“Microarrays” Reais e Virtuais: Passo a Passo...“Microarray” virtual: passo a passo O tapete...
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“Microarrays” Reais e
Virtuais: Passo a Passo
Versão 2.3
Anastasios KoutsosAlexandra ManaiaJulia Willingale-Theune
ELLS – European Learning Laboratory for the Life Sciences
VersãoPortuguesa
“Microarrays” Reais e Vir-
tuais: Passo a Passo
Versão 2.3
Anastasios Koutsos, Alexandra Manaia e Julia Willingale-Theune
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“Microar rays” Rea is e V i r tua is
“Microarrays” reais: passo a passo
Produção dos fragmentos de ADN
Para produzir os microarrays os cientistas:
- usam a “PCR (polymerase chain reaction)”,
técnica de amplificação de ADN que produz
milhares de pequenos fragmentos de ADN em
cadeia dupla.
- ou, caso conheçam a sequência nucleotídica
do gene, podem encomendar a produção de
fragmentos em cadeia simples com idêntica
composição nucleotídica.
“Microarray” virtual: passo a passo
O tapete
Pode fabricar o seu próprio tapete ou pode
escrever-nos ([email protected]) e encomendar a
versão do tapete em plástico (1x2.5 m),
especialmente concebida para ser utilizada na
sala de aula por 40 Euros (não incluindo custos
de envio).
Impressão ou “spotting”
Os microarrays de ADN podem ser facilmente
produzidos no laboratório usando lâminas de
vidro, como as que são correntemente utilizadas
em microscopia. Imprimir 20 000 pequeníssimos
“spots ” de ADN (cada “spot” contendo biliões
de cópias de ADN de um mesmo gene) numa
pequena superfície é uma tarefa muito difícil.
Os “spots” têm de ser exactamente da mesma
forma e equidistantes uns dos outros. Estas
dificuldades conseguem ser ultrapassadas
graças à utilização de robots no fabrico dos
“microarrays”.
Impressão ou “spotting”
No “Microarray Virtual”, um tapete de tecido
representa a lâmina de vidro contendo 10 spots.
Cada “spot” contém fragmentos de ADN em
cadeia simples, específicos de um destes 10
genes: Alexandre Fleming, Jacques Monod,
Thomas Morgan, Barbara Mcclintock, Leo
Szilárd, John Kendrew, Francis Crick, Rosalind
franklin, Maurice Wilkins e James Watson. As
moléculas de ADN são representadas por Velcro
colorido. Por exemplo, para o gene John
Kendrew, os fragmentos de Velcro são
vermelhos. Terá que colocar os fragmentos
de Velcro correspondentes a cada gene, no
respectivo “spot” (círculo), no seu tapete de
“microarray”.
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O braço do robot transporta um conjunto
especial de 48 tubos capilares em ouro até
aos reservatórios, onde se encontram as várias
soluções de fragmentos de ADN que vão ser
impressos nas lâminas. Como estes capilares
são muito sofisticados, delicados e caros, o
robot está equipado com apenas 48, que são
utilizados inúmeras vezes. O braço do robot
mergulha os capilares nas amostras, retira-as e
posiciona-se sobre uma fila de lâminas de vidro
pré-tratadas. Então, pressiona ligeiramente os
capilares, de modo a que cada capilar deposite
200nl de amostra na lâmina de vidro. Quando
uma linha de “spots” fica impressa na primeira
lâmina, o braço move-se para a segunda lâmina
e assim sucessivamente, de modo a que
todas as lâminas possuam uma fila equivalente
de “spots”. Quando uma fila está completa em
todas as lâminas, o braço lava os capilares,
mergulhando-os depois num novo conjunto de
amostras. Regressa então à primeira lâmina
onde imprime uma nova fila de spots. O
processo é repetido muitas vezes até à produção
de uma série de lâminas- cada lâmina é um
“microarray” com 20,000 spots. Após impressão
as lâminas são aquecidas para fixar o ADN ao
vidro.
Extracção de mARN
O mARN é representado por lanternas de bolso.
Cada lanterna corresponde a mARN de cadeia
simples específico de um determinado gene (Velcro
vermelho para o mARN correspondente ao gene
John Kendrew). Cada lanterna tem também uma
etiqueta de identificação.
Extracção de mARN
Para realizar uma experiência com microarrays,
os cientistas extraem mARN das células que
querem estudar. A extracção é um processo
relativamente simples.
Para cada experiência, é necessário utilizar
mARN proveniente de dois tipos de células:
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células controlo e do tipo celular que se está a
estudar. Por exemplo, cientistas interessados em
estudar células cancerosas, utilizariam mARN de
células normais (não-cancerosas) como controlo
e mARN proveniente de células cancerosas do
mesmo tipo de tecido.
Uma vez extraídas, as moléculas de mARNs
precisam de ser marcadas com moléculas
fluorescentes1, de modo a poderem ser
detectadas mais tarde, na superfície do
microarray. O mARN das células controlo é
geralmente marcado com uma molécula
fluorescente verde e o mARN das células em
estudo é marcado com um marcador
fluorescente vermelho.
O número exacto e os nomes das lanternas será
discutido adiante. Por agora basta saber que
existem umas lanternas correspondentes ao
mARN das células controlo e outras
correspondentes ao mARN das células em
estudo.
As lanternas precisam de ser marcadas com
papel transparente autocolante verde ou
vermelho representando o mARN dos tipos
celulares: vermelho para o mARN das células
cancerosas e verde para o mARN das células
controlo.
Hibridação
Trata-se agora de hibridar os mARNs marcados
com as moléculas fluorescentes (lanternas) com as
moléculas de ADN (Velcro), presentes no
microarray (tapete). Coloca-se a mistura de
lanternas em contacto com o “microarray” (tapete).
Apenas as lanternas com Velcro de cores
apropriadas irão hibridar com as moléculas de
ADN em cadeia simples, presentes no
“microarray”. Por exemplo: as lanternas com
Velcro vermelho vão hibridar com o Velcro
vermelho no “microarray” e as lanternas com
Velcro amarelo hibridarão com o Velcro amarelo no
“microarray”.
As lanternas com uma cor de Velcro que não
exista no “microarray” (tapete) não se ligarão. As
moléculas de Velcro que apresentam mais do que
uma cor (ver na figura abaixo, a lanterna que está
na mão), representam a situação em que apenas
Hibridação
Neste passo, o mARN controlo (marcado a
verde) é misturado com o mARN teste (marcado
a vermelho). A mistura é vertida sobre a
superfície da lâmina de vidro que é então
incubada a 42°C, de modo a que as cadeias
simples mARN da mistura se liguem (hibridem)
ao ADN complementar no microarray. Após
12 horas, o “microarray” é lavado de modo a
remover as moléculas de mARN que não tenham
encontrado alvos complementares nas lâminas.
O “microarray” está então pronto a ser
digitalizado –“scanneado”.
1 As cores não são vísiveis à luz normal.
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Scanning do “microarray”—aquisição de
imagem
Chegou o momento de identificar quais os
mARN que hibridaram com as moléculas alvo de
ADN. Para tal, utiliza-se um “scanner laser”,
segundo um princípio semelhante ao “scanner”
que digitaliza as imagens para uso, num
computador. O laser faz o “scanning” da lâmina
e combina as imagens, produzindo uma imagem
final que se assemelha à figura abaixo:
Reparando atentamente na figura acima,
notamos que não há só “spots” vermelhos e
verdes mas também “spots” amarelos e laranja.
uma porção do mARN é complementar ao ADN
presente no “microarray”. Nestes casos, a
hibridação é muito fraca e as moléculas de
mARN fracamente ligadas, são eliminadas
durante a lavagem.
Colocar as lanternas no tapete, ligando-as ao
Velcro da mesma cor, no tapete. Neste ponto
deve ligar-se a luz das lanternas.
Scanning do “microarray”—aquisição de
imagem
Para fazer o “scanning” do microarray virtual, ligar
todas as lanternas que se encontram sobre o
tapete do microarray, não as retirando dos seus
lugares. Desligar então as luzes da sala e observar
o microarray. Ir analisando o microarray “spot” a
“spot” (círculo a círculo).
O que se pode dizer acerca da intensidade de
cores? É de notar que no “microarray” virtual não
é possível reproduzir os “spots” amarelos. No
entanto, os spots vermelhos e verdes são
fácilmente distinguíveis. Convém anotar o número
de lanternas vermelhas e verdes para cada gene.
Estes dados serão necessários para a análise dos
resultados.
Tal como para os microarrays reais, os círculos
mostram uma gradação de cores. Num círculo
onde só há lanternas vermelhas, só o mARN de
células cancerosas hibridou com as moléculas de
ADN. Do mesmo modo, os círculos verdes
correspondem a uma hibridação exclusivamente
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Os spots vermelhos contêm apenas mARN de
células cancerosas, e os “spots” verdes apenas
mARN das células controlo, não cancerosas.
Mas o que acontece se quantidades idênticas de
mARN das células controlo e das células
cancerosas hibridarem com o mesmo ADN alvo?
Da sobreposição dos sinais verde e vermelho
resulta um sinal amarelo! É preciso não esquecer
que o mARN hibrida com o ADN no
“microarrray” que lhe é complementar, e que um
“spot” no microarray representa biliões de cópias
de ADN de UM único gene. Por outras palavras,
quando um “spot” é amarelo, quer dizer que
existem quantidades aproximadamente iguais de
mARN desse gene nas células cancerosas e nas
células controlo.
Quando um “spot” é laranja, quer dizer que
existe uma quantidade relativa maior de mARN
desse gene nas células cancerosas do que nas
células controlo (normais).
Os “spots” pretos correspondem a uma ausência
de mARN específico desses genes, quer nas
células controlo quer nas células cancerosas.
de mRNA das células controlo. Os círculos
amarelos correspondem a igual quantidade de
mARN nas células cancerosas e nas células
controlo. Isto é uma simplificação, pois como
vemos, no “microarray” real pode observar-se
grande variação na cor dos “spots” (ver o “ícone”
para esta actividade na página Web!), que só
consegue ser decifrada com auxílio de um
“scanner laser” e de um programa de análise.
Normalização
No “Microarray de ADN” nem sempre a
intensidade do “spot” corresponde à quanti-
dade real de mARN que hibridou. Isto porque o
processo de marcação do mARN é influenciado
pelo tamanho da cadeia do mARN e pelo tipo
de marcador utilizado. Um processo matemático
designado por normalização corrige as
intensidades dos “spots”, de modo a que estas
reflictam a quantidade de mARN presente nas
moléculas hibridadas. Depois da normalização a
análise dos dados pode prosseguir.
Normalização
Segundo o que puderam ler quanto ao fabrico
dos “microarrays” reais, os cientistas conseguem
estimar a quantidade de mARN, a partir da cor do
spot após scanning e análise do “microarray”. Em
paralelo, também podemos estimar o número de
lanternas por círculo, através da intensidade da luz.
Mas consideremos o seguinte exemplo: se
existe uma lanterna num “spot”, e se noutro “spot”
existem duas lanternas, e se todas as lanternas
tiverem o mesmo número de baterias, então será
de esperar que a luz emitida por duas lanternas
seja duas vezes tão intensa quanto a de uma só
lanterna.
Mas o que acontecerá se as baterias das duas
lanternas possuírem apenas metade da
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Análise e “Clustering”
Se os cientistas analisassem os resultados “spot”
a “spot”, levariam anos a analisar um
“microarray”. Assim, os cientistas desenvolveram
uma maneira de associarem os genes que têm
um comportamento semelhante em grupos- os
“clusters”. Existem programas de computador
que permitem executar estes passos
automaticamente.
intensidade? Nesse caso, as duas lanternas num
“spot” serão tão intensas quanto a única lanterna
no outro “spot”. Por outras palavras, a
quantidade de luz das lanternas no
“microarray” virtual não depende apenas do
número de lanternas, mas também do tipo de
baterias que existem em cada lanterna.
Análise e “Clustering”
Este passo será explicado na secção: Exercícios
de clustering para a sala de aula [PDF].
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a todos os que contribuíram para a elaboração desta
actividade:
- Ao Udo Ringeisen e a toda a equipa do Departamento de Fotografia do EMBL (EMBL
Photolab), pela impressão dos tapetes do “microarray” em tecido, (para demonstração
em cursos ou festivais de ciência) e pela produção da versão em plástico, (para
utilização na sala de aula);
- Ao Thomas Sandmann, na altura estudante de doutoramento no EMBL-Heidelberg,
por várias discussões e sugestões muito úteis e também por nos ter chamado a
atenção para o excelente material sobre “microarrays” intitulado ‚Snapshots of Science
and Medicine‘, produzido pelo “NIH Office of Science Education”, em conjunto com o
“Office of Research on Women‘s Health”;
- Ao Russ Hodge, na altura, no Departamento de Comunicação e Relações Públicas
do EMBL-Heidelberg (“Office of Information and Public Affairs” [OIPA]), bem como a
toda equipa do “European Learning Laboratory for the Life Sciences” [ELLS], por muitas
discussões, sugestões e apoio;
- A Giovanni Frazzetto, Mehrnoosh Rayner e Vassiliki Koumandou por terem lido a
primeira versão desta actividade e por terem contribuído para melhorá-la com as suas
ideias e comentários.
- A vários amigos e colegas do EMBL-Heidelberg com quem partilhámos ideias,
entusiasmo e dúvidas;
- “Os Exercícios para a sala de aula” foram adaptados do material sobre “microarrays”
intitulado “Snapshots of Science and Medicine”, produzido pelo “NIH Office of Science
Education”. Pode ser encontrado no seguinte website:
science-education.nih.gov/snapshots;
Imagem de capa por André-Pierre Olivier;
Traduzido por Alexandra Manaia;
Editado por Corinne Kox e Sonia Furtado.
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