DETERMINACION DE AMINOACIDOS PATRON POR HPLC EN FASE REVERSA

PROPUESTA DEL METODO, PRESENTADO POR:RICARDO MARTINEZ SUAREZ

JAVIER EDUARDO MUÑOZ TORRESLAURA CATALINA PEREZ LUQUE

MONICA ALEJANDRA PINEDA MUÑOZ

UNIVERSIDAD PEDAGOGICA Y TECNOLOGICA DE COLOMBIAFACULTAD DE CIENCIAS BASICASESCUELA DE CIENCIAS QUIMICAS

PROGRAMA DE QUIMICA DE ALIMENTOSTUNJA2011

AMINOACIDOS

1. Estructura y clasificación de los aminoácidos.

Como su nombre indica los aminoácidos son compuestos que poseen un grupo amino (-NH2) y un grupo ácido en su estructura. Los aminoácidos son los precursores de los péptidos y las proteínas, y en ellos el grupo amino y el grupo carboxilo, se encuentran unidos al mismo átomo de carbono, conocido como carbono-α (α-aminoácidos). La estructura general de los α- aminoácidos (a excepción de la prolina, que es cíclica) se muestra en la siguiente figura.

Figura 1: Estructura química de un aminoácido en el plano y estructura espacial.

Las 20 α-aminoácido presentes en las proteínas son de la serie L- y la diferencia entre los aminoácidos viene dada por el grupo -R, o cadena lateral, unida al carbono-α. Teniendo en cuanta a la naturaleza del grupo -R los aminoácidos pueden clasificarse en:

Neutros o apolares Polares sin carga Polares con carga negativa Polares con carga positiva

Neutros o Apolares. Son 8 los aminoácidos que se consideran no polares por su cadena lateral. La alanina, valina, leucina e isoleucina, poseen cadenas laterales de hidrocarburos alifáticos. La metionina posee una cadena lateral de éter tiólico (C-S-C). La prolina es el único aminoácido cíclico, pues el grupo -R se cierra sobre el N del grupo α-amino (realmente es un amina secundaria). Por su parte, la fenilalanina y el triptófano contienen grupos aromáticos.

Polares sin carga. Siete son los α-aminoácidos cuyo grupo -R es polar pero sin carga. La glicina posee la cadena más simple, un átomo de hidrógeno. La serina y la treonina son portadores de un grupo hidroxilo (-OH). La asparragina y la glutamina, poseen cadenas laterales que contienen en su estructura un grupo amida, y por hidrólisis dan lugar, respectivamente, a aspartato y glutamato, dos aminoácidos con carga negativa. La tirosina posee un grupo fenólico y la cisteína debe su polaridad a la presencia de un grupo tiólico (-SH).

Polares con carga negativa. Existen dos α-aminoácidos cuyo de carga negativa a pH fisiológico, debida a la presencia de un grupo carboxilo (-COOH), el ácido glutámico y el ácido aspártico.Polares con carga positiva. Tres son los α-aminoácidos que poseen grupos –R cargados positivamente a pH fisiológico. La lisina posee una cadena lateral de butilamonio, la arginina presenta un grupo -R de guanidina y la histidina es portadora de un grupo -R de imidazolio.

Para este estudio se desea realizar la determinación de 5 aminoácidos: Lisina e Histidina los cuales son polares con carga positiva Isoleucina y Leucina los cuales son Neutros o polares Glicina el cual es polar sin carga

2. MATERIALES Y REACTIVOS

2.1 MATERIAL

2.1.1 MUESTRAS

Para las muestras patrón (lisina, Histidina, Isoleucina, Leucina y Glicina), se preparan 25mL de solución en agua tipo HPLC o des ionizada para cada aminoácido a una concentración inicial de 0,5M, realizando diluciones seriadas a partir de esta solución, para obtener diferentes concentraciones y realizar las curvas de calibración.

2.2 REACTIVOS

Para fase móvil se prepara una disolución por gradiente de agua tipo HPLC, acetonitrilo y acetato de sodio (en diferentes proporciones), realizando previamente la filtración y desgasificación de cada uno de los eluyentes.

PREPARACION DE LAS MUESTRAS

Para preparan las muestras antes de la corrida, se realiza una derivatización añadieron 20 μL de la mezcla de los estándares diluidas a 60 μL de una disolución tampón de borato sódico 0.2 mM a pH 8.8 y agitando vigorosamente. Posteriormente, a esta mezcla se le añadió 20 μL de la solución 6-aminoquinolil-N-hidrosicuccinimidil carbamato (AQC) agitando nuevamente otros 10 segundos y se llevo a un baño de agua a 55°C durante 10 minutos, como se muestra en la figura 2, este procedimiento

Figura 2: procedimiento de derivatización (tomado de Trabajo de investigación presentado por Raquel Callejón “Desarrollo de un método de HPLC para la determinación de aminoácidos en vinagre y su validación en muestras reales”)

EQUIPO

El equipo de HPLC a utilizar es agilent 1200 series, compuesto por: inyector manual, desgasificador, bomba cuaternaria, detectores UV-visible con lámparas de wolframio y deuterio, horno, columna C18 en fase reversa y ordenador EZ-CRHOM.

ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS

Se partio de las condiciones cromatograficas recomendadas en el método original para vinos (Hernández-Orte et al., 2003) (tomado del trabajo de investigación de Raquel Callejón)

- Fases moviles: acetato sodico 0.14 M a pH 4.92 y 5.15, acetonitrilo y agua tipo HPLC filtrada y des gasificada - Flujo: 1 mL/min.- Temperatura de la columna: 34°C.- Deteccion: fluorescencia con λex de 250 nm y λem de 395nm.

ORDEN DE ELUCIÓN

Según el Trabajo de investigación presentado por Raquel Callejón “Desarrollo de un método de HPLC para la determinación de aminoácidos en vinagre y su validación en muestras reales” el orden de elución de los aminoácidos escogidos para las corridas son: Histidina, Glicina, Lisina, Isoleucina y Leucina.