เครื่องมือวิทยาศาสตร

299

บทที่ 13 : เครื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซ

(FLUOROMETER)

มีสารอินทรียและสารอนินทรียหลายชนดิเมื่อดูดกลืนแสงจากภายนอกเขาไปจะเปลงแสงที่มีความยาวคลื่นเทากับความยาวคลื่นแสงที่ดดูกลืนเขาไป(resonance radiation) หรือมีความยาวคลื่นมากกวาออกมาในทุกทิศทาง แตถาการเปลงแสงออกมาอาศัยพลังงานจากปฏิกิริยาเคมี จะเรยีกวา “การเปลงแสงทางเคมี” หรือ “chemiluminescence” และถาอาศยัพลังงานจากกระบวนการทางชีววิทยาจะเรียกวา “การเปลงแสงทางชีวภาพ” หรือ “bioluminescence” แตถาเปลงแสงเนื่องจากคุณสมบัติในตวัของมันเองเรยีกวา “การวาวแสง” หรือ “fluorescence” การหาปริมาณสารโดยการวัดความเขมของแสงฟลูออเรสเซนซไดเร่ิมมาตั้งแตป ค.ศ. 1966 แตการใชงานยังไมเปนทีแ่พรหลายมากนกั เนื่องจากเครือ่งมือมีราคาแพงและมวีิธีการประยุกตใชงานนอย จนกระทั่งในปจจุบนัมีแนวโนมการใชเทคนิคดังกลาวมากขึ้น เพราะเครื่องวัดแสงฟลูออกเรสเซนซมีราคาถูกลง และมีประสิทธิภาพในการวิเคราะหสูงขึ้นมาก กลาวคือการวิเคราะหโดยวดัความเขมของแสงฟลูออเรสเซนซมีขอดีกวาการวิเคราะหดวยการวัดส(ีcolorimetry) อยางนอย 4 ประการคือ

ประการแรก มีความจําเพาะสูง(high specificity) เนื่องจากสารประกอบฟลูออเรสเซนซ (fluorescence compound) แตละชนิดเปลงแสงออกมามีลักษณะคงที่ที่แตละความยาวคลื่นของแสงตกกระทบ ในทางปฎิบัติพบวามีสารรบกวนไมกี่ชนิดที่สามารถเปลงแสงฟลูออเรสเซนซได และถึงแมวาจะมีสารรบกวนบางชนิดสามารถเปลงแสงฟลูออเรสเซนซไดก็ตาม แตมักจะเปนความยาวคลืน่อื่นที่ไมตรงกับสารที่ตองการวิเคราะห นอกจากนีย้ังสามารถใชรูปแบบการเปลงแสงฟลูออเรสเซนซที่มีลักษณะจําเพาะของสารแตละชนิดเพื่อการจําแนกชนิด (identify) สารตัวอยางได ประการที่สอง มีความไวสูง(high sensitivity) สามารถวิเคราะหสารปริมาณนอยไดดกีวาการวัดดวยการวดัการดูดกลืนแสงไดถึง 1,000 – 500,000 เทา โดยเครื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซขนาดเล็ก(microflourometer) สามารถวิเคราะหสารไดนอยถึง fmole(femtomole, 10 –15 ) ประการที่สาม วิธีการวิเคราะหสวนใหญทําไดงาย รวดเรว็ และมีราคาในการวิเคราะหต่าํ

ประการที่ส่ี สามารถประยุกตใชงานไดในวงกวางทั้งในดานการแพทย วงการอุสาหกรรม ในดานสิ่งแวดลอม ในดานเทคโนโลยีชีวภาพ เนื่องจากมีชวงของการวิเคราะหกวาง ตัวอยางเชน ใชวิเคราะห bicarbonate, estrogen, cortisol, thyroxin, bile acid, nucleotides, protoporphyrin, glucose, heparin, lactate, plasminogen, protease, amikacin, digoxin, phenobarbital, quinidine, phenyltoin, thiamine, urea, Ag, Al, B, Be, Br, Ca, Cd, Cu, F , Ga, Ge, Li, Na, NO2

-, Pb, Se, Sb, Zn, Zr , เปนตน

เครื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซ

300

หลักการวัด ปกติอิเล็กตรอนจะอยูเปนคูในสถานะพื้น(ground state, S0) เมื่อไดรับพลังงานจากแสงความยาวคล่ืนสั้น ทําใหอิเล็กตรอนเดี่ยวมีพลังงานสูงขึ้นและกระโดดไปอยูในออรบิทัล (orbital) ที่สูงขึ้นตามระดับของพลังงานที่ไดรับ (S1, S2, S3,……..) (รูปที่ 13.1) เมื่อกลับสูสถานะพื้นจะเปลงแสงฟลูออเรสเซนซที่มีความยาวคลื่นเทากับความยาวคลื่นที่ดดูกลืนเขาไป(resonance fluorescence) แตเนื่องจากการกลับเขาสูสถานะพื้นของอิเล็กตรอนของอะตอมของสารเปลงแสง มีการสูญเสียพลังงานไปสวนหนึ่ง เนื่องจากการชน(collision) และการสั่น(vibration) ของอะตอม และการถายเทพลังงานใหสารละลาย จึงทําใหแสงที่เปลงออกมาขณะกลับเขาสูสถานะพื้นมีความยาวคลื่นแสงมากกวาแสงทีถู่กดูดกลืน(direct line fluorescence) แสงดังกลาวจะเกิดขึ้นในชวงสั้น ๆ (10-7 – 10-9 วินาที) หลังจากหยดุสองแสงตกกระทบ เรียกการเปลงแสงชนิดนี้วา “การวาวแสง”

สารเปลงแสงบางชนิดมีอิเล็กตรอนพลังงานสูง(S1)(รูปที่ 13.1) เปลี่ยนไปเปนอเิล็กตรอนพลังงานสูงที่มีระดับพลังงานใกลเคียงกัน(T1, triplet state) หลังจากเกิดการสูญเสียพลังงานบางสวน อิเล็กตรอนจะกลับสูสถานะพื้นพรอมกับเปลงแสงที่มีความยาวคลื่นยาวกวาออกมา แตเนื่องจากการเปลี่ยนสถานะจาก triplet state มาสูสถานะพื้นใชเวลามากกวา 10-9 วินาทีจนถึงหลายวินาที ทาํให

S33ห4444หกกกดดดด

รูปท่ี 13.1 การเปลงแสงเนื่องจากการเปลี่ยนระดับพลังงานของอะตอม มองเห็นแสงทีเ่ปลงออกมาเปนเวลานาน ถึงแมวาจะหยุดสองแสงตกกระทบแลวก็ตาม เรียกกระบวนการนี้วา “การเรืองแสง” หรือ “phosphorescence”

S3 S2 Excited state การสูญเสียพลังงาน S1

Excited triplet state

λ 2 λ1

λ3 ฟลูออเรสเซนซ ฟอสฟอเรสเซนซ

S0 สถานะพื้น(ground state)

เครื่องมือวิทยาศาสตร

301

จากรูปที่ 13.1 จะเห็นไดวาเมื่อใชแสงตกกระทบที่มีความยาวคลื่นต่ํากวา (λ1) อิเล็กตรอนจะ

ไปอยูในออรบิทัลที่มีพลังงานสูงกวา(S3) เมื่อใชแสงตกกระทบทีม่ีความยาวคลื่นมากกวา(λ2),(λ3) ในทางปฏิบัตถึิงแมวาจะใชแสงสีเดียว(monochromatic light) สองกระทบสารเปลงแสงก็ตาม แสงที่ เกิดขึ้นมกัมีหลายความยาวคลื่น เพราะอิเล็กตรอนพลังงานสูงมีการสูญเสียพลังงานหลายขั้นตอน ซ่ึงแตละขั้นตอนจะเปลงแสงฟลูออกเรสเซนซที่มีความยาวคลื่นแตกตางกนัออกมาเรียกวา “stepwise fluorescence” และการชนของอะตอมพลังงานสูงกับอิเล็กตรอนของธาตุอ่ืนทําใหเกิดการเปลงแสงฟลูออเรสเซนซไดเชนกนัเรยีกวา “sensitized fluorescence” เมื่อมีแสงตกกระทบ(I0) สารเปลงแสงที่มีความหนา(t) แสงที่ผานออกมา(It) จะมีความสัมพันธกับความเขมของแสงฟลูออเรสเซนซ(F) ดังนี้

จะเห็นไดวาความสัมพันธของความเขมขนและความเขมของแสงฟลูออเรสเซนซจะเปน

เสนตรงเมื่อ εct มีคานอยกวา 0.05 แตถาคา εct มากกวา 0.05 ความสัมพันธจะเปนเสนโคงไปทางแกนความเขมขน ในกราฟความสัมพันธระหวางความเขมของแสงและความเขมขนของสารเปลงแสงเพราะความเขมขนที่มากของสารเปลงแสงทําใหอิเล็กตรอนพลังงานสูงสูญเสียพลังงานโดยการชนกันเองเพิ่มขึน้(self quenching)

ปจจัยที่มีผลตอการเปลงแสงฟลูออเรสเซนซ นอกจากความเขมของแสงฟลูออเรสเซนซจะเปนสัดสวนโดยตรงกับ ความเขมของสารเปลงแสงแลว ยังมีปจจยัที่เกีย่วของกับการเปลงแสงฟลูออเรสเซนซดังนี้ 1. ออกซิเจนในสารละลาย จะลดการเปลงแสงฟลูออเรสเซนซ โดยการเรงการเปลี่ยนสถานะของอิเล็กตรอนพลังงานสูง(S1) ไปเปน triplet state 2. อุณหภูมิสูง ชวยใหอิเล็กตรอนเกิดการชนกันมาก มีการถายเทพลังงานไปสูสารละลายมาก ทําใหแสงฟลูออเรสเซนซมีความเขมลดลง โดยพบวาสารตัวอยางสวนใหญจะมีอัตราการลดลง

F = k(I0-It)-----------------------------------------------(1)

จากกฎของเบยีร I0/ It = 10-εct ------------------------------------------------(2) แทนคาสมการ (2) ในสมการที่ (1)

F = klo (1-10 εct )

= kl0 [(2.3 εct – (-2.3 εct )2 – (-2.3 εct )3…)] 2! 3!

ถา εct นอยกวา 0.05 F = K/c = 2.3 εctI0

เครื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซ

302

ของความเขมของแสงฟลูออเรสเซนซในอัตรารอยละ 1-2 ตออุณหภูมทิี่เพิ่มขึ้น 1 องศาเซลเซียส อาจแกไขโดยการควบคุมอุณหภมูิของปฏิกิริยาใหเปลี่ยนแปลงไมเกิน 0.1 องศาเซลเซียส 3. ความหนดืของสารละลาย สารละลายที่มีความหนดืมากทําใหแสงฟลูออเรสเซนซเขมขึ้น เนื่องจากลดการชนกันของอิเล็กตรอน 4. พีเอช มผีลตอความเขมของแสงและความยาวคลื่นแสงที่เปลงออกมาของสารเปลงแสงบางชนิด โดยเฉพาะสารประกอบอะโรมาติก (aromatic compound) 5. โครงสรางของสารเปลงแสง จากการศกึษาพบวาสารประกอบอะโรมาติกไฮโดรคารบอน

(aromatic hydrocarbon) ที่มีระดับพลังงานแทรนซิชันต่ํา(low energy transition level) (π→π∗) เปลงแสงฟลูออเรสเซนซที่เขมมากกวาสารประกอบที่มโีครงสรางแบบอะลิฟาติก (aliphatic) และอะลิไซคลิกคารบอนิล(alicyclic carbonyl) ที่มีพันธะคู(double bond) 6. การดูดกลนืแสงดวยสารเปลงแสง(self absorption) เกิดขึ้นในกรณีที่แสงที่เปลงออกมามีความยาวคลื่นใกลเคียงกับแสงที่ตกกระทบสารเปลงแสงมาก ทําใหแสงฟลูออเรสเซนซที่เกิดขึ้นบางสวนถูกดดูกลืนไวดวยอะตอมของสารเปลงแสง

7. การกระเจงิของแสง(light scattering) แสงรบวนที่เกิดขึน้ที่พบมากมีอยู 5 ชนิดคือ Rayleigh scattering, Raman scattering แสงตกกระทบทตุิยภูม(ิsecondary order ray) แสงกระเจิงจากสารชีวโมเลกุลขนาดใหญ และแสงกระเจิงเนื่องจากความขุน ซ่ึงสามารถลดการรบกวนหรือแกไขโดยการตัดแสงรบกวนเหลานี้ออกดวยตวักรองแสงที่เหมาะสม หรือเลือกใชความยาวคลื่นแสงตกกระทบและความยาวคลื่นแสงที่ตองการวัดใหเหมาะสม

7.1 Rayleigh scattering เกิดขึ้นเนื่องจากโมเลกุลไดรับพลังงานจากแสงตกกระทบทําใหอะตอมเกิดการเปลี่ยนระดับพลังงาน แตไมมีการสูญเสียพลังงาน ดังนัน้จึงปลอยแสงฟลูออเรสเซนซที่มีความยาวคลื่นเทากับความยาวคลื่นแสงตกกระทบ ซ่ึงจะทําใหความไวในการวเิคราะหลดลง (รูปที่ 13.2)

7.2 Raman scattering เนื่องจากโมเลกุลของสารละลายไดรับพลังงานจากแสงตกกระทบ แตมีการสูญเสียพลังงานขณะอะตอมกลับสูสถานะพื้น จึงปลอยแสงฟลูออเรสเซนซที่มีความยาวคลื่นมากกวาคลื่นแสงตกกระทบเล็กนอยซ่ึงมักจะไมมีผลรบกวนการตรวจวิเคราะห(รูปที ่13.2)

7.3 แสงตกกระทบทุติยภมูิ(secondary order ray) เปนความยาวคลืน่ของแสงตกกระทบที่มักจะเกิดที่ความยาวคลื่นเปน 2 เทา ของความยาวคลื่นแสงตกกระทบ ดังนั้นในกรณีที่วดัความยาวคล่ืนแสงฟลูออเรสเซนซหางจากคลื่นแสงตกกระทบมาก อาจจะถกูรบกวนจากคลื่นแสงตกกระทบทุติยภูม ิหรือคล่ืนแสงตกกระทบตติยภูม(ิtertiary order ray) ดวย(รูปที่ 13.2 และตารางที่ 13.1) 7.4 การกระเจิงของแสงจากสารชีวโมเลกุลขนาดใหญ เกิดขึ้นจากสารตัวอยางมีโปรตีนหรือสารประกอบอื่นที่มีโปรตีนเปนองคประกอบ ทําใหสารชีวโมเลกุลเหลานี้ปลอยแสงฟลูออเรสเซนซออกมารบกวนการวิเคราะห การลดการรบกวนจากสารชีวโมเลกุลอาจทําไดโดยการเลือกความ

เครื่องมือวิทยาศาสตร

303

ความเขมของแสง

ความยาวคลืน่แสง

รูปท่ี 13.2 แสงที่เปลงออกมาเมื่อมีแสงตกกระทบสารประกอบฟลูออเรสเซนซ

ยาวคล่ืนแสงตกกระทบใหอยูนอกชวงความยาวคลื่น 260-290 นาโนเมตร ซ่ึงเปนชวงความยาวคลื่นที่โมเลกุลของโปรตีนถูกกระตุนดวยแสงไดดี

7.5 การกระเจิงของแสงเนื่องจากความขุน สารแขวนลอยที่เปนของแข็งสามารถสะทอนแสง ทําใหเกิดการกระเจิงของแสงซึ่งอาจทําใหคาความเขมของแสงสูงกวาความเปนจริง 8. สารประกอบฟลูออเรสเซนซมีความเขมขนสูงเกินไป ทําใหแสงตกกระทบสองผานไมทั่วถึง ทําใหแสงฟลูออเรสเซนซเกิดขึ้นนอยกวาความเปนจริง(inner filter effect) 9. แสงรบกวนจากควิเวทท อาจเกิดเนื่องจากเนื้อควิเวททมีสารเจือปน หรือเกิดจากการลางคิวเวททไมสะอาด 10. แสงรบกวนจากสารรบกวน ซ่ึงเกดิจากสารรบกวนที่มีอยูในสารละลาย หรือสารตัวอยาง 11. การสลายตัวของสารตัวอยาง อาจเกดิขึ้นเนื่องจากแสงทําใหสารตัวอยางซึ่งมักมีปริมาณ นอยอยูแลวถูกทําลายโดยการออกซิเดชันจากแสง(photo oxidation) ทําใหวัดคาไดต่ํากวาความเปนจริง การลดการถูกทําลายดังกลาวอาจทาํไดโดยการเกบ็สารตัวอยางในที่มืด หรือการลดการเกิดฟองอากาศในตัวอยางดวยการไมเขยาอยางรุนแรง และควรรีบวัดคาความเขมของแสงทันทีที่ปลอยแสงตกกระทบไปยังสารตัวอยาง โดยเฉพาะอยางยิ่งการใชหลอดกําเนิดแสงที่เปนหลอดเลเซอรพบวาแสงเลเซอรจะทําลายสารตัวอยางไดมากกวาหลอดไฟกําเนิดแสงชนดิอืน่

แสงตกกระทบปฐมภูมิ แสงตกกระทบทุติยภูมิ

Raman scattering

ฟลูออเรสเซนซจากสารรบกวน

ฟลูออเรสเซนซจากสารตัวอยาง

เครื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซ

304

12. การถายเทพลังงาน(quencing) เกิดขึ้นเนื่องจากโมเลกุลของสารฟลูออเรสเซนซสูญเสียพลังงานใหกบัโมเลกุลของสารละลายหรือโมเลกุลของสารอื่นที่อยูในสารละลายมาก ทําใหความเขมของแสงฟลูออเรสเซนซลดลง ตารางที่ 13.1 แสดง Raman scattering ท่ีความยาวคลื่นตาง ๆ ของแสงตกกระทบ

แสงตกกระทบ (นาโนเมตร)

น้ํา

Ethyl alcohol

Cyclohexane

Carbontetra chloride

Chloroform

248 271 267 267 - - 313 350 344 344 320 346 365 416 405 408 375 410 405 469 459 458 418 461 436 511 500 499 450 502

องคประกอบและคุณสมบัติ เครื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซ มีองคประกอบและคณุสมบัติคลายกับที่พบในเครื่องวัดการดูดกลืนแสงดงันี้

1. หลอดไฟกาํเนิดแสง(light source) ใชหลอดเมอคิวรีความดันสูง(high pressure mercury lamp) ซ่ึงสามารถปลอยแสงที่มีความเขมมากที่ความยาวคลื่น 253.6, 280.4, 334.1, 435.8, 546, 577 และ 1,014 นาโนเมตร หรือใชหลอดเมอคิวรีความดันต่าํ(low pressure mercury lamp) ซ่ึงสามารถปลอยแสงที่เขมมากที่ความยาวคลื่น 254 นาโนเมตร แตนิยมใชหลอดซีนอน (xenon lamp) มากที่สุด เพราะสามารถปลอยคลื่นแสงออกมาในชวงกวางพอเพียงสําหรับการวิเคราะหสารตาง ๆ ในชวง 190-1,200 นาโนเมตร แตอยางไรก็ตามในระยะหลังไดนิยมใชหลอดเลเซอรมากขึ้นเนื่องจากสําแสงเลเซอรมีความยาวคลื่นจําเพาะ มีขนาดเล็กทําใหสามารถประยุกตใชงานเฉพาะอยาง ตัวอยางเชนใช อารกอนเลเซอรในเครื่องโฟลวไซโตมิเตอร(flow cytometer ) ใช ฮีเลียม-นีออน เลเซอร สําหรับเครื่องวัดขนาดของอนุภาคเปนตน และยงัมีการนําเอาไดโอดเปลงแสง(light emitting diode) มาเปนแหลงกําเนิดแสง เนื่องจากมขีนาดเล็กสามารถนําไปประยุกตใชงานในเครื่องมือขนาดเล็กไดด ี

2. ตัวแยกแสงตกกระทบ(excitation filter) มีทั้งชนิดที่เปนตัวกรองแสง(light filter) และเกรตติง มหีนาที่กรองแสงหรือแยกความยาวคลื่นแสงที่ไมตองการใหตกกระทบสารตัวอยางออก ในกรณีที่เปนเกรตติงมักจะไมคอยมีปญหาในการใชงาน เพราะสามารถจําแนกแสงตกกระทบไดดีและใหแถบแสงทีแ่คบ แตในกรณีที่ใชตวักรองแสงจําเปนตองเลือกใชงานใหถูกตองเหมาะสม เพราะใหแถบแสง (band width) ที่ผานออกมากวางประมาณ 15 นาโนเมตร การเลือกใชงานจึงไมควรให

เครื่องมือวิทยาศาสตร

305

รูปท่ี 13.3 ทางเดินของแสงในเรื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซชนิดลําแสงเดี่ยว(ก) และชนิด ลําแสงแยก(ข)

ความกวางของแถบแสงไปซอนทับตัวกรองแสงปลอยออก(emission filter, F2)(รูปที่ 13.3) เพราะแสงตกกระทบที่ผานออกมาจากตัวกรองแสงตกกระทบ(F1) อาจจะผานตวักรองแสงปลอยออก(F2) ไปสูตัวไวแสงดวย ทําใหวัดความเขมของแสงไดสูงกวาคาจริง และเพื่อใหการวดัมีความไวมากที่สุด ตัวแยกแสงตกกระทบ(F1, G1) ควรใหสําแสงตกกระทบที่มีความเขมสูง และควรมคีวามยาวคลื่นแสงใกลเคียงกับความยาวคลื่นแสงที่เขมมากของหลอดไฟกาํเนิดแสง

เครื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซ

306

3. คิวเวทท คิวเวทททีใ่ชมทีั้งชนิดทรงกระบอก และชนิดสี่เหล่ียม คิวเวททชนิดสี่เหล่ียมมีความเหมาะสมในการใชงานมากกวา เนื่องจากลดการกระเจิงของแสงตกกระทบ(light scattering)ไดมากกวาควิเวททชนิดกลม คิวเวททที่ทาํจากควอทซสามารถใชงานไดในทกุชวงความยาว คล่ืนแสงตั้งแต 190 นาโนเมตรขึ้นไป จนถึง 2,700 นาโนเมตร คิวเวททที่ทําจากแกวชนิดบอโรซิลิเคท (borosilicate glass) สามารถใชงานไดเมือ่แสงตกกระทบมีความยาวคลื่นมากกวา 320 นาโนเมตรขึ้น ไป จนถึง 2,500 นาโนเมตร คิวเวททพลาสติกสามารถใชงานไดในบางชวงคลื่น แตตองระวังการมีสารวาวแสงที่เจือปนอยู ซ่ึงอาจทําใหเกิดการรบกวนในบางชวงคลื่นของการวัดแสง

4. ตัวแยกแสงปลอยออก(emission filter) มีทั้งชนิดที่เปนตัวกรองแสง(light filter) และเกรตติง มีหนาที่ตัดแสงรบกวนตาง ๆ เชน Rayleigh scattering และ Raman scattering ออก แตปลอยใหเฉพาะความยาวคลื่นที่ตองการวัดผานไปสูตัวไวแสง

5. ตัวกรองแสง(optical filter) ในเครื่องวดัแสงฟลูออเรสเซนซบางแบบใชตัวกรองแสงเพื่อทําหนาที่กรองคลื่นแสงที่ปลอยออกมาจากตัวแยกแสงปลอยออก เพือ่เลือกชวงความยาวคลื่นบางชวงใหตกกระทบตัวไวแสง ทั้งนี้เพื่อเพิ่มความจําเพาะในการวัดใหมากขึ้น 6. ตัวไวแสง(light detector) นยิมใชโฟโตมัลติพลายเออทิวบ เพราะมีชวงการวดักวางตั้งแต 300-1,000 นาโนเมตร และสามารถขยายจํานวนโฟตอนไดเปนจํานวนมาก ทําใหแสงฟลูออเรสเซนซที่เปลงออกมา(emission light) ซ่ึงสวนมากมีความเขมนอยมาก ถูกขยายจํานวนโฟตอนใหมากขึ้นจนวงจรอิเล็กทรอนิกสสามารถวัดไดอยางถูกตอง แตอยางไรก็ตามในเครือ่งมือขนาดเล็กที่ใชในภาคสนามนิยมใชโฟโตไดโอดที่ทําจากสารกึ่งตวันําเปนตัวไวแสง เนื่องจากมีขนาดเล็กใชกระแสไฟฟานอย แตมีขอจํากัดในการใชงานบาง เพราะสามารถวัดความเขมของแสงไดดีเมื่อมคีวามเขมของแสงนอยถึงระดับปานกลาง 7. ภาคแสดงผล สามารถวัดความเขมของแสงออกมาในหนวย % T (transmittance) หรือวัดออกมาในหนวยความเขมขนในเครื่องมือที่มีระบบคํานวณผลอัตโนมตัิ 8. แผงควบคุม อาจประกอบดวยปุมควบคมุดังนี ้

8.1 สวิทชปดเปดไฟฟา (ON/OFF switch) ใชเพื่ออุนเครื่องและหลอดไฟกําเนดิแสงกอน ใชงาน

8.2 ปุมจายกระแสไฟฟาใหหลอดไฟกําเนิดแสง (lamp start knob) ควรเปดหลังจากเปด สวิทชไฟฟาในขอ 8.1

8.3 ปุมปรับศูนย (zero knob, blank adjust knob) ใชปรับ 0% T เมื่อใสรีเอเจนตอางอิง (reagent blank) ลงในชองใสสารตัวอยาง โดยการปรับความกวางของชองแสง(aperture) ที่อยูบน ชัตเตอร(shutter) เพื่อปรับปริมาณแสงที่ตกกระทบสารตัวอยาง

8.4 ปุมเลือกความยาวคลื่นแสงตกกระทบ(Ex. knob) ใชเลือกความยาวคลื่นแสงตกกระทบ โดยการเลือกตัวกรองแสงหรือการควบคุมการเคลื่อนที่ของเกรตติง

เครื่องมือวิทยาศาสตร

307

8.5 ปุมเลือกความยาวคลื่นแสงฟลูออเรสเซนซ (Em. knob) ทํางานเชนเดยีวกับปุมควบคุม ในขอ 8.4

8.6 ปุม Std ใชสําหรับปรับความกวางของชองแสงบนซัตเตอรที่อยูหลังสารตัวอยาง เพือ่ กําหนดปริมาณแสงฟลูออเรสเซนซที่ตกกระทบตัวไวแสง

8.7 ปุมเลือกชวงการวัด (range selector knob) ใชสําหรับเพิ่มความไวในการวัด โดยการ เปลี่ยนอัตราการขยายสัญญาณไฟฟาจากตวัไวแสง

ชนิดของเครื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซ เครื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซมีรูปรางตาง ๆ กัน คลายคลึงกับเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร(รูปที่ 13.4) อาจแบงออกเปน 2 ชนิด ตามชนิดของตัวแยกแสง คือ เครื่องฟลูออโรมิเตอรชนิดใช

รูปท่ี 13.4 รูปรางของเครื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซ ฟลเตอร (filter fluorometer) และเครื่องฟลูออโรมิเตอรชนิดใชเกรติง(spectrofluorometer) แตในที่นี้จะแบงชนิดตามระบบทางเดนิแสงออกไปเปน 2 ชนิดคือ 1. ชนิดลําแสงเดี่ยว(single beam type) พบในเครื่องวดัแสงฟลูออเรสเซนซชนิดที่ใชตัวกรองแสงเปนตัวแยกแสง ในการวัดความเขมของแสงจะใชลําแสงเดียวกนัสําหรับวัดสารอางอิง สารมาตรฐานและสารตัวอยาง(รูปที่ 13.3 ก.) มีขอดีและขอเสียเชนเดยีวกบัเครื่องวัดการดูดกลืนแสงชนิดลําแสงเดี่ยว นิยมวางสารตัวอยางและตัวไวแสงเปนมุมฉากซึ่งกันและกัน เพื่อลดการรบกวนจากแสงที่ไมตองการ ตัวกรองแสงตกกระทบ(F1, excitation filter) มีหนาทีด่ดูกลืนแสงที่มองเห็นได(visible

เครื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซ

308

light) แตปลอยใหแสงอัตราไวโอเลตผาน สวนตัวกรองแสงปลอยออก (F2, emission filter) มีหนาที่ดูดกลืนแสงอัตราไวโอเลตไว แตยอมใหแสงที่มองเห็นไดผานไปสูตัวไวแสง 2. ชนิดลําแสงแยก (splited beam type) สรางขึ้นเพื่อลดความผิดพลาดอันเนื่องจากความไมคงที่ของแสงตกกระทบ โดยการแยกลําแสงตกกระทบสวนหนึ่งใหสองไปยังตวัไวแสงอางองิอยูตลอดเวลาที่วดัความเขมของแสงฟลูออเรสเซนซ (รูปที่ 13.3 ข) สัญญาณไฟฟาทีเ่กิดจากตัวไวแสงวัด จะถูกเปรยีบเทียบกับสัญญาณไฟฟาทีเ่กิดจากตัวไวแสงอางอิง แลวขยายใหเหมาะสมสําหรับการอานคาตอไป ดังนั้นจึงมีความแมนยําในการวัดความเขมของแสงฟลูออเรสเซนซดีมาก ระบบนี้นิยมใช เกรตติง 2 อันเปนตวัแยกแสง เกรตติงตวัแรก(G1) ทําหนาที่กําหนดความยาวคลื่นแสงที่ตกกระทบ สวนเกรตติงตวัที่สอง(G2) ทําหนาที่เลือกแสงที่เปลงออกมาใหตกกระทบตัวไวแสง เกรตติงสามารถแยกความยาวคลื่นแสงไดละเอียดและตอเนื่อง จึงสามารถประยุกตใชงานและเพิม่ประสิทธิภาพในการวิเคราะหปริมาณสารเปลงแสงไดดีกวาการใชตัวกรองแสง

วิธีใช การใชงานเครือ่งฟลูออโรมิเตอรแตละรุน แตละแบบ มีวิธีการที่แตกตางกันออกไป โดยเฉพาะอยางยิ่งเครื่องมือรุนใหมทีใ่ชโปรแกรมคอมพวิเตอรควบคุมการทํางาน แตอยางไรก็ตามยังคงไวซ่ึงขั้นตอนพื้นฐานการใชงานที่สําคัญ ๆ ไว ในที่นีจ้งึเสนอขั้นตอนการใชงานของเครื่องวัดความเขมของแสงฟลูออเรสเซนซอยางงาย ซ่ึงมีขั้นตอนที่สําคัญดังนี้ 1. เปดสวิทชจายกระแสไฟฟาเขาสูเครื่องมือ 2. เปดสวทิชจายกระแสไฟฟาใหหลอดไฟกําเนดิแสง เพื่ออุนหลอดไฟกําเนดิแสงนาน 20-30 นาทีกอนใชงาน 3. เลือกใชตัวกรอง หรือเกรตติงที่เหมาะสม เพื่อกําหนดความยาวคลื่นแสงตกกระทบ (exitation wavelength) และความยาวคลื่นแสงที่ตองการวัด(emission wavelength) 4. ใสรีเจนตอางอิง(reagent blank) ในชองใสคิวเวทท แตการวิเคราะหบางชนิดอาจใชอากาศเปนตัวอางอิง(air blank) 5. เปดชัตเตอร ปรับ 0% T โดยหมนุปุม Blank 6. ใสสารมาตรฐานที่ทราบคาลงในชองใสคิวเวทท 7. เปดชตัเตอรปรับ 90-100% T โดยปรับชองแสงออก (ปุม Std) หรือปรับใหไดคาเทากับความเขมขนของของสารมาตรฐาน ถาตองการอานคาออกมาในหนวยความเขมขนโดยตรง ในกรณีที่ไมสามารถปรับใหไดตัวเลขที่ตองการอาจแกไขโดยการเพิ่ม หรือลดอัตราการขยายสัญญาณ 8. ทําซ้ําในขั้นตอนขอ 4-7 จนแนใจวาคาตัวเลขไมเปลี่ยนแปลง 9. ใสสารตัวอยางในชองใสคิวเวทท อานคาที่ได และควรตรวจสอบคาของสารมาตรฐานหลังการวัดสารตัวอยางทุก ๆ 5-10 ตัวอยาง

เครื่องมือวิทยาศาสตร

309

ขอควรปฏิบัติในการใชงาน เพื่อใหการวัดความเขมของแสงฟลูออเรสเซนซเปนไปอยางถูกตอง เหมาะสม และเกิดความปลอดภัยควรปฏิบัติดังนี้ 1. ติดตั้งเครื่องมือในสถานที่ที่มีอุณหภูมคิอนขางคงที่ และปราศจากการสั่นสะเทือน 2. อุนหลอดไฟกําเนดิแสงใหพอเพยีงกอนใชงาน และหามมองแสงจากหลอดไฟกําเนิดแสงโดยตรง เพราะแสงอัลตราไวโอเลตอาจทําลายกระจกตา 3. ควรใชคิวเวททที่มีความแตกตางกนัของ %T ไมเกนิ 1% และควรใชคิวเวทททีไ่มมีสารเปลงแสงเจือปนในเนื้อคิวเวทท 4. ใชสารเคมทีี่มีความบริสุทธิ์สูง(fluorescent grade) ที่ปราศจากการเจือปนจากสารเปลงแสงอ่ืน ๆ 5. ควรเก็บสารมาตรฐานไวในลักษณะของสารละลายที่มีความเขมขนมาก เมื่อตองการใชงานจึงนํามาเจอืจางดวยตัวเจอืจางที่เหมาะสม เพื่อปองกันสารมาตรฐานถูกทําลายในขณะเก็บไว 6. สารตัวอยางและสารมาตรฐาน ควรมีคาพีเอช และมอุีณหภูมิเทา ๆ กัน เพื่อลดอิทธิพลของพีเอช และอณุหภูมิที่อาจทําใหคาเปลี่ยนแปลง 7. ไมควรใหมฟีองอากาศในสารละลายที่จะวดัความเขมของแสงฟลูออเรสเซนซ 8. ควรเก็บน้ํายาตาง ๆ ไวในขวดแกวชนดิบอโรซิลิเคท หรือขวดพลาสติกชนิดโพลีเอธิลีน (polyethylene) ที่มีฝาปดสนิท

9. หลังจากวัดความเขมของแสงเสร็จ ไมควรปลอยใหสารละลายแชอยูในควิเวททนาน เพราะจะทําใหลางออกยาก ซ่ึงอาจจะมีผลรบกวนการวัดคาความเขมของแสงในตวัอยางอื่น ๆ ตอไป

10. เลือกขนาดคิวเวททใหเหมาะสมกบัชวงของการวัด ซ่ึงควิเวททที่จะใชโดยท่ัวไปจะมีเสนผาศูนยกลาง 10 มม. แตถาตองการใหชวงสูงสุดของการวัดเพิ่มขึ้นใหใชควิเวททขนาดโตขึ้นกวา 10 มม. แตจะสูญเสียชวงต่ําสุดของการวัดไปบางเล็กนอย

11. วัดคาความเขมของแสงสูงสุดไมเกิน 0.1 ทั้งนี้เพื่อลดความผิดพลาดจาก inner filter effect

การเลือก การเลือกเครื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซควรพิจารณาถึงประสิทธิภาพ และความเหมาะสมกับการใชงาน(practicability) ดังนี้ 1. มีความไว(sensitivity) สูง มีขีดจํากัดการวิเคราะหชวงต่ํา (lower detection limit) ดี 2. ควรใชเครือ่งชนิดลําแสงแยกเพราะใหคาความถูกตอง และมีความแมนยําในการวัดดกีวาเครื่องชนิดลําแสงเดี่ยว 3. ใชสารตัวอยางสําหรับการวิเคราะหนอย เครื่องวดัแสงฟลูออเรสเซนซควรมีคิวเวททขนาดเล็ก(micro cuvette) เพื่อความสะดวกในการตรวจวิเคราะหสารตัวอยางที่มีปริมาณนอย ๆ และเพื่อ

เครื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซ

310

ชวยใหประหยดัน้ํายามากขึ้น 4. เครื่องมือมีระบบควบคุมอุณหภูมิในชองใสคิวเวททใหอยูในชวง ± 0.1 องศาเซลเซียส เพื่อชวยใหการวัดมีความถูกตองและแมนยํามากยิ่งขึ้น 5. มีชวงการอานคากวาง ซ่ึงจะชวยใหการวิเคราะหครอบคลุมคากวางขึ้นโดยไมตองเจือจางตัวอยาง 6. มีเสถียรภาพสูง(high stability) มีระบบแสงและวงจรอิเล็กทรอนิกสที่มีคุณภาพสูงสามารถควบคุมคาความเขมของแสงใหคงที่ตลอดเวลาไดเปนเวลานาน 7. ใชงาย ตัวอยางเชน การปรับ 0% T การใสสารตัวอยาง การเลือกตัวแยกแสง การปรับ 100%T เปนตน 8. เครื่องมือที่ใชระบบไมโครโพรเซสเซอร ควบคุมการทํางาน จะชวยเพิ่มประสิทธิภาพเครื่องมือในดาน การปรับ 0%T แบบอัตโนมัติ การตัดแสงรบกวน การสรางกราฟแสดงการเปลงแสงแบบตอเนื่องของสารตาง ๆ การคํานวณทางคณิตศาสตร การสรางกราฟมาตรฐาน และการตรวจหาความผิดปกติของเครื่องมือ ฯลฯ. 9. บํารุงรักษางายและเสยีคาใชจายนอย

ปญหาและสาเหตุ เครื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซอาจเกิดความผิดปกติในการวัดความเขมของแสง อันเนื่องจากสาเหตุที่แตกตางกันดังตารางที่ 13.2 แตปญหาที่พบไดบอยโดยท่ีผูทําการวิเคราะหเองไมทราบคือ ปญหาการปนเปอนจากขั้นตอนตาง ๆ ในการตรวจวิเคราะห ดังนัน้ในการตรวจวิเคราะหจึงควรมีการทําซ้ํา 2-3 คร้ัง และควรตรวจสอบความถูกตองจากคาของสารควบคุม หรือสารมาตรฐานที่ทราบคาดวยทกุครั้ง ตารางที่ 13.2 ปญหาและสาเหตุท่ีอาจพบในการใชเคร่ืองวัดแสงฟลูออเรสเซนซ

ปญหา

สาเหตุ

แสงของหลอดไฟกําเนิดแสงมีความเขมไมคงที่ - อุณหภูมิรอบ ๆ หลอดไฟต่าํเกินไป - กระแสไฟฟาเล้ียงหลอดไฟกําเนดิแสงไมคงที่ - หลอดไฟกําเนิดแสงเสื่อม - อุนหลอดไฟกําเนิดแสงไมนานพอ

คาความเขมของแสงเปลี่ยนแปลงชา -สารเปลงแสงใชเวลานานในการเกดิแสงที่มี ความเขมมากที่สุด ตัวอยางเชน quinine - ตัวไวแสงเสือ่ม

เครื่องมือวิทยาศาสตร

311

ตารางที่ 13.2 ปญหาและสาเหตุท่ีอาจพบในการใชเคร่ืองวัดแสงฟลูออเรสเซนซ(ตอ)

ปญหา

สาเหตุ

วัดคาไดต่ํากวาคาจริง - มีสีเจือปนในการตัวอยาง -สารตัวอยางมคีวามเขมขนมากเกินทําใหเกดิ self quenching -สารตัวอยางมอุีณหภูมิสูง -มีสารรบกวนในสารตัวอยาง -สารตัวอยางมอีอกซิเจนและลายปนอยูมาก -ความเขมขนของสารมาตรฐานไมถูกตอง

วัดคาไดสูงกวาคาจริง -ตัวกรองแสงตกกระทบมีความกวางของแถบแสงซอนทับกบัแถบแสงที่ไดจากตวักรองแสงปลอยออก -มีแสงรบกวน หรือมีแสงกระเจิง -มีสารเปลงแสงเจือปนในสารตัวอยาง -สารมาตรฐานมีคาไมถูกตอง

เม่ือพิจารณาโครงสรางและหลักการทํางานของเครื่องวดัแสงฟลูออเรสเซนซโดยละเอียด จะ

เห็นไดวาเครื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซมีประโยชนมากสําหรับการวิเคราะหสารที่มีปริมาณนอย ๆ ซ่ึง

ถาใชวิธีการอืน่ ๆ มักจะถูกรบกวนไดงายและไดคาไมถกูตอง และในปจจุบันเทคนิคการวัดความเขม

ของแสงฟลูออเรสเซนซไดถูกนําไปประยกุตใชในเครื่องวิเคราะหอัตโนมัติมากขึน้ตามลําดับ จึงเปน

สิ่งท่ีนาสนใจติดตาม เพื่อนาํมาประยุกตใชในหองปฏิบตัิการวิทยาศาสตรตอ ๆ ไป

เครื่องวัดแสงฟลูออเรสเซนซ

312

บรรณานุกรม

1. Ferris CD. Guide to medical laboratory instruments. Boston : Little, Brown and Company, 1980.

2. Goldner HJ. Fluorescence future,s radiate with promising applications. Research & Development 1993;35:5-6.

3. Guilbault GG. Practical Fluorescence. 2nd ed. New York: Marcel Dekker Inc, 1990. 4. Lakowicz JR. Principle of Fluorescence Spectroscopy. New York: Plenum Press, 1983. 5. Lee LW, Schmidt LM. Elementary principles of laboratory instruments. 5th ed. Toronto

: The C.v. Mosby Company, 1983. 6. Mokelke S. Measuring water quality: why a field fluorometer ? Water Engineering &

Mnagement 1996;143:27-9. 7. Peet KR, Gnther PA. Statistical accuracy in fluorescence fluctuation experiments.

European Biophysics Journal 1997;25:163-9. 8. Pinta M. Modern methods for trace element analysis. Michigan : Ann Arbor Science

Publishers Inc, 1988. 9. Skoog DA, West DM. Principle of instrumental analysis. 2nd ed. Tokyo : Holt-Saunders

International Editions, 1980. 10. Thomas HE. Handbook of automate electronic clinical analysis. Virginia : A Prentice-

Hall Company, 1979.

เครื่องมือวิทยาศาสตร

313