A base da espectrometria de massas - UEL Portal · Mass spectra and isotopes The Nobel Prize in...

A base da espectrometria de massas

JJ Thomson's 'Plum Pudding Model' of the atom, a sphereof positive charge containing electrons

The father of MS and the first massspectrometrist to win the Nobel Prize.

Pure species and mixtures

Mass spectra and isotopes

The Nobel Prize in Chemistry 1922"for his discovery, by means of his mass spectrograph, of isotopes, in a largenumber of non-radioactive elements, and for his enunciation of the whole-number rule"

Francis William AstonAt the end of 1909 he accepted the invitation of Sir J.J.Thomson to work as his assistant at the Cavendish Laboratory, Cambridge, onstudies of positive rays. It was during this period that he obtaineddefinite evidence for the existence of two isotopes of the inert gasneon.

EI : Ionização por elétrons(Dempster e Nier)

• Moléculas neutras, na fase gasosa (dessorçãotérmica), a uma pressão típica de 10-5 torr, são bombardeadas por elétrons, com energia típica de 70 eV. Ocorre principalmente a retirada ou captura de um eléctron formando íons M+. ou M-.. Íons positivos são em geral predominantes (~100 vezes mais). M-. se tornam importantes para moléculas com alta EA.

M + e- (70 eV) → M+. (~ 5 eV) + 2e- (65 eV)

Princípio Geral de EI

M M

e-

+

F2

F4F3

F1

Princípios Gerais

• Processo unimolecular. Os íons formados são rapidamente extraídos da fonte de ionização pelo eletrodo de repulsão("repeller“).

• Íons moleculares são formados com excesso de energia interna e se fragmentam total ou parcialmente.

• EI é bastante popular: produz tanto o íon molecular (massa) como também fragmentos (estrutura); espectros reprodutíveis; bibliotecas de espectros de EI a 70 eV; estável; fácil de operar; alta sensibilidade.

• Aplica-se a moléculas de média e baixa polaridade e baixo peso molecular (~500u), voláteis e termo-estáveis: moléculas orgânicas relativamente pequenas.

Princípios Gerais

• Quando o íon molecular não é observado (devido a dissociação excessiva), é inútil diminuir a energia dos elétrons.

• Uma em cada 103-105 moléculas que entram na fonte de EI éionizada.

• EI ocorre em ~10-16 s. Ocorre sem mudanças nas distâncias internucleares (Frank-Condon).

• Esquema Geral

• A diminuição da energia dos elétrons provoca uma queda brusca nas intensidades absolutas de todos os íons, mas um aumento na intensidade relativa do íon molecular.

Espectros Típicos de EI a 70 eV

2-Hydroxy-1,2-diphenyl-ethanone

(mainlib) 1-Octanol10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

0

50

100

15 18

27

29

37

39

41

45 50

56

62

70

73 77

84

91 97 101 112

OH

(mainlib) 1-Octene10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

0

50

100

14

27

29

31

39

41

43

45

55

59 62

70

72 77

83

91 97

112

(mainlib) 2-Octene10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

0

50

100

15

2729

32

39

41

51

55

67

70

77

83

97

112

Alguns espectros de EI apresentam dissociação excessiva, outros pouca dissociação.

M+. = massa e isótopos

F+ = estrutura

Espectro de Massas: Ionização por Elétrons (EI)

Isômeros C3H6O

M-1 Perda de hidrogênio radicalar M - .H

M-15 Perda de metil radicalar M - .CH3

M-29 Perda de etil radicalar M - .C2H5

M-31 Perda de metoxi radicalar M - .OCH3

M-43 Perda de propil radicalar M - .C3H7

M-45 Perda de etoxi radicalar M - .OC2H5

M-57 Perda de butil radicalar M - .C4H9

M-2 Perda de hidrogênio M – H2

M-18 Perda de água M – H2O

M-28 Perda de CO ou etileno M-CO ou M-C2H4

M-30 Perda de formaldeido M- CH2O

M-32 Perda de metanol M-CH3OH

M-44 Perda de CO2 M-CO2

M-60 Perda de ácido acético M-CH3CO2H

(mainlib) 1-Octanol10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

0

50

100

15 18

27

29

37

39

41

45 50

56

62

70

73 77

84

91 97 101 112

OH

(mainlib) 1-Octene10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

0

50

100

14

27

29

31

39

41

43

45

55

59 62

70

72 77

83

91 97

112

Íon Molecular

“Chemical Ionization”CI

Munson and Field - 1966

Princípios Gerais

• Ionização por reação química (ex: protonação : MH+). A exotermicidade da reação controla a extensão dos processos dissociativos.

• Gases ionizantes típicos: metano, isobutano, amônia.

• Como em EI, aplica-se a moléculas de média e baixa polaridade e baixo peso molecular (~500u), voláteis e termo-estáveis: "moléculas orgânicas". Uma aplicação típica de CI ocorre para substâncias que não apresentam o íon molecular por EI.

• Adutos formados entre M e o íon reagente podem ser observados (Ex. M-NH4

+). Estes adutos podem diferenciar isômeros.

• CI é uma técnica branda de ionização, por provocar pouca ou nenhuma fragmentação da molécula ionizada.

CI – IONIZAÇÃO QUÍMICA

Ionização Química (CI).

ReaçãoÍon/molécula

50 eV+ e- e-+

térmicaCH4 + e-

70 eV+CH4 + H+CH4

CH3+

H2++CH4 CH4+ CH5

+ + CH3

CH3+ + CH4

CH4++ CH4

C2H5+

C2H3+

C3H5+

+

+

+

H2

H2

H2

H+

+CH4

CH2+

CH2+

C2H3+

Controle da Exotermicidade da Reação: Extensão de Fragmentação

Ionização Química (CI).

• Ionização Química Positiva:Metano:

CH4 + e -----> CH4+. + 2e ------> CH3

+ + H.

CH4+. + CH4 -----> CH5

+ + CH3.

CH4+. + CH4 -----> C2H5

+ + H2 + H.

Isobutano:

i-C4H10 + e -----> i-C4H10+. + 2e

i-C4H10+. + i-C4H10 ------> i-C4H9

+ + C4H9 +H2

Amônia:

NH3 + e -----> NH3+. + 2e

NH3+. + NH3 ------> NH4

+ + NH2.

NH4+ + NH3 --------->N2H7

+

• Ionização Química Positiva:Metano:

CH4 + e -----> CH4+. + 2e ------> CH3

+ + H.

CH4+. + CH4 -----> CH5

+ + CH3.

CH4+. + CH4 -----> C2H5

+ + H2 + H.

Isobutano:

i-C4H10 + e -----> i-C4H10+. + 2e

i-C4H10+. + i-C4H10 ------> i-C4H9

+ + C4H9 +H2

Amônia:

NH3 + e -----> NH3+. + 2e

NH3+. + NH3 ------> NH4

+ + NH2.

NH4+ + NH3 --------->N2H7

+

Reserpina CH4 CI

Reserpina EI 70 eV

APCI – “Atmospheric Pressure Chemical Ionization”

APPI – “Atmospheric Pressure Photo-Ionization”

SIMS – IONIZAÇÃO POR ÍONS SECUNDÁRIOS1970 Benninghoven

ion guns (LMIG) Ga+ and In+

Csþ ions give higher yield

SF5+, Bi+n, Au+n

FAB – IONIZAÇÃO POR BOMBARDEAMENTO DE ÁTOMOS ACELERADOS (liquid SIMS)

Xe + e- IONIZAÇÃOXe

+

ÍON LENTO

Xe+

ÍON LENTO

ACELERAÇÃOXe

+

ÍON RÁPIDO

Xe+

ÍON RÁPIDO

ÁTOMO LENTO

ÁTOMO LENTO

Xe+TROCA DE ENERGIA + Xe

ÁTOMO RÁPIDO

Xe+

ÍON LENTO

Formação de átomos acelerados

Índice de popularidade - FAB

Matrizes

Efeito da Matriz

Sistema CF-FAB (continuous-flow FAB)

Yamashita, M.; Fenn, J.B., J. Phys. Chem. 88 (1984) 4451.

Whitehouse, C.M.; Dreyer, R.N.; Yamashita, M.; Fenn, J.B., Anal. Chem. 57 (1985) 675.

Fenn, J.B.; Mann, M.; Meng, C.K.; Wong, S.F.; Whitehouse, C.M., Science 246 (1989) 64.

"Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules,“

The Nobel Prize in Chemistry 2002

"for the development of methods for identification and structure analyses of biological macromolecules"

Popularidade do Electrospray

Príncipio Geral

• Uma solução acidificada ou basificada da amostra (ou “neutra” de um sal) é submetida a um spray eletrolítico sob pressão atmosférica. Um fino “spray” (aerosol) se forma (cone de taylor) na presença de um alto campo elétrico (+4000V ou – 4000V). O contra-íon é oxidado oureduzido e formam-se gôtas com excesso de carga (positiva ou negativa). O solvente das gôtas evapora com redução de volume, e as gôtas se subdividem. Eventualmente, devido a alta repulsão entre os íons de mesma carga, ou se formam gôtas contendo apenas um íon (modelo CRM) ou íons são expelidos das gôtas para a fase gasosa (modelo IEM de evaporação de íons).

COHO

NH2

HCl

NaOHC

O

OH2N

-

COH

OH3N

+C

OH

OH3N

+Cl-

CO

OH2N

-Na+

ESI Positivo

ESI Negativo

+ 4.000 V

- 4.000 V

“Enganando” as moléculas neutras com curvas

Z-spray (Micromass)

Fonte Z-spray

0.00 0.40 0.80 1.20 1.60Time

ESI+, Full Scan

Extracted at m/z 256

Total Run Time > 25 Hr

More than 500 mg salt

n = 1n = 509

MS

Fonte de ESI: Ionização sob pressão atmosférica !

Positive ESI-MS m/z spectrum of the protein hen egg white lysozyme

Proteínas

Ionização a Pressão Atmosférica (API). Eletrospray (ESI)/Pequenas moléculas

Possibilidade de formação de íons com múltiplas cargasPossibilidade de formação de íons com múltiplas cargas

Espectros de ESI-MS típicos : “Pequenas Moléculas”

n=(M1- 1)/(M2 –M1)n=(1131.2 – 1)/(1211.9-1131.2) = 14,1

M = n(M1 – 1) ⇒ 14 (1131.2 – 1)= 15822,8

MALDI vs ESI

Popularidade do Electrospray

MALDI – “Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization”

(Karas & Hillenkamp - 1987)

The Nobel Prize in Chemistry 2002

"for the development of methods for identification and structure analyses of biological macromolecules"

Popularidade do MALDI

MALDI “…fazendo um elefante voar !”

MALDI- IONIZAÇÃO/DISSORÇÃO A LASER ASSISTIDA POR MATRIZ

Matrizes

• Razão matriz-amostra: 100:1 a 5000:1

(1) α-cyano-4-hydroxycinnamic acid : CCA

(2) 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid (sinapinic acid) : SA

(3) 2,5-dihydroxybenzoic acid.

• Prepara-se solução da amostra e matriz (pequenas moléculas orgânicas). O solvente é evaporado resultando em uma solução sólido-sólido que é depositada sobre a superfície da sonda. Esta solução é então irradiada com laser. Ocorre aquecimento localizado e seletivo. A matriz absorve fortemente a radiação do laser. Ocorre a evaporação rápida da matriz e a molécula ionizada (ex: MH+) éentão liberada para a fase gasosa, e acelerada em direção ao analisador de massas pelo alto potencial (20.000 V) aplicado à sonda.

Espectros e Aplicações

MALDI de polímerosMALDI de polímeros

Conceitos Importantes

Notação dos Espectro de Massas

• Informações Estruturais• Informação da Massa do Compostos

m/z0 50 100 150 200 250

Ion

Abun

danc

e (%

)

0

20

40

60

80

100

Eixo y: Abundância %Eixo x: Relação massa/carga (m/z)

Isóbaros

São moléculas com diferentes elementos e mesma de massa molecular.

Ex.: [C5H6O4]+; [C6H10O3]+, [C9H22]+ = 130 Da

Isótopos

São núcleos associados ao mesmo elemento da tabela periódica (mesmo númeroatômico) mas com diferentes números de nêutrons.

Ex: Hidrogênio, Deutério e Trítio

Isóbaros

São moléculas com diferentes elementos e mesma de massa molecular.

Ex.: [C5H6O4]+; [C6H10O3]+, [C9H22]+ = 130 Da

Isótopos

São núcleos associados ao mesmo elemento da tabela periódica (mesmo númeroatômico) mas com diferentes números de nêutrons.

Ex: Hidrogênio, Deutério e Trítio

Algumas definições importantesAlgumas definições importantes

Elemento Isótopo Abund. Relativa Isótopo Abund. Relativa Isótopo Abund. RelativaCarbono 12C 100 13C 1.1Hidrogênio 1H 100 2H 0.016Nitrogêio 14N 100 15N 0.38Oxigênio 16O 100 17O 0.04 18O 0.2Enxoger 32S 100 33S 0.78 34S 4.4Cloro 35Cl 100 37 Cl 32.5Bromo 79Br 100 81Br 98

Espectro de Massas: ISÓTOPOS

Espectro de Massas: abundância isotópica

Pico do Carbono 13Pico do Carbono 13

Pico monoisotópicoPico monoisotópico

Espectro de Massas

m/z0 50 100 150 200 250

Ion

Abun

danc

e (%

)

0

20

40

60

80

100PrecursorPrecursor

FragmentosFragmentos

Espectro de dissociação/fragmentaçãoEspectro de dissociação/fragmentação

Íon molecular

(mainlib) Benzoic acid, 2-hydroxy-, methyl ester10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

50

100

15

1828

39

4550

53

55

65

76 81

92

104 109

120

137

152

OH

O

O

(mainlib) Benzoic acid, 2-hydroxy-, methyl ester10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

50

100

15

1828

39

4550

53

55

65

76 81

92

104 109

120

137

152

OH

O

O

C7H6O3138.12

138.031694C 60.87% H 4.38% O 34.75%

Espectro de Massas: abundância isotópicaPara se estimar o número de carbonos em uma molécula: dividir a intensidade de A+1 por 1.1 (abundância do Carbono 13 na natureza).

Para se estimar o número de carbonos em uma molécula: dividir a intensidade de A+1 por 1.1 (abundância do Carbono 13 na natureza).25%25%

25 / 1.1 = 23,7~ 23 átomos de

carbono na molécula

25 / 1.1 = 23,7~ 23 átomos de

carbono na molécula


Br - CH315 uma

79Br-CH3 = 9481Br-CH3 = 96

Informações:• Relação m/z• Presença dos isótopos• Diferença de massa entre os sinais


Cloro Peso atômico = 35,453Mistura de Cloro 35 (75,77%) e Cloro 37 (24,23%)

40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61mass0

100

%

7.49e1250.0

52.0

CH3Cl

40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60mass0

100

%

50.0

52.0

Padrão isotópico: Cloro 35 (75,77%) e Cloro 37 (24,23%)

CH3Cl

74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96mass0

100

%

84.0

86.0

87.9

CH2Cl2

108 110 112 114 116 118 120 122 124 126 128 130 132mass0

100

%

117.9119.9

121.9

123.9

CHCl3

145 150 155 160 165mass0

100

%

153.9

151.9

155.9

157.9

CCl4

Padrões isotópicos complexos

165 170 175 180 185 190mass0

100

%

3.06e12178.9436

172.9467

165 170 175 180 185 190mass0

100

%

3.06e12178.9436

172.9467

265 270 275 280 285 290mass0

100

%

1.52e12279.8496

265 270 275 280 285 290mass0

100

%

1.52e12279.8496

Composto contendo 1 átomo de RutênioComposto contendo 1 átomo de Rutênio

Composto contendo 2 átomo de RutênioComposto contendo 2 átomo de Rutênio

Evidência do número de elementos presentes na moléculaEvidência do número de elementos presentes na molécula

Medida de Massa Molecular

Ex: M = 249C20H9+ C19H7N+ C13H19N3O2+

Ex: M = 249C20H9+ 249.0700C19H7N+ 249.0580C13H19N3O2+ 249.1479

Sistemas de Baixa resolução

Sistemas de Alta resolução

MassaMassa nominalMassa de um íon de uma determinada fórmula empírica calculada através do isótopomais abundante.

Ex : M=249 C20H9+ or C19H7N+ or C13H19N3O2

+

Massa exataMassa de um íon da uma determinada fórmula empírica calculada através da massa exatado isótopo mais abaundante da cada elemento.

Ex : M=249 C20H9+ 249.070

C19H7N+ 249.0580C13H19N3O2

+ 249.1479

Faixa de massas- Limite superior e inferior de m/z observáveis por um dado analisador de massas.

Resolução

Medida da habilidade de um analisador de massas de separar íons adjacentes.

249 249.0700 249.0580 249.1479

3 compostos diferentesMesma massa nominal

Baixa Resolução

3 compostos diferentes3 massas exatas diferentes

alta resolução

C20H9+C19H7N+

C13H19N3O2+ C20H9+ C19H7N+ C13H19N3O2+

Massa Exata [C18H15P]+ m/z 262.0911

Massa exata (ppm)=106 (Mcal. – Mobs)/Mobs

Caminhos de Fragmentação

Possibilidades de EI

Regra do Nitrogênio

• Contém Números ímpares de nitrogênio:

Íon molecular [M]+. terá massa ímpar!!

• Contém Números pares de átomos de Nitrogênio ou não contémátomos de nitrogênio:

Íon molecular [M]+. terá massa par!!

• Contém Números ímpares de nitrogênio:

Íon molecular [M]+. terá massa ímpar!!

• Contém Números pares de átomos de Nitrogênio ou não contémátomos de nitrogênio:

Íon molecular [M]+. terá massa par!!

Regras do elétron impar

Regras do elétron par

Fragmentação direcionada pelo elétron

Fragmentação direcionada pela carga

Rearranjos

A base da espectrometria de massas - UEL Portal · Mass spectra and isotopes The Nobel Prize in...

Documents

Transcript of A base da espectrometria de massas - UEL Portal · Mass spectra and isotopes The Nobel Prize in...