ANÁLISE MOLECULAR DO GENE FMR1 EM PACIENTES EM...

SIMP.TCC/Sem.IC. 2018(13); 359-374 FACULDADE ICESP / ISSN: 2595-4210 359

CURSO BIOMEDICINA

ANÁLISE MOLECULAR DO GENE FMR1 EM PACIENTES EM INVESTIGAÇÃO DIAGNÓSTICA PARA A SÍNDROME DO X-FRÁGIL MOLECULAR ANALYSIS OF FMR1 GENE IN PATIENTS IN DIAGNOSTIC INVESTIGATION FOR X-FRAGILE SYNDROME

Anna Karolina Silva Ramos

Juliana Forte Mazzeu de Araújo

Erica Carine Campos Caldas Rosa

Resumo Introdução: A Síndrome do X-frágil (SXF) é uma doença genética com padrão de herança dominante ligada ao cromossomo X, apontada como a causa mais frequente de deficiência intelectual (DI) herdada, causada por mutações numéricas na sequência da trinca CGG no gene FRM1 (Fragile X Mental Retardation 1) e localizada na extremidade do braço longo do cromossomo X (Xq27.3), com prevalência de 1:3600 a 4000 homens e 1:6000 a 8000 mulheres. A mutação completa apresenta (>200) repetições da trinca CGG, causando a diminuição da proteína Fragile Mental Retardation Potein (FMRP), gerando fenótipo comportais como dificuldade de desenvolvimento, DI, características autistas e algumas características faciais, como, face alongada, orelhas proeminentes, macroquidismo. Objetivo: diagnóstico molecular por técnicas eficazes de 41 pacientes com suspeita de DI de etiologia genética e SXF, que tiveram seus resultados inconclusivos no exame de triagem para SXF. Materiais e Métodos: foram realizadas PCR e detecção do tamanho de fragmento das amostras em Sequenciador automático para diferenciação de alelos homozigotos e heterozigotos para a SXF. Resultado: a frequência de indivíduos homozigotos no estudo foi de 44% e 56% heterozigotos. Conclusão: A identificação dos alelos dos pacientes permitiu a confirmação diagnóstica de mutação no gene FMR1 nas pacientes homozigotas, possibilitando o correto aconselhamento genético para as famílias. Palavras-chave: Síndrome do X-Frágil; Detecção de fragmento; Gene FMR1; Abstract Introduction: Fragile X syndrome (FXS) is a genetic disease with a dominant inheritance pattern linked to the X chromosome, identified as the most frequent cause of inherited intellectual disability (DI) caused by numerical mutations following the CGG crack in the gene FRM1 (Fragile X Mental Retardation 1) and located at the end of the long arm of the X chromosome (Xq27.3), with a prevalence of 1: 3600 to 4000 men and 1: 6000 to 8000 women. The complete mutation presents (> 200) repetitions of the CGG crack, causing the decrease of the Fragile Mental Retardation Potein (FMRP) protein, generating behavioral phenotype such as developmental difficulty, DI, autistic characteristics and some facial features, such as elongated face, prominent ears , macroquidismo. Objective: molecular diagnosis by effective techniques of 41 patients with suspected IDD of genetic etiology and FXS, who had their inconclusive results in the screening test for FXS. Materials and Methods: PCR and fragment size detection of samples were performed in automated sequencer for differentiation of homozygous and heterozygous alleles for SXF. Results: the frequency of homozygous individuals in the study was 44% and 56% heterozygous. Conclusion: The identification of the alleles of the patients allowed the diagnostic confirmation of mutation in the FMR1 gene of the patients studied, allowing the correct genetic counseling for the families. Keywords: X-Fragile syndrome; Fragment detection; FMR1 gene;

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Introdução

A Síndrome do X-frágil (SXF) é uma doença genética com padrão de herança dominante ligada ao cromossomo X, sendo apontada como a causa mais frequente de

deficiência intelectual (DI) herdada(2,4,8,12,13,19,21,22) e caracterizada como um distúrbio cognitivo que faz parte de um grupo heterogêneo de doenças(4,9) que é responsável pelo retardo do

Como citar esse artigo:

Ramos AKS, Araújo JFM, Rosa ECCC. Análise molecular do gene FMR1 em pacientes em

investigação diagnóstica para a síndrome do x-frágil. Anais do 13 Simpósio de TCC e 6

Seminário de IC da Faculdade ICESP. 2018(13); 359-374


Figura 1 - Estrutura do gene FRM1 e repetições CGG. Modificado de Filipovic-Sadic et al. (2010)(5)

desenvolvimento, impedindo que o indivíduo resolva problemas e estabeleça relações sociais(13,16). Sua prevalência mundial é de aproximadamente 1:3600 a 4000 homens e 1:6000 a 8000 mulheres (20).

No Brasil poucos estudos foram feitos, com diferentes linhas de pesquisa, sendo que em 2012 a frequência estimada era de aproximadamente 8% dos homens e 4% das mulheres com DI (4). Já em (2015) em um estudo feito na Bahia, a frequência diagnóstica de SXF feita pelo o Serviço público para SXF foi de 4,7% da amostra inicial de 106 pacientes com DI incluídos no estudo (17).

A SXF, é causada por alterações no gene FRM1 (Fragile X Mental Retardation 1), que recebeu o nome de sítio frágil, localizada na extremidade do braço longo do cromossomo X (Xq27.3) (3,8,10,14,15,19,21,22), representado na (Figura 1). A alteração no sitio frágil é causada por uma mutação no número de repetições da trinca de bases da sequência CGG que ocorre na região 50 UTR do gene Fragile Mental Retardation 1 (FMR1), devido à amplificação dos trinucleotídeos CGG ser maior que 200 repetições ocorre hipermetilação da fita de DNA com o silenciamento ou a baixa produção da proteína Fragile X Mental Retardation-Protein (FMRP)(3,8,10,14,15,19,21,22).

A proteína FRMP está relacionada à plasticidade e à maturação sináptica e é essencial para o desenvolvimento das conexões entre as células nervosas e a maturação das sinapses (10) em pequena quantidade ou ausente, tem forte associação com a Deficiência Intelectual (DI) e com o fenótipo do comportamento dos indivíduos afetados com mutação completa (15,16,23).

O fenótipo da SXF é mais comum em homens que em mulheres, pois os homens possuírem apenas um cromossomo X, podendo ser hemizigoto para a SXF e as mulheres dois cromossomos X, podendo ser homozigotas ou heterozigotas SXF (2,4,16). Em relação às principais características do fenótipo, a hiperatividade, impulsividade, características do autismo como pobre contato visual, timidez, flapping com as mãos(15,16,23), atraso no desenvolvimento e rosto mais alongado, orelhas largas e proeminentes, normalmente com inserção baixa, fronte larga, mandíbula proeminente, palato alto arqueado e macrocefalia, sintomas mais comuns no sexo masculino, tais características podem se manifestar em diferentes fazes da vida, sendo que os homens são mais afetados que as mulheres, estas apresentam um grau mais leve do fenótipo (2,4,16), graças ao genótipo (15).

A mutação numérica no gene FMR1 também é responsável por 2 outras Síndromes

relacionadas com a pré-mutação para a SXF, com expressões clínicas diferentes: (i) Insuficiência ovariana primária precoce (FXPOI), (ii) Síndrome do Tremor e Ataxia associada a SXF (8). A quantidade de repetições dos trinucleotídeos CGG, está retratada na Tabela 1 com os 4 alelos gerados de acordo com a quantidade de repetições.

Tabela 1 - Alelos do gene FMR1 e a quantidade de repetições.

Alelos do Gene FMR1

N° de Trinucleotídeos

Normal 6 a 44 CGG Gray Zone 45 a 54 CGG Pré-mutado 55 a 200 CGG Mutado >200 CGG

Fonte: Wheeler et al., (2017) (22).

Devido à incidência e ao fator hereditário, e a essa síndrome ser a causa mais comum de deficiência intelectual ligada ao cromossomo X, o diagnóstico é de grande importância para o aconselhamento genético da família do paciente, tanto por medidas de precaução quanto para o correto tratamento. Esta pesquisa tem como objetivo realizar o diagnóstico molecular em pacientes com suspeita de DI de etiologia genética e SXF, que tiveram seus resultados inconclusivos no exame de triagem para a SXF, tornando-se necessária a investigação do gene FMR1.

A técnica utilizada para investigação do gene FMR1 utilizada nesse estudo foi a detecção de tamanho de fragmento que se apresenta mais conveniente que a técnica de Southern blotting que tem alto custo e necessita de DNA de alta qualidade, já na detecção de fragmento o processo é mais simplificado para uma rotina laboratorial (1).

É importante ressaltar que aconselhamento genético tem foco em auxiliar as famílias a tomar decisões médicas e pessoais esclarecidas, através da informação sobre os distúrbios genéticos herdados e suas consequências (17) e o estudo apresenta parte do diagnóstico de alguns pacientes e não o diagnóstico completo.

Materiais e métodos

Critérios Éticos : O projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética das FACULDADES ICESP/Promove de Montes Claros da Associação Educativa do Brasil/ SOEBRAS de CAAE: nº 79475117.6.0000.5141 em 31/10/2017 (ANEXO I). Este estudo seguiu todas as normas estabelecidas pela Resolução 466/2012 do Conselho Nacional de Saúde, que trata da pesquisa em seres humanos. Após


aprovação pelo Comitê de Ética, foi aplicado um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) aos parentes responsáveis pelos pacientes que concordaram em participar deste estudo (ANEXO II). Aos menores participantes foi aplicado um Termo de Assentimento Livre e Esclarecido (TALE) (ANEXO III). Após a concordância e assinaturas dos termos, foi realizada a coleta de dados clínicos nos prontuários dos pacientes.

Caracterização do Estudo: Trata-se de um estudo transversal descritivo e observacional. O projeto foi realizado através de uma triagem após classificação pelos médicos geneticistas Hospital Universitário de Brasília dos casos de DI isolados ou sindrômicos de etiologia desconhecida, com suspeita de DI de causa genética.

Amostra: Compuseram este estudo

quarenta e um pacientes do sexo feminino que apresentaram resultados inconclusivos para o teste molecular convencional. O material biológico (5mL de sangue periférico em heparina e 5 mL de sangue periférico em EDTA) foi coletado pelo técnico do Laboratório de Genética Clínica da UnB para as devidas análises laboratoriais de rotina (Cariótipo por banda G) no Laboratório de Genética.

Critérios de Inclusão : Foram incluídos

pacientes em investigação diagnóstica para deficiência intelectual e em concordância em participar do estudo, após assinatura do TCLE ou do TALE, por eles ou por seus responsáveis.

Critérios de Exclusão : Foram excluídos

portadores de neoplasias malignas, infecção pelo vírus da imunodeficiência humana e de infecções de outra natureza que estavam ativas (tuberculose, micoses profundas) e pacientes do sexo masculino com resultados negativos para DI, SXF.

Procedimentos do estudo

Figura 2 - Ordem dos procedimentos do estudo e do pré-estudo.

1) Os médicos do Hospital Universitário de Brasilia (HUB) estabeleceram a suspeita de casos de SXF ou DI de causa genética.

2) Para esses pacientes foi aplicado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) para os parentes responsáveis pelos pacientes que concordaram em participar deste estudo (ANEXO II) e aos menores participantes foi aplicado um Termo de Assentimento Livre e Esclarecido (TALE) (ANEXO III).

3) Após a concordância e assinaturas dos termos, foi realizada a coleta de dados clínicos nos prontuários dos pacientes.

4) Após a triagem das pacientes, o DNA dos leucócitos do sangue periférico dos pacientes foi extraído através do método Puregene “Salting out”.

Este método é dividido em etapas, sendo a primeira de lise celular, onde foi utilizado 5 mMol/L MgCl2, 1 mMol/L EDTA pH 8,0 em uma reação e, 10 mMol/L Tris pH 7,5, 1 mMol/L EDTA pH 8,0 e 1% SDS em outra. Para cada reação a solução foi centrifugada a 3400 rpm por 10 minutos. Para a segunda etapa utilizou-se 1 mL da solução de precipitação de proteína (7,5 Mol/L

Tabela 2 - Sequências de oligonucleotideos utilizados.

Gene Direto 5´ -----3´ Reverso 5´ -----3´

FRM1 AGC CCC GCA CTT ACC ACC CC CGT CAG CTG CGT TTC GGT TTC ACT TCC GGT

FRM1 FAM/ AGC CCC GCA CTT ACC ACC CC CGT CAG CTG CGT TTC GGT TTC ACT TCC GGT

Oligos utilizados nos marcadores. Primeira linha = primer c, segunda linha = primer reverso fluorescente ;

de Acetato de amônia) ao lisado celular. Centrifugou-se a 3400 rpm por 10 minutos. As

proteínas precipitadas formam um pellet marrom escuro e compacto. Na etapa de precipitação de DNA, o sobrenadante foi transferido para um Tubo Cônico contendo 3 mL de isopropanol. O


tubo foi invertido lentamente até que se formasse um novelo de DNA. A reação foi centrifugada a 3400 rpm (rotação por minuto) por 3 minutos. Retirou-se o sobrenadante, e adicionou-se 3 mL de etanol 70%. A reação foi novamente centrifugada. Depois disso, drenou-se o tubo e deixou-se o DNA secar a temperatura ambiente por 15 minutos. Na última etapa da extração, acrescentou-se ao tubo com o DNA 200-250 µl de TE (da Anfimetrix) 1x, o que resultou em uma concentração aproximada de 700 ng/µl. O DNA foi armazenado a -8ºC.

5) O DNA obtido a partir de cada amostra foi quantificado através de leitura em espectrofotômetro Nanodrop (Thermo Fisher Scientific) cuja razão 260/280 foi entre 1.8 e 2.0. Após os resultados das análises do cariótipo as amostras dos pacientes com DI e SXF com resultado negativo e/ou inconclusivo foram encaminhadas para avaliação molecular específica.

6) Foi feito um exame molecular de triagem, onde os alelos normais e com a pré-mutação na região 5´UTR foram analisados através da técnica da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) convencional utilizando sequências especificas (Tabela 2) de iniciadores para o gene FRM-1 (repetições polimórficas do trinucleotídeo CGG).

7) Foi feita a separação dos pacientes inconclusivos.

8) Os pacientes inconclusivos foram encaminhados para o estudo, totalizando 41 pacientes do sexo feminino.

9) Para os pacientes com resultados inconclusivos para a SXF foi realizada uma amplificação utilizando o método de PCR – CGG específico com oligonucleotídeo direto (Foward) marcado com fluorescência (FAM) (Tabela 1), seguida de eletroforese capilar no sequenciador ABIPRISM 3130xls da Thermo Fisher. A reação de amplificação do gene FMR1 para os inconclusivos ocorreu no termociclador Veriti (Thermo Fisher) de acordo com o programa: 94ºC por 4 min, 98ºC por 45s, 64ºC por 45s, 72º por 2s e 72º por 10 min, em um ciclo de 34 vezes perfazendo um volume final de 25μl contendo aproximadamente 100ng de DNA genômico, 0.75 pmol de cada inicidores (Tabela 1), dNTP 200μM, 10 μl de 5x Q-solution (Qiagen), 2.5 μl de 10x PCR Buffer e 1U de Platinum Taq DNA polimerase (Thermo Fisher).

10) Foi realizada leitura em gel de agarose a 1% dos amplicons que foram corados com 3 µL de brometo de etídio. A preparação das amostras para correr no gel se iniciou com 5 µL de DNA amplificado mais 3 µL de corante

azul de bromofenol ,tampão de corrida (TBE 1x) e padrão de peso molecular 1kb plus, com corrida de aproximadamente 45 min a 100 V e 62 mA (miliAmper) cujo resultado foi analisado após ser fotografado no aparelho Amersham imager 600.

11) Detecção de fragmento por Sequenciador automático: Para os resultados inconclusivos, foi feita uma PCR com marcador fluorescente, para então ser feita a detecção do tamanho do fragmento CGG por eletroforese capilar em sequenciador automático ABI 3130xls. Esta técnica se baseia na análise do fragmento do gene alvo FRM1 detectado através da utilização de 8,85μl Formamida Hidi e 0,15μl de Liz 500 (marcador de massa molecular) perfazendo um total de 9μl acrescidos de 1μl do DNA amplificado com primer marcado com Fluorescência de coloração azul (FAM-dye). Neste método de detecção de fragmento utilizado, o tamanho do fragmento é obtido pela leitura do número de repetições do trinucleotídeos CGG da amostra, formando picos (7), alelos homozigotos (alelo 29) que possuem mutação e alelos heterozigotos (alelos 29/30 ou 29/32), que são considerados normais.

12) Análise diagnóstica: -PCR inconclusiva: apenas uma banda. -Detecção de fragmento: Homozigose: 2 alelos iguais normais ou 1 alelo normal + 1 mutação utilizando outro kit, o da Assuragen; Heterozigose: paciente normal). - Em relação ao tamanho de fragmento, uma amostra normal deve possuir 200 a 225 pb em mulheres e aproximadamente 200 pb em homens normais (1).

13) Análise Estatística : Para a análise intergrupos, aplicou-se o Teste de Kolmogorov e Smirnov para verificar a normalidade dos dados. As variáveis apresentaram distribuição normal, sendo utilizado o teste ANOVA one-way para comparação os resultados entre os grupos, para a avaliação da relação entre as variáveis categóricas e numéricas foram utilizados os testes de análise de variância (ANOVA) e teste T de Student. Foi realizada a estatística descritiva através das frequências de cada tipo de paciente encaminhado, dos motivos de encaminhamento, dos diagnósticos etiológicos dos pacientes, de indivíduos homozigotos e heterozigotos e de alelos homozigotos e heterozigotos em cada tipo de paciente, foram calculados utilizando o GeneAlex 6.0. A incidência de pacientes com a DI e a SXF foi calculada a partir dos resultados do aconselhamento genético nos prontuários dos pacientes e do exame molecular para os inconclusivos. A análise dos fragmentos foi realizada utilizando o


software Coffalyser.Net (McHolland). A análise estatística foi realizada no sofware GraphPad Prism 5.0 nível de significância está fixado em 5% (p < 0,05).

Retorno ao paciente: Aconselhamento genético e acompanhamento para a família.

Resultados

A amostra foi composta por 41 pacientes todas do sexo feminino, com uma média de idade de 12.68±2.68 anos, peso de 17.68±2.85, estatura de 9.60±4.30, perímetro cefálico de 23.94±4.05 e comprimento da mão de 14.77±6.02, atendidas no ambulatório de genética do Hospital Universitário de Brasília (HUB), e encaminhadas para o Laboratório de Genética Clínica da UnB, que obtiveram resultados iniciais de PCR inconclusivos.

Figura 3 - Gel de PCR contendo amostras inconclusivas para a Síndrome do X-frágil.

No exame de triagem com a PCR (Figura 2), os resultados inconclusivos aparecem com apenas uma banda, que pode significar a expressão tanto em homozigose, com alelos de mesmo tamanho ou heterozigose com duas situações: (i) alelos de tamanhos semelhantes, (ii) um alelo normal e outro mutado com grande pré-mutação(6). Não houve diferenças significativas entre os grupos estudados em relação aos dados antropométricos, perímetro cefálico e comprimento da mão.

Os resultados da tabela 3 mostram a frequência de cada paciente encaminhado para diagnóstico de doença genética, sendo 7 (17%) irmãs de pacientes encaminhados para investigação molecular, 12 (29%) mães de pacientes encaminhados para investigação molecular, e 22 (54%) pacientes encaminhados para investigação molecular direta. Analisando estes dados podemos perceber que os grupos das irmãs e das mães formam juntos o grupo de pacientes com histórico familiar de diagnóstico para doença genética 19 (46%).

Tabela 3 - Frequência dos pacientes encaminhados para diagnóstico de doença genética.

Classe de paciente

N° de casos / Frequência

encaminhado

Irmã de paciente encaminhado para investigação molecular 7 (17%) Mãe de paciente encaminhado para diagnóstico 12 (29 %) Paciente encaminhado para investigação molecular direta 22 (54%)

Os resultados da Tabela 4 indicam as frequências dos motivos de encaminhamento dos pacientes mostrando as frequências de 18 (44%) para o retardo neuromotor ou DI, 17 (41,50%) para o histórico familiar de retardo neuromotor ou DI, 3 (7%) o Transtorno do espectro autista (TEA), 1 (2,5%) para o déficit de atenção e hiperatividade e 2 (5%) para o transtorno de comportamento.

Tabela 4 - Frequência dos motivos de encaminhamento dos pacientes.

Indicação de encaminhamento N° de casos/ frequência Retardo neuromotor ou DI 18 (44%) Histórico familiar de retardo neuromotor ou DI 17 (41,50%) TEA 3 (7%)

Défict de atenção e hiperatividade 1 (2,5%)

Transtorno de comportamento 2 (5%)

Total 41 (100%) DI = Deficiência Intelectual; TEA = Transtorno do Espectro autista; SXF= Síndrome do X Frágil;

A Figura 4 sobre diagnóstico etiológico, fala sobre uma avaliação realizada referente a uma doença, para comprovação de sua causa (18), seus resultados mostram que 26 (63,40%) dos pacientes não tiveram seu diagnóstico etiológico informado, 4 (9,75%) dos pacientes possuem histórico familiar que sugere X recessivo, 1 (2,40%) dos pacientes possuem histórico familiar que sugere etiologia autossômica dominante, 2 (4,80%) são de poligenia provável, 1 (2,40%) de consanguinidade, 5 (12,10%) de histórico familiar nada sugere, 1 (2,40%) de etiologia esporádica X recessivo ou X dominante, 1 (2,40%) de etiologia ambiental provável.


Figura 4 - Frequência dos diagnósticos etiológicos dos pacientes.

Figura 5 – Resultado de amostra Homozigota na detecção de fragmento.

No resultado da eletroforese capilar são formados picos de acordo com o número de repetições, onde mulheres homozigotas apresentam 1 pico (Figura 5) e necessitam de diferenciação para saber o tipo de mutação, já as mulheres heterozigotas apresentam 2 picos (Figura 6) onde as amostras são consideradas normais(6). Na análise das 41 amostras a média e desvio padrão dos tamanhos dos picos em homozigose foi de 298±12.51 e em heterozigose foi de 304±2.70.

Com os resultados de todos os pacientes na detecção de fragmento, foi possível calcular a frequência genotípica como mostrado na Figura 7. Cuja frequência de indivíduos homozigotos foi de 44% e de heterozigotos foi de 56%. Neste método de detecção de fragmento é possível detectar se a amostra é composta de homozigotas caracterizadas pelo alelo 29 e heterozigotas alelos 29/30 ou 29/32.

Figura 6 – Resultado de amostra Heterozigota na detecção de fragmento.

Figura 7 - Frequência de homozigotas e heterozigotas para o gene FMR1.

Os resultados da Tabela 5 indicam a frequência de alelos homozigotos e heterozigotos em cada tipo de paciente encaminhado mostram que a quantidade de irmã encaminhada homozigota é de 3 (7,3%), mãe encaminhada homozigota é de 6 (14,6%), paciente encaminhada homozigota 9 (22%), irmã encaminhada heterozigota 4 (9,8), mãe encaminhada heterozigota 6 (14,6%), paciente encaminhada heterozigota 13 (31,7%). Tabela 5- Frequência de alelos Homozigotos e Heterozigotos em cada tipo de paciente encaminhado.

Tipo de paciente encaminhado e alelo Frequência Irmã encaminhada homozigota 3 (7,3%) Mãe encaminhada homozigota 6 (14,6%) Paciente encaminhada homozigota 9 (22%) Irmã encaminhada heterozigota 4 (9,8%) Mãe encaminhada heterozigota 6 (14,6%) Paciente encaminhada heterozigota

13 (31,7%)

Diagnóstico etiológico

Não informado

Histórico familiar

sugere XRHistórico familiar

sugere ADPoligenia provável

Consanguinidade

Hist. familiar nada

sugereEsporádica XR ou XD

Etiologia ambiental

provável

44%

56%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

Homozigotas Heterozigotas

18 pacientes

22 pacientes


Discussão

No estudo realizado por Amancio e

colaboradores (2013) foi relatada a presença de 2 homens inconclusivos no exame PCR de triagem (1), porém após análise de fragmento, neste estudo todos os pacientes encaminhados que foram inconclusivos foram do sexo feminino, que é o mais comum (6).

Na analise de dados para o estudo, foi possível notar poucos dados sobre amostras inconclusivas no exame de PCR. No exame realizado por Amancio e colaboradores (2013) apenas 3 amostras era de mulheres em um grupo de 35 pacientes estudados, elas foram diagnosticadas como 1 não afetada e 2 inconclusivas no exame de análise de fragmento (1), no estudo de Mattei et al. (1981) foram relatados os casos de 20 pacientes, sendo 1 mulher que acabou sendo mutação completa (11).

Não foi possível realizar a análise dos dados de fenótipos físicos e comportamentais de todos os pacientes pois a maioria dos pacientes não tinham esses dados em seu prontuário ou não eram donos do RF do prontuário, desfalcando algumas informações o que gerou invalidação para a pesquisa, já a intenção é a avaliação do gene FMR1 de 41 pacientes.

Analisando os dados da Tabela 3 nota-se que 7 (17%) irmãs de pacientes encaminhados para investigação de doença genética, 12 (29%) mães de pacientes encaminhados para investigação de doença genética, o que reforça a informação de que após do diagnóstico de um membro da família com mutação completa para SXF, a investigação familiar deve ser feita, com identificação de mais portadores da síndrome na família e em seguida um aconselhamento genético (1). Analisando estes dados podemos perceber que os grupos das irmãs e das mães formam juntas o grupo de pacientes com histórico familiar de diagnóstico para doença genética 19 (46%), chamando atenção para o fato de que elas foram encaminhadas, principalmente devido ao diagnóstico para aconselhamento genético, afirmando o que o fenótipo das mulheres é mais brando em relação ao dos homens (4,12).

Complementando o que foi sugerido no estudo de Amancio (2013) que os homens em diagnóstico sejam considerados em dois grupos diferentes, pacientes com suspeita clínica e pacientes com histórico familiar para a SXF (1), a sugestão deste estudo é que todos os pacientes sejam considerados nesses dois grupos, já que as mulheres possuem mais chances de herança genética de mutação completa para os filhos, pois a cada geração essa mutação numérica vai

se deslocando (16,22), e esse tipo de diferenciação ajuda no aconselhamento genético.

Os resultados da Tabela 4 mostram que 1 (2,5%) das pacientes tem déficit de atenção e hiperatividade, 1 (2,5%) com suspeita de Síndrome do X-Frágil, 1 (2,5%) com histórico familiar de Síndrome do X-Frágil e 1 (2,5%) com transtorno de comportamento, mostram como é muito inferior a quantidade de pacientes com essas características em relação aos paciente com DI ou retardo neuromotor 17 (41,50%) e em relação também à histórico familiar de retardo neuromotor ou DI 17 (41,50%) que continuam sendo os maiores motivos de encaminhamento para investigação entre os pacientes(4,8,12,19,22). Ainda analisando os dados de motivos de encaminhamento na Tabela 3, podemos notar que a frequência da hiperatividade foi de 1 (2,5%), dado muito inferior à frequência relatada por Silveira em (2014), que foi de 80% da amostragem, o estudo afirmou que essa característica deveria ser mais estudada em pacientes com essa síndrome, porém no presente estudo, tal característica não obteve relevância diagnóstica para a síndrome no geral (17).

Os dados da Figura 4 sobre frequência dos diagnósticos etiológico, mostram que mais de 63,40% dos pacientes não tiveram seu diagnóstico informado, tornando essa informação sobre riscos genéticos limitado, dificultando o esclarecimento das patologias, tendo em vista que esses são dados relacionados à triagem inicial dos pacientes, que servem de base para encaminhamento para outros exames mais específicos e algumas condições como TEA tem 20 a 25% de seu diagnóstico esclarecido com a identificação de fatores genéticos e ambientais (23).

A porcentagem dos genótipos homozigotos deste estudo foi de 44% representando na Figura 7 e foi muito superior ao que foi relatado por Filipovic- Sadic em (2010) de 22% de homozigotos entre o total de mulheres (5).

Na análise das 41 amostras a média e desvio padrão dos tamanhos dos picos em homozigose foi de 298 ± 12.51 e em heterozigose foi de 304 ± 2.70, não foram encontrados dados para comparação.

Não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos estudados em relação aos dados antropométricos, perímetro cefálico e comprimento da mão.

Os dados da Tabela 5 referentes à quantidade de mães heterozigotas é de 6 (14,6%) dão uma boa base para descobrir a origem da síndrome de alguns pacientes já diagnosticados, tendo em vista que em 30% dos casos esporádicos de SXF, existe a chance de serem herdados das mães, que devem ser


examinadas para heterozigose (23). Os demais dados podem ser usados para aconselhamento genético, visto que futuramente essas pacientes podem querer constituir família.

Conclusão:

Este estudo foi realizado apenas com

pacientes inconclusivos no exame de triagem, então todas as amostras homozigotas desse estudo apresentam mutação para Síndrome do X-Frágil em seus alelos, o que foi comprovado pelo exame molecular de detecção de fragmento (genotipagem em sequenciador automático 3130), onde os indivíduos foram classificados como homozigotos e heterozigotos, com tamanhos de fragmento maiores que o de mulheres normais.

A identificação dos alelos dos pacientes permitiu a confirmação diagnóstica de mutação no gene FMR1 dos pacientes estudados, possibilitando o correto aconselhamento genético para as famílias, através do diagnóstico de membros da mesma, para que os médicos do ambulatório de genética do HUB estabeleçam o correto acompanhamento destes pacientes.

Os dados obtidos com o trabalho podem ser melhorados através da diferenciação entre os indivíduos heterozigotos e a recoleta de dados físicos e comportamentais de alguns pacientes possibilitando um diagnóstico mais completo para um aconselhamento genético.

Foi possível observar que existe poucos estudos do gene FMR1 tratando apenas de

amostras de mulheres/ inconclusivas, esse campo merece ser mais explorado. Agradecimentos:

Primeiramente agradeço a Deus por ter possibilitado que chegue a este momento da minha graduação e por ter enviado pessoas maravilhosas que possibilitaram a realização de alguns dos meus sonhos.

Agradeço aos meus pais Wilmar e Luciana por terem feito tudo que puderam para que eu seguisse meus sonhos, obrigada por acreditarem em mim. Agradeço aos meus irmãos, familiares e amigos por todas as vezes que transformei uma conversa comum, numa discussão sobre meu TCC, vocês são maravilhosos e sempre me apoiaram.

Agradeço especialmente a minha orientadora Profa .Dra Erica Caldas Rosa por ter me dado a oportunidade de participar da realização desta pesquisa, por toda a paciência e cuidado em me passar tudo que eu precisava saber, por acreditar tanto no meu potencial e me apoiar.

Agradeço a Profa Dra Juliana Forte Mazzeu de Araújo, Chefe do Laboratório de Genética Clínica da UNB por permitir que esse projeto tenha sua pesquisa realizada no Laboratório de genética Clínica da UNB, pela paciência e dedicação.

Agradeço também aos que estiveram dispostos a me ajudar enquanto estive no laboratório Aluísio, Hallina, Laís, assim como á todos os colaboradores envolvidos.

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2015.

ANEXO I


ANEXO II


ANEXO III

ANÁLISE MOLECULAR DO GENE FMR1 EM PACIENTES EM...

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