se distribuam aleatoriamente nos cromossomos. Loci posicionados proximamente aos centrmeros apresentavam maior probabilidade de sofrer ruptura sob efeito da radiao. Estas observaes levaram concluso de que a espiralao dos cromossomos durante a replicao, devido s tenses mecnicas envolvidas, influenciaria fortemente a suscetibilidade a eventos mutacionais. Estas inferncias seriam mais tarde confirmadas em um estudo dos efeitos da radiao gama gerada por 60Co em T. paludosa And. and Woods. (Sparrow & Singleton, 1953). Os conceitos de temporalidade e sensibilidade que emergiram desses estudos tornaram-se extremamente importantes na seleo de bioindicadores para mutagnese, uma vez que sincronia no desenvolvimento celular e preciso nos perodos de recuperao aps os tratamentos mostraram-se dois fatores decisivos para a performance dos bioensaios. A maior suscetibilidade dos cromossomos meiticos quando comparados com os mitticos foi mais tarde confirmada em um estudo da influncia da falta de oxignio na meiose em T. paludosa (Steinitz, 1944). Esta pesquisa representou a primeira tentativa de observao de microncleos nas clulas me do plen como indicadores diretos de fragmentao cromossmica. Uma taxa espontnea de 0,87% de clulas contendo microncleos foi definida para T. paludosa, aumentando para 8,0% em clulas expostas a anaerobiose nos estgios iniciais da prfase. O ritmo dos estgios da meiose foi ainda melhor caracterizado em um estudo da diferenciao das anteras de T. paludosa (Taylor, 1950). Aproximadamente 24 h se passaram para compleio do ciclo meitico, permitindo a definio do perodo de recuperao apropriado entre a exposio das inflorescncias

a agentes txicos, e sua fixao para anlise do nmero de microncleos, consequentemente da atividade genotxica. O crescente interesse nas capacidades radiomimticas (especialmente genotxicas) de substncias qumicas nos anos 50 sugeriram a utilizao de Tradescantia como um bioindicator. Um ensaio de mitose no tubo polnico foi primeiramente empregado em um estudo comparativo de agentes qumicos simples em T. paludosa (Smith & Lofty, 1954). xido de etileno (um agente mutagnico conhecido), queteno (um composto com resultados inconclusivos), e cloreto de metila (um agente alquilante de baixa potncia) foram comparados para induo de quebras em cromtides e eroso e contrao nos cromossomos. O ensaio do tubo polnico mostrou-se efetivo na deteco de genotoxicidade, os resultados revelando que os compostos mais ativos (xido de etileno e queteno) causavam mais numerosas e extensivas aberraes cromossmicas. A propcia seleo de compostos a serem testados nesta pesquisa permitiu a demonstrao da sensibilidade de Tradescantia, e sua capacidade para diferenciar precisamente efeitos comparativamente similares. Numa srie de artigos a respeito do papel de determinados nutrientes na meiose, a produo de microncleos nos micrsporos de T. paludosa foi tomada como indicativa de quebra cromossmica (Steffensen, 1953; Steffensen, 1954; Steffensen, 1955). Estudando os efeitos da deficincia em magnsio (Mg) na meiose, o autor notou uma maior sensibilidade dos micrsporos quando comparados com pontas radiculares, de acordo com as evidncias prvias de maior suscetibilidade de clulas meiticas que mitticas. Microncleos apareciam em maior nmero em plantas deficientes em Mg, clcio (Ca) e enxofre (S). Note-se que os dois primeiros nutrientes so responsveis pela ligao de macromolculas no ncleo, contribuindo para a estabilidade de protenas e DNA. Uma taxa espontnea de microncleos de 0,84% foi registrada, aumentando para 3,89% em plantas cultivadas com meio deficiente em Ca (Steffensen, 1955). Estes nmeros vm corroborar observaes prvias de produo de microncleos em T. paludosa (Steinitz, 1944). Mais de 30 anos aps a observao de microncleos para deteco de danos meiose feita por Steinitz, Ma e colaboradores (Ma et al., 1978) no Laboratrio Nacional Brookhaven desenvolveram o ensaio do microncleo-na-ttrade (Trad-MCN) para mutagnese. Empregando o clone hbrido 4430 (T. hisutiflora Bush x T. subacaulis Bush) eles compararam a reduo de microncleos nas clulas me do plen com

mutaes para clulas cor-de-rosa nos plos estaminais de Tradescantia expostas ao conhecido agente mutagnico 1,2-dibromoetano (DBE). J naquele tempo o ensaio da mutao em plos estaminais (Underbrink et al., 1973b) vinha sendo extensivamente empregado e era um teste reconhecido para mutagnese radiobiolgica e qumica. O ensaio do microncleo, contudo, exibiu uma eficincia aproximadamente 36 vezes maior. Esta sensibilidade extraordinria foi creditada muito menor especificidade do dano necessrio para produzir microncleos quando comparada mutao nos plos estaminais. De acordo, poderia assumir-se que numerosos loci em qualquer dos 12 cromossomos de Tradescantia estaria sujeitos a danos que resultariam em quebra dos cromossomos, e consequentemente em microncleos. Em contraste, somente um locus em um nico cromossomo poderia sofrer mutao para produo de clulas cor-de-rosa em plos estaminais (Ma et al., 1978). A enorme sensibilidade e simplicidade do ensaio Trad-MCN foi ainda demonstrada em experimentos nos quais baixas doses de raios-X eram comparadas com dois agentes mutagnicos conhecidos, EMS e azida sdica (NaN3) em ambas formas gasosa e lquida (Ma, 1979a). Uma dose de raios-X de apenas 20-rad induziu altas frequncias de microncleos (23 MCN/100 ttrades), enquanto apenas 1,8 MCN/100 clulas foram induzidos por 50-rad de raios-X em linfcitos humanos (Countryman and Heddle, 1976 cited in Ma, 1979a), ou 2,5 MCN/100 eritroblastos de camundongo em cultura de medula ssea expostas a 35-rad de raios-X (Janssen and Ramel, 1976 cited in Ma, 1979a). Enquanto ocorria 0,2% mutaes por rad no ensaio do plo estaminal (Trad-SHM), ocorria 1,6% MCN por rad no ensaio Trad-MCN. A relao entre dose e efeito no ensaio Trad-MCN com raios-X resultou num coeficiente de correlao de 0,99. Os resultados obtidos com os agentes qumicos confirmaram estes dados, tanto em relao