Acute mutation of retinoblastomagene function is sufficient

for cell cycle re-entry

Julien Sage, Abigail L. Miller, Pedro A. Pérez-Mancera,Julianne M. Wysocki & Tyler Jacks

Henrique C. De PaoliOrientador: Dr. J. Miguel Ortega

Modelo da Inativação de Rb

EXON3

Cél. Tronco

MEFs cRb lox/lox

Rb/cond Rb/cond

cond/cond(normal)

MEFs cRb lox/lox

• Taxa de proliferação normal• Expressão de Rb normal

Vetor Adeno Cre

Infecta TODASas células

24 hrs

EXON 3

EXON 3

Gene mRNA Proteína Rb3 dias

p130 Normalp107 Aumentada

Rb-/-

nocaute

MEFs: p107 aumentada

Adeno não muda proliferaçãowt, Rb-/-, Rblox/lox

ENTÃO:

Rb-/-

cRblox/lox

+ Cre

cRb-/-

• Mesma proliferação!!!• Param em confluência com a mesma densidade!!!

? Elas ficam quiescentes? (G0)

- soroG0 (quiescente)

Confluência :10%SF

3 dias em 0,1%SF

Tripsiniza (separa) G0

Adeno 0,1%SF

3 dias 0,1% SF

+BdUr por 24hrs

Alguém está em fase ?

Adeno normal(MOCK)

Adeno Cre

1º Experimento:

Rb-/- Não previne de entrar em G0 (80%)

cRblox/lox 90% em G0

cRb-/- (cre) 50% em G0

Nocaute Rb-/-

entra MELHORem G0 20%

Perda AgudacRb-/-

entra PIORem G0 50%

Compensação durante o desenvolvimento?

cRblox/lox

p21p16

alvosE2F(CiclinaE, MCM6)

p107p19

p130

cRb-/-

p21p16alvosE2F

p107p19p130

===

===

= Nocaute (Rb-/-)Este para em G0!

Alguém estácompensando

a falta deRb aqui?

Logo, não pode ser isso!

Será que é a p107 que faz a Rb-/- entrar em G0?

Rb-/-

RNAicontra p107

(p130 OK!)

10%SF 0,1%SFMock 100% 20%si-p107 100% 70%

Logo, é isso!

Vamos fazer uma cultura só com cél. quiescentes!Observou-se que a maioria morria por falta da Rb e p107! Logo:

Usa-se Lentivíruspq infecta

apenascél que não

estãoem divisão!

Protocolode 6 dias

3x BdUr

E RNAi para p19?

E na cRblox/lox cRb-/-?

A p107 teria que subir muito rápido para compensar a perda de Rb!

Logo, infecta com Adeno no dia -6, Rb, ficando sem soro, e:=> deu tempo de p107 subir (similar à Rb-/-)=> entrou em G0

Senescência • Rb-/- fica senescente• Sem Rb, Sem p107, sem p130 => Não fica

Mais um caso desobreposição

Só que... Mutação em Rb é que dá câncer!!!

Rb-/- senescente p107Rblox/lox senescente p107cRblox/lox senescente + Adeno Cre cRb-/- 3 dias

BdUr 24hrs

Ad Mock: 10-20%Ad Acre: 50%

H-ras

cRblox/lox

Ad

Ad Cre

2 98

27 73

3 dias

(Mitose) Podecompletar o ciclo

(não só BdUr)

• Injetar anti-corpos contra p53 reverte a senescência, temporariamente.

• cRb-/- pode se dividir várias vezes?

cRblox/lox

Senescente

Ad

Ad+Cre => 14/16 proliferaram

LV+Cre => proliferaram

Devolve Rb e retorna à

senescência!(not shown)

Conclusão:

• Os diferentes membros da familia Rb (p107 e p 130) sao igualmente capazes de induzir e manter o estado de senescencia

• A analise de Rb-/- pos-senescente mostrou que os marcadores associados a senescencia sao dependentes da funcao de Rb, controlando assim alguns aspectos do programa de senescencia

• A parada no ciclo celular induzido pela senescencia nao ‘e um processo irreversivel.

• Para ocorrer a compensacao funcional de Rb ‘e preciso uma ausencia mais prolongada de pRb e um reset mais complexo da maquinaria do ciclo celular.

• Por esta razao, a perda aguda de Rb pode, por si so, estimular a re-entrada no ciclo celular das celulas quiescentes (G0) e senescentes (envelhecidas).