E-seminar26 de Septiembre de 2014

José Juan Rivero Marabé

Especialista de producto GC y GCMS

Agilent Technologies, Spain

Máximas prestaciones para el análisis de

hormonas y dioxinas en muestras

alimentarias

Reto analítico en Alimentación y Medioambiente

Niveles

ultrabajos

Residuos:

>1000 Pesticidas

>300 Drogas veterinarias

Contaminantes naturales:

>500 Micotoxinas

>500 Toxinas de plantas

>100 Biotoxinas marinas

>1000 Contaminanates: Medioambientales:

Dioxinas, PCBs, HPAs, Retardantes de llama, PFCs, Biocidas, Disruptores endocrinos, Metales pesados

>>Cientos de contaminantes de procesos y adulterantes:

Acrilamida, Aminas heterocíclicas, Furanos, desinfectantes, Melamina…

¿ Por qué MS/MS ?

Hoy día, MS/MS es una técnica de rutina y representa una poderosa herramienta

analítica para la determinación de ultratrazas en matrices incluso muy complejas,

así como para resolver problemas graves como compuestos con la misma masa.

Gran

selectividad eliminación del

fondo de la

matriz.

Inigualable

sensibilidad

Buena

calidad

espectral confirmación

más fiable

Preparación

de muestra

más sencilla

¿Cuándo usar MS/MS?

Cuando la Matriz es compleja se pueden producir

Interferencias por coincidencia de los iones de

cuantificación del analito con los de la matriz

Permite la cuantificación

selectiva de compuestos

CONOCIDOS en

muestras que presentan

un elevado fondo

químico

Mejor S/N en matrices

complejas que el que

puede obtenerse por

tecnologías que trabajan

en Scan o SIM.

Las exigencias de las

normativas más actuales

resultan más fáciles de

cumplir gracias al poder

de la confirmación

MS/MS o alta resolución

de masas

Portfolio Agilent GCMSMS

Nuevo Agilent 7010

GC/MS/MS Triple Cuadrupolo

4a GeneraciónIntroducido Junio 2014

Nuevo GCQQQ Agilent 7010

7000C

7010

Septiembre 2013

Junio 2014

Portfolio de GCMSMS Agilent

¿Cual de ellos usar?: Tipo de aplicación

* Problemas complejos de separación cromatográfico y de detección.

* Screening indiscriminado

* Analíticas de altísima sensibilidad

* Efecto matriz sea muy grave

* Mejores LD en EI

P Ej.- Dioxinas & Hormonas.

* La mayoría de las aplicaciones.

* Métodos en PCI y NCI.

P Ej: Pesticidas, PAHs, contaminantes emergentes

Ejemplos de Aplicaciones target

Análisis de:

- Dioxinas, Furanos y PCBs en matrices

medioambientales y alimentarias

- Hormonas

- Problemas graves de matriz

- Mejores LD en EI

Análisis de:

- Pesticidas

- PAHs

- Ftalatos

- PBDEs

- Métodos en PCI y NCI

7010

7000C

Mejoras introducidas en el Agilent 7010

Agilent 7010: Basado en la exitosa plataforma 7000C

Cuadrupolos

hiperbólicos reales

recubiertos de oro

Detector

de Triple

Eje

Celda de colisión compacta

con aceleración axial para

cambio rápido de condiciones

MRM (800 MRM/sec) y

reducción del ruido por uso de

He Quenching

Fuente de iones:

Mayor eficacia en la

ionización

20-30x mas iones

Nueva EPC preparada para Backflush

Medida de la sensibilidad

Parámetro S/N anticuado

En los ultimos 15 años, S/N se ha incrementado desde

10:1 to > 1000:1. Esto hace que sea dificil de predicir el

verdadero limite de detección, incluso cuando es

observable el ruido de fondo

¿Que reportamos con S/N para la mayoría de sistemas de MS hoy?

Este elevado valor de S/N viola los

principios de la química Analítica y no

cumple las normas de Calidad a seguir

Maneras de manipular S/N

Para un Sistema de MS las especificaciones S/N, la mayoría de las

manipulaciones vienen a traves de la manipulacion del ruido y no de

incrementar la señal (ion count)

Aumentando la señal

• Incrementando la ganancia

• Picos más estrechos

• Incrementando el promedio de scan

Bajando el ruido

• Seleccionando la zona de mejor ruido

• Estrechar zona de ruido

• Ajustar la zona de línea base

• Aplicar suavizados y filtrados

• Variedad de algoritmos de calculo del ruido: Peak-to-Peak, RMS, ...

a. Peak-to-peak

b. RMS

c. Smoothing

d. Baseline noise filtering

S/N de diferentes zonas de ruido1 pg reserpine on-column, mismo fichero

S/N de diferentes zonas de ruido1 pg reserpine on-column, mismo fichero

S/N: 1,938

RMS x 1

Zona de ruido:

1.3 - 1.4 min

Anchura: 0.1 min

Ruido 2.39

S/N: 6,682

RMS x 1

Zona de ruido:

0.9 - 1.0 min

Anchura: 0.1 min

Ruido 0.69

S/N: 10,745

RMS x 1

Zona de ruido:

0.9 – 0.95 min

Anchura: 0.05 min

Ruido 0.43

-5X

Limite de detección instrumental (IDL)Definido por estadísticas

IDL = t ∙ SD = t ∙ (%RSD / 100) ∙ cantidad medida

Criterio basado de formula estadística, seguido por multitud de normativas y guías de

validación metodológicas

• La mínima cantidad de analito que es detectable y que se pueda distinguir del ruido de fondo con un nivel de confianza

IDL

• Valor de “t” Student, para

• 99% nivel de confianza

• n – 1 grados de libertadt

• Desviación estándar relativa / precisión del área de pico a la cantidad medida

• Con n replicados inyectados%RSD

• Limitado a 2 – 5 x veces mayor que el Limite de Detección (DL)

Cantidadmedida

• Ajuste Teórico de %RSD basado en

estadísticas

• %RSD aumenta cuanto mas bajo es la

cantidad inyectada

%RSD vs. Cantidad Inyectada

Especificaciones IDL Agilent 7010 Triple Cuadrupolo

IDL = 0.5 fg

2 fg/µL OFN standard

8 inyecciones consecutivas

1 µL splitless

Comprobado en fábrica

Comprobado en instalación

Mas iones = Mejor Precisión

¿Sólo cuestión de mejores limites de detección?

• Limites de detección mejores – hasta un orden de magnitud

en muchos casos

• Mismos limites de detección, pero

• Menor cantidad de muestra

- Diluyendo, o inyectando menos – Aumenta la vida de Liner y columna

- Bajar escala de muestra– 1 litro a 100 ml, o 10 g a 1 g

• Menor preparación de muestra

- Sin pasos de preconcentración

• l/l extracción

• SPE

• Evaporar y disolver

Aumento de la vida del liner

64 injecciones de

extracto de

QuEChERS manzana

2 µl

0.5 µl

Menor Volumen de InjecciónMejora resultados y menor mantenimiento

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 2 4 6 8 10 12 14

CAL

0.5 µl injections (1/4 of the normal 2 µl injection)

10 ppb (MRL) - Average RSD = 5.5%

Menor tiempo de adquisición por MRM

- Tiempos de Dwell más cortos

• Acorte de los tiempos de run

• Mas compuestos a analizar por run

• Mas cualificadores para mayor confianza

- Menores RSDs

• Mayor confianza en los resultados

40

60

80

100

120

140

160

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Mevinphos

PCB

Chloropropham

HCB

Fonofos

Terbacil

Tefluthrin

Chlorothalonil

PCA

Vinclozolin

Metolachlor

Chlorpyrifos

Dacthal

Diphenamid

Procymidone

Prothiofos

Fludioxonil

DDE-p,p'

Oxyfluorfen

Flusilazole

Endrin

Bromopropylate

Tebufenpyrad

Fenarimol

Coumaphos

*Same transition, Plum matrix, result based on one analysis, n= 5 cal sets 0.1-100 ppb

0.02 0.05 0.1 0.5 1 5 10 (Cal) 20 50 100

7010 estabilidad de los ratios de iones

ppb

%

Ratio (+/- 20%) mantenido a niveles

de concentracion 10 veces abajo

Demostración de 1 ms tiempo de Dwell

1050→1040 1040→1030…

280→270 270→260

…

…

…

80→70

272→222

Actualización en su plataforma de GC/TQ

7010: El Nuevo

standard para las

mejores prestaciones

en EI

7000C: La opción más allá del

estándar de confianza

necesario para cumplir con

todas las regulaciones hoy día

incluido alimentación infantil

Actualización

Agilent 7010Análisis de hormonas

derivatizadas (TMS)

Condiciones cromatográficas y de detección

Agilent 122-5512UI

15m DB-5MS x 250 μm x 0.25 μm

Temperatura de Horno

160 °C (0.3min) 30 °C/min hasta 290ºC (0 min) 50

°C/min hasta 305 °C (0 min)

Post Run 70 °C

ALS

Syringe Size 5 μL

Injection Volume 1 μL

Front MM Inlet He

Mode Pulsed Splitless

Heater 250 °C

Injection Pulse Pressure 25 psi Until 0.5 min

Flujo 1.2 mL/min

4mm STGW UI liner

QQQ EPC Celda de Colisión

He Quench 2.25 mL/min

N2 Collision Gas 1.5 mL/min

Temp Linea transferencia: 250 °C

Cálculo del IDL para la E2-TMS

Test Date: 6-6-14 Customer: Melissa

Start Time: Serial #:

Finish Time: ALS: 7693

inj peak Area peak Ht peak Area peak Ht

1 685 - -

2 631 - -

3 604 - -

4 762 - -

5 726 - -

6 682 - -

7 686 - -

8 734 7.6% #DIV/0!

9 684 7.6% #DIV/0!

10 698 6.8% #DIV/0!

11 680 4.3% #DIV/0!

12 626 4.8% #DIV/0!

Min RSD-> 4.3%

IDL-> 25.9-fg

200fg E2 Injected

Moving RSD

IDL = t ∙ SD = t ∙ (%RSD / 100) ∙ cantidad medida

Calibración de E2-TMS (5 replicas consecutives)

0.05 - 10 ng/mL E2-TMS, 1 uL

injected

(50-10,000 fg)

R^2 = 0.9999

Cromatogramas E2-TMS a 0, 0.05, y 0.5 ng/mL

Blanco de reactivo 50 fg 500 fg

E1-TMS calibración

50 fg on column

(ESTD)

E1-TMS calibración

0.05 - 10 ng/mL E1-TMS, 1 uL injected(50-10,000 fg)R^2 = 0.9999

(ESTD)

DHT-TMS calibración

5 pg en columna(ESTD)

DHT-TMS calibración

1 - 10 ng/mL DHT-TMS, 1 uL

injected

(1-10 pg)

R^2 = 0.9989

(ESTD)

Agilent 7010Análisis de Dioxinas,

Furanos y PCBs

Colaboraciones realizadas para Análisis de DioxinasAgilent 7010

Validation of GC-MS/MS

confirmatory method for the

European official control of

levels of dioxins, furans, and

dioxin-like PCBs in foodstuffs

A New Evaluation of Triple

Quadrupole GC/MS for Dioxin

Analysis in Food Samples Using a

Novel Source Technology

J.F. FocantUniversidad de Lieja

P. FürstCVUA-MEL (Alemania)

Condiciones cromatograficas y de detecciónAgilent 7010

Gas Chromatograph Agilent 7890B

Columns (1) 60 m x 0.25mm ID x 0.25 um DB-5ms Ultra Inert (122-5562UI)

Inlet Front MMI Inlet He, outlet 7010

Carrier gas Helium

Carrier gas mode Constant flow

Column Flow 1.0 mL/min

Injection Port MMI

Auto-sampler Agilent 7693A

Injection mode Solvent Vent

Injection Dispense Speed 69 μL/min

75°C (0.02)-720°C/min to 3250°C (5)

Vent Flow : 100 mL/min per min Vent Pressure 10 psi Until 0.02 min

Injection volumen 2.5 μl

Injection port liner

Oven program deg C (min) 120°C (5)-25°C/min to 250°C (5)-3°C/min to 285°C (0)

Run Time 26.867 min

Mass Spectrometer Agilent7010 MS/MS

MS Interface 280ºC

MS Source 250ºC

MS Quad 150ºC

Cromatograma TIC (Dioxinas+Furanos+PCBs)

2378-TCDD (41 fg/μl; 2 μl inyectado)

Especificaciones para análisis de Dioxinas2,3,7,8-TCDD a nivel de 5 fg/ul

2,3,7,8-TCDD

5 fg/ul; 2 ul inyectado

10 fg en columna

6 inyecciones consecutives de muestra grasa(0.79 pg-TEQ/g grasa)

RSD promedio: 6.7%

Resumen

1. Plataforma de MSMS completa. 7000C, 7010 y 7200B

2. Inversión continua de Agilent en desarrollo de todos sus sistemas de MS,

para cumplir con las más rigurosas normativas.

3. Política de Agilent de proteger la inversión al poder ser actualizables

equipos antiguos hasta los últimos modelos.

4. Alta sensibilidad no solo implica mejores LD, también menor

mantenimiento o mejores RSD

5. Sistemas de Alta sensibilidad para aplicaciones tradicionales de alta

robustez y alto rendimiento.(7000C)

6. Sistemas de Ultra alta sensibilidad en EI para aplicaciones especiales:

Dioxinas, PCBs, Hormonas (7010)

José Juan Rivero MarabéAgilent Technologies, Spain

jose.rivero@agilent.com

901 11 68 90