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CARMEN ANTONIA SANCHES ITO

ÁCIDO NALIDÍXICO COMO MARCADOR PREDITIVO DE SENSIBILIDADE ÀS

FLUORQUINOLONAS EM Escherichia coli ISOLADAS DE UROCULTURA

CURITIBA

2004

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CARMEN ANTONIA SANCHES ITO

ÁCIDO NALIDÍXICO COMO MARCADOR PREDITIVO DE SENSIBILIDADE ÀS

fLUORQUINOLONAS PARA Escherichia coli ISOLADAS DE UROCULTURA

Dissertação apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre, pelo Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Setor de Ciências da Saúde, da Universidade Federal do Paraná - UFPR. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Libera Maria Dalla Costa

CURITIBA

2004

ii

AGRADECIMENTOS

Um trabalho de pesquisa é sempre uma tarefa que conta com a contribuição de inúmeras pessoas e de várias instituições, cujos nomes quero deixar registrados aqui.

Prof.ª Dr.ª Libera Maria Dalla Costa, que aceitou orientar este trabalho e

que me deu muitas de suas horas de lazer. Hospital das Clínicas da Universidade Federal do Paraná – equipes de:

Bacteriologia: Adriane Ceschin Maestri, Aurora da C. F. da Silva Faria, Cecilia Kazuko Goya, Cesar Renato Zambao, Dilair Camargo de Souza, Eliane Meri B. Mendes, Gislene Maria D. Botão, Helena Aguilar P. H. M. de Souza, Irene de Morais, Izabel Joana de Lima, Jaqueline Sena Duraes, Jussara Kasuko Palmeiro, Keite da Silva Nogueira, Laura Lucia Cogo, Luciana Costa, Mara de Fatima C. Hack, Margareth Indiukov Neves, Maria Bernadete Mira, Maria Estela M. de Lima, Marisa Viante Rossi, Maristela de Paiva Lima, Marli Terezinha Karpstein, Marluza Apª Ramos Andrade, Roberto Ribeiro dos Santos, Rosalia Rubel, Rute Ricardo da Silva, Sugleri, Zozimo Oractz Neto. Central de Soluções: Acir de Miranda Saiz, Josiane Meyer, Maria Olívia Mendes de Camargo, Paulo de Tarso Túllio, Pedro Horlap. Virologia: Meri Bordignon Nogueira, Sonia Mara raboni, Clyete Santos da Silveira. Imunogenética: Noemi Farah Pereira, Ana Lucia Vieira Mion, Marcia Fabricio de Melo.

Escola Paulista de Medicina – Laboratório Especial de Microbiologia Clínica

e Laboratório de Retrovirologia, especialmente a Dr.ª Ana Cristina Gales, Patrícia Munerato, Maria Cristina Tognim, Liana Carballo Menezes e Andréa Pereira.

Os amigos Luine Rosele Renaud Vidal Tsuchiya e Waldemar de Paula

Junior. Altair Coelho, do Laboratório Alpha, e sua equipe, especialmente as amigas

Larissa Bail, Adriana Van Santen e Ana Cristina Defino. César Roberto Busato e Juarez Gabardo. As empresas Newprov, Bristol-Myers Squibb, Merck Sharp & Dohme e

Bayer, pelo fornecimento de parte do material. Miguel Sanches Neto. Marcos Ito e Julia Sanches Ito, por terem compreendido minhas longas

ausências da vida familiar.

iii

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS ..................................................................................................v

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. vii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................. viii

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................1

2 REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................................3

2.1 QUINOLONAS.......................................................................................................3

2.2 DESCOBERTA E EVOLUÇÃO..............................................................................3

2.3 RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE...................................................................8

2.4 CLASSIFICAÇÃO DAS PRINCIPAIS QUINOLONAS..........................................11

2.5 EFEITOS ADVERSOS ........................................................................................12

2.6 INTERAÇÃO MEDICAMENTOSA .......................................................................13

2.7 MECANISMO DE AÇÃO .....................................................................................13

2.8 MECANISMOS DE RESISTÊNCIA ÀS QUINOLONAS.......................................19

2.8.1 Mutações nos genes que codificam para DNA girase e Topoisomerase IV .....22

2.8.2 Bombas de efluxo .............................................................................................28

2.8.3 Resistência mediada por plasmídios ................................................................29

2.9 PREVENÇÃO DE SELEÇÃO DE MUTANTES....................................................30

3 OBJETIVOS ..........................................................................................................33

3.1 OBJETIVO GERAL.............................................................................................33

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..............................................................................33

4 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................34

4. 1 AMOSTRAS......................................................................................................34

4.1.1 Estocagem das amostras bacterianas.............................................................34

4.2 TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS POR DISCO-

DIFUSÃO EM ÁGAR .................................................................................................35

4.3. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) PELO

MÉTODO DE DILUIÇÃO EM ÁGAR..........................................................................36

4.3.1 Preparo das soluções de antibióticos ..............................................................37

4.3.2 Preparo das placas de Mueller-Hinton ágar com antimicrobiano ....................39

4.3.3 Procedimento técnico do teste de diluição em ágar ........................................41

iv

4.4 PESQUISA DE MUTAÇÕES NA REGIÃO DETERMINANTE DE

RESISTÊNCIA ÀS QUINOLONAS (QRDR) DOS GENES gyrA e parC....................44

4.4.1 Extração do DNA bacteriano ...........................................................................44

4.4.2 Amplificação da QRDR dos genes gyrA e parC por PCR................................45

4.5 SEQÜENCIAMENTO DO PRODUTO AMPLIFICADO .......................................46

4.5.1 Purificação do produto de PCR .......................................................................46

4.5.2 Seqüenciamento..............................................................................................46

4.5.3 Precipitação de DDNTPs não incorporados .....................................................47

4.5.4 Determinação da seqüência do DNA...............................................................47

4.6 SÍNTESE DOS PROCEDIMENTOS REALIZADOS NESTE TRABALHO ..........48

5 RESULTADOS ......................................................................................................50

5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA...................................................................50

5.2 TESTES DE SENSIBILIDADE ÀS QUINOLONAS POR DISCO-DIFUSÃO ........52

5.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA........................54

5.4 PESQUISA DE MUTAÇÕES NOS GENES gyrA e parC.....................................63

5.4.1 Amplificação das QRDRs dos genes gyrA e parC............................................63

5.4.2 Seqüenciamento das QRDRs dos genes gyrA e parC ....................................65

6. DISCUSSÃO .........................................................................................................67

7. CONCLUSÕES .....................................................................................................78

REFERÊNCIAS .........................................................................................................80

v

LISTA DE TABELAS TABELA 01 - DIVISÃO DAS PRINCIPAIS QUINOLONAS.............................................. 12

TABELA 02 - ATIVIDADE DA TROVAFLOXACINA EM COMPARAÇÃO COM A

CIPROFLOXACINA NOS DOIS PRINCIPAIS SÍTIOS DE AÇÃO DE

DIFERENTES ESPÉCIES BACTERIANAS...............................................

19

TABELA 03 - MUTAÇÕES NO SÍTIO DE AÇÃO EM Klebsiella pneumoniae................. 25

TABELA 04 - MUTAÇÕES NO SÍTIO DE AÇÃO EM Escherichia coli............................ 25

TABELA 05 - MUTAÇÕES NO SÍTIO DE AÇÃO EM Pseudomonas aeruginosa.......... 26

TABELA 06 - MUTAÇÕES NO SÍTIO DE AÇÃO EM Staphylococcus aureus................ 27

TABELA 07 - MUTAÇÕES NO SÍTIO DE AÇÃO EM Streptococcus pneumoniae......... 27

TABELA 08 - COMPONENTES DO SISTEMA DE EFLUXO DAS PRINCIPAIS

BACTÉRIAS...............................................................................................

29

TABELA 09 - CONCENTRAÇÕES DOS ANTIMICROBIANOS TESTADAS PARA

AMOSTRAS DE E. coli..............................................................................

38

TABELA 10 - INICIADORES UTILIZADOS NA AMPLIFICAÇÃO DA QRDR DOS

GENES gyrA e parC..................................................................................

45

TABELA 11 - PERCENTUAL DE RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS DETECTADO

PELO MÉTODO AUTOMATIZADO...........................................................

51

TABELA 12 - DISTRIBUIÇÃO DOS FENÓTIPOS DE RESISTÊNCIA ÀS

QUINOLONAS PELO MÉTODO DE DISCO-DIFUSÃO............................

52

TABELA 13 - DISTRIBUIÇÃO DOS ISOLADOS E PERCENTUAL CUMULATIVO

POR CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA PELO MÉTODO DE

DILUIÇÃO EM ÁGAR................................................................................

55

TABELA 14 - POTÊNCIA E ATIVIDADE DOS ANTIMICROBIANOS TESTADOS

PELO MÉTODO DE DILUIÇÃO EM ÁGAR EM 385 AMOSTRAS E.

coli..............................................................................................................

56

TABELA 15 - PERCENTUAL DE SENSIBILIDADE À NITROFURANTOÍNA E AO

SULFAMETOXAZOL/TRIMETOPRIM EM AMOSTRAS SENSÍVEIS E

RESISTENTES ÀS QUINOLONAS...........................................................

57

TABELA 16 - RESULTADO DO TESTE DE ACURÁCIA DOS MÉTODOS DE

DIFUSÃO E DILUIÇÃO EM ÁGAR PARA OS 385 ISOLADOS DE E.

coli.............................................................................................................

58

TABELA 17 - DISTRIBUIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (AD) DA

CIPROFOXACINA DOS 385 ISOLADOS DE E. coli.................................

vi

CIPROFOXACINA DOS 385 ISOLADOS DE E. coli................................. 63

TABELA 18 - LOCALIZAÇÃO E TIPO DE MUTAÇÕES NOS GENES gyrA E parC

POR GRUPO DE AMOSTRAS..................................................................

66

vii

LISTA DE FIGURAS FIGURA 01 - ESTRUTURA BÁSICA DAS QUINOLONAS................................................... 08

FIGURA 02 - PRINCIPAIS SUBSTITUINTES NA MOLÉCULA DAS QUINOLONAS......... 10

FIGURA 03 - NUCLEÓIDE E FORMAÇÃO EM ALÇA DO DNA BACTERIANO.................. 16

FIGURA 04 - REGIÃO 4 α-HÉLICE DA DNA GIRASE......................................................... 16

17 FIGURA 05 -

FIGURA 06 -

COMPLEXO TERNÁRIO: DNA GIRASE-DNA-QUINOLONAS............

PRINCIPAIS MECANISMOS DE RESITÊNCIA ÀS QUINOLONAS.... 21

FIGURA 07 - JANELA DE SELEÇÃO DE MUTANTES........................................................ 32

FIGURA 08 - ESTRUTURA QUÍMICA DA QUINOLONAS UTILIZADAS................... 36

FIGURA 09 - EXEMPLO DE DILUIÇÃO SERIADA DA SOLUÇÃO ESTOQUE DO ÁCIDO

NALIDÍXICO....................................................................................................

40

FIGURA 10 - ESQUEMA SIMPLIFICADO DO MÉTODO DE ÁGAR DILUIÇÃO

UTILIZADO.....................................................................................................

42

FIGURA 11 - EXEMPLO DA DETERMINAÇÃO DA CIM DO ÁCIDO NALIDÍXICO PELO

MÉTODO DE DILUIÇÃO EM ÁGAR.............................................................

43

FIGURA 12 - DIAGRAMA SIMPLIFICADO DOS PROCEDIMETOS TÉCNICOS

REALIZADOS.................................................................................................

49

FIGURA 13 - DISTRIBUIÇÃO DO NÚMERO DE AMOSTRAS FEMININAS E

MASCULINAS POR FAIXA ETÁRIA..............................................................

51

FIGURA 14 - DISTRIBUIÇÃO DO NÚMERO TOTAL DE AMOSTRA E NÚMERO DE

AMOSTRAS RESISTENTES PELO MÉTODO DE DISCO-DIFUSÃO POR

FAIXA ETÁRIA EM AMOSTRAS FEMININAS................................................

53

FIGURA 15 - DISTRIBUIÇÃO DO NÚMERO TOTAL DE AMOSTRA E NÚMERO DE

AMOSTRAS RESISTENTES PELO MÉTODO DE DISCO-DIFUSÃO POR

FAIXA ETÁRIA EM AMOSTRAS MASCULINAS............................................

53

FIGURA 16 - COMPARAÇÃO DO HALO DE INIBIÇÃO EM mm (DD) COM A CIM EM

µg/mL (AD) DAS QUINOLONAS TESTADAS...............................................

60

FIGURA 17 - COMPARAÇÃO DO HALO DE INIBIÇÃO EM mm (DD) DO ÁCIDO

NALIDÍXICO COM A CIM EM µg/mL (AD) DA NORFLOXACINA,

CIPROFLOXACINA E GATIFLOXACINA NAS 385 AMOSTRAS

ESTUDADAS..................................................................................................

61

FIGURA 18 - PRODUTO DE AMPLIFICAÇÃO DO GENE gyrA e parC OBTIDOS DA

AMOSTRA......................................................................................................

64

viii

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

Ala - alanina

Arg - arginina

Asn - asparagina

Asp - ácido aspártico

AUC - área sob a curva

AUIC - área sob a curva inibitória

CIM - concentração inibitória mínima

CIP - ciprofloxacina

dATP - dinucleotídeo adenosina trifosfato

dCTP - dinucleotídeo citosina trifosfato

DDNTP -- dideoxidinucleotídeo trifosfato

dGTP - dinucleotídeo guanosina trifosfato

DMSO - dimetilsulfóxido de sódio

DNTP - dinucleotídeo trifosfato

dTTP - dinucleotídeo timina trifosfato

Gln - glicina

GTF - gatifloxacina

gyrA - gene que codifica para GyrA

GyrA - subunidade A da DNA girase

gyrB - gene que codifica para GyrB

GyrB - subunidade B da DNA girase

His - histidina

Ile - isoleucina

Leu - leucina

Lis - lisina

mL - mililitro

mm - milímetro

n - número de amostra

NAL - ácido nalidíxico

ix

NOR - norfloxacina

NCCLS - comitê nacional para padronização de laboratórios

parC - gene que codifica para ParC

ParC - subunidade C da Topoisomerase IV

parE - gene que codifica para ParE

ParE - subunidade E da Topoisomerase IV

Phe - fenilalanina

Pro - prolina

QRDR - região determinante de resistência às quinolonas

Ser - serina

SUT - sulfametoxazol/trimetoprim

Thr - triptofano

TSA - teste de susceptibilidade aos antimicrobianos

Tyr - tirosina

UFC - unidades formadoras de colônias

Val - valina

v/v - volume a volume

µg - micrograma

µL - microlitro

x

RESUMO

A infecção do trato urinário é uma das patologias mais comuns na prática clínica. O principal agente etiológico é Escherichia coli. As quinolonas são amplamente utilizadas na terapêutica dessas infecções e o aumento da resistência a esses fármacos é preocupante. Neste estudo, avaliou-se o padrão de susceptibilidade de 385 amostras de E. coli isoladas de urocultura. Os métodos utilizados foram disco-difusão e diluição em ágar. Testaram-se as seguintes quinolonas: ácido nalidíxico, norfloxacina, ciprofloxacina e gatifloxacina. Foram pesquisadas mutações nos genes gyrA e parC em doze amostras, das quais duas eram sensíveis às quinolonas, cinco resistentes somente ao ácido nalidíxico e cinco resistentes a todas as quinolonas. Das 385 amostras de E. coli, 53 foram classificadas como resistentes a pelo menos uma quinolona testada. Ciprofloxacina apresentou maior potência (CIM50 ≤ 0,015 µg/mL), entretanto, o percentual de sensibilidade foi igual ao da norfloxacina (91,4%) e ligeiramente menor do que o da gatifloxacina (92,7%). O ácido nalidíxico apresentou potência (CIM50 = 2 µg/mL) e sensibilidade (86,2%) menores do que as apresentadas pelas fluorquinolonas. A comparação entre os métodos de difusão e diluição em ágar mostrou uma boa relação para as quinolonas testadas, sensibilidade entre 97%-98% e especificidade de 100% . O ácido nalidíxico revelou-se um bom marcador preditivo da sensibilidade às fluorquinolonas em E. coli no teste de difusão em ágar, a sensibilidade desse método de triagem foi de 100% e especificidade de 95%. No sequenciamento, as amostras sensíveis às quinolonas não apresentaram mutações; naquelas resistentes apenas ao ácido nalidíxico foi encontrada uma única mutação em gyrA, com elevação da CIM para as demais quinolonas testadas. Nas amostras resistentes, foram observadas três mutações, duas em gyrA e uma em parC. Com base nos resultados encontrados neste estudo, sugerimos o uso do ácido nalidíxico como marcador preditivo de sensibilidade de E. coli às fluorquinolonas.

Palavras-chave: infecção urinária, resistência às quinolonas, Escherichia coli.

xi

ABSTRACT

Urinary tract infection is one of the most usual pathologies in clinical practice. Escherichia coli is the main ethiologic agent. Quinolones are widely used as a therapeutic agent in these infections. In this study 385, it has been evaluated 385 E. coli isolates from urine culture by using disk-diffusion and agar-dilution tests. The following quinolones were tested: nalidixic acid, norfloxacin, ciprofloxacin and gatifloxacin. Twelve strains were tested for presence of mutation in gene gyrA and parC, two strains were susceptible, five were only resistant to nalidixic acid and five were resistant to all quinolones tested. From 385 strains E. coli tested, 53 were classified as resistant to at lest one quinolone tested. Ciprofloxacin has shown the highest potency (MIC50 ≤ 0.015 µg/mL), however, the percentage of sensibility was similar to norfloxacin (91,4%), but less than gatifloxacin (92,7%). Nalidixic acid has shown potency (MIC50 = 2 µg/mL) and susceptibility (86,2%) lower than for fluoroquinolones. Comparison between the disk-diffusion and agar-dilution showed a good relation for quinolones tried, sensibility of 97%-98% and specificity of 100%. The nalidixic acid it shown a good marker predictive of the sensibility to fluoroquinoles in E. coli in the disk-diffusion test, this screening method provided a sensibility of 100% and specificity of 95%. From sequenced strains, the susceptible to quinolones has not presented mutations, in those resistant strains to nalidixic acid, only one mutation in gyrA, with increasing MIC for the other quinolones tested were found and in resistant strains to all quinolones only three mutations, two in gyrA gene and one in parC gene were found. On the base of results found in this study we sugest to use nalidixic acid as a predictive marker of sensibility to fluoroquinolones in E. coli.

Key-words: urinary infection, quinolones resistance, Escherichia coli.

1

1 INTRODUÇÃO

As quinolonas representam um importante avanço na terapêutica

antimicrobiana das infecções, comunitárias e hospitalares, do trato urinário, onde

Escherichia coli, continua sendo o principal agente etiológico nas infecções agudas.

O ácido nalidíxico foi o primeiro antimicrobiano desse grupo utilizado

clinicamente. Na década de 80, as fluorquinolonas foram introduzidas na terapêutica

antiinfecciosa. Esta classe possui compostos administráveis, por via oral e

parenteral, amplo espectro de atividade para vários tipos de infecção, incluindo

infecção complicada do trato urinário (ITU), infecções gastrointestinais, doenças

sexualmente transmissíveis, infecções do trato respiratório e osteomielite crônica. A

emergência de bactérias resistentes foi observada logo após o uso terapêutico das

fluorquinolonas, especialmente em isolados nosocomiais. Mas a preocupação se

intensificou com o aumento do relato de resistência em infecções adquiridas na

comunidade por E. coli, Neisseria gonorrhoeae e espécies de Salmonella e

Campylobacter (ACAR & GOLDSTEIN, 1997).

Algumas classes de antimicrobianos podem ser avaliadas quanto à

resistência por meio de um marcador, que tem a função de triagem. No caso das

quinolonas, há indícios de que o ácido nalidíxico possa exercer este papel. Apenas

uma mutação no gene responsável pela codificação do sítio alvo confere resistência

a este fármaco, enquanto as fluorquinolonas podem apresentar diminuição na

potência, detectada somente pela elevação da concentração inibitória mínima (CIM).

O objetivo deste trabalho foi determinar a potência e atividade das quinolonas

em E. coli isoladas de infecção do trato urinário, bem como pesquisar o principal

mecanismo genético envolvido na resistência. Objetivou-se ainda, correlacionar a

SENSIBILIDADE do ácido nalidíxico com as fluorquinolonas. As quinolonas testadas

foram o ácido nalidíxico (NAL), norfloxacina (NOR), ciprofloxacina (CIP) e

gatifloxacina (GTF). A suscepitibilidade às quinolonas foi determinada por dois

testes, difusão em ágar e diluição em ágar como método de referência.

Nitrofurantoína (NIT) e sulfametoxazol/trimetoprim (SUT) foram testados como

opções terapêuticas.

2

Foi realizada ainda amplificação e sequenciamento da região que determina

resistência às quinolonas (QRDR) dos genes gyrA e parC, para relacionar o nível de

resistência com a presença de possíveis mutações.

3

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 QUINOLONAS As quinolonas representam uma classe de antimicrobianos composta por

drogas estruturalmente semelhantes, totalmente sintéticas. Agentes bactericidas,

dependentes da concentração, que podem ser administrados por via oral ou

endovenosa. A manipulação do núcleo quinolônico levou ao desenvolvimento de

várias quinolonas que são agrupadas em diferentes gerações (ANDRIOLE, 1998).

A introdução do flúor na posição seis do anel quinolônico melhorou a

atividade antimicrobiana, recebendo a denominação de fluorquinolonas. As

fluorquinolonas são indicadas na terapêutica da infecção do trato urinário (ITU),

doenças sexualmente transmissíveis, infecções gastrintestinais e abdominais,

infecções do trato respiratório, infecções ósseas e articulares, da pele e suas

estruturas, infecções sistêmicas e na prevenção ou erradicação da colonização

(HOOPER, 2000).

Essa classe de agentes terapêuticos, em contínua expansão, tem sido usada

clinicamente em grande escala, tanto em pacientes hospitalares quanto em

ambulatoriais (HOOPER, 2000).

ENA et al. (1998) advogam que as taxas de resistência às fluorquinolonas

são mais elevadas em países em desenvolvimento. Isso dar-se-ia em função da

utilização de quinolonas menos potentes, como o ácido nalidíxico, ou ainda pelo uso

de regimes incompletos de compostos mais potentes, como a ciprofloxacina. Já em

países desenvolvidos, o aumento de resistência estaria ainda associado ao

crescimento no consumo geral de quinolonas, infecções urinárias complicadas e ao

amplo uso de catéter vesical.

2.2 DESCOBERTA E EVOLUÇÃO

Primeira quinolona de uso clínico, o ácido nalidíxico foi descoberto

acidentalmente por Lesher em 1962, durante a síntese de um composto

antimalárico, a cloroquina. Naquela época, constituía uma boa opção terapêutica

4

para o tratamento de infecções urinárias, pois apresentava atividade satisfatória

contra bactérias Gram negativas aeróbias (BARLOW, 1963). Porém, a atividade

limitada às enterobactérias e o fato de não alcançar concentração sérica adequada

restringiram a indicação do ácido nalidíxico para o tratamento de infecções urinárias

não complicadas (ANDRIOLE, 1996).

Nos anos 70, outras quinolonas, como o ácido oxonílico e a cinoxacina, foram

sintetizadas. Apesar de possuírem atividade antimicrobiana discretamente superior

à do ácido nalidíxido, tais compostos não constituíram descoberta significativa.

Quase que paralelamente, foi desenvolvido, no Japão, o ácido pipemídico, que já

apresentava alguma atividade, ainda que limitada, contra Pseudomonas aeruginosa.

Com características farmacocinéticas semelhantes ao NAL, ele também é indicado

para infecções urinárias não complicadas (ANDRIOLE, 1996).

A identificação da enzima DNA girase em 1976, levou a uma melhor

compreensão do mecanismo de ação, possibilitando o desenvolvimento das

quinolonas. Outro fator significativo foi a capacidade de manipular o núcleo

quinolônico, levando à obtenção de inúmeras substâncias substituídas em várias

posições no anel central, com melhora nas propriedades farmacocinéticas, aumento

na meia-vida e ampliação da atividade antibacteriana (ANDRIOLE, 1996).

Com a incorporação da molécula de flúor na posição 6 do anel quinolônico

houve um aumento importante na potência em relação às bactérias Gram negativas

e a ampliação do espectro de ação para as bactérias Gram positivas. Essas

quinolonas passaram a ser chamadas de fluorquinolonas (DOMAGALA, 1986).

Lançada em 1986, a primeira quinolona desse grupo foi a norfloxacina, que

apresenta excelente atividade em bactérias Gram negativas aeróbias, incluindo

Pseudomonas aeruginosa, e boa atividade também contra bactérias Gram positivas.

Indicada para infecções urinárias, infecções gonocócicas uretrais e cervicais não

complicadas e prostatite e infecções gastrointestinais, embora com limitações em

termos de farmacocinética e farmacodinâmica (TAVARES, 1996).

Logo após, outras fluorquinolonas, como ciprofloxacina (1987) e a ofloxacina

(1991), foram lançadas, apresentando alta absorção intestinal e ótima penetração

na maioria dos órgãos e tecidos, com excelente potência e espectro de ação contra

bactérias Gram negativas e Gram positivas (ANDRIOLE, 1998).

5

O uso hospitalar desses fármacos iniciou com as quinolonas de “segunda

geração” em função da melhoria nos parâmetros farmacocinéticos e

farmacodinâmicos, que permitiu a administração por via oral e endovenosa, a

redução das doses diárias, a ampliação do espectro de ação antimicrobiano e a

elevação da potência bactericida (TAVARES, 1996).

Até então, estas quinolonas apresentavam atividade relativamente baixa

contra algumas bactérias Gram positivas, especialmente Streptococcus

pneumoniae. A atividade delas também era restrita contra bactérias anaeróbicas e

contra os agentes etiológicos responsáveis pelas “pneumonias atípicas”, tais como

Legionella pneumophila, Micoplasma pneumoniae e Chlamydia pneumoniae

(ANDRIOLE, 1998).

Novas modificações deram origem aos análogos di e tri-fluorados do ácido

nalidíxico, criando a terceira geração das quinolonas, representadas pela

esparfloxacina (1997), temafloxacina (1992), grepafloxacina (1998), levofloxacina

(1997) e lomefloxacina (1992). Destas, somente a levofloxacina se encontra

disponível comercialmente no Brasil (MENDES, 1998).

Esta geração possui maior potência contra Gram positivos, especialmente

Streptococcus pneumoniae. São usadas com segurança no tratamento de infecções

de vias aéreas, atingindo ótimas concentrações no sangue e tecidos, embora ainda

possuam atividade limitada contra anaeróbios Gram negativos e os agentes das

pneumonias atípicas. Alguns destes compostos também apresentam meia-vida

longa, o suficiente para permitir administração uma vez ao dia (ANDRIOLE, 1998).

Apesar das melhoras efetuadas nesse grupo, a toxicidade também foi

ampliada, limitando o uso de alguns representantes. O primeiro composto desta

geração, a temafloxacina, foi lançada no início da década de 90. Foi retirada

rapidamente do mercado por apresentar efeitos tóxicos, que incluem principalmente

vasculites, alterações de coagulação e hepatotoxicidade (BLUM, 1994).

Outros representantes desse grupo também demonstraram problemas de

toxicidade, como a esparfloxacina que, embora cause fototoxicidade, foi liberada

para o uso intra-hospitalar nos Estados Unidos. Já a grepafloxacina foi associada a

relatos de casos graves de toxicidade (FINCH, 1996).

Mais recentemente surgiu um novo grupo de quinolonas, também

denominado por alguns pesquisadores como “quinolonas respiratórias” (BLONEAU,

6

1999; LOBER, 1999). Ainda não há consenso quanto ao agrupamento das novas

quinolonas em gerações. Entretanto alguns pesquisadores colocam essas novas

substâncias numa quarta geração de quinolonas, pelo fato de apresentarem

atividade contra bactérias anaeróbias e potência ainda superior contra Gram

positivos (AMYES, 1997).

Esses compostos possuem meia-vida prolongada e melhor desempenho em

termos de farmacocinética, farmacodinâmica, e potência antimicrobiana, podendo

ser utilizados em dose única diária (BERGAN, 1998).

Com o avanço da atividade sobre bactérias Gram positivas, atípicas e

anaeróbicas, estas novas quinolonas são usadas com segurança para o tratamento

de infecções de vias aéreas. As principais quinolonas incluídas nesta quarta

geração são a trovafloxacina (1997), gatifloxacina (1999), moxifloxacina (1999) e

clinafloxacina (1999) (KING, 2000).

A trovafloxacina foi restrita ao uso hospitalar nos Estados Unidos e foi

retirada do mercado europeu por problemas relacionados à toxicidade hepática.

Esses problemas parecem estar associados à sua estrutura química e ao fato de

apresentar eliminação predominantemente gastrointestinal (SMITH, 1997).

Em estudos in vitro, clinafloxacina mostrou ser um potente composto desta

geração contra bactérias Gram negativas e Gram positivas (EDNIE,1998;

CLARK,1999) e contra bactérias anaeróbias (SNYDMAN, 2000). O uso desta

fluorquinolona é, entretanto, restrito por causa de efeitos adversos, como

fototoxidade e hipoglicemia (ZHANEL et al, 2002).

Gatifloxacina e moxifloxacina, disponíveis no Brasil, representam um

importante avanço na evolução das quinolonas. Possuem maior potência e maior

espectro de ação contra os principais patógenos responsáveis por infecções do trato

respiratório, contra enterobactérias e outras bactérias Gram negativas. Maior

potência, associada à posologia de uma vez ao dia e à baixa toxicidade, propicia

uma contribuição significativa para o tratamento de vários tipos de infecções

comunitárias e hospitalares. No entanto, como para qualquer outro novo

antimicrobiano de amplo espectro, sua utilização deve ser bastante criteriosa para

evitar o rápido desenvolvimento de resistência (GALES, 2001).

8

2.3 RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE

A estrutura básica das quinolonas compreende um ciclo comum (Figura 1), o

ácido 4-oxo-1,4-diidropiridino-3-carboxílico condensado na posição orto com outro

ciclo de natureza aromática, sendo que este núcleo é denominado 4-oxo-1,4-

quinolona ou simplesmente 4-quinolona (CARVALHO, 1998).

Nem todas as quinolonas desenvolvidas apresentam este núcleo principal,

algumas possuem estrutura química, características farmacológicas e

antimicrobianas semelhantes. Esses análogos podem pertencer ao grupo das

naftiridinas, cinolinas, piridopirimidinas e 2-piridonas. Contudo, todos os compostos

disponíveis atualmente são quinolinas ou naftiridinas (SUH, 1995; HOOPER, 2000).

FIGURA 1 - ESTRUTURA BÁSICA DAS QUINOLONAS

FONTE: HOOPER, 2000

As modificações estruturais produziram importantes alterações, exercendo

influência na atividade antimicrobiana, aumentando a afinidade com o sítio alvo,

melhorando a penetração nas células e alterando a farmacocinética ou a toxicidade

das quinolonas. Os principais radicais substituintes e a posição no anel quinolônico

podem ser observados na Figura 2.

As pesquisas demonstram que modificações estruturais em todas as

posições (Figura 1) no núcleo quinolônico, exceto no grupo 4-oxo, produzem

potentes agentes antimicrobianos (ZHANG, 1991).

9

A posição 1 do anel quinolônico está relacionada à ligação com o sítio alvo,

requer a presença de substituintes, já que aquelas que não o possuem são inativas.

A atividade é aumentada com grupos como etila, ciclopropila, terc-butila e derivados

fenílicos. Os radicais que proporcionam maior potência são ciclopropila e 2,4-

difluorfenila.

A presença de substituintes na posição 2 leva à inatividade (ZHANG, 1991).

As posições 3 e 4 são consideradas críticas para a atividade das quinolonas

e nenhuma substituição útil tem sido relatada. Logo, a 3-carboxila e a 4-carbonila

devem ser mantidas (ZHANG, 1991; BRYSKIER, 1995).

Fatores estéricos devem ser levados em consideração para substituições na

posição 5, pois pode ocorrer alteração da estrutura planar da molécula,

Normalmente, esta posição não contém substituinte, no entanto, a introdução de um

grupo metila, hidroxila ou amina melhora a atividade biológica contra Gram positivas.

Esta posição depende também da variação do substituinte no carbono 7.

(BRYSKIER, 1995; WAGSTAFF, 1997).

A adição de um átomo de flúor na posição 6 eleva consideravelmente a

atividade antibacteriana, aumentando a afinidade pela enzima e a penetração nas

células. Essa modificação é encontrada com freqüência entre os compostos

quinolônicos com sucesso clínico (CARVALHO, 1998).

Os substituintes em carbono 7 determinam o espectro antimicrobiano e

desempenham, ainda, maior papel no controle da permeabilidade da célula

bacteriana. Grupos como hidroxipurolinil, aminopirrolidinil, metilpiperazinil e

piperazinil conferem alta afinidade do composto ao sítio alvo, aumentando sua

atividade contra Pseudomonas aeruginosa (SUH, 1995; BRYSKIER, 1995).

Substituindo-se o carbono 8 por um átomo de nitrogênio, produzem-se as

1,8-naftiridinas, que possuem excelente atividade. A adição de flúor, assim como a

presença de anel oxazilínico entre esta posição e o N-1, confere potente atividade

aos compostos (CARVALHO, 1998). No entanto, a adição de grupos nitro ou amino

diminui a atividade, sendo menor que a dos não substituídos (ZHANG, 1991).

10

FIGURA 2 - PRINCIPAIS SUBSTITUINTES NA MOLÉCULA DAS QUINOLONAS

FONTE: PETERSON, L.R, 2001 NOTA: R1: Ciclopropila

R5: Amino ou Metila

R7: Aminopirrolidina ou piperazina

R8: Metoxila

ou

ou

ou

ou

11

2.4 CLASSIFICAÇÃO DAS PRINCIPAIS QUINOLONAS

Algumas classes de antibióticos como as cefalosporinas e quinolonas

apresentam vários representantes e são normalmente agrupadas em gerações.

Em relação às quinolonas, há divergências entre os autores e classificações

baseadas nas estruturas químicas ou atividades biológicas têm sido propostas.

Entretanto, o número de novos compostos sintetizados, com diversas estruturas

químicas e atividades antimicrobianas, dificulta a elaboração de uma classificação

prática e completa (BRYSKIER & CHANTOT, 1995).

Alguns autores fazem a divisão levando em consideração espectro de ação;

outros, o período de lançamento (KING et al.,2000). A divisão didática das principais

quinolonas, a seguir, sumarizada na Tabela 1, foi baseada nestes aspectos.

A primeira geração tem uso restrito às infecções urinárias não complicadas,

pois alcançam baixos níveis séricos e têm ação predominantemente sobre bacilos

Gram negativos. O ácido nalidíxico e o ácido pipemídico são os representantes do

grupo.

Na segunda geração encontram-se a norfloxacina, ciprofloxacina, ofloxacina

e perfloxacina. A norfloxacina tem baixo tempo de meia-vida e espectro estreito de

ação, além de não alcançar bons níveis séricos, ficando restrito às infecções

urinárias baixas. As demais fluorquinolonas deste grupo alcançam bons níveis

séricos e são usadas em todas as infecções urinárias, infecções do trato respiratório

por bacilos Gram negativos e infecções de pele. A ciprofloxacina é a quinolona com

maior atividade contra Pseudomonas aeruginosa e ainda apresenta a vantagem de

ter boa penetração óssea.

A terceira geração é representada pela esparfloxacina, grepafloxacina,

levofloxacina e lomefloxacina. Administradas uma vez ao dia, possuem espectro

ampliado para Gram positivos e bactérias atípicas. Indicadas em pneumonia

adquirida na comunidade, exacerbação aguda da bronquite crônica, infecções

urinárias e de pele.

Na quarta geração encontram-se os mais novos representantes das

quinolonas, como a clinafloxacina, gatifloxacina, moxifloxacina e trovafloxacina.

Possuem espectro ampliado incluindo Gram positivos, anaeróbios e atípicos. São

usadas em infecções intra-abdominais, urinárias, pneumonia nosocomial e adquirida

12

na comunidade, com a vantagem de agir contra Streptococcus pneumoniae

resistente às penicilinas e cefalosporinas.

TABELA 1 - DIVISÃO DAS PRINCIPAIS QUINOLONAS

GERAÇÃO REPRESENTANTES

Primeira geração Ácido nalidíxico, ácido pipemídico

Segunda geração Norfloxacina, ciprofloxacina, perfloxacina, ofloxacina

Terceira geração Esparfloxacina, grepafloxacina, levofloxacina, lomefloxacina

Quarta geração Gatifloxacina, moxifloxacina

2.5 EFEITOS ADVERSOS

As quinolonas são medicamentos de boa tolerância, sendo referidos efeitos

adversos em 5 a 10% dos pacientes que as utilizam. Na maioria dos casos as

queixas relacionam-se à esfera digestiva, com náuseas, vômitos, diarréias e dor

abdominal. Manifestações de hipersensibilidade não são comuns, mas podem surgir

sob a forma de urticária, eosinofilia, erupções maculopapulares e febre (TAVARES,

1999).

Esses quimioterápicos podem causar efeitos tóxicos sobre o sistema nervoso

central, em freqüência variável e dependendo da dose. Manifesta-se por sonolência,

cefaléia, insônia, tonteiras, fadiga, depressão e até convulsão. Fotossensibilidade,

manifestada pelo escurecimento da pele em exposição à luz solar, é ocorrência

freqüente com o uso prolongado das fluorquinolonas, em especial a perfloxacina

(ANDRIOLLE, 1998).

O uso em crianças, adolescentes, mulheres grávidas ou nutrizes não é

recomendado pelo fato de haver riscos destes medicamentos causarem lesões

articulares e interferirem no crescimento ósseo (TAVARES, 1999).

13

2.6 INTERAÇÃO MEDICAMENTOSA

A principal interação medicamentosa das quinolonas é com antiácidos

contendo alumínio e magnésio. A administração concomitante de antiácidos

contendo hidróxido de alumínio reduz a absorção das quinolonas. Portanto, a

administração deve ser 1 a 2 horas antes da ingestão de antiácidos ou pelo menos

4 horas depois. Esta restrição não se aplica aos bloqueadores dos receptores H2.

Quinolona administrada simultaneamente com teofilina pode resultar em aumento

da concentração plasmática da teofilina, eventualmente desencadeando efeitos

colaterais induzidos pela mesma. Nos casos em que a administração simultânea é

indispensável, são necessários a monitorização das concentrações séricas de

teofilina e o reajuste conveniente da dose. Estudos experimentais revelam que a

associação de doses elevadas de quinolonas com alguns antiinflamatórios não

esteróides, mas não com o ácido acetilsalicílico, pode causar convulsões. Em casos

isolados, após a administração concomitante de ciprofloxacina e ciclosporina, foram

observados aumentos transitórios da concentração de creatinina sérica, tornando

necessário o controle rigoroso destes níveis (LOBER, 1999).

2.7 MECANISMO DE AÇÃO

As quinolonas inibem a síntese de DNA bacteriano e, em concentrações

elevadas, inibem também a síntese de RNA. Esses efeitos são mediados pela

habilidade desses compostos em estabilizar em inibir as topoisomerases

bacterianas do tipo II – DNA girase e Topoisomerase IV, complexo enzimático

importante para a replicação do DNA (HOOPER, 2001).

O cromossoma bacteriano é formado por uma molécula de DNA circular,

única e longa. Trabalhos com E. coli demonstram que o DNA apresenta uma

estrutra compactada, dividida em domínios que formam alças (loop domain

estruture) para poder situar-se no interior da célula, ocupando um espaço mínimo,

chamado de nucleóide (Figura 3), já que em extensão ele é 1500 vezes maior que a

bactéria. Os domínios são intervalos de 50 kb do cromossomo, formando alças, que

variam de 30 a 200 em número e estão fixadas por âncoras, produzindo uma

14

estrutura com aspecto de flor. A estrutura da âncora não é conhecida, mas

elementos de seqüências repetidas (REP), além de proteínas, podem estar

envolvidos (TRUN & MARKO, 1998).

O tamanho do DNA é extremante reduzido pelas dobras na formação dos

domínios em alça que ainda sofre um processo de superespiralização negativa, que

recebe essa denominação porque o sentido é contrário ao sentido da hélice do DNA

na sua forma linear. O processo de superespiralização reduz um pouco o tamanho

do DNA, mas principalmente favorece as ligações entre as fitas de DNA intra-alça e

evita o emaranhado de alças vizinhas (TRUN & MARKO, 1998).

Devido à característica compactada do DNA, a duplicação do cromossoma

bacteriano passa por problemas topológicos durante a divisão celular. Para iniciar a

replicação do DNA, a enzima DNA helicase desenrola a fita dupla de DNA antes que

a DNA polimerase exerça sua ação. A abertura da fita junto com a ação da

polimerase gera tensão na forquilha de replicação. Além disso, a transcrição de

determinados genes resulta em superespirilização positiva, comprometendo a

progressão da DNA polimerase. Outra questão relacionada à topologia do DNA

ocorre ao final da duplicação cromossômica, onde as fitas filhas ficam entrelaçadas.

Esses e outros problemas topológicos da duplicação do DNA são resolvidos

por um conjunto de enzimas denominadas topoisomerases que são capazes de

romper a fita de DNA, passar a outra fita pelo local e reparar o local da ruptura. As

enzimas que rompem e restauram fita simples são classificadas como

topoisomerases do tipo I e são representadas pelas topoisomerases I e III. Aquelas

que rompem e restauram fita dupla pertencem ao tipo II, como a DNA girase ou

topoisomerase II e a topoisomerase IV.

A DNA girase é a única enzima bacteriana que introduz superespirais

negativos e retira superespirais positivos da molécula de DNA. A topoisomerase IV é

responsável pela separação das fitas filhas de DNA após a divisão cromossômica

(decatenação). DNA girase e topoisomerase IV (topoisomerases do tipo II) são os

sítios alvos das quinolonas.

DNA girase é um tetrâmero que consiste em duas subunidades A e duas

subunidades B, codificadas pelos genes gyrA e gyrB, respectivamente. Ambas as

subunidades contêm uma região 4-hélice que liga a enzima ao DNA (Figura 4). A

15

topoisomerase IV também possui duas subunidades, codificadas pelos genes parC

e parE, que são homólogos aos genes gyrA e gyrB (HOOPER, 2000).

As quinolonas ligam-se à DNA girase ou topoisomerase IV na presença de

DNA, alterando a conformação das enzimas. Atuam inibindo a função dessas

enzimas e ainda promovem um efeito tóxico para a célula por capturar uma ou

ambas as enzimas do cromossomo bacteriano criando um complexo ternário,

medicamento-enzima-DNA (Figura 5), no qual as fitas duplas rompidas do DNA são

mantidas juntas pelas enzimas. As quinolonas se fixam através de pontes de

hidrogênio, entre os grupos carbonila e carboxila dos anéis quinolônicos e as bases

do DNA, sendo que os grupamentos adjacentes são unidos à mesma fita,

orientados em sentidos opostos para evitar repulsão de cargas (DRLICA, 1999).

O bloqueio da replicação do DNA pode ocorrer por duas vias, a principal

envolve a remoção do complexo quinolona-DNA Girase, liberando a dupla fita

rompida de DNA. O DNA tem relaxadas suas espirais e passa a ocupar maior

espaço que o contido nos limites do corpo bacteriano. Além disso, as extremidades

livres do DNA induzem a síntese descontrolada de RNA mensageiro e de proteínas,

a produção de exonucleases e degradação cromossomal (TAVARES, 1996;

HOOPER, 1998).

A segunda via consiste na dissociação da enzima complexada ao DNA.

Ocorre liberação das pontas de DNA ligadas às subunidades da enzima levando à

morte celular. Esta via ocorrre quando as células são tratadas com altas

concentrações de quinolonas (HOOPER, 1998).

16

FIGURA 3 - NUCLEÓIDE E FORMAÇÃO EM ALÇA DO DNA BACTERIANO

FONTE: Adaptado de ASM microbellibrary.org©Graham

FIGURA 4 - REGIÃO 4 α-HÉLICE DA DNA GIRASE

FONTE: SINDELAR et all, 2000

Nucleóide: a) os nucleóides(n) brilhantes aparecem contra o citoplasma escuro, células com aproximadamente 1 µm de comprimento; b) visão ampliada do nucleóide, formação em alça do DNA.Nucleóide: a) os nucleóides(n) brilhantes aparecem contra o citoplasma escuro, células com aproximadamente 1 µm de comprimento; b) visão ampliada do nucleóide, formação em alça do DNA.Nucleóide: a) os nucleóides(n) brilhantes aparecem contra o citoplasma escuro, células com aproximadamente 1 µm de comprimento; b) visão ampliada do nucleóide, formação em alça do DNA.Nucleóide: a) os nucleóides(n) brilhantes aparecem contra o citoplasma escuro, células com aproximadamente 1 µm de comprimento; b) visão ampliada do nucleóide, formação em alça do DNA.

17

FIGURA 5 – COMPLEXO TERNÁRIO: DNA GIRASE-DNA-QUINOLONAS

FONTE: HOOPER, 2000.

DNA girase

ATP-B

DNA girase-A

Quinolonas

DNA circular

DNA girase

ATP-B

DNA girase-A

Quinolonas

DNA circular

18

A afinidade pelo sítio de ação depende do gênero da bactéria e da quinolona.

Em bactérias Gram negativas como Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa e

Neisseria gonorrhoeae, o principal sítio de ação das quinolonas é a DNA girase,

sendo a topoisomerase IV o sítio secundário. Em Gram positivas, como

Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae os sítios são contrários (PAN,

1998).

Como essas enzimas apresentam diferentes funções, a resposta às

quinolonas irá diferir de acordo com o principal alvo de ação de cada bactéria. Em

adição, nem todas as bactérias possuem as duas enzimas, por exemplo,

Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori e Treponema pallidum possuem

apenas DNA girase (HOOPER, 2001).

As quinolonas mais antigas, como a ciprofloxacina e a ofloxacina, apresentam

excelente atividade contra a DNA girase de bactérias Gram negativas e contra as

topoisomerase IV de bactérias Gram positivas. Sua atividade contra a DNA girase

de Gram positivos e contra as topoisomerase IV de Gram negativos é relativamente

fraca. Dessa maneira, as bactérias podem tornar-se resistentes à ciprofloxacina

através de mutações pontuais nos gens que codificam a enzima para qual ela

apresenta maior atividade, pois sua atuação na outra enzima (Girase de Gram

positivos ou Topoisomerases IV de Gram negativos) não será suficiente para inibir

adequadamente a bactéria (DRLICA & ZHAO, 1997).

Por outro lado, as novas quinolonas apresentam excelente atividade contra

ambas as enzimas, tanto em bactérias Gram negativas quanto Gram positivas.

Essas características proporcionam não só maior potência como também tornam

mais difícil o desenvolvimento de resistência, pois a bactéria terá que apresentar

mutações nas duas enzimas, uma vez que a atuação em qualquer uma das enzimas

será suficiente para inibir a bactéria (HOOPER, 1998).

A tabela 2 ilustra a afinidade pelo sítio alvo entre uma quinolona de 2ª

geração (ciprofloxacina) e outra de 4ª geração (trovafloxacina).

19

TABELA 2 – ATIVIDADE DA TROVAFLOXACINA EM COMPARAÇÃO COM A CIPROFLOXACINA NOS DOIS PRINCIPAIS SÍTIOS DE AÇÃO DE DIFERENTES ESPÉCIES BACTERIANAS

CIPROFLOXACINA TROVAFLOXACINA

BACTÉRIA DNA Girase Topo IV DNA Girase Topo IV

E. coli

****

*

****

****

S. pneumoniae

S. aureus * **** **** ****

FONTE: HOOPER, 1998

2.8 MECANISMO DE RESISTÊNCIA ÀS QUINOLONAS

A resistência às fluorquinolonas apareceu num período muito curto após a

introdução dessas drogas, o uso extensivo principalmente de ciprofloxacina e

ofloxacina levou à seleção de cepas mutantes resistentes. Algumas bactérias como

S. aureus e P. aeruginosa, uma única mutação já é suficiente para surgir resistência

observável clinicamente. No caso de S. aureus e estafilococos coagulase negativos,

cepas resistentes à meticilina desenvolveram resistência às fluorquinolonas mais

rapidamente que as cepas meticilina-sensíveis (HOOPER, 2001).

Campylobacter jejuni, Escherichia coli e Neisseria gonorrhoeae desenvolvem

resistência a esses fármacos por meio de múltiplos eventos mutacionais. Fatores

epidemiológicos podem estar envolvidos, pois há uma nítida correlação entre o uso

desses antibióticos em humanos e em aves domésticas. Esse mecanismo explica

porque patógenos zoonóticos, como Campylobacter jejuni, têm aumentado a

resistência por pressão seletiva em animais reservatórios dessas bactérias

(HOOPER, 2001).

A presença de portadores fecais de E. coli resistente às quinolonas parece

ser comum em alguns países. Na Espanha, adultos que nunca usaram esses

medicamentos e crianças no primeiro ano de vida, para as quais eles são raramente

prescritos, apresentavam cepas mutantes. Provavelmente, a aquisição foi feita via

cadeia alimentar, uma vez que também foram isoladas E. coli resistentes em aves

domésticas (HOOPER, 2001).

20

A propagação clonal pessoa-a-pessoa também é importante. Nos Estados

Unidos têm ocorrido surtos de infecção por Neisseria gonorrhoeae resistente às

fluorquinolonas (HOOPER, 2001).

Além dos fatores epidemiológicos, as características farmacocinéticas e

farmacodinâmicas dos antibióticos influenciam de forma marcante a atividade

antimicrobiana in vivo e o desenvolvimento de resistência. O pico de concentração

do nível plasmático em relação à concentração inibitória mínima (CIM), a área sob a

curva de concentração (AUC) em relação a CIM e o tempo acima da CIM são os

fatores mais importantes (FILE, 2001).

Parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos que se correlacionam com

a eficácia podem ser dependentes da concentração (níveis plasmáticos mais

elevados) ou dependentes do tempo (manutenção de níveis plasmáticos por um

período mais prolongado). A eficácia das quinolonas é concentração dependente,

determinada pela AUC ou pelo pico de concentração da droga no plasma (FILE,

2001).

O parâmetro primário para determinar a eficácia é a área sob a curva

inibitória (AUIC), definida como AUC em 24 horas dividida pela CIM do patógeno, o

que resulta em AUIC = AUC/CIM . Tem-se demonstrado, por exemplo, que para

bacilos Gram negativos há melhor eficácia e menor possibilidade de desenvolver

resistência quando os valores da AUIC estão acima de 100 e para S. pneumoniae

quando estão entre 25 a 30 (WRIGHT et al, 2000).

Calculando os valores da AUIC para S. pneumoniae no plasma e no soro

para várias fluorquinolonas, há uma ampla variação nos resultados. Deve-se levar

em consideração a característica individual de ligação com as proteínas

plasmáticas, quando os agentes são comparados de acordo com os resultados

séricos. Ciprofloxacina mostrou baixa eficácia contra pneumococo (AUIC de 13);

levofoxacina (AUIC=36), sparfloxacina (AUIC=29) e grepafloxacina (AUIC=40)

mostraram atividade “borderline”; moxifloxacina (AUIC=110), gatifloxacina

(AUIC=112) e gemifloxacina (AUIC=88) mostraram a melhor atividade. Esses

resultados indicam que as novas quinolonas são mais indicadas para prevenir o

aparecimento de resistência aos pneumococos, por possuírem afinidade aumentada

pelo sítio alvo (FILE, 2001).

21

A bactéria pode resistir à ação das quinolonas de diversas maneiras,

dependendo do medicamento e do organismo. No caso dos agentes mais recentes,

parece necessário mais de um mecanismo para o desenvolvimento de resistência

clinicamente significativa.

O desenvolvimento de resistência bacteriana foi observado com o uso de

ácido nalidíxico e com menos freqüência com as quinolonas mais recentes.

Entretanto, a exposição a concentrações crescentes destes fármacos resulta em

cepas altamente resistentes de muitas espécies, podendo existir resistência cruzada

a outras quinolonas (SADER, 1994).

As bactérias podem tornar-se resistentes às quinolonas principalmente por

meio de mutações nos genes gyr e par, proporcionando um alvo insensível (Figura

6). Podem ainda apresentar diminuição da incorporação do fármaco, tanto por

redução da permeabilidade das porinas quanto por aumento do sistema de efluxo

ativo (HOOPER, 2001). Outro mecanismo de resistência relatado é a aquisição do

gene qnr, mediado pelo plasmídeo pMG252 (TRAN & JACOBY, 2002). Até o

momento, não foram identificadas enzimas que degradem especificamente as

quinolonas.

FIGURA 6 – PRINCIPAIS MECANISMOS DE RESITÊNCIA ÀS QUINOLONAS

FONTE: SHEN, 1994.

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22

2.8.1 Mutações nos genes que codificam para DNA Girase e Topoisomerase IV

Como foi apresentado anteriormente, as quinolonas atuam ligando-se às

topoisomerases II e IV. Essas enzimas são homólogas, constituídas de quatro

subunidades cada . A topoisomerase II é composta por duas subunidades GyrA e

duas subunidades GyrB, enquanto a topoisomerase IV é contituída por duas

subunidades ParC e duas ParE. As subunidads GyrA e ParC constituem o principal

alvo de ação das quinolonas. Portanto, mutações nos genes que codificam essas

subunidades irão acarretar a diminuição da afinidade da bactéria pelas quinolonas,

e conseqüentemente, sua resistência (HOOPER, 2000).

Em geral, a resistência às quinolonas, associada a mutações nas

topoisomerases, ocorre de modo escalonado e cumulativo, ou seja, mutações

simples no sítio principal de ação da droga são associadas a moderados graus de

resistência, enquanto mutações adicionais no sítio primário e/ou secundário levam

ao alto grau de resistência (HOOPER, 2000).

O alto grau de resistência às quinolonas surge de maneira gradual após

sucessivas mutações nos seus sítios de ação (step wise mutations). Geralmente, a

primeira mutação simples ocorre no principal alvo de ação, a segunda mutação

simples no alvo secundário e a terceira mutação novamente no sítio principal de

ação. A cada mutação há um aumento na CIM para as fluorquinolonas, o que torna

importante o reconhecimento de amostras com baixos graus de resistência

(DRLICA, 1999).

Em E. coli, a maioria das mutações ocorre em uma pequena porção do

principal alvo de ação das quinolonas, o gene gyrA. Essa parte do gene é

denominada “Região Determinante de Resistência às Quinolonas” (QRDR) e

codifica os aminoácidos situados entre as posições 67 e 106 (YOSHIDA, 1990).

A substituição mais comumente observada é a da serina pela leucina ou

triptofano na posição 83, podendo resultar em um aumento da concentração

inibitória mínima para ciprofloxacina superior a 40 diluições. Elevações ainda

maiores são alcançadas quando ocorre uma segunda mutação, levando à

substituição do ácido aspártico na posição 87. Mutações na região determinante de

resistência às quinolonas do gene parC, com substituições do resíduo serina na

posição 80 e do ácido glutâmico na posição 84, também têm sido observadas em

23

amostras com alto grau de resistência às quinolonas. Essas mutações, porém,

sempre são acompanhadas de mutações duplas no gene gyrA (KUMAGAI, 1996).

Raramente, a resistência às fluorquinolonas em E. coli tem sido associada a

mutações nos genes gyrB e parE. Ainda não se compreende como mutações nestes

genes podem afetar a resistência às quinolonas nesta bactéria (HOOPER, 2001).

Em recente estudo realizado por GALES (2001), todas as amostras de E. coli

resistentes à ciprofloxacina apresentavam duas mutações no gene gyrA que

levaram a substituições nas posições 83 e 87, e mutações simples no gene parC.

Tais amostras demonstraram CIMs elevadas para ciprofloxacina, sendo ainda

resistentes a outras quinolonas testadas, tais como gatifloxacina, trovafloxacina e

ofloxacina. As mutações encontradas por este estudo são semelhantes àquelas

referidas por outros autores (HEISIG, 1996; KUMAGAI, 1996).

Embora a única amostra de E coli com uma mutação simples nos genes gyrA

e parC tenha sido também classificada como resistente à ciprofloxacina, a CIM para

este antimicrobiano foi pelo menos quatro vezes menor que aquela demonstrada

pelos isolados com duas mutações no gene gyrA. Além disso, essa amostra foi

classificada como sensível à gatifloxacina (GALES, 2001).

Esse fato sugere que múltiplas mutações são necessárias para o surgimento

de alto grau de resistência às quinolonas e que as metoxi-quinolonas, como a

gatifloxacina e moxifloxacina, apresentam maior atividade contra bactérias com

mutações simples, como relatado previamente (DRLICA, 1999; HOOPER, 1998;

BRISSE, 1999a; HOOPER, 2001).

Nenhuma mutação foi detectada nos genes gyrA e parC entre as amostras

de E coli categorizadas como sensíveis à ciprofloxacina com CIMs < ou = 0,015

µg/mL. Por outro lado, mutações simples no gene gyrA foram detectadas nas

amostras sensíveis à ciprofloxacina com CIMs entre 0,12 e 0,5 µg/mL. A mutação

mais comum levou à substituição da serina pela leucina na posição 83. Não se

desenvolveram mutações simples no gene parC nos isolados sensíveis à

ciprofloxacina com CIMs entre 0,12 e 0,5 µg/mL (GALES, 2001).

Nas enterobactérias, o mecanismo mais importante de resistência às

quinolonas é a alteração na subunidade GyrA da DNA girase, seguida de mutações

24

em ParC, subunidade da topoisomerase IV (BRISSE, 1999b). As principais trocas

de aminoácidos para este grupo podem ser observadas na tabelas 3 e 4.

Em Klebsiella pneumoniae ciprofloxacina resistente demonstrou-se a

mudança do aminoácido serina 83 pela tirosina, fenilalanina ou isoleucina. Em

Klebsiella spp, uma alteração única em Ser 83 da subunidade GyrA foi associada

com uma CIM da ciprofloxacina de 2 µg/mL. Mudanças adicionais nos aminoácidos

na posição 87 (ácido aspártico) em GyrA ou na posição 80 (serina) em ParC

geralmente aumentam a CIM. Isolados sem mutações em GyrA e ParC

demonstraram CIM para ciprofloxacina de 0,06 µg/mL (BRISSE, 1999).

Klebsiella oxytoca mostrou a mudança na posição 83 de triptofano para

isoleucina. Todos os isolados de Enterobacter cloacae mostraram uma mudança de

serina 83 para fenilalanina ou tirosina, e isolados de Enterobacter aerogenes uma

mudança de serina 83 para isoleucina ou tirosina (BRISSE, 1999).

Para Pseudomonas aeruginosa as principais alterações na QRDR ocorrem no

gene gyrA da DNA girase, como pode ser observado na tabela 5.

Em Campylobacter jejuni, a mutação no gene gyrA determina resistência à

ciprofloxacina. As mutações observadas ocorreram na posição 86 com troca do

aminoácido tirosina por isoleucina (ZIRNSTEIN, 1999).

Em relação às bactérias anaeróbicas como Bacteriodes fragilis, poucos

dados foram publicados, mas a alteração de efluxo e a alteração da região

determinante de resistência do gene gyrA podem estar envolvidas no mecanismo de

resistência às quinolonas (PETERSON, 1999).

Mutações em DNA girase e topoisomerase IV também conferem resistência

às quinolonas em bactérias atípicas como Mycoplasma hominis e Ureaplasma

urealyticum. As quinolonas de quarta geração são mais eficazes contra estas

bactérias, uma vez que estas requerem duas ou mais mutações em sítios diferentes

para se tornarem resistentes a esta nova classe (BEBEAR, 2000).

25

TABELA 3 - MUTAÇÕES NO SÍTIO DE AÇÃO EM Klebsiella pneumoniae

DNA GIRASE TOPOISOMERASE IV

Gyr A Gyr B ParC ParE

Ser 83 * * Tyr

Ser83 * * Phe

Ser83 *

Asp87 *

* Phe

* Tyr

Ser83 * * Ile Ser80 * * Ile

Ser83 * * Phe Ser80 * * Ile

FONTE: BRISSE,1999.

TABELA 4 - MUTAÇÕES NO SÍTIO DE AÇÃO EM Escherichia coli


Gyr A Gyr B Par C Par E

Ala 67* * Ser Ser 426* * Asn Gly 78* *Asp Leu 445* *His

Ser 80* * Arg Lys 444* * Glu Gly 78* * Cys

Gly 81* * Asp Ser 80* * Ile

Gly 81* * Cys Glu 84* *Gly

Asp 82* * Gly Glu 84 Lys

Ser 83* * Ala

Ser 83* * Leu

Ser 83* * Trp

Ala 84* * Pro

Aps 87* * Asn

Asp 87* * Gly

Gln 106* * Arg

Gln 106* *His

FONTE: PAN, 1998; HEISIG, 1996.

26

TABELA 5 - MUTAÇÕES NO SÍTIO DE AÇÃO EM Pseudomonas aeruginosa



Thr 83 Ile

Asp 87 * * Asn

Asp 87 * * Gly

Asp 87 * * Tyr

Asn 116 * * Tyr

FONTE: KOHLER, 1997.

Em Staphylococcus aureus, estudos genéticos mostram que uma única

mutação em grlA (que equivale ao gene parC em Escherichia coli) é capaz de

causar resistência às quinolonas, fato que não se manifesta em uma única mutação

em gyrA (Tabela 6). Portanto, ao contrário do que ocorre em Escherichia coli, o

primeiro alvo de ação é a topoisomerase IV (MORRISSEY, 1999).

O uso intenso de fluorquinolonas em ambiente hospitalar é um elemento de

risco para o aumento de casos de S. aureus resistentes à meticilina (MRSA), onde

possivelmente um dos fatores envolvidos seja a seleção de MRSA pela exposição

dessas bactérias a concentrações subinibitórias das fluorquinolonas, em especial a

ciprofloxacina (SADER, 1994).

Resistência às fluorquinolonas é considerada alta entre amostras de

Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA) (JONES, 1999).

Em Streptococcus pneumoniae, estudos genéticos têm mostrado que a

primeira mutação ocorre na região determinante de resistência às quinolonas

(QRDR) nos genes parC ou parE da topoisomerase IV, observada na tabela 7

(MORRISSEY, 1999).

VARON et al. (1999) encontraram três tipos de resistência em Streptococcus

pneumoniae. O primeiro nível de resistência foi obtido quando um único alvo, ParC

ou GyrA, dependendo da fluorquinolona, foi modificado. O segundo nível, quando

uma segunda mutação foi adicionada no outro alvo, ParC ou GyrA. O aumento da

resistência se completa com uma dupla mutação em ambas as enzimas GyrA e

ParC.

27

BRISSE (1999b), analisando amostras de Enterococcus faecium com

alterações em genes parC e gyrA em combinação com outros mecanismos de

resistência restringiram severamente a atividade in vitro de nove quinolonas

testadas.

TABELA 6 - MUTAÇÕES NO SÍTIO DE AÇÃO EM Staphylococcus aureus


Gyr A Gyr B GrlA GrlB

Asp 73 * * Gly Asp 437 * * Asn Ser 80 * * Phe Asp 432 * * Asp

Ser 84 * * Ala Arg 458 * * Gln Ser 80 * * Try Asn 470 * * Asp

Ser 84 * *Leu Ser 81 * * Pro

Ser 85 * * Pro Glu 84 * * Lys

Glu 88 * * Lys Ala 116 * * Glu

Asp 82 * * Gly Ala 116 * * Pro

FONTE: PAN, 1998.

TABELA 7 - MUTAÇÕES NO SÍTIO DE AÇÃO EM Streptococcus pneumoniae



Ser 81 * * Phe Asp 435 * * Asn Ser 79 * * Phe Asp 435 * * Asn

Ser 83 * * Phe Glu 474 * * Lys Ser 79 * * Tyr Pro 454 * * Ser

Ser 83 * * Tyr Ser 80 * * Pro

Ser 84 * * Phe Asp 83 * * Ala

Ser 84 *

* Tyr Asp 83 * * Gly

Glu 85 * * Lys Asp 83 * * His

Glu 87 * * Gln Asp 83 * * Tyr

Glu 87 * * Lys Ala 84 * * Thr

Trp 93 * * Arg Arg 95 * * Lys

Lys 137 * * Asn

FONTE: PAN, 1998.

28

2.8.2 Bombas de Efluxo

Resistência causada por redução da acumulação de quinolonas tem sido

observada com o aumento da expressão de bombas de efluxo, encontradas na

membrana citoplasmática de bactérias Gram positivas e Gram negativas (FILE,

2001).

Quando quinolonas são utilizadas como substrato destas bombas, há uma

redução da concentração intracelular delas. Este sistema tem sido reportado em

várias bactérias como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus

aureus e Streptococcus pneumoniae. Estas bombas estão presentes em muitas

bactérias, e eventualmente associadadas a um aumento de 2 a 4 vezes na CIM do

antimicrobiano (HOOPER, 2001).

O sistema de efluxo tem o papel de remover toxinas do citoplasma ou da

membrana citoplasmática e, geralmente, o substrato natural deste sistema é

desconhecido. Genes como nor, mex e nfx têm sido estudados. Por mutações em

tais genes, estas proteínas de efluxo são expressas em grande quantidade,

ocorrendo a resistência. O risco de aquisição de resistência pode ser reduzido,

evitando quinolonas que são bons substratos de bomba de efluxo, como a

norfloxacina (HOOPER, 2001).

As bombas de efluxo nas bactérias Gram negativas também podem estar

ligadas a outras proteínas capazes de facilitar a extrusão da droga através do

periplasma e da membrana externa (HOOPER, 2000). Nestas bactérias, o sistema

de efluxo possui, tipicamente, três componentes: uma bomba de efluxo localizada

na membrana citoplasmática, uma proteína de membrana externa e uma proteína

de fusão da membrana. Esta tem a função de ligar a bomba de efluxo à proteína da

membrana externa. Em amostras de Escherichia coli, os componentes do sistema

de efluxo AcrAB são: a bomba AcrB, a proteína de fusão da membrana AcrA e a

proteína de membrana externa TolC. Os genes que fazem parte do sistema MAR, e

que irão regular o sistema de efluxo AcrAB, são marA, acrR, robA e soxS. Mutações

cromossômicas nesses genes levam à superexpressão do sistema e,

conseqüentemente, à resistência às fluorquinolonas (HOOPER, 2001).

Os componentes das bombas de efluxo variam conforme o gênero e podem

ser vistos na tabela (8) a seguir.

29

TABELA 8 - COMPONENTES DO SISTEMA DE EFLUXO DAS PRINCIPAIS

BACTÉRIAS

COMPONENTES DA BOMBA DE EFLUXO

BACTÉRIA Bomba Proteína de fusão de membrana

Proteína de membrana externa

Gene regulatório ou mutação

Mex B Mex A Opr M mex R

Mex D Mex C Opr J mfz B

Mex F Mex E Opr N mex T

Pseudomonas

aeruginosa

mex Y Mex X Opr M mex Z

Escherichia coli

Acr B

Acr A

Tol C

acr B, mar A,

rob A, sox S

Staphylococcus

aureus

Nor A -- -- flq B promotor de

mutação, arl RS

S. pneumoniae Pmr A -- -- ?

FONTE: HOOPER, 2001.

Nas bactérias Gram negativas, as bombas de efluxo localizadas na

membrana interna podem agir concomitantemente com proteínas da membrana

externa, chamadas de porinas. Estas, por sua vez, podem apresentar mudanças na

quantidade, tamanho, estrutura e função, o que reduz a difusão através dos canais

protéicos da membrana externa para produzir uma resistência de baixo nível (FILE,

2001).

2.8.3 Resistência Mediada por Plasmídios

Resistência às quinolonas pode ser transferida de bactéria para bactéria por

meio de plasmídeos (MARTINEZ, 1998).

Resistência às quinolonas codificada pelo gene qnr e mediada pelo

plasmídeo pMG252 foi descoberta em um isolado clínico de Klebsiella pneumoniae

(1994) nos EUA. O gene codifica para uma proteína, pertencente a uma família de

proteínas pentapeptídeos repetidos, que proteje a DNA girase da inibição pelas

30

quinolonas. Esta proteína possui 218 aminoácidos com domínios repetidos de 11 e

28 cópias, uma atrás da outra, separadas por uma única glicina e com uma

seqüência consenso de A/C/D/NL/FXX (TRAN & JACOBY, 2002).

A prevalência do gene qnr tem sido investigada por PCR em mais de 350

bactérias Gram negativas de 14 gêneros, provenientes de 18 países e de 24

estados dos EUA. Neste estudo, a resistência às quinolonas mediadas por

plasmídeo foi rara, somente 6 das 350 amostras. Das 6 positivas, 5 eram Klebsiella

e 1 E. coli (JACOBY et al, 2003).

2.9 PREVENÇÃO DA SELEÇÃO DE MUTANTES

Várias estratégias têm sido usadas para diminuir o desenvolvimento de

resistência bacteriana aos antimicrobianos. Em relação à resistência bacteriana às

quinolonas mediada por mutações, surgiu uma estratégia nova baseada na

concentração do antimicrobiano capaz de inibir o surgimento de mutantes

resistentes. Esse índice é chamado de “Mutant Prevent Concentration” (MPC) e seu

valor varia entre as quinolonas para diferentes microrganismos (ZHAO & DRLICA,

2001).

Conceitualmente, a seleção de mutantes resistentes ocorre dentro de uma

variação de concentração específica da droga, chamada janela de seleção de

mutantes. O limite inferior da janela é a menor concentração da droga que inibe a

maioria das cepas sensíveis à droga. Esta concentração pode ser aproximada da

CIM50. O limite superior da janela é a concentração que inibe o crescimento da

maioria dos resistentes, com uma mutação. Acima desse limite, o crescimento

celular requer duas ou mais mutações de resistência (Figura 7).

Devido ao fato de raramente ocorrerem mutações múltiplas, poucos mutantes

serão seletivamente amplificados quando a concentração da droga exceder o limite

superior. Por exemplo, com fluorquinolonas, a freqüência de mutação para

resistência é menor que um numa população de 107 UFC/mL. Já a possibilidade de

encontrar uma célula com duas mutações que conferem resistência às

fluorquinolonas é de uma célula em uma população maior do que 1014 UFC/mL. Em

um caso clínico típico, a população bacteriana pode chegar até 1010 UFC/mL células

31

no sítio de infecção, mas a possibilidade de atingir 1014 UFC/mL é remota. Então a

resistência raramente ocorrerá quando a concentração da droga está acima do

limite superior da janela de seleção de mutantes, que define a MPC – “Mutant

Prevent Concentration” (Drlica, 2001).

A técnica para a detecção da MPC é semelhante ao método de ágar diluição.

A bactéria é inoculada em placas de MH ágar com diferentes concentrações do

antibiótico testado. O inóculo bacteriano, no entanto, é extremamente alto. Nas

técnicas utilizadas para determinar a sensibilidade, o inóculo é da ordem de 105-106

UFC/mL, enquanto para determinar a MPC é de 1010 UFC/mL.

A resistência aos antimicrobianos está emergindo em uma ampla variedade

de patógenos adquiridos na comunidade e no hospital. Quando a resistência

multidroga começou a aparecer, principalmente em bacilos Gram negativos

entéricos, foi mediada em sua grande maioria por plasmídeos. O papel das

mutações na gênesis da resistência bacteriana acabou sendo subestimado.

Contudo, para alguns microrganismos como M. tuberculosis, este mecanismo ocupa

o principal papel na dimuinição da sensibilidade à rifampicina, etambutol e

fluorquinolonas. Similarmente, resistência às fluorquinolonas em N. gonohrreae, S.

pneumoniae e espécies de Salmonella freqüentemente resultam de mutações nos

loci gyrA, gyrB e parC. As mutações podem ainda préexistir em genes transferíveis

de resistência, apresentando uma função diferente por aumentar ou expandir o

espectro de resistência (TENOVER, 2001).

Alguns fatores contribuíram na emergência da resistência, como as mutações

em genes de resistência, a troca de informação genética no qual genes de

resistência são transmitidos para o hospedeiro, a pressão seletiva exercida pelo

antibiótico no hospital e na comunidade e a incapcidade de alguns laboratórios em

testar métodos que detectem fenótipos de resistência emergentes (TENOVER,

2001).

A resistência bacteriana aos antimicrobianos é um fenômeno ecológico

originado da resposta da bactéria ao amplo uso de antibióticos e da presença deste

no ambiente, representando um dilema terapêutico mundial. E a concentração que

previne o surgimento de mutantes é um índice microbiológico que vem sendo

utilizado para minimizar o surgimento de bactérias resistentes aos antimicrobianos.

32

FIGURA 7 – JANELA DE SELEÇÃO DE MUTANTES

FONTE: ZHAO & DRLICA, 2001

Tempo após a administração

Con

cent

raçã

o sé

rica

/teci

dual

da

dro

ga

Janela de seleção de mutantes

Tempo após a administração

Con

cent

raçã

o sé

rica

/teci

dual

da

dro

ga

Janela de seleção de mutantes

33

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o uso do ácido nalidíxico como marcador preditivo da resistência às

outras quinolonas.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

a) Determinar o perfil de sensibilidade ao ácido nalidíxico, norfloxacina,

ciprofloxacina e gatifloxacina de Escherichia coli isoladas de urocultura.

b) Comparar os métodos de difusão em ágar e diluição em ágar para

detecção de resistência quali e quantitativa às quinolonas.

c) Estudar o principal mecanismo de resistência por meio de reação em

cadeia da ppolimerase (PCR) e sequenciamento das regiões

determinantes de resistência às quinolonas (QRDR) dos genes gyrA e

parC.

d) Avaliar o perfil de sensibilidade de Escherichia coli frente à nitrofurantoína

e sulfametoxazol/trimetoprim.

34

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 AMOSTRAS

Foram coletadas 385 amostras sucessivas de Escherichia coli, isoladas de

pacientes com suspeita de infecção urinária, atendidos no Hospital de Clínicas da

Universidade Federal do Paraná, durante o período de seis meses, de maio a

novembro de 2002. Foi incluída apenas uma amostra por paciente, com

desenvolvimento bacteriano único e contagem de colônias igual ou superior a 104

UFC/mL (CLARRIDGE et al, 1998). Todas as amostras foram correntemente

submetidas ao processo de identificação e teste de SENSIBILIDADE aos

antimicrobianos (TSA) do sistema automatizado WalkAway® (Dade Behring™).

Dados referentes ao paciente, como gênero, idade, unidade clínica, foram

obtidos do mapa de trabalho do setor de bacteriologia com informações fornecidas

pelo médico requisitante. Além disso, o resultado do (TSA) pelo sistema

automatizado também foi registrado.

4.1.1 Estocagem das Amostras Bacterianas

Escherichia coli isoladas primariamente em meios seletivos foram repicadas

em meio não seletivo, ágar tríptico de soja, e incubadas a 35ºC por 18-24 horas. Na

seqüência, foram armazenadas em frascos estéreis contendo caldo tríptico de soja

/Glicerol 15% (v/v), em freezer a - 70 ºC (JONES et al, 1994).

35

4.2 TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS POR DISCO DIFUSÃO

EM ÁGAR

O teste de disco difusão em ágar (DD) consiste no cultivo da bactéria sob a

qual deposita-se disco de papel impregnado com o antibiótico numa concentração

fixa.

Foi determinado o padrão de sensibilidade a quatro quinolonas com ação em

trato urinário, representando as diferentes gerações de quinolonas utilizadas no

Brasil (Figura 8). Escherichia coli ATCC 25922 foi utilizada como controle de

qualidade dos discos e do ágar Mueller-Hinton (MH). Placas inoculadas com a

bactéria, sem os discos dos antimicrobianos, foram utilizadas para monitorar o

crescimento bacteriano no meio. Os discos utilizados foram: ácido nalidíxico (NAL)

30µg, norfloxacina (NOR) 10µg e ciprofloxacina (CIP) 5µg, todos adquiridos

comercialmente da empresa Newprov®. Gatifloxacina (GTF) 5µg foi doada pelo

laboratório Bristol Myers Squibb®. O teste foi realizado conforme as normas do

documento M2-A7 (NCCLS, 2000), sumarizado abaixo.

O inóculo foi preparado subcultivando as amostras em Ágar Tríptico de Soja

duas vezes antes do teste. Na sequência, transferiu-se 3 a 5 colônias isoladas de

morfologia similar para um tubo contendo 4 a 5 mL de salina estéril. A turvação do

inóculo foi comparada com a turvação do tubo 0,5 da escala de McFarland (1,5 x

108UFC/mL) com auxílio de aparelho fotométrico, em absorbância de 625 nm. O

limite de leitura aceitável variou entre 0.08 e 0,10; quando o inóculo inicial não ficou

dentro do limite aceitável, a turbidez foi ajustada com mais bactéria ou mais salina

estéril conforme a necessidade. As placas de ágar Mueller-Hinton (MH) foram

inoculadas com a suspensão bacteriana por meio de swab impregnado, de modo a

cobrir homogeneamente toda a superfície da placa. Os discos foram colocados

manualmente sobre a superfície do ágar com auxílio de uma pinça estéril, a cerca

de 24 mm um do outro e a 15 mm da parede da placa. Após a secagem, por

período máximo de 15 minutos, as placas foram incubadas a 35 ºC por 16 a 24

horas. Após a incubação foi realizada a medição do diâmetro do halo de inibição. Os

resultados foram interpretados conforme os parâmetros da tabela 2A, do documento

M100-S12 (NCCLS, 2002).

36

FIGURA 8 – ESTRUTURA QUÍMICA DA QUINOLONAS UTILIZADAS

ÁCIDO NALIDÍXICO NORFLOXACINA

GATIFLOXACINACIPROFLOXACINA

ÁCIDO NALIDÍXICO NORFLOXACINA

GATIFLOXACINACIPROFLOXACINA

37

4.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) PELO MÉTODO DE ÁGAR-DILUIÇÃO

No intuito de avaliar a potência e atividade de NAL, NOR, CIP e GTF frente

às amostras testadas, determinou-se a concentração inibitória mínima (CIM). Foram

testados também nitrofurantoína (NIT) e sulfametoxazol/trimetoprim (SUT), por

tratarem-se de opções terapêuticas para infecções do trato urinário.

4.3.1 Preparo das soluções de antibióticos

Ácido nalidíxico, norfloxacina e nitrofurantoína foram adquiridos

comercialmente da empresa Sigma-Aldrich. SUT, da mesma empresa, foi doado

pelo Laboratório Especial de Microbiologia Clínica da Universidade Federal de São

Paulo (UNIFESP), CIP foi adquirida da empresa ICN Biomedicals. A gatifloxacina

foi usada na forma medicamentosa (solução injetável na concentração de 4mg em

200 mL), doada pelo laboratório Bristol Myers Squibb®, devido à falta de

disponibilidade do sal puro.

Foram testadas as concentrações fornecidas pela literatura (NCCLS), entre

as quais encontram-se os pontos de corte (breakpoints) para classificação das

amostras nas categorias sensível (S), resistente (R) e intermediário (I). A amostra

era composta de E. coli sensíveis e resistentes às quinolonas, inicialmente

classificadas pelo teste de difusão em ágar. Com o objetivo de diminuir os custos,

foram utilizados dois esquemas de diluições conforme as concentrações na tabela

9.

38

TABELA 9 – CRITÉRIOS DE INTERPRETAÇÃO DE SENSIBILIDADE SEGUNDO O NCCLS E

CONCENTRAÇÕES DOS ANTIMICROBIANOS TESTADOS PARA AMOSTRAS DE E.

coli

PONTO DE CORTE (µg/mL)

CONCENTRAÇÕES TESTADAS (µg/mL)

ANTIBIÓTICO

S R SENSÍVEIS RESISTENTES

NAL ≤ 16 ≥ 32 0,5-16 1-512 NOR ≤ 4 ≥ 16 0,015-8 2-256 CIPRO ≤ 1 ≥ 4 0,015-8 0,5-64 GATI ≤ 2 ≥ 8 0,015-8 0,5-64 NITRO ≤ 32 ≥ 128 0,5-256 0,5-256 SUT ≤ 2/38 ≥ 4/76 0,03/06-16/304 0,03/06-16/304

A concentração da solução estoque (SE) foi calculada a partir da maior

concentração testada para cada antimicrobiano, do volume de MH ágar utilizado nas

placas e do volume final da SE. A quantidade em mg do antimicrobiano necessária

para preparar as soluções foi calculada usando a seguinte fórmula:

Peso (mg)= Vol. do Solvente(mL) X Conc. da Solução Estoque (µm/mL)

Potência do antibiótico(µg/mL)

A concentração da solução estoque utilizada foi de 51200 µg/mL para o NALe

NOR, de 6400 µg/mL para a CIP e NIT, de 1600 µg/mL para a GTF e 15200/800

µg/mL para sulfametoxazol/trimetoprim.

O solvente utilizado para NAL, NOR e Sulfametoxazol foi NaOH 0,1 M/L,

ácido lático para Trimetoprim e água ultrapura para CIP. Gatifloxacina já estava na

forma solúvel (solução injetável). Água ultrapura foi usada como diluente para esses

antimicrobianos. Para Nitrofurantoína foi usado dimetilsulfóxido de sódio (DMSO)

como solvente e diluente, neste caso foi incluído uma placa controle a mais com MH

ágar e DMSO, na mesma proporção dos antimicrobianos, para o controle de

eventual efeito inibitório do DMSO.

39

As soluções de antimicrobianos foram esterilizadas por membrana filtrante de

0,22 µ de diâmetro (Millipore), divididas em alíquotas e estocadas a 4ºC, – 20ºC ou

– 70ºC, conforme indicado.

4.3.2 Preparo das placas de Mueller-Hinton ágar com antimicrobiano

Foram realizadas diluições seriadas a partir da solução estoque (SE), com

água ultrapura e DMSO para NIT. Diluiu-se a SE até a maior concentração a ser

testada, as seguintes foram obtidas com diluição 1:2 até alcançar a menor

concentração desejada – ver exemplo da diluição do NAL na Figura 9.

O ágar Mueller-Hinton foi preparado com os cuidados necessários e

conforme instruções do fabricante. Foram distribuídas alíquotas em frascos de

Castañeda estéreis. O volume distribuído em cada frasco foi de 48 mL para

Sulfametoxazol/Trimetoprim e 49 mL para os demais antimicrobianos. Após resfriar

em banho-maria até 48-50ºC, foi adicionada a solução diluída do antimicrobiano, 2

mL para SUT (um mL de sulfametoxazol e um mL de trimetoprim) e 1 mL para os

outros antibióticos, totalizando 50 mL, volume necessário para atingir a espessura

preconizada de 4-5 mm do ágar. Após a homogeneização, o meio foi distribuído em

placas estéreis descartáveis. As placas foram, então, refrigeradas e utilizadas até 48

horas após o preparo.

40

FIGU

RA

9 – EX

EM

PLO

DE

DILU

IÇÃ

O S

ER

IAD

A D

A S

OLU

ÇÃ

O E

STO

QU

E D

O

ÁC

IDO

NA

LIDÍX

ICO

1 mL SE+

7 mL H

2O

Solução 1

6400 µg/mL

Solução Estoque (SE)

51200 µg/mL

1 mL S1+

7 mL H

2O

Solução 2

800 µg/mL

2 mL S2+

2 mL H

2O

Solução 3

400 µg/mL

2 mL S3+

2 mL H

2O

Solução 4

200 µg/mL

2 mL S4+

2 mL H

2O

Solução 5

100 µg/mL

2 mL S5+

2 mL H

2O

Solução 6

50 µg/mL

2 mL S6+

2 mL H

2O

Solução 7

25 µg/mL

2 mL S7+

2 mL H

2O

Solução 8

12,5 µg/mL

2 mL S8+

2 mL H

2O

Solução 9

6,25µg/mL

2 mL S9+

72mL H

2O

Solução 10

3,12 µg/mL

2 mL S10+

2 mL H

2O

Solução 11

1,56 µg/mL

1 mL S 2

+

49 mLMH

16 µg/mL

1 mL S 8

+

49 mLMH

0,25 µg/mL

1 mL S 9

+

49 mLMH

0,12 µg/mL

1 mL S 10

+

49 mLMH

0,06 µg/mL

1 mL S 4

+

49 mLMH

4 µg/mL

1 mL S 5

+

49 mLMH

2 µg/mL

1 mL S 6

+

49 mLMH

1 µg/mL

1 mL S 7

+

49 mLMH

0,5 µg/mL

1 mL S 3

+

49 mLMH

8 µg/mL

1 mL S 11

+

49 mLMH

0,03 µg/mL

1 mL SE+

7 mL H

2O

Solução 1

6400 µg/mL

Solução Estoque (SE)

51200 µg/mL

1 mL S1+

7 mL H

2O

Solução 2

800 µg/mL

2 mL S2+

2 mL H

2O

Solução 3

400 µg/mL

2 mL S3+

2 mL H

2O

Solução 4

200 µg/mL

2 mL S4+

2 mL H

2O

Solução 5

100 µg/mL

2 mL S5+

2 mL H

2O

Solução 6

50 µg/mL

2 mL S6+

2 mL H

2O

Solução 7

25 µg/mL

2 mL S7+

2 mL H

2O

Solução 8

12,5 µg/mL

2 mL S8+

2 mL H

2O

Solução 9

6,25µg/mL

2 mL S9+

72mL H

2O

Solução 10

3,12 µg/mL

2 mL S10+

2 mL H

2O

Solução 11

1,56 µg/mL

1 mL S 2

+

49 mLMH

16 µg/mL

1 mL S 8

+

49 mLMH

0,25 µg/mL

1 mL S 9

+

49 mLMH

0,12 µg/mL

1 mL S 10

+

49 mLMH

0,06 µg/mL

1 mL S 4

+

49 mLMH

4 µg/mL

1 mL S 5

+

49 mLMH

2 µg/mL

1 mL S 6

+

49 mLMH

1 µg/mL

1 mL S 7

+

49 mLMH

0,5 µg/mL

1 mL S 3

+

49 mLMH

8 µg/mL

1 mL S 11

+

49 mLMH

0,03 µg/mL

41

4.3.3 Procedimento técnico do teste de agar-diluição

O inóculo bacteriano foi preparado de forma semelhante ao utilizado para o

TSA por DD (ver ítem 4.2). Na seqüência, realizou-se a diluição do inóculo pois a

concentração final por “spot” de 5-8 mm deve ser de 104. Para obter esta

concentração, o inóculo inicial foi diluído 1:10 em solução salina estéril, obtendo a

concentração de 107 UFC/mL. Após a inoculação no MH ágar, os “spots” ficaram

com a concentração de cerca de 104, pois os inoculadores depositam entre 1-2 µL

da amostra sobre a superfície do ágar (Figura 10).

Foram distribuídas alíquotas de 100 µL do inóculo diluído em placas tipo

ELISA de 96 poços, para um replicador Steer com 96 pinos. As amostras foram

inoculadas inicialmente em uma placa controle sem antibiótico. Na seqüência, as

placas foram inoculadas partindo da placa de menor concentração do

antimicrobiano (Figura 11). No final, foi inoculada outra placa controle sem

antimicrobiano, para avaliar a eventual contaminação e o carreamento de

antimicrobianos durante o procedimento.

As placas foram mantidas em temperatura ambiente por no máximo 30

minutos para secagem. Após este período as placas foram incubadas a 35ºC por

16-20 horas.

A concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada como a menor

concentração que inibiu completamente o crescimento bacteriano visível. A película

causada pelo depósito bacteriano foi desconsiderada. CIM50 e CIM90 foram definidas

como a concentração inibitória mínima para inibir o crescimento bacteriano de 50%

e 90% das amostras, respectivamente.

42

FIGURA 10 - ESQUEMA SIMPLIFICADO DO MÉTODO DE ÁGAR DILUIÇÃO UTILIZADO

Diluição 1:10

(108UFC/mL)

1 a 2 µL por amostra 104 UFC/mL por spot

Inóculo Inicial

(107UFC/mL)(107UFC/mL)

Placa tipo ELISA

Replicador de SteerPlaca de MH ágar com antibiótico

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

Diluição 1:10

(108UFC/mL)

1 a 2 µL por amostra 104 UFC/mL por spot

Inóculo Inicial

(107UFC/mL)(107UFC/mL)

Placa tipo ELISA

Replicador de SteerPlaca de MH ágar com antibiótico

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

43

FIGURA 11 - EXEMPLO DA DETERMINAÇÃO DA CIM DO ÁCIDO NALIDÍXICO PELO MÉTODO DE ÁGAR-DILUIÇÃO

NOTA: Na figura, 96 amostras de E. coli foram inoculadas em ágar MH com concentrações crescentes de ácido nalidixíco (NAL). Em a) placa controle sem NAL, b) ágar MH com 0,5 µg/mL de NAL, c) ágar MH com 1µg/mL de NAL, d) ágar MH com 2 µg/mL de NAL, e) ágar MH com 4 µg/mL de NAL, f) ágar MH com 8 µg/mL de NAL, g) ágar MH com 16 µg/mL de NAL e h) placa controle sem NAL.

NOTA EPECÍFICA: → indica a concentração inibitória mínima (CIM), determinada como a menor concentração onde não houve desenvolvimento bacteriano que a bactéria no exemplo foi na diluição de 2 µg/mL (d).

a

c

g

e

b

d

f

h

a

c

g

e

b

d

f

h

44

4.4 PESQUISA DE MUTAÇÕES NA REGIÃO DETERMINANTE DE RESISTÊNCIA ÀS QUINOLONAS (QRDR) DOS GENES gyrA E parC

Das 53 amostras resistentes ao ácido nalidíxico, selecionaram-se 10

amostras para pesquisa de mutações nas QRDRs dos genes gyrA e parC. O critério

de seleção das amostras foi baseado nos resultados DD para o ácido nalidíxico e na

CIM da ciprofloxacina. Das amostras resistentes estudadas, 5 pertenciam ao grupo

2 (NAL resistentes e fluorquinolonas sensíveis) e 5 pertenciam ao grupo 3

(resistentes a todas as quinolonas, com exceção de uma amostra que apresentou

sensibilidade à gatifloxacina nos testes de difusão em ágar e ágar-diluição). Foram

incluídos, ainda, dois isolados sensíveis às quinolonas (grupo 1).

A investigação da presença de mutações que conferem resistência às

quinolonas foi realizada por PCR (Polimerase Chain Reaction) e seqüenciamento

do produto de PCR. A região amplificada compreende o local onde as QRDRs dos

genes gyrA e parC estão localizadas.

4.4.1 Extração do DNA bacteriano

O método de extração do DNA foi segundo BROWN & AMYES (1998),

modificando apenas a quantidade da amostra utilizada na PCR. Após isolamento

em ágar sangue, três colônias de cada isolado foram transferidas para tubos do tipo

eppendorff de 1,5 mL com 300 µL de H2O (ultrapura, esterilizada por membrana

filtrante 0,2 µm de diâmetro da Millipore), homogeinizadas em agitador do tipo

vortex, aquecidas a 100ºC em termobloco por 10 minutos, resfriadas em

temperatura ambiente e centrifugadas a 14.000 rpm por 5 minutos. Quinze

microlitros do sobrenadante foram utilizados em cada reação de amplificação.

45

4.4.2 Amplificação da QRDR dos genes gyrA e parC por PCR

Na reação de amplificação foram utilizados os “primers” ou iniciadores

(Tabela 10) para o gene gyrA: 5’ CCGTCGCGTACTTTACGC 3’ (fita sentido) e 5’

CGTTCACCAGCAGGTTAG 3’ (fita antisentido). Para o gene parC: 5’

TCTGAACTGGGCCTGAATG 3’ (fita sentido) e 5’ CTCAATAGCAGCTCGGAATA 3’

(fita antisentido) (GEORGIOU et al., 1996; EVERET et al, 1996). Foi preparada uma

solução (master mix) para PCR contendo H2O ultrapura estéril, tampão de reação

da enzima (10X concentrado), MgCL2 50 mM, dinucleotídeos (dATP, dTTP, dGTP e

dCTP) 0,2 mM cada, solução de iniciadores (primer mix) contendo as fitas sentido

(sense) e anti-sentido (anti-sense) 50 ρM cada e 2,5 unidades da Taq DNA

polimerase (MGM). O volume final foi de 60 µL de reação, 45 µL da master mix e

15 µL da amostra. A solução mãe (master mix) foi preparada de forma semelhante

para os dois genes, mudando apenas os primers.

TABELA 10 - INICIADORES UTILIZADOS NA AMPLIFICAÇÃO DA QRDR DOS GENES gyrA e parC

GENE SEQUENCIA REGIÃO ALVO

(Nucleotídeos)

Nº DE PARES

DE BASE

Sentido 5’ CCGTCGCGTACTTTACGC 3’ gyrA Anti-sentido 5’ CGTTCACCAGCAGGTTAG 3’ 135 - 448 313

Sentido 5’ TCTGAACTGGGCCTGAATG 3’ parC

Anti-sentido 5’ CTCAATAGCAGCTCGGAATA 3’ 148 - 401 253

A termociclagem foi realizada em aparelho da Eppendorff. O programa

incluiu um estágio preliminar de 10 minutos a 95ºC, seguidos de 35 ciclos a 90ºC

por 1 minuto, 58ºC (gyrA) ou 53ºC (parC) por 1 minuto e 72ºC por 3 minutos. Os

produtos da reação foram conservados em freezer a -20ºC.

46

Oito microlitros do produto amplificado foram submetidos à eletroforese em

gel de agarose a 1%, por cerca de uma hora a uma voltagem constante de 100 V.

Na seqüência, o gel foi corado com brometo de etídio (0,5 µg/mL) por 20 minutos,

visualizados e fotografados sob luz UV em transiluminador.

4.5 SEQUENCIAMENTO DO PRODUTO AMPLIFICADO

As amostras foram seqüenciadas no laboratório ALERTA da disciplina de

Doenças infeciosas e parasitárias da Universidade Federal de São Paulo - Escola

Paulista de Medicina (Unifesp/EPM), com o apoio da Dra. Ana Cristina Gales, que

gentilmente disponibilizou os insumos e a infra-estrutura necessários para a

realização desse método.

4.5.1 Purificação do produto de PCR

O produto de PCR dos genes gyrA e parC foram purificados com o “Kit

Concert Rapid PCR Purification System” (Life Technologies, Valencia, CA, USA),

conforme as instruções do fabricante. Após a purificação do produto foi realizada

eletroforese para quantificar o DNA por meio de comparação visual a outro gel com

quantidades conhecidas de DNA (controle do Kit de seqüenciamento), sendo

avaliados o tamanho e a intensidade das bandas formadas. Foi realizada a diluição

da amostra quando necessária.

4.5.2 Seqüenciamento

O DNA foi seqüenciado pelo método de terminação de cadeia com

dideoxinucleotídeos (dDNTPs) e revelado com corantes fluorescentes (Big Dye® -

Applied biosystems). Para cada teste foram realizadas duas reações, uma para a

fita sentido e outra para a fita anti-sentido. A reação de sequenciamento foi

47

preparada em dois tubos de microcentrífuga, utilizando-se de 2 a 10 µL da amostra

purificada, conforme a quantidade de DNA presente nas mesmas.

Os iniciadores utilizados foram os mesmos da PCR, porém numa

concentração menor (5 ρM) e em reações separadas. O volume final da reação foi

de 20 µL: 4 µL da mistura de reação Big Dye, 4 µL de tampão 2,5 X concentrado, 2

µL do primer e 10 µL da amostra pura ou diluída com água ultrapura.

Depois de preparada a reação, os tubos foram colocados em termociclador

com o seguinte programa: um ciclo de 94ºC por 2 minutos, 96ºC por 10 segundos,

50ºC por 30 segundos e extensão final de 60ºC por 4 minutos.

4.5.3 Precipitação de DDNTPs não incorporados

Ao final da reação de PCR o produto foi precipitado para eliminação dos

DDNTPs marcados que não foram incorporados na reação. O produto do

seqüenciamento foi transferido para novos tubos, foram adicionados 80 µL de

isopropanol a 75%, homogeneizados em vortex e centrifugados a 12000 rpm por 30

minutos, a 22ºC. O isopropanol foi removido com pipeta. O passo seguinte foi

adicionar 100 µL de etanol a 70%, homogeneizar em vortex e centrifugar a 12000

rpm por 10 minutos. O etanol foi removido, as amostras secas por 1 minuto em

termo-bloco a 94ºC. Foram adicionados 20 µL de TSR (polímero que acompanha o

Kit de seqüenciamento). As amostras foram submetidas a um choque térmico:

termo-bloco 1 minuto a 94ºC e, em seguida, os tubos foram colocados por 3 minutos

no freezer a –20ºC.

4.5. Determinação da seqüência do DNA

As amostras foram transferidas para os tubos de sequenciamento e estes

colocados no aparelho ABI BioPrism 310 (Foster City, Califórnia, EUA). A

interpretação análise e edição das seqüências foram realizadas com o auxílio do

“software Sequencing Analysis” do aparelho ABI BioPrism 310. A comparação com

48

as seqüências conhecidas já publicadas dos genes gyrA e parC, para pesquisa das

mutações, foi realizada no mesmo software.

SPIN

4.6 SÍNTESE DOS PROCEDIMENTOS REALIZADOS NESTE TRABALHO

Trezentos e oitenta e cinco amostras de E. coli foram submetidas ao teste de

SENSIBILIDADE aos antimicrobianos (TSA) por dois métodos, difusão em ágar e

ágar diluição (método de referência). As seguintes quinolonas foram avaliadas pelo

método de difusão em ágar, ácido nalidíxico (NAL), norfloxacina (NOR),

ciprofloxacina (CIP) e gatifloxacina (GTF). A concentração inibitória mínima foi

determinada pelo método de ágar diluição. Além das quinolonas citadas,

nitrofurantoína (NIT) e sulfametoxazol/trimetoprim (SUT) foram incluídos. Doze

amostras foram selecionadas para a pesquisa de mutações nos genes gyrA e parC

que conferem resistência às quinolonas, o critério de seleção dessas amostras foi

baseado na CIM da CIP. Das doze amostras, duas pertenciam ao grupo 1 (sensível

às quinolonas), cinco pertenciam ao grupo 2 (resistentes somente ao ácido

nalidíxico) e cinco pertenciam ao grupo 3 (resistentes às quinolonas). A sequência

dos procedimentos realizados está na figura 12.

49

FIGURA 12 – DIAGRAMA SIMPLIFICADO DOS PROCEDIMETOS TÉCNICOS REALIZADOS

D isco-difusãoN A L , NO R ,C IP e G TF

Ág ar-diluiçãoN A L , N O R ,C IP , G TF, N IT e S U T

Sequenciam ento(g yrA e p a rC )

P rod u tos d a P CR

PCR (g yrA e pa rC)G ru po 1 : 2 a m o s trasG ru po 2 : 5 a m o s trasG ru po 3 : 5 a m o s tras

T SAn :3 85

E. co lin :3 85

50

5 RESULTADOS

5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA

No período de maio a novembro de 2002, foram coletadas 385 amostras de

E. coli, isoladas em urocultura, processadas no período do estudo. Todas com

desenvolvimento bacteriano único, a maior parte (91,5%) com contagem de colônias

igual ou superior a 105 UFC/mL, e o restante com contagem superior a 104 UFC/mL.

A origem dos pacientes era predominantemente ambulatorial. As mulheres

participaram com o maior número de amostras, 327 (84,9%), e os homens com 58

(15,1%).

Quanto à idade, as amostras foram distribuídas por faixa etária, com intervalo

de 10 em 10 anos, com exceção da primeira década, que foi avaliado o número de

amostras até 1 ano e de 2 a nove anos (Figura 13). O número de amostras (A)

femininas (F) e masculinas (M) por faixa etária foi: 20 A até 1 ano (13 F e 7 M), 29 A

entre 2 e 9 anos (22 F e 7 M), 29 A entre 10 e 19 anos (26 F e 3 M), 59 A entre 20 e

29 anos (55 F e 4 M), 57 A entre 30 e 39 anos (56 F e 1 M), 67 A entre 40 e 49

anos (62 F e 5 M), 41 A entre 50 e 59 anos (35 F e 6 M), 41 A entre 60 e 69 anos

(32 F e 9 M), 33 A entre 70 e 79 anos (21 F e 12 M) e 9 A entre 80 e 89 anos (5 F e

4 M). Observa-se que as amostras masculinas foram mais freqüentes nos extremos

da faixa etária e as femininas entre os 20 e 50 anos.

51

FIGURA 13 - DISTRIBUIÇÃO DO NÚMERO DE AMOSTRAS DE E. coli ISOLADAS DE PACIENTES DO GÊNERO FEMININO E MASCULINO, SEGUNDO A FAIXA ETÁRIA

Os resultados retrospectivos do teste de sensibilidade aos antimicrobianos,

teste realizado pelo método automatizado WalkAway® (Dade Behring™), estão

sumarizados na Tabela 11. Sulfametoxazol e ampicilina são os antibióticos com

menor atividade para os microorganismos testados. Ceftriaxona apresentou o

melhor resultado, com apenas um isolado resistente, os demais antibióticos

apresentaram percentual de resistência entre 3,7% e 8,8%.

TABELA 11 – PERCENTUAL DE RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS DETECTADO PELO MÉTODO AUTOMATIZADO WALKAWAY® DE 385 ISOLADOS DE E. coli.

PERCENTUAL DE RESISTÊNCIA DE 385 ISOLADOS DE E. coli TESTADOS

NOR AMP CFZ CRO GENTA NITRO SUT

8,8 51,7 6,5 0,26 3,7 5,4 46,4

(NOR) Norfloxacin, (AMP) Ampicilina, (CFZ) Cefazolina, (CRO) Ceftriaxona, (GENTA) Gentamicina, (NIT) Nitrofurantoína, (SUT) Sulfametoxazol.

0

10

20

30

40

50

60

70

Até 1 2-9 10-19 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89

FAIXA ETÁRIA (ANOS)

Nº

DE

AM

OS

TRA

Feminino Masculino

52

5.2 TESTE DE SENSIBILIDADE ÀS QUINOLONAS POR DISCO DIFUSÃO EM

ÁGAR

O resultado do TSA por DD ao ácido nalidíxico, norfloxacina, ciprofloxacina e

gatifloxacina demonstrou variação nas quatro quinolonas testadas. Foi detectada

resistência a pelo menos uma quinolona em 52 amostras, das quais 18 amostras

apresentaram resistência somente ao ácido nalidíxico (foram incluídas neste grupo

as 3 amostras com resultado intermediário para o NAL).

Os gráficos das figuras 14 e 15 apresentam a relação entre a idade e o

número de isolados para amostras femininas e masculinas. Entre as mulheres, o

número de amostras é maior entre 20 e 50 anos de vida, as amostras resistentes,

no entanto, estão concentradas entre a faixa de 15 e 30 anos e acima dos 60. Entre

os homens, o número de amostras é elevado na primeira década, apresentando

poucos islolados resistentes; a partir dos 30 anos há uma proporção entre o número

de amostras e o número de isolados resistentes, ambos aumentam gradativamente

com a faixa etária, principalmente acima dos 60 anos.

As quinolonas testadas pelo método de difusão em ágar mostraram fenótipos

variados de resistência, os predominantes foram resistência aos quatros

antimicrobianos testados (26 amostras) e resistência apenas ao ácido nalidíxico e

sensibilidade aos demais (18 amostras), fenótipos 1 e 2, respectivamente (Tabela

12).

TABELA 12 - DISTRIBUIÇÃO DOS FENÓTIPOS DE RESISTÊNCIA ÀS QUINOLONAS PELO MÉTODO DE DIFUSÃO EM ÁGAR

FENÓTIPO

NAL

NOR

CIP

GTF TOTAL

1 R R R R 26

2 R S S S 15

3 R I R S 2

4 R S I I 1

5 R R R I 4

6 R R R S 1

7 I S S S 3

(NAL) ácido nalidíxico, (NOR) norfloxacina, (CIP) ciprofloxacina, (GTF) gatifloxacina R, resistência; S, sensibilidade; I, intermediário

53

FIGURA 14 - DISTRIBUIÇÃO DO NÚMERO TOTAL DE AMOSTRA E NÚMERO DE AMOSTRAS RESISTENTES PELO MÉTODO DE DIFUSÃO EM ÁGAR POR FAIXA ETÁRIA EM AMOSTRAS FEMININAS

FIGURA 15 – DISTRIBUIÇÃO DO NÚMERO TOTAL DE AMOSTRA E NÚMERO DE

AMOSTRAS RESISTENTES PELO MÉTODO DE DIFUSÃO EM ÁGAR POR FAIXA ETÁRIA EM AMOSTRAS MASCULINAS

AMOSTRAS FEMININAS

0

10

20

30

40

50

60

70

0-6 m 7 m - 9 10-19 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

TOTAL RESISTENTES

Nº

tota

l de

amos

tras

Nº

de a

mos

tras

res

iste

ntes


AMOSTRAS MASCULINAS

0

2

4

6

8

10

12

14

0-6 m 7 m - 9 10-19 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

TOTAL RESISTENTES

Nº

tota

l dea

mos

tras

Nº

de a

mos

tras

res

iste

ntes


54

5.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM)

Das 385 amostras de E. coli testadas, 53 apresentaram resistência no

mínimo a uma quinolona testada pela técnica de ágar-diluição, equivalente a 13,8%

de resistência geral às quinolonas.

Ciprofloxacina e gatifloxacina apresentaram as menores concentrações

capazes de inibir a maioria (cerca de 86%) dos isolados, com diferença de 1 a 2

diluições entre ambas (≤ 0,03 µg/mL e 0,06-0,12 µg/mL), respectivamente.

Norfloxacina apresentou uma diluição maior que a da gatifloxacina para inibir 87,5%

dos isolados. Para nitrofurantoína, cerca de 95% das amostras de E. coli foram

inibidas com uma CIM de 32 µg/mL. Devido ao fato do Sulfametoxazol/Trimetoprim

ter um percentual de resistência elevado, somente 47,7% dos isolados de E. coli

foram inibidos com a maior concentração abaixo do ponto de corte. Esses dados

podem ser observados na Tabela 13.

55

TABELA 13 – DISTRIBUIÇÃO DOS ISOLADOS E PERCENTUAL CUMULATIVO POR CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA PELO MÉTODO DE ÁGAR-DILUIÇÃO

ÁCIDO NALIDÍXICO

CIM (µµg/mL) ≤≤1 2 4 8 16 32 64 128 256 ≥≥512

N

%

8

(2,1)

223

(60)

99

(85,7)

2

(86,2)

3

(87)

1

(87,3)

4

(88,3)

2

(88,8)

5

(90,1)

38

(100)

NORFLOXACINA

CIM (µµg/mL) ≤≤0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 ≥≥256

N

(%)

3

(0,8)

188

(49,6)

130

(83,4)

16

(87,5)

7

(89,3)

5

(90,6)

1

(90,9)

1

(91,2)

2

(91,7)

2

(92,2)

6

(93,8)

10

(96,4)

7

(98,2)

7

(100)

CIPROFLOXACINA

CIM (µµg/mL) ≤≤0,015 0,03 0,06 0,12 0,25 2 4 8 16 32 ≥≥64

N

%

248

(64,4)

83

(86)

5

(87,3)

12

(90,4)

3

(91,2)

1

(91,4)

1

(91,7)

3

(92,5)

6

(94)

13

(97,4)

10

(100)

GATIFLOXACINA

CIM (µµg/mL) ≤≤0,015 0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 4 8 16 32 ≥≥64

N

%

7

(1,8)

178

(48)

126

(80,7)

22

(86,4)

8

(88,5)

8

(90,6)

2

(91,1)

3

(91,9)

12

(95)

6

(96,6)

9

(98,9)

4

(100)

NITROFURANTOÍNA

CIM (µµg/Ml) ≤≤4 8 16 32 64 128 ≥≥256

N

%

3

(0,8)

5

(2,1)

187

(50,7)

169

(94,6)

14

(98,2)

5

(99,5)

2

(100)

SULFAMETOXAZOL/TRIMETOPRIM

CIM (µµg/mL) ≤≤0,6/0,03 1,2/0,06 2,4/0,12 4,7/0,25 9,5/0,5 19/1 38/2 76/4 ≥≥304/16

N

%

8

(2,1)

57

(16,9)

100

(42,9)

17

(47,3)

6

(48,8)

5

(50,1)

3

(50,9)

3

(51,7)

186

(100)

56

No que se refere à potência, ciprofloxacina foi a quinolona que mais se

destacou com CIM50 ≤ 0,015 µg/mL para os 385 isolados de E. coli testados

(Tabela 14). Contudo, o percentual de inibição de crescimento bacteriano foi igual

ao da norfloxacina (91,4%) e um pouco menor que o da gatifloxacina (92,7%). O

ácido nalidíxico apresentou os piores índices em relação à potência (CIM50 de 2

µg/mL) e à sensibilidade (86,2%).

Além das quinolonas, foi determinada a CIM da nitrofurantoína e do

sulfametoxazol/trimetoprim (SUT). A nitrofurantoína mostrou boa atividade, inibindo

o crescimento bacteriano de 94,6 % das amostras; já a taxa de sensibilidade para o

SUT foi muito baixa (53,2 %). Ambas não apresentaram potência tão boa quanto à

das quinolonas, CIM50 de 16 µg/mL e CIM50 de 9,5/0,5 µg/mL, respectivamente.

Para avaliar se havia diferença na sensibilidade ao SUT e à NIT entre

amostras de E. coli resistentes e sensíveis às quinolonas, foi realizada uma análise

separada desses grupos. Nas amostras sensíveis às quinolonas (n: 332), a

sensibilidade à nitrofurantoína aumentou para 98,5 % e, nas resistentes (n: 53), ela

caiu para 72 %. Sulfametoxazol/trimetoprim foi sensível em 51,2 % das amostras

sensíveis e em 43,4 % das resistentes às quinolonas (Tabelas 14 e 15).

TABELA 14 – POTÊNCIA E ATIVIDADE DOS ANTIMICROBIANOS TESTADOS PELO MÉTODO DE ÁGAR-DILUIÇÃO EM 385 AMOSTRAS E. coli

ANTIMICROBIANO CIM50 µg/mL

CIM90 µg/mL

%

Sensibilidade

Ácido nalidíxico 2 256 86,2

Norfloxacina 0,12 1 91,4

Ciprofloxacina ≤0,015 0,12 91,4

Gatifloxacina 0,06 0,5 92,7

Nitrofurantoína 16 32 94,6

Sulfametoxazol/Trimetoprim 9,5/0,5 ≥ 304/16 53,2

57

TABELA 15 – PERCENTUAL DE SENSIBILIDADE À NITROFURANTOÍNA E AO SULFAMETOXAZOL/TRIMETOPRIM EM AMOSTRAS SENSÍVEIS E RESISTENTES ÀS QUINOLONAS

QUINOLONAS ANTIMICROBIANO

Sensíveis (n: 332) Resistentes (n: 53)

NITROFURANTOÍNA 98,5 % 72 %

SULFAMETOXAZOL/TRIMETOPRIM 51,2 % 43,4 %

Das 385 amostras de E. coli testadas, 53 amostras apresentaram resistência

no mínimo a uma quinolona testada pela técnica de ágar-diluição. Com base nesses

resultados, as amostras de E. coli foram divididas em três grupos: grupo 1

compreende as amostras (n: 332) sensíveis às 4 quinolonas testadas; grupo 2

representa as amostras (n: 19) resistentes ao ácido nalidíxico e sensíveis às demais

quinolonas; no grupo 3 estão as amostras (n: 34) resistentes a todas as quinolonas

testadas.

Os resultados dos métodos de difusão em ágar (DD) e diluição em ágar (AD)

das quinolonas testadas foram comparados por meio do teste de acurácia. Os

dados foram plotados num gráfico, onde, no eixo das abscissas (X), encontram-se

os diâmetros dos halos de inibição do fármaco fornecidos pelo DD e, no eixo das

ordenadas (Y), as CIMs, determinadas por AD, considerado o método de referência

(Figura 16). As discrepâncias entre os dois métodos foram classificadas em erros do

tipo alfa, falsa resistência; e erros do tipo beta, falsa sensibilidade (JEKEL, 1999).

Erros do tipo alfa (falsa resistência) não ocorreram em nenhuma amostra. Os erros

do tipo beta (falsa sensibilidade) ocorreram em 3 casos das 385 amostras de E. coli

avaliadas, 1 caso com NAL, 1 com NOR e 1 envolvendo a GTF. Essas quinolonas

também apresenteram discrepâncias na categoria Intermediário. No entanto, esses

resultados não interferiram na avaliação da sensibilidade e especificidade pois a

categoria “intermediário” foi incluída no grupo dos resistentes. Ciprofloxacina foi a

única quinolona testada que não apresentou nehuma discrepância entre os dois

métodos.

A correlação entre os dois métodos para as quinolonas é a que segue e os

valores de Sensibilidade (S), Especificidade (E), Valor preditivo positivo e negativo

58

(VPP e VPN) e Taxa de erros do tipo alfa e beta estão na tabela 16 . Para o NAL,

das 333 amostras sensíveis pelo DD, 332 apresentaram CIM ≤ 8 µg/mL (sensíveis)

pelo método de ágar diluição e uma amostra apresentou CIM de 16 µg/mL

(intermediário). Das 3 amostras intermediárias pelo método de DD, 1 foi classificada

como intermediária (CIM = 16 µg/mL) e 2 como resistentes (CIMs de 32 e 64

µg/mL). Todas as amostras resistentes ao NAL apresentaram CIMs ≥ 64 µg/mL,

com exceção de 1 amostra que apresentou CIM de 16 µg/mL (intermediário).

Duas amostras foram classificadas como intermediárias para NOR pelo DD, a

determinação da CIM revelou uma amostra intermediária (CIM de 8 µg/mL) e outra

resistente (CIM de 16 µg/mL). O resultado da GTF demonstrou 5 amostras

intermediárias no DD, 4 delas apresentaram CIM de 8 µg/mL (resistente) e 1 com

CIM de 4 µg/mL (intermediário). Entre as amostras sensíveis pelo DD, 1 foi

classificada na categoria intermediário (CIM de 4 µg/m) no método de diluição em

ágar.

TABELA 16 – RESULTADO DO TESTE DE ACURÁCIA ENTRE OS MÉTODOS DE

DIFUSÃO E DILUIÇÃO EM ÁGAR PARA OS 385 ISOLADOS DE E. coli.

QUINOLON

A

S

(%)

E

(%)

VPP

(%)

VPN

(%)

ERRO

ALFA (%)

ERRO

BETA (%)

NAL 98,7 100 100 99,7 0 1,9

NOR 97 100 100 99,7 0 2,9

CIP 100 100 100 100 0 0

GTF 97 100 100 99,7 0 3,0

LEGENDA: Sensibilidade (S), Especificidade (E), Valor preditivo positivo (VPP) e Valor

preditivo negativo (VPN), ácido nalidíxico (NAL), norfloxacina (NOR), ciprofloxacina (CIP) e

gatifloxacina (GTF).

O poder discriminatório do ácido nalidíxico em detectar resistência a outras

quinolonas, por meio do método de ágar difusão, foi avaliado (Figura 17). Todas as

333 amostras com halo de inibição ≥ 19 mm para o NAL (amostras sensíveis) eram

também sensíveis a NOR, CIP e GTF. As 49 amostras resistentes ao ácido

nalidíxico foram classificadas pelo método de ágar-diluição em três categorias (R, S

59

e I) para as fluorquinolonas: Resistentes (NOR: 32 A, CIP: 33 A e GTF: 31 A);

Sensíveis (NOR: 15 A, CIP: 15 A e GTF: 16 A) e duas amostras com resultado

intermediário para NOR e GTF e uma para CIP. Em relação à categoria

intermediário, as 3 amostras com este resultado para o NAL foram classificadas

como sensíveis a NOR, CIP e GTF. A sensibilidade e a especificidade do disco de

ácido nalidíxico (30µg), no método de difusão em ágar, em detectar resistência à

NOR, CIP e GTF foi de 100% e 95% respectivamente. O valor preditivo negativo

(VPN) foi de 100% para as três quinolonas citadas, já o valor preditivo positivo (VPP)

foi de 65,4% para NOR e CIP; e de 63,5% para GTF.

As amostras resistentes ou intermediárias ao NAL e sensíveis às outras

quinolonas testadas apresentaram elevação da CIM em 2 ou mais diluições. Por

exemplo, quando as amostras eram sensíveis à CIP e ao NAL, 99% delas

apresentaram CIM entre 0,015 e 0,03; no entanto, quando sensíveis à CIP e

resistentes ao NAL (n:15), 13 amostras apresentaram CIMs entre 0,12 e 0,25 µg/mL.

O mesmo foi observado para a GTF e a NOR, 94% das amostras sensíveis à GTF e

ao ácido nalidíxico apresentaram CIMs entre 0,03 e 0,06. Quando as amostras

apresentavam resistência ao NAL e sensibilidade à GTF, as CIMs ficaram acima de

0,25 µg/mL. Para NOR e NAL sensíveis, 96% das amostras apresentam CIMs entre

0,06 e 0,12 µg/mL e, quando NAL resistente, as CIMs situam-se entre 0,25 e 0,5

µg/mL.

60

FIGURA 16 - COMPARAÇÃO DO HALO DE INIBIÇÃO EM mm (DD) COM A CIM EM µg/mL (AD) DAS QUINOLONAS TESTADAS

61

FIGURA 17 - COMPARAÇÃO DO HALO DE INIBIÇÃO EM mm (DD) DO ÁCIDO NALIDÍXICOCOM A CIM EM µg/mL (AD) DA NORFLOXACINA, CIPROFLOXACINA E GATIFLOXACINA NAS 385 AMOSTRAS ESTUDADAS.

62

Para se observar a variação na CIM da ciprofloxacina, os três grupos de

amostras (1: sensíveis a todas as quinolonas, 2: resistência somente ao ácido

nalidíxico, 3: resistente a todas quinolonas) foram distribuídos conforme o gênero e

a CIM para ciprofloxacina. Os dados foram avaliados estatisticamente com o teste

do Qui-quadrado (χ2).

A freqüência dos grupos 1, 2 e 3 não se distribui nos gêneros de forma

independente. As maiores contribuições para o valor de χ2 são as classes: homens

no grupo 3 e mulheres no grupo 3. No gênero masculino apareceram bem mais

indivíduos no grupo 3 do que se esperaria se essa distribuição fosse independente.

Ocorreu o mesmo com as mulheres, porém no sentido inverso, apareceram menos

indivíduos no grupo 3 do que se esperava.

Na Tabela 17 podemos observar que as amostras do grupo 1 (quinolonas

sensíveis) apresentaram CIM para ciprofloxacina ≤ 0,03 µg/mL, com exceção de 2

amostras, uma com CIM de 0,06 µg/mL e a outra com CIM de 0,012 µg/mL (ambas

maculinas), e as amostras do grupo 3 (quinolonas resistentes) apresentaram CIM >

que 4 µg/mL. Esses resultados eram esperarados uma vez que essa amostras são,

respectivamente, sensíveis e resistentes à Ciprofloxacina. No entanto, no grupo 2

(NAL resistente e demais quinolonas sensíveis), apesar de sensíveis à

Ciprofloxacina, houve uma significativa elevação da CIM para concentrações acima

de 0,06 µg/mL. Esse evento foi mais freqüente do que o esperado no grupo 2, numa

distribuição independente (ρ< 0,0005).

63

TABELA 17 - DISTRIBUIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA POR AD DA CIPROFLOXACINA DOS 385 ISOLADOS DE E. coli

5.4 PESQUISA DE MUTAÇÕES NOS GENES gyrA e parC

A caracterização genética do principal mecanismo de resistência às

quinolonas em E. coli, foi realizada em 10 das 53 amostras resistentes ao ácido

nalidíxico e duas amostras sensíveis às quatros quinolonas testadas. A escolha das

amostras foi baseada nos grupos 1, 2 e 3 com diferentes CIMs para NAL e

ciprofloxacina. Foram selecionadas 2 amostras do grupo do grupo 1 (quinolonas

sensíveis); 5 amostras do grupo 2 (NAL resistente e demais quinolonas sensíveis) e

5 amostras do 3 (quinolonas resistentes).

5.4.1 Amplificação das QRDRs dos genes gyrA e parC

As bandas observadas na detecção dos produtos da PCR apresentaram

tamanhos correspondentes aos fragmentos esperados, 313 pares de base para

gyrA e 253 pares de base para parC (Figura 18).

0,015 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128

1 218 72 - - - - - - - - - - - - 290F 2 - 2 3 9 3 - - - - - - - - - 17

3 - - - - - - - - 1 3 2 7 3 4 20327

M 1 30 9 2 1 - - - - - - - - - - 422 - - - 2 - - - - - - - - - - 23 - - - - - - - 1 - - 4 6 1 2 14

58TOTAL 385

GRUPOS

CIM: Concentração inibitória mínima

LEGENDA:

2: Amostras resistentes somente ao ácido nalidíxico1: Amostras sensíveis

F: FemininoM: Masculino

TOTALGRUPOCIM (µg/ml) DA CIPROFLOXACINA

GÊNERO

3: Amostras resistentes às 4 quinolonas testadas

FIGURA 18 – PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO DOS GENES gyrA e parC OBTIDOS DE ISOLADOS CLÍNICOS DE E. coli

LEGENDA: 1 - Marcador de peso molecular 100 pb (gibco-BRL®, Life Technologies) 2G, 3G e 4G – Produto de PCR para o gene gyrA. Amostras 345, 837 e 4557 2P, 3P e 4P – Produto de PCR para o gene parC. Amostras 345, 837 e 4557

313 pb253 pb

100200300400500

1PM

2G345

3G837

4G4557

2P345

3P837

4P4557

313 pb253 pb

100200300400500

1PM

2G345

3G837

4G4557

2P345

3P837

4P4557

100200300400500

1PM

2G345

3G837

4G4557

2P345

3P837

4P4557

65

5.4.2 Sequenciamento da QRDR dos genes gyrA e parC

O resultado da reação de seqüenciamento das 12 amostras selecionadas

pode ser observado na Tabela 18. As duas amostras do grupo 1 (amostras

sensíveis às quinolonas testadas) não apresentaram mutações na QRDR dos

genes estudados. Das 5 amostras resistentes somente ao NAL (grupo 2), 3

apresentaram uma mutação no aminoácido 83 do gene gyrA, uma amostra com

duas mutações, uma no aminoácido 83 do gene gyrA e a outra mutação no

aminoácido 80 do gene parC. Destas 5 amostras, uma não apresentou

mutações. Entre as 5 amostras resistentes às quinolonas (grupo 3), todas

apresentaram três mutações, duas no gene gyrA (aminoácidos 83 e 87) e uma

mutação no aminoácido 80 do gene parC. As mutações detectadas no gene

gyrA foram constantes: na posição 83 o aminoácido serina foi substituído por

leucina e na posição 87, o ácido aspártico foi substituído pela asparagina. Para

o gene parC, 5 amostras com substituição de serina por isoleucina e 1 amostra

com substituição de serina por arginina.

As amostras resistentes ao ácido nalidíxico (grupo 3) com três mutações

(2 no gene gyrA e 1 no gene parC) apresentaram CIMs elevadas para CIP

(tabela 18). Aquelas com somente uma mutação no gene gyrA apresentaram

discreta elevação da CIMs para CIP, ainda ficando, entretanto, dentro da

categoria sensível. A única amostra com duas mutações, uma mutação no gene

gyrA e a outra mutação no aminoácido no gene parC, apresentou discreta

elevação nas CIMs das quinolonas. Nestas amostras a troca no aminoácido 80

do gene parC foi por arginina, diferente das amostras que apresentavam três

mutações. Resultados semelhantes foram encontrados para NOR e GTF.

66

TABELA 18 - LOCALIZAÇÃO E TIPO DE MUTAÇÕES NOS GENES gyrA E parC POR GRUPOs DE AMOSTRAS DE E. coli

MUTAÇÃO

CIM µg/mL gyrA parC

AMOSTRA GRUPO NAL CIP 83 87

Ser Ala Val Tyr Asp 80 Asp Ser Ala

5384 1 1 0,03 ..-.........-...........-........-..........-.. ..-.........-...........-.. 9850 1 1 0,015 ..-.........-...........-........-..........-.. ..-.........-...........-..

837 2 64 0,03 ..-.........-...........-........-..........-.. ..-.........-...........-.. 4633 2 64 0,25 Leu......-..........-..........-..........-.. ..-.........-...........-..

9233 2 64 0,12 Leu......-..........-..........-..........-.. ..-.........-...........-.. 4557 2 >512 0,12 Leu......-..........-..........-..........-.. ..-.........-...........-..

8889 2 >512 0,25 Leu......-..........-..........-..........-.. ..-.......Arg.......-.. 6556 3 >512 8 Leu......-...........-..........-.......Asn ..-.......Ile.......-..

345 3 >512 64 Leu........-...........-........-.......Asn ..-.......Ile.......-.. 6723 3 >512 64 Leu........-...........-........-.......Asn ..-.......Ile.......-..

5850* 3 >512 4 Leu........-...........-........-.......Asn ..-.......Ile.......-.. 6452 3 >512 32 Leu........-...........-........-.......Asn ..-.......Ile.......-..

LEGENDA: GRUPOS

1: Amostras sensíveis 2: Amostras resistentes somente ao ácido nalidíxico 3: Amostras resistentes às 4 quinolonas testadas

CIM: Concentração inibitória mínima NAL: Ácido Nalidíxico CIP: Ciprofloxacina AMINOÁCIDOS: Ala, alanina; Arg, arginina; Asn, asparagina; Asp, ácido aspártico; Ile, isoleucina; Leu, leucina; Lis, lisina; Tyr, tirosina; Val, valina.

67

6. DISCUSSÃO

A infecção do trato urinário (ITU) é uma das doenças infecciosas mais

comuns, sendo menos freqüente apenas do que as infecções respiratórias. Nos

Estados Unidos, as ITUs são responsáveis por 5,2 milhões de consultas

médicas anuais, onde 10% das ITUs representam episódios graves e 80%

requerem exames laboratoriais e tratamento antimicrobiano. O custo estimado

das ITUs em geral, naquele país, ultrapassa 1,5 bilhões de dólares anuais

(STAMM & NORRBY, 2001; KARLOWSKY, 2001).

As enterobactérias são os agentes mais comuns de infecção urinária, e

dentre estas, Escherichia coli é o principal representante nas infecções agudas.

Mesmo em infecções hospitalares, onde estão presentes outros patógenos, este

microrganismo predomina (BISHARA et al.,1997; WINSTANLEY et al, 1997;

VROMEN et al.1999; GALES et al, 2000).

Neste trabalho foram avaliados os isolados de E. coli de urocultura,

coletados por jato médio e com contagem de colônias igual ou superior a 104

UFC/mL, ponto de corte recomendado pela literatura como critério de

diagnóstico microbiológico de ITU. Não foi realizada uma avaliação

epidemiológica porque o objetivo do trabalho foi estudar a resistência de E. coli

às quinolonas utilizadas no trabalho e, por isto, outras bactérias Gram negativas

e bactérias Gram positivas foram excluídas, o que poderia interferir numa

análise epidemiológica fidedigna.

A incidência de ITUs depende da idade e do gênero do paciente. A ITU é

doença que acomete predominantemente as mulheres. A prevalência de

bacteriúria em mulheres aumenta gradualmente com a idade, chegando a 10%

a 20% em mulheres idosas. A associação de ITU com intercurso sexual pode

também contribuir para esta incidência aumentada, porque a atividade sexual

aumenta as chances de contaminação da uretra feminina que, sendo mais

curta, facilita a ascenção da bactéria. A exposição a espermicidas e o uso prévio

de antibióticos são fatores de risco para ITU em mulheres na fase pré-

menopausa. A incidência de bacteriúria também aumenta durante a gravidez,

como resultado de alterações anatômicas e hormonais que favorecem as ITUs

(STAMM & NORRBY, 2001). Para os homens, as ITUs são mais comuns

68

durante o primeiro ano de vida, associadas principalmente às mal-formações

congênitas e após os 60 anos, quando o aumento da incidência de hipertrofia da

próstata interfere com o esvaziamento da bexiga predispondo à ITU (NICOLLE,

2001).

Os dados avaliados no presente estudo em relação ao gênero e idade,

mostraram uma distribuição de amostras semelhantes aos índices de ITU

citados na literatura. Entre os pacientes do gênero masculino, o maior número

de amostras foi encontrado no primeiro ano de vida e acima de 60 anos e o

número de isolados resistentes aumenta com a idade, possivelmente em

decorrência do uso de quinolonas no tratamento de prostatites, onde os

antimicrobianos atingem níveis teciduais menores, entre outras causas. Já entre

as mulheres, o maior número de casos foi encontrado na faixa etária entre os 20

e 45 anos, e justamente neste período observa-se um número menor de

isolados resistentes. explicado em parte pela presença de gestantes neste

grupo onde as quinolonas são contra indicadas. Além disso, outros fatores,

como o uso prévio de antimicrobianos, podem estar envolvidos mas não

puderam ser avaliados.

KARLOWSKY et al. (2002) avaliaram a sensibilidade à Ampicilina e ao

SUT em E. coli isoladas de ITU em mulheres nos Estados Unidos. Neste

trabalho, foram encontrados índices de resistência para ampicilina de 37% e

para SUT de 16,1%, sugerindo que outras terapias deveriam ser consideradas

de acordo com o índice local de resistência a tais drogas.

Os dados retrospectivos do presente estudo revelaram altos índices de

resistência à ampicilina (51,7%) e ao SUT (46,4%). A resistência à ampicilina

pode estar associada à disseminação de genes localizados em plasmídios, que

codificam enzimas que inativam a ampicilina (geralmente β-lactamases do tipo

TEM-1). Resistência ao SUT, por sua vez, é decorrente de alterações nas

enzimas diidrofolato redutase e diidropteroato sintetase, principalmente pela

aquisição de novos genes localizados em plasmídios. Taxas elevadas de

resistência ao SUT (38%-59%) para E. coli têm sido descritas em países da

América Latina (HUOVINEN, 1997).

WINSTANLEY et al., em 1997, avaliaram a suscetibilidade

antimicrobiana de bactérias isoladas do trato urinário num período de 10 anos.

69

No trabalho desses autores, a ampicilina mostrou os piores índices de

sensibilidade para todas as enterobactérias. Esse resultado condiz com os

obtidos no presente trabalho, indicando que esse antibiótico não deve ser

utilizado empiricamente para tratamento de ITU.

Durante os anos 70, as taxas de resistência aos β-lactâmicos em

microrganismos hospitalares já se mostravam elevadas, 30% dos isolados de

Escherichia coli eram resistentes à ampicilina e 20 a 30% dos isolados de

Klebsiella pneumoniae à cefazolina - fato este que estimulou o uso das

cefalosporinas de amplo espectro, tais como a ceftriaxona e a ceftazidima (NEU,

1989).

Em relação às cefalosporinas, os isolados do presente estudo

demonstraram um percentual de resistência à cefazolina de 6,5 % e à

ceftriaxona de 0,26 %. A sensibilidade moderada dos patógenos urinários frente

à cefalotina é preocupante, pois este antibiótico é a droga de primeira escolha

para cistites em gestantes, onde o número de antibióticos permitidos é limitado e

a presença de infecção é frequente. Provavelmente não foram encontrados

altos índices de resistência à ceftriaxona porque a maioria dos isolados eram de

pacientes ambulatoriais.

A boa sensibilidade da gentamicina para E. coli encontrada neste

trabalho (3,7%) não descarta a preocupação com o decréscimo significante na

sensibilidade a estes antimicrobianos em bacilos Gram negativos, por ser uma

opção para o tratamento de infecções do trato urinário, tanto em pacientes

hospitalizados quanto nos medicados em domicílio (WEBER et al., 1997).

GOETTSCH et al. (2000) demonstraram um aumento na resistência de

amoxacilina e SUT nos isolados de Escherichia coli, em infecções no trato

urinário de pacientes ambulatoriais da Holanda. Com o passar dos anos,

fluorquinolonas passaram a ser prescritas mais freqüentemente para o

tratamento dessas infecções, ocasionando um aumento de E. coli resistente a

estes antibióticos, dificultando seu tratamento.

ZHANEL et al. (1998) avaliaram a resistência bacteriana de 2000 isolados

do trato urinário de pacientes ambulatoriais no Canadá. Os dados mostraram

que a nitrofurantoína e a ciprofloxacina foram mais eficientes que SUT e

amoxacilina na terapia empírica dessas infecções.

70

A resistência antimicrobiana de bactérias Gram negativas, isoladas em

urina de pacientes ambulatoriais entre 1983 e 1997, foi analisada por VROMEN

et al (1999). Durante o período de estudo, a sensibilidade de E. coli ao SUT

diminuiu de 79% para 62%, aumentou para a nitrofurantoína de 79% para 91%

e permaneceu estavelmente baixa para a amoxacilina (41%). Neste mesmo

trabalho, os autores demostraram que a sensibilidade para a norfloxacina,

avaliada a partir de 1990, diminuiu de 87% para 71%. Acredita-se que a

prescrição empírica deste antimicrobiano foi a responsável por esta mudança na

sensibilidade. Este decréscimo observado na sensibilidade da norfloxacina é

preocupante. Durante o período de tempo relativamente curto em que tais casos

foram avaliados, houve um aumento na resistência destes antibióticos em torno

de 25%.

Em outro trabalho em um hospital universitário de Paris, entre 1992 e

1998, ROBERT et al (2001) também constataram uma redução na sensibilidade

da E. coli para fluorquinolonas (pefloxacin, de 95 para 90%; ciprofloxacin, de 99

para 95%).

Pesquisadores estudaram, num hospital de Valencia, 218 casos de cistite

aguda em mulheres entre março e novembro de 2000. O elevado índice de

isolados de E. coli resistentes às quinolonas mostrou-se persistente (18,4% para

ciprofloxacina; 19,6% para norfloxacina e 22,3% para o ácido pipemídico).

Excelente sensibilidade foi observada para amoxacilina-clavulanato e

aminoglicosídeos. Para a ampicilina e o SUT, a resistência também foi alta,

respectivamente, 54,7% e 35,8%. A nitrofurantoína apresentou baixos índices

(3,3%) de resistência (QUEIPO et al., 2001).

KAPOOR e AGGARWAL, em 1997, encontraram taxas ainda mais altas

de resistência para as quinolonas em ITUs nosocomiais em Nova Delhi, cerca

de 62% das amostras eram resistentes ao ácido nalidíxico, 52% à norfloxacina e

51% à ciprofloxacina.

No Brasil, um estudo com bactérias isoladas do trato urinário revelou que

houve, com o passar dos anos, um aumento gradativo na resistência às

quinolonas, entretanto as taxas foram bem menores: 9,1% para a norfloxacina e

para a ciprofloxacina e 16,5% para o ácido nalidíxico (LOPES et al., 1998).

71

No presente trabalho, das 385 amostras de E. coli testadas pelo método

de difusão em ágar, 52 amostras foram classificadas como resistentes a pelo

menos uma quinolona testada. É importante ressaltar que dentre estas 52

amostras, 15 amostras foram classificadas como resistentes e 3 como

intermediárias ao ácido nalidíxico, permanecendo sensíveis às demais

quinolonas. Houve ainda variação no fenótipo de resistência por este método

para 8 amostras, sete envolvendo resultados intermediários, que é a categoria

que oferece mais resultados de difícil interpretação (M2-A7, NCCLS, 2000).

Ácido nalidíxico foi a quinolona com maior percentual de isolados resistentes

(13,5%), seguido da ciprofloxacina (8,8%), norfloxacina (8,6%) e da gatifloxacina

(8,0%).

A variação nas taxas de sensibilidade das diferentes quinolonas pode ser

explicada pelo mecanismo de resistência, onde o nível de resistência depende

da enzima-alvo afetada e do número de mutações acumuladas. Além disso, há

uma relação entre o nível de resistência a potência específica de cada fármaco,

principalmente para as quinolonas mais novas (SANDERS, 2001).

No presente estudo, os resultados da determinação da CIM dos

antimicrobianos testados confirmaram que as quinolonas são fármacos

potentes, pois mesmo as mais antigas, como o NAL, exibiram CIM50 ≤ 2,0

µg/mL. Valores bem menores que os encotrados para SUT (CIM50 9,5/0,5

µg/mL) e para a nitrofurantoína (CIM50 16 µg/mL). Entre as quinolonas testadas,

esperava-se que a potência e a atividade fossem maiores entre as quinolonas

mais novas. Porém, apesar das modificações estruturais presentes na

gatifloxacina (GTF), que conferem maior afinidade com os dois alvos (DNA

girase e topoisomerase IV), a ciprofloxacina (CIP) apresentou os melhores

resultados com CIM50 ≤ 0,015 µg/mL e CIM90 de 0,12 µg/mL. Gatifloxacina

apresentou CIM50 ≤ 0,06 µg/mL e CIM90 de 0,5 µg/mL.

Apesar das diferenças de potência entre as quinolonas, o índice de

sensibilidade foi praticamente o mesmo para as fluorquinolonas (NOR, CIP e

GTF), sendo discretamente mais alto para GTF. O mecanismo de resistência

cruzada entre as quinolonas poderia explicar índices de sensibilidade

semelhantes para fármacos com diferentes potências da mesma classe, já que

72

um evento mutacional confere elevação na CIM, em 4 a 8 vezes, conferindo alto

nível de resistência para as quinolonas mais antigas (menos potentes), como o

NAL, e baixo nível de resistência às fluorquinolonas, percebido apenas pela

elevação da CIM. A ocorrência de uma amostra sensível somente à

gatifloxacina poderia ser explicado pelo fato dessa quinolona interagir nos dois

alvos de ação com a mesma a intensidade, o que, teoricamente, necessitaria de

mais mutações para diminuir a sensibilidade.

Resistência ao SUT tem aumentado em todo o mundo, limitando seu uso

como antibiótico empírico. Desde o final da década de 80 já se observava uma

notável redução na sensibilidade dos uropatógenos a este antimicrobiano. Em

1989, LAMIKANRA & NDEP , relataram uma incidência de resistência de 63,3%.

WINSTANLEY et al. (1997), relataram uma taxa média de resistência das

enterobactérias ao SUT de cerca de 30%. No Brasil, BERDICHEVSKI et al.,

1998, demonstraram que 34,25% desta mesma classe de microrganismos

estavam resistentes a esta droga. Quando avaliados uropatógenos na América

Latina, como realizado pelo programa SENTRY, a freqüência de resistência foi

42,6% (GALES, 2000).

O resultado da determinação da CIM90 para SUT encontrado no presente

trabalho foi elevada (≥ 304/16 µg/mL), com percentual de resistência de 46,8%

pelo método de ágar diluição, número muito próximo daquele obtido pelo

sistema automatizado (46,4%). Tais dados são semelhantes aos reportados em

outros trabalhos. No Brasil, a alta incidência de resistência pode estar associada

ao alto consumo deste fármaco, que é distribuído gratuitamente nas unidades

de saúde.

O resultado dos seis antimicrobianos, testados no presente trabalho pelo

método de diluição em ágar, demonstrou que a nitrofurantoína foi o antibiótico

com a menor taxa de resistência entre os isolados E. coli, com

aproximadamente 95% de sensibilidade. Felizmente, a presença de múltiplos

mecanismos de ação têm evitado o surgimento de E. coli resistentes a este

fármaco. Nitrofurantoína é uma alternativa para tratamento das infecções

urinárias não complicadas, mas o estreito espectro de atividade e a baixa

distribuição tecidual limitam seu uso em casos complicados de ITU (McCUE,

1997; ZOLER, 1999; KARLOWISKY et al., 2002).

73

Quando se comparam as duas metodologias (diluição em ágar e difusão

em ágar) para as quinolonas testadas, observa-se uma boa relação entre os

dois métodos, sensibilidade entre 97%-98% e especificidade de 100%. Os

resultados discrepantes estavam relacionados à categoria intermediária,

principalmente para o ácido nalidíxico e gatifloxacina. Segundo o NCCLS,

documento M2–A7 (2000), essa categoria inclui uma zona tampão para

prevenção de eventuais fatores técnicos não controlados, causadores das

maiores discrepâncias na interpretação. Isso poderia justificar os resultados

discrepantes para NAL e GTF, já que, devido à baixa difusão no ágar do NAL,

este é correntemente usado na forma sódica. Para GTF, foi usada uma

apresentação diferente da recomendada pela literatura em função da ausência

comercial do produto no momento da realização do trabalho. Contudo, os

resultados da cepa controle mantiveram-se nos limites confiáveis.

O NAL foi utilizado neste trabalho com intuito de verificar a possibilidade

de sua aplicabilidade como indicador de resistência às fluorquinolonas em E.

coli, uma vez que a determinação da CIM não é amplamente difundida nas

rotinas de laboratórios, devido ao seu custo elevado e por ser técnica

trabalhosa.

As 333 amostras sensíveis ao NAL (DD) eram também sensíveis às

outras quinolonas testadas pelo método de referência (AD). As amostras

resistentes ao NAL (49 A) apresentaram resultados variados em relação às

categorias S, R e I no método de AD, valor preditivo positivo em torno de 65%.

Constatou-se que algumas dessas amostras apresentam sensibilidade às

demais quinolonas, porém com elevação nas CIMs para as mesmas. Este

fenômeno poderia ser explicado pelo principal mecanismo de resistência, que

depende do número de mutações acumuladas. Outros mecanismos de

resistência como bombas de efluxo e mutações em genes secundários (gyrB e

parE) podem estar envolvidos, mas, infelizmente, não puderam ser avaliados

em função dos custos envolvidos e do tempo necessário para mais análises.

É interessante notar que o número de amostras resistentes ao NAL e

sensíveis às fluorquinolonas foi maior entre as mulheres. Entre os homens, a

quantidade de amostras totalmente resistentes às quinolonas foi mais freqüente

(Tabela 17), talvez pela associação entre ITU e prostatite, onde as quinolonas

74

são bastante utilizadas apesar dos níveis teciduais serem inferiores aos obtidos

no trato urinário, o que facilita a seleção de mutantes resistentes. Em crianças

do gênero masculino, alterações funcionais e anatômicas poderiam favorecer a

permanência do microorganismo no sítio de infecção, propiciando a seleção de

mutantes com alto nível de resistência.

Mutações nos genes que codificam para topoisomerase IV relacionam-se

com a diminuição da sensibilidade às quinolonas. Esta enzima é considerada o

alvo secundário das quinolonas em E. coli, fato referidos em diversos trabalhos

científicos, nos quais se observou que a topoisomerase IV da cepa selvagem

não é dominante sobre o alelo resistente e a sua inibição, que é primariamente

bacteriostática, leva a uma lenta parada na replicação. Mutações podem ocorrer

nos genes parC e parE. Mutações em parC ocorrem geralmente nas posições

78, 80 e 84, com substituição de glicina por aspartato, serina por arginina ou

isoleucina e glicina por aspartato, respectivamente. Em parE, as mutações com

troca de aminoácidos não são comuns, mas já foi detectada a troca de leucina

por histidina na posição 445 (BROWN & AMYES, 1998).

Patógenos clínicos com diminuição na sensibilidade às quinolonas têm

comumente alterações no gene gyrA que codifica para a subunidade GyrA da

enzima DNA girase. Mutações pontuais que se correlacionam com a

sensibilidade diminuída às quinolonas têm sido localizadas numa região

chamada “Quinolone Resistance Determining Region” (QRDR). Em E. coli,

incluem os aminoácidos 67-106 (codificados pelos nucleotídeos 201-320). Este

é principal mecanismo em enterobactérias. Mutações no gene gyrB de bactérias

com diminuída sensibilidade às quinolonas têm sido relatadas, porém com

menor importância.

No presente trabalho, para verificar a associação entre o mecanismo

genético de resistência e fenótipo das bactérias estudadas, 10 amostras de E.

coli resistentes e 2 amostras sensíveis às quinolonas foram submetidas à

amplificação e seqüenciamento das QRDRs dos genes gyrA e parC (Tabela 17).

O grupo das amostras resistentes era composto de 5 amostras resistentes

somente ao NAL (grupo 2), com CIMs para CIP variando entre 0,03 e 0,25

µg/mL, e 5 amostras resistentes a todas as quinolonas (grupo 3), com CIMs

75

para CIP variando entre 4 e ≥ 64 µg/mL, à exceção de 1 que era sensível à

gatifloxacina.

Dentre as cinco amostras de E. coli do grupo 2, uma amostra com CIM

para CIP de 0,03 µg/mL não apresentou nenhuma mutação e quatro amostras

com CIM para CIP ≥ 0,12 µg/mL apresentaram mutações nos genes gyrA e

parC. Dessas quatro amostras, 3 apresentaram uma única mutação no gene

gyrA na posição 83 (Ser → Leu) e uma amostra apresentou 2 mutações, uma

mutação em gyrA na posição 83 (Ser → Leu) e outra em parC na posição 80

(Ser → Arg). Mutação única em gyrA determina um baixo nível de resistência às

fluorquinolonas, que não é observado no método de difusão em ágar, mas pode

ser observado pelo método de diluição em ágar pela elevação na CIM da CIP

acima de 0,12 µg/mL. A única amostra desse grupo que não apresentou

mutação também não apresentou elevação na CIM para CIP, possivelmente

outros fatores estão envolvidos como mutações em outras regiões dos genes

estudados ou em outros genes.

A despeito de a ciprofloxacina requerer duas ou mais mutações no

principal alvo para expressar alto nível de resistência às fluorquinolonas,

quinolonas mais antigas, como o ácido nalidíxico, são capazes de expressar alto

nível com apenas uma mutação e, a exemplo de outros trabalhos realizados

com E. coli e Salmonella, este antimicrobiano pode ser usado como marcador

de resistência às fluorquinolonas pelo método de difusão em ágar (AGUIAR et

al., 1992; ENA et al., 1998; HAKANEN et al, 1999; GALES et al., 2000).

As amostras do grupo 3 apresentaram três mutações, duas no gene gyrA

e uma em parC, confirmando a necessidade de mutações múltiplas para a

expressão de alto nível de resistência às quinolonas. Duas mutações no alvo

principal estão associadas a alto nível de resistência, fato observado nas nossas

amostras seqüenciadas. As cinco amostras com resistência à CIP apresentaram

três mutações, duas em gyrA e uma em parC. Em gyrA, ocorreu uma troca de

aminoácidos na posição 83 (Ser → Leu) e na posição 87 (Asp → Asn). Em

parC, a troca de aminoácido ocorreu na posição 80 (Ser → Ile). A única amostra

resistente ao NAL e sensível à CIP (CIM de 0,25 µg/mL), apresentou duas

mutações, uma em gyrA na posição 83 (Ser → Leu) e outra em parC na posição

76

80 (Ser → Arg), fato observado por outros autores e que demonstraram a

necessidade do acúmulo de mutações no principal gene de resistência para a

quinolona.

EVERETT et al. (1996) estudaram os mecanismos individuais de

resistência às fluorquinolonas em isolados veterinários e humanos de E. coli,

com CIMs para CIP variando entre 2 e 128 µg/mL. Os 36 isolados continham

mutação em gyrA (troca de serina por leucina no códon 83) e 26 isolados

também apresentavam uma mutação no códon 87, com troca de aspartato por

asparagina em 14 amostras, por tirosina em 6 amostras, por glicina em 5

amostras e por histidina em 1. Vinte e quatro isolados apresentaram uma única

mutação em parC no códon 80, a troca da serina por isoleucina ocorreu em 17 A

e por arginina em 2. Em três amostras a mutação ocorreu no códon 84 com

troca do ácido glutâmico por lisina. Nenhuma mutação foi encontrada nos genes

gyrB e parE. Este trabalho demonstra que o alto índice de resistência dos

isolados em E. coli envolve a aquisição de múltiplas mutações em gyrA. As

mutações em gyrB e parE são menos freqüentes.

VILA et al (1994) pesquisaram mutações na QRDR nos genes gyrA e

gyrB de 27 isolados clínicos de E. coli. A CIM para CIP variou entre 0,007 e 128

µg/mL e de 2 a 2000 µg/mL para o NAL. Os 15 isolados com CIM para CIP ≥ 1

µg/mL mostraram mudança da serina 83 por leucina. Nos 11 isolados clínicos

com CIMs ≥ 8 µg/mL para CIP foi encontrada uma dupla mutação, em serina 83

e aspartato 87 na subunidade A da DNA girase. Todos os isolados com CIM ≥

128 µg/mL para o NAL mostraram uma mutação em gyrA no códon 83 que

acarretou troca da serina por leucina. Somente em um dos 27 isolados clínicos

manifestou-se a troca do aminácido lisina por ácido glutâmico no códon 447 na

subunidade B da DNA girase, demonstrando a predominância dos mutantes

gyrA sobre gyrB. O autor observou ainda que uma mutação na serina 83 é

suficiente para gerar alto nível de resistência ao NAL, enquanto uma segunda

mutação, geralmente em asparagina 87 na subunidade A da DNA girase, ocupa

um papel complementar no desenvolvimento de cepas com alto nível de

resistência à CIP.

77

Na Alemanha, LEHN et al. (1996) relataram 19 amostras E. coli

resistentes às fluorquinolonas. Todas apresentaram uma mutação no

aminoácido 83 do gene gyrA, o que levou à substituição de serina por leucina.

Dezoito amostras tinham também uma mutação no aminoácido 87, em 16

amostras houve substituição de aspartato por asparagina e em 2 amostras a

troca foi de aspartato por glicina.

O encontro de mutações simples no gene gyrA das amostras sensíveis à

ciprofloxacina é preocupante, pois a seleção de mutantes adicionais poderia ser

favorecida com a presença das fluorquinolonas. Geralmente, os laboratórios de

microbiologia utilizam a técnica de difusão em ágar para predizer a sensibilidade

aos antimicrobianos. Como esta técnica não fornece a CIM, não é possível

observar a elevação da CIM para ciprofloxacina apresentadas por estas

amostras com mutações simples. Sugere-se que os laboratórios testem o ácido

nalidíxico como um marcador para avaliar a presença de mutações simples no

gene gyrA, já que a resistência às quinolonas resulta principalmente das

mutações seqüenciais e acumulativas. Assim, caso o clínico optasse pelo

tratamento com quinolonas, a presença de mutações adicionais poderia ser

observada e correlacionada ou não à falência terapêutica (ROBERT, 2001).

Considerando a freqüência da infecção urinária e a grande diferença no

perfil de sensibilidade das bactérias nos diversos locais onde foram estudadas,

torna-se necessário o conhecimento local da prevalência e do padrão de

resistência antimicrobiana. A freqüente observação do comportamento

bacteriano frente aos antimicrobianos ajuda não somente a prever o futuro da

resistência bacteriana, mas também contribui para a instituição de uma

terapêutica adequada.

Em relação às quinolonas, o presente estudo alerta para o aumento

específico da resistência a esses fármacos e sugere que o ácido nalidixico seja

usado como marcador de resistência às fluorquinolonas em E. coli.

78

7 CONCLUSÕES

I. A taxa de resistência geral às quinolonas nas amostras avaliadas neste

estudo foi de 13,8 %.

II. A comparação entre os métodos de difusão e diluição em ágar mostrou

uma boa relação para as quinolonas testadas, sensibilidade entre 97%-

98% e especificidade de 100% .

III. O ácido nalidíxico revelou-se um bom marcador preditivo da sensibilidade

às fluorquinolonas em E. coli no teste de difusão em ágar:

- As 333 amostras sensíveis ao ácido nalidíxico eram também

sensíveis à norfloxacina, ciprofloxacina e gatifloxacina

testadas pelo método de referência.

- As 53 amostras resistentes ao ácido nalidíxico eram

classificadas como resistente, sensível ou intermediário às

fluorquinolonas pelo método de referência. Nas amostras com

resistência somente ao ácido nalidíxico houve uma

significativa elevação na CIM da ciprofloxacina.

A sensibilidade desse método de triagem foi de 100% e especificidade de

95%. Tais resultados nos permitem sugerir que o ácido nalidíxico pode ser

empregado como marcador de resistência às quinolonas, no antibiograma

pelo método de difusão em ágar, na rotina laboratorial.

IV. O sequenciamento de algumas amostras evidenciou que a presença de

mutação única está relacionada com resistência ao ácido nalidíxico e

elevação da CIM para as fluorquinolonas.

V. Nas amostras de E. coli resistentes a todas as quinolonas, a presença de

três mutações, duas no alvo principal e uma no alvo secundário,

confirmou a correlação entre múltiplas mutações e a expressão de alto

nível de resistência.

79

VI. O número de isolados de E. coli com alto nível de resistência foi mais

freqüente entre os homens, na população estudada.

VII. Confirmou-se o elevado percentual de E. coli resistente ao

sulfametoxazol/trimetoprim (46,8%).

VIII. A nitrofurantoína apresentou um bom percentual de sensibilidade (94,6%)

dentre as 385 amosras de E. coli anlisadas. Quando consideradas

apenas as amostras resistentes às quinolonas, este percentual caiu para

72,0%.

80

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