Aмьсгалын замын өвчин үүсгэгчзарим вирүсийг R-Mix хибрид эсийн

өсгөвөрт өсгөвөрлөниммунофлюоресцент микроскопын

аргаар илрүүлсэн дүн

С.Цацрал ХӨСҮТ, Вирүс судлалын лаборатори

Судалгааны ажлын үндэслэлДэлхийд хамгийн элбэг тохиолдож байгаа өвчний нэг бол

амьсгалын замын өвчин юм. Зарим судлаачдын бичиж байгаагаар хүнбүр жилд дунджаар 6 удаа энэ өвчнөөр өвчилдөг бөгөөд нас баралт нь65-аас дээш мөн 2-оос доош насныханд их байдаг онцлогтой.

Манай улсад 2007/2008 оны байдлаар ТТӨ 10000 хүн ам тутамд745.1 тохиолдол бүртгэгдэж, нийт амбулитороор үйлчлүүлсэн 3,947,059 хүний 4.8% нь ТТӨ гэсэн оноштой, мөн уушгины хатгалгаа гэсэноноштой 11034 хүний 52(0,47%) нь нас барсан үзүүлэлттэй байна.

Эндээс харахад ТТӨ нь жил бүр нийт хүн амын багагүй хувийгхамран тархаж эрүүл мэндийн болон эдийн засгийн хохиролучруулдаг, дэлхийн олон орны нийгмийн эрүүл мэндийн тулгамдсанасуудлын нэг байсаар байгаа юм.

Амьсгалын замын өвчлөлийн анхдагч шалтгааны 95 орчим хувьнь вирүс байдаг бөгөөд манайд одоогоор эдгээр вирүсүүдийг цогцбайдлаар оношлох арга, технологи хомс байгаа тул энэ судалгаагаар АНУ-ын DHI, Inc., компанид боловсруулсан R-Mix хибрид эсийн өсгөвөр ашиглан иммунофлюоресцент микроскопын аргаар (R-Mix/DFA) ТТӨүүсгэгч 4 төрлийн 7 хэвшинжийн вирүс илрүүлэх хурдавчилсан аргыг уламжлалт бусад аргатай харьцуулан судлах зорилт тавьсан юм.

Судалгааны ажлын зорилго

Томуу, томуу төст өвчин (ТТӨ) үүсгэгч4 төрлийн 7 хэвшинжийн вирүсийгDiagnostic Hybrids компаны R-Mix хибридэсийн өсгөвөрт өсгөвөрлөн эдгээр вирүсийн эсрэгтөрөгч илрүүлэх DFA цомог оношлуур ашиглан дархантуяаралт бичил харуур (ДТБХ)-ын аргаарялган дүйх шинэ технологийг MDCKэнгийн эсийн өсгөвөр болонполимеразын гинжин урвал (ПГУ)-ынаргатай харьцуулан судлахад оршино.

Судалгааны ажлын зорилт

R-Mix хибрид эсийн өсгөвөрт өсгөвөрлөн(R-Mix/DFA) ДТБХ-ын аргаар ТТӨ вирүсүүдийнхэвшинжийг тодорхойлохMDCK энгийн эсийн өсгөвөрт өсгөвөрлөн ЦНУ-аар томуугийн вирүсийн таньцыг тодоройлохMDCK болон R-Miх эсийн өсгөвөр, R-Miх эсийнөсгөвөрт ДТБХ-ын аргаар ТТӨ вирүсүүдийг тодорхойлох аргыг ПГУ-ын аргатай тус тусхарьцуулах

Судалгааны материал, арга зүй

Судалгааны хамрах хүрээ, материал

Улаанбаатар хотын БЗД, БГД, СБД, СХД, ХУД, ЧД, НД, БНД-үүдийн нэгдсэн эмнэлэг болонзарим өрхийн эмнэлэг, ЭНЭШТ, Дархан-уул, Орхон, Ховд, Дорнод, Дорноговь, Сэлэнгэ, Өвөрхангай аймгуудын нэгдсэн эмнэлэг болонөрхийн эмнэлэгт ТТӨ-ний хурц үедээ үзүүлж буйүйлчлүүлэгчдийг хамруулсан.

Судалгаанд ХӨСҮТ-ийн Вирүс судлалынлабораторт 2007-2009 онуудад цуглуулсан хамар залгиурын арчдас 18705 сорьцноос санамсаргүйтүүврийн аргаар сонгон авсан 2950 (15,7%)сорьцыг материал болгон ашиглалаа.

50 сорьцонд дээрхи 2 аргыг ПГУ-ын аргатайхарьцуулан дүгнэв.

Diagnostic HybridsБидний туршин үзэж байгаа энэхүү шинэ

технологи нь АНУ-д 1983 онд үүсгэн байгуулагдсанDIAGNOSTIC HYBRIDS компаний бүтээл юм. Энэ ньамьсгалын замын өвчин үүсгэгч 7 хэвшинжийнвирүс (томуугийн А болон В хүрээний вирүс, аденовирүс, респиратор-синцитиал вирүс, ижтомуугийн 1, 2, 3-р хүрээний вирүс)-ийг нэг дорөсгөвөрлөх боломжтой R-Mix (Mixed Readycell)хибрид эсийн өсгөвөр болон эдгээр вирүсийнэсрэг өвөрмөц эсрэгбие бүхий будагч бодисагуулсан DFA (D³UltraDFA Respiratory virus screening & ID kit) цомог оношлуураас бүрддэг.

R-Mix хибрид эсийнөсгөвөр

R-Mix-ийг анх 1998 онд гаргаж авсанбөгөөд энэ нь А549 (Human Lung Carcinoma), Mv1Lu (Mink Lung) гэсэнэсүүдийн холимог хибрид эсийн өсгөвөр юм.

Уг эс нь 2003 онд олон улсынстандартын ISO 13485 тоот гэрчилгээавсан .

R-Mix хибрид эсийн өсгөвөртөсгөвөрлөх

R-Mix эсийн өсгөвөр ньзориулалтын тавиур шилбүхий хуруу шилэнд 100%-ийнургалттайгаар хуурай мөстэйсаванд хөлдүү байдлаар тээвэрлэгдэн ирдэг.

Эсийн өсгөвөрийг гүнхөлдөөгчид -70°С-д хөлдүүбайдлаар хадгаланхэрэглэхийн өмнөзориулалтын халаагууртгэсгээн үйлдвэрлэгчийнзааврын дагуушинжлэгдэхүүнийг халдаана.

АмьсАмьсггалыналын замынзамын ввииррүсийнүсийнхэвхэвшинжийшинжийг тг тодоодорхрхойлоойлохх

Томуугийн А, В хүрээнийвирүс, аденовирүс, рс вирүс, иж томуугийн 1, 2, 3-рхүрээний вирүсүүдийнхэвшинжийг тодорхойлохдооэдгээр вирүсүүдийн эсрэгөвөрмөц эсрэгбие бүхийбудагч бодис агуулсан DFA (direct fluorescent antibody) цомогоношлуур ашигланхалдварлуулсан эсийнөсгөвөрөө будажиммунофлюресцентмикроскопт харна.

Японы Olympus DP71микроскоп

Бэлтгэл ажил

-70°С-д хөлдөөсөн тубтэй эсээ зориулалтынхалаагуурт 4 мин тавьж гэсгээнэ

Мөсний талст үлдсэн эсэхийнажиглаад тэжээлээ соруулж авна

0,5 мл зайлагч уусмалхийгээд 4 мин тавина

Уусмалаа соруулж аваад1 мл тэжээгч тэжээл хийнэ

3 ширхэг тубтэй R-Mix эстус бүрд 200 мкл сорьц халдаана

Центрифугт 750 эрг/мин-нд40 мин хурилдуурдаад

37°С-д 16-24 цаг өсгөвөрлөнө

1-р шатАмьсгалын замын вирүс илрүүлэх

будгаар будна

Эсээ иммонофлюресцентмикроскопт харна

Эсд дархан туяаралт өгсөн Эсд дархан туяаралт өгөөгүй

2, 3-р шатЭсээ 8 хуваагаад Monoclonal будгаар

будаж микроскопт харна

2-р шатДахин 16-24 цаг өсгөвөрлөөд амьсгалын замынвирүс илрүүлэх будгаар будаж микроскопт харна

Эсд дархан туяаралтөгөөгүй бол амьсгалын

замын вирүс байхгүй гэж үзнэ

Эсд дархан туяаралт өгсөн

Полимеразын гинжин урвал

РНХ ялгахQIAamp Viral RNA Mini Kit РНХ ялгах

цомгийг үйлдвэрлэгчийн зааврын дагууашиглан томуугийн А болон В хүрээнийвирүс, респиратор-синцитиал вирүс, ижтомуугийн 1, 2, 3 хэвшинжийнвирүсүүдийн РНХ-г ялгасан.

ДНХ ялгахQIAamp DNA Mini and Blood Mini Kit ДНХ

ялгах цомгийг үйлдвэрлэгчийн зааврийндагуу ашиглан Аденовирүсийн ДНХялгасан.

Нэг шатлалт УТ-ПГУQIAGEN компаний УТ-ПГУ-ын OneStep RT-PCR

цомгийг үйлдвэрлэгчийн зааврийн дагууашиглсан.

30''15'

34 давталт

denaturation annealing extension

Reverse transcription

10' 1'

60°С42°С 50°С

30'

95°С 94°С

50°С30''

72°С 72°С1' 10'

ПГУQIAGEN компаний ПГУ-ын Taq PCR Master Mix

цомгийг үйлдвэрлэгчийн зааврийн дагуу ашигланАденовирүсийг тодорхойлсон.

30''30'

34 давталт

denaturation annealing extension

94°С 94°С

50°С30''

72°С 72°С1' 10'

Ашигласан праймерийнжагсаалт

334bpN ген5‘-GATGTTACGGTGGGGAGTCT-3‘5‘-GTACACTGTAGTTAATCACA-3‘

RSVA-FRSVA-R

10

234bpM ген5‘-TTCTAACCGAGGTCGAAACG-3‘5‘-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3‘

A/M30F-2A/M264R2-2

1

726bpНА ген5‘-AGCAAAAGCAGGGGAAAATAA-3‘5‘-GCTATTTCTGGGGTGAATCT-3‘

H1F1H1R-727

2

563bpНА ген5‘-ACTATCATTGCTTTGAGC-3‘5‘-TGGCATAGTCACGTTCAG-3‘

H3HAF-7H3HAR-570

3

1142bpНА ген5‘-AGCAGAAGCGTTGCATTTTC-3‘5‘-ACCAGCAATAGCTCCGAAGA-3‘

BF-1BR-1143

4

193bpМ ген5‘-GCCGAGAAGGGCGTGCGCAGGTA-3‘5‘-ATGACTTTTGAGGTGGATCCCGGA-3‘

AD-FAD-R

5

317bpHN ген5‘-CCTTAAATTCAGATATGTAT-3‘5‘-GATAAATAATTATTGATACG-3‘

PIP1-FPIP1-R

6

203bpHN ген5‘-AACAATCTGCTGCAGCATTT-3‘5‘-ATGTCAGACAATGGGCAAAT-3‘

PIP2-FPIP2-R

7

102bpHN ген5‘-CTGTAAACTCAGACTTGGTA-3‘5‘-TTTAAGCCCTTGTCAACAAC-3‘

PIP3-FPIP3-R

8

838bpN генP ген

5‘-GTCTTACAGCCGTGATTAGG-3‘5‘-GGGCTTTCTTTGGTTACTTC-3‘

RSVAB-FRSVAB-R

9

ПГУ-ынбүтээгдэхүүн

Эх үүсвэрНуклейн хүчлийн дараалалПрайиерийн нэр№

183bpN ген5‘-AATGCTAAGATGGGGAGTTC-3‘5‘-GAAATTGAGTTAATGACAGA-3‘

RSVB-FRSVB-R

11

Гель электрофорез

1%-ийн агарозын гельд 100 мл тутамд13мкл бромт этидий нэмж, 100V-т 30 минутгүйлгэн, хариуг трансиллюминаторт302нм гэрэлд уншсан.

Томуугийн вирүсийг MDCK эсийн өсгөвөрт өсгөвөрлөх

MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) эсийн өсгөвөрт Америкийн өвчнийхяналт сэргийлэлтийнтөвөөс гаргасанпротоколийн дагууөсгөвөрлөсөн.

Томуугийн вирүс таньцлах96 нүхтэй U

хэлбэрийн урвалийнсамбарт усан гахайнцусны улаан эсийн0,75%-ийн цийдмэгашиглан ЦНУ-аартомуугийн вирүсийгтаньцласан.

Судалгааны ажлынүр дүн

ТТӨ вирүс илэрсэн байдал(долоо хоногоор)

0

5

10

15

20

25

30

45 48 51 2 5 8 11 14 17 20 23 26 29 32 35 38 41 44 47 50 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

-

5

10

15

20

25

30

35

4045

50

5560

6570

7580

IA IB AD RSV P1 P2 P3 халдаасан сорьцын тоо

2007 2008 2009

Вирүсийн тоо Сорьцын тоо

Судалгаанд хамрагдсанхүмүүсийн насны ангилал

Судалгаанд хамрагдсан хүмүүсийнхүмүүсийн хүйсийн харьцаа

R-Mix хибрид эсийн өсгөвөрт ТТӨүүсгэгч вирүс илрүүлсэн байдал

Иж томуу 1, 11.3%

Иж томуу 2 , 1.2%

Респираторсинцитиал, 9.6%

Аденовирүс , 11.7%

Томуу В , 6.8%

Иж томуу 3 , 16.1%

Томуу А , 32.3%

R-Mix хибрид эсийн өсгөвөрт ТТӨүүсгэгч вирүсүүдийн харагдах байдал

(Olympus DP71 маркийн иммунофлюресцент микроскоп, 10x40 өсгөлт)

Томуугийн А хүрээний вирүс Томуугийн В хүрээний вирүс Аденовирүс

Респиратор синцитиал вирүс Иж томуу 1 вирүс Иж томуу 3 вирүс

MDCK эсийн өсгөвөрт томуугийнвирүс илрүүлсэн байдал

Эндээс харахад R-Mix эсийн өсгөвөр нь MDCK эсийнөсгөвөрөөс 2,3 дахин олон томуугийн вирүс илрүүлжбайгаагаас гадна 3 төрлийн вирүсийг нэмж илрүүлэх чадвартай байгаа юм.

32.3%

14.9%

6.8%

2.0%

0.0%

5.0%

10.0%

15.0%

20.0%

25.0%

30.0%

35.0%

Томуу А Томуу В

R-Mix хибрид эсийн өсгөвөр MDCK эсийн өсгөвөр

MDCK болон R-Mix эсийн өсгөвөртөсгөвөрлөгдсөн үр дүнг ПГУ-тай

харьцуулсан байдал

ТТӨ үүсэгч вирүсMDCK эсийн

өсгөвөр

R-Mix эсий

н

өсгөвөр

ПГУ

Эерэг үр дүн 2 25 20Томуугийн А

хүрээний вирүс1 10 10

Томуугийн Вхүрээний вирүс

1 2 2Респиратор-

синцитиал вирүс- 8 6

Аденовирүс - 2 1Иж томуугийн 1

вирүс- 2 0

Иж томуугийн 2 вирүс

- 0 0Иж томуугийн 3

вирүс- 1 1

Сөрөг үр дүн 48 25 30

Томуугийн А, В хүрээний вирүс, иж томуугийн 3 вирүс 100% Рс вирүс75%Аденовирүсийн хувьд 50%

MDCK болон R-Mix эсийн өсгөвөртөсгөвөрлөгдсөн үр дүнг ПГУ-тай

харьцуулсан байдал

Томуугийн A(H1N1), A(H3N2) вирүсийн электрофореграмм

Бүх эерэг гарсан томуугийн А хүрээнийвирүсийн дэд хэвшинжийг HA1, HA3, NA1, NA2генийн өвөрмөц дараалал бүхий праймер ашигланУТ-ПГУ-ын аргаар тодорхойлоход 2(20%) нь A(H1N1)вирүс, үлдсэн 8(80%) нь A(H3N2) вирүс байлаа.

Рс вирүсийн А болон Вхэвшинжийн электрофореграмм

Харин респиратор-синцитиал вирүсийн RSVA, RSVB хэвшинжийг N-генийн өвөрмөц дараалалбүхий праймер ашиглан УТ-ПГУ аргаартодорхойлоход 100% RSVA хэвшинжид хамаарчбайсан.

Статистик боловсруулалтҮнэн магад (Хи-квадратын шалгуур)

R-Mix эсийн өсгөвөр ашигласан ДТБХ-ын арга 50%, ПГУ-ын арга 40%

Х2=10 байхад v=1 гэж үзвэл р=0,01 Х01

2=6,63 буюу Х2≥Х012 тэглэх таамаглал

няцаагдаж 99%-ийн үнэн магадтайгаарбатлагдаж байна.

R-Mix хибрид эсийн өсгөвөрт ПГУ-ын аргаартодорхойлогдоогүй вирүсүүдийн

харагдах байдал(Olympus DP71 маркийн иммунофлюресцент микроскоп, 10x20 өсгөлт)

№39, RSV antidody, 5day №44, RSV antidody, 5day №43, AD antidody, 4day

№7, P1 antidody, 5day №31, P1 antidody, 5day

Дүгнэлт2007/2008 оны томуугийн улиралд томуугийн А болон В хүрээнийвирүс, аденовирүс, рс вирүс, иж томуугийн вирүсүүд зэрэгцэнэргэлтэнд байжээ. Харин 2008/2009 оны томуугийн улиралдтомуугийн А хүрээний вирүс болон иж томуугийн 1, 3-р хүрээнийвирүсүүд давамгайлан эргэлтэнд байсан байна. R-Mix хибрид эсийн өсгөвөрт томуугийн вирүс нийт шинжлэгдэхүүний 3,3%-д нь илэрч байсан бол харин MDCK эсийнөсгөвөрт 1,4%-д нь илэрч байгаа юм. Энэ нь R-Mix хибрид эсийнөсгөвөр нь MDCK эсийн өсгөвөрөөс даруй 2,3 дахин олонтомуугийн вирүсийг илрүүлж байгаа бөгөөд нэмж 3 төрлийнвирүсийг илрүүлэх чадвартай байлаа. R-Mix хибрид эсийн өсгөвөр ашигласан ДТБХ-ын аргыг ПГУ-ынаргатай 50 шинжлэгдэхүүнд харьцуулалт хийн туршиж үзэхэдДТБХ-ын аргын хувьд вирүс илрүүлэх чадвар 50%, ПГУ-ын арга40%-тай байгаа нь статистикийн Х2-ийн шалгуураар 99% үнэнмагадтайгаар батлагдаж байна (X2=10 p=0,01).

Практик зөвлөмжR-Mix хибрид эсийн өсгөвөр нь MDCK эсийн өсгөвөртэйхарьцуулахад өртөгийн хувьд өндөр боловч ТТӨ үүсгэгчолон вирүсийг нэг дор өсгөвөрлөн оношлох боломжтой, хугацаа бага шаарддаг зэрэг давуу талуудтай байна, харинөндөр мэдрэг арга болох ПГУ-тай харьцуулахад өртөг ньхарьцангуй хямд, ПГУ-д заавал ашиглагддаг шиг нарийнтоног төхөөрөмж, урвалж оношлуур шаардлагагүй, оношлох ажилбар нь хялбар, вирүсийг ялган авахболомжтой, мэдрэг чанарын хувьд ПГУ-ын аргатайдүйцэхүйц зэрэг хэд хэдэн давуу талуудтай байгаа ньцаашид энэхүү шинэ технологийг практикт нэвтрүүлэхбүрэн боломжтой байна. Гүн хөлдөөгч болон иммунофлюоресцент микроскопоор тоноглогдсон нөхцөлд энэ аргыг хөдөө орон нутагт нэвтрүүлж болох юм.

Анхаарал тавьсандбаярлалаа