7241990 APOSTILA Fundamentos de Lab Oratorio

8/14/2019 7241990 APOSTILA Fundamentos de Lab Oratorio

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA CURSO TÉCNICO EMBIOTECNOLOGIA

Fundamentos de Laboratório

Júlio Xandro Heck Jane Elisabete Marques de Almeida Caon

Porto Alegre, 2006



OS AUTORESJúlio Xandro Heck é formado em Química Industrial de Alimentos, Mestre emMicrobiologia Agrícola e do Ambiente (ênfase em Tecnologia de Bioprocessos) pelaUFRGS e Doutor em Biologia Celular e Molecular (ênfase em Biotecnologia) pelaUFRGS. Foi bolsista de Pós-doutorado do CNPq e atualmente é professor na EscolaTécnica da UFRGS. Jane Elisabete Marques de Almeida Caon é formada em Biologia,Especialista em Programas de Saúde e Mestre em Ecologia pela UFRGS. Professora naEscola Técnica UFRGS.



APRESENTAÇÃOEste manual foi desenvolvido com o objetivo de servir como guia básico para odesenvolvimento do Componente Curricular de Fundamentos de Laboratório, oferecidopara o Curso Técnico em Biotecnologia, da Escola Técnica da UFRGS. Não é nossaintenção fornecer ao aluno subsídios para a realização de todas as operaçõesutilizadas em laboratórios de Biotecnologia e nem permitir a utilização eficientede qualquer equipamento disponível, pois esta tarefa seria extremamente extensa e,provavelmente, não teríamos sucesso. No entanto, esperamos que a nossa obra sirva

de orientação geral para o desenvolvimento das atividades cotidianas do Técnico emBiotecnologia e torne mais fácil o desempenho de suas atividades profissionais.

Os autores



UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA DA UFRGS Curso deBiotecnologia Fundamentos de Laboratório Professor: Charley Christian Staats

Aula 1: NOÇÕES BÁSICAS DE BIOSSEGURANÇA ACIDENTES COM SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS EPRIMEIROS SOCORROS Orientações gerais sobre comportamento em um laboratório deBiotecnologia 1. Ao entramos em um laboratório (de química, bioquímica,microbiologia, etc) devemos sempre colocar o jaleco (avental, guarda pó, etc).Este procedimento é IMPRESCINDÍVEL. Não devemos tolerar que pessoas circulem pelo

laboratório sem a vestimenta adequada. Obviamente, o jaleco deve ser limpo eadequado para a função. 2. Não coloque lanches, cigarros e outros materiais sobreas mesas do laboratório, pois elas podem estar contaminadas com produtoscorrosivos ou tóxicos . 3. Mantenha seu lugar de trabalho em perfeito estado delimpeza e evite obstáculos inúteis na sua bancada de trabalho. 4. É expressamenteproibido fumar no ambiente de laboratório. 5. Nunca use tubos de vidro com asbordas cortantes, mesmo em caso de urgência. Vidro trincados jamais devem serusados. 6. Não faça força sobre o vidro. 7. Lubrifique os tubos de vidro paraintroduzi-los nas rolhas. No caso de rolhas de borracha, use glicerina comolubrificante.



7. Proteja suas mãos com luvas de couro ao colocar rolhas em um tubo. 8. Osfrascos com amostras contaminadas com solução ácida, soda cáustica ou outrosmateriais corrosivos devem ser lavados com água após serem usados. 9. Vidrosquebrados devem ser jogados em recipientes próprios e nunca despejados no lixocomum. 10. Ao sifonar ou pipetar líquidos, NUNCA FAÇA ISSO COM A BOCA, usepipetadores apropriados. 11. Materiais tóxicos ou voláteis devem ser manipuladosem local apropriado (capela de exaustão). Na falta desta, fazer esse procedimentoao ar livre, fora do laboratório, tomando as devidas precauções. 12. Amostras e

produtos químicos em recipientes sem rótulos na devem ser usados. 13. Amostrasquentes devem ser identificadas como tal. 14. Roupas contaminadas devem sertrocadas imediatamente. 15. O bico de Bunsen deve ser usado somente em lugaresisentos de inflamáveis ou explosivos. 16. Coloque os recipientes contendo produtosem seus lugares apropriados, isso evitará erros na análise e possíveis acidentes.17. Jogue o lixo nos locais adequados. 18. No caso de diluições, DERRAME SEMPRE OÁCIDO NA ÁGUA E NÃO a água no ácido. 19. Evite tocar em produtos que não conhece.20. Não procure, com fins recreativos, misturar reativos e produtos sem saber oque vai acontecer. 21. Evite respirar vapores e fumaças. 22. Rotule os recipientesantes de enchê-los. 23. Não beba água, café, leite, refrigerantes, etc, em locaisque sejam apropriados (béqueres, por exemplo). 24. Não jogue na pia líquidoscorrosivos ou inflamáveis que não tenham sido previamente diluídos. 25. Se, poracaso, quebrar um frasco de vidro, não apanhe os estilhaços com as mãos. Use uma

escova ou vassoura.



26. REDOBRE SUA ATENÇÃO QUANTO ESTIVER FAZENDO ALGUM EXPERIMENTO NO LABORATÓRIO,POIS SÓ ASSIM PODERÁ INTERPRETAR CORRETAMENTE OS RESULTADOS E GARANTIR A SUASEGURANÇA E A DE TODOS QUE ESTIVEREM NO LABORATÓRIO.

Acidentes com substâncias químicas e primeiro socorros Vale a pena lembra que édever de todos o conhecimento dos riscos dos produtos químicos que estão sendomanipulados no laboratório. Os procedimentos gerais, em caso de acidentes, estãolistados a seguir: Derramamento de ácidos e bases: ÁCIDOS: antes de lavar com água

é correto adicionar Ca(OH) 2 (hidróxido de cálcio). BASES: adicionar NAHSO4(bissulfato de sódio). Respingos de produtos químicos sobre a pele e mucosas: 1.Lavar com água corrente em abundância, sem esfregar a superfície afetada, até queseja removido o componente químico em contato com a pele ou a mucosa. 2. Retiraras roupas da pessoa e tomar cuidado para não se contaminar neste processo. Lavaras roupas separadamente, antes de usar.

3. Procurar atendimento médico, se necessário.

Respingos sobre os olhos 1. Lavar os olhos com água corrente em abundância,forçando levemente as pálpebras, assegurando que a água banhe-os totalmente. 2.Todos os acidentes causados por agentes químicos que envolvam os olhos devemreceber cuidados médicos.



Inalação de gases 1. Remover imediatamente a pessoa do local e afrouxar as roupas.2. Se a vítima estiver inconsciente, deite-a e verifique a respiração. Se arespiração estiver parada, inicie respiração artificial. 3. Procure assistênciamédica. Ingestão 1. Se o ocorrer o contato de qualquer produto químico com a boca,enxágüe com bastante água, tomando cuidado para não engolir. Se o composto químicofoi ingerido, beber água para diluí-lo no estômago. 2. Não induzir vômito. 3.Transportar a vítima para o centro médico mais próximo. O tratamento dosdiferentes tipos de intoxicação baseia-se, fundamentalmente, em terminar a

exposição do organismo à substância, promover a excreção, empregar antídotos ouantagonistas da substância química e, se esta for ingerida, aplicar medidas desustentação. A seguir estão apresentados alguns antídotos e suas aplicações.Antídoto Acetato de amônio (solução 61,5%) para lavagem gástrica Ácido acético 1%Hidróxido de cálcio (solução 0,14%) para administração oral Amido de milho (80g/L) Indicado para acidentes com: Formaldeído

Hidróxidos Ácidos

Iodo




Aula 2: INSTRUMENTOS E MATERIAIS DE LABORATÓRIO - Agarradores: Utilizados parasegurar buretas, balões, erlenmeyers, condensadores e funis nos suportes.

- Argola: Suporte para funil de separação, funil simples, tela de amianto efrascos que são coletados sobre a tela de amianto quando aquecidos.

- Balança analítica: Instrumento usado para determinação de massas de reagentes.As balanças analíticas possuem precisão de 0,0001 g.

- Balão de fundo chato: Empregado para aquecimento ou armazenamento de líquidos ousolução.



- Balão volumétrico: Balão de fundo chato e gargalo comprido, calibrado paraconter determinados volumes líquidos. Possui um traço de referência, que marca ovolume exato. Utilizado na preparação de soluções de concentrações conhecidas.

- Bastão de vidro: É um bastão de vidro maciço utilizado para agitações e paraauxiliar na transferência de líquidos de um recipiente para outro (direcionador defluxo).

- Béquer (becker): Recipiente de vidro utilizado para aquecer substâncias,recolher filtrados, fazer decantações, misturar reagentes, preparar soluções erealizar reações.

- Bico de Bunsen: Bico de gás especialmente construído para usos em laboratórios.Utilizado para aquecimento até temperaturas de 800ºC. Além deste, utilizam-seoutros métodos de aquecimento em laboratório: banho-maria e banho de óleo.

Como utilizar o bico de bunsen: 1. abrir a chave geral de gás do laboratório. 2.abrir a válvula do registro de gás individual de cada bico (ele está localizado,geralmente, próximo do bico). 3. verificar se a entrada de ar do bico está aberta.Com ela fechada não é possível ligar o bico. 4. girar a válvula que ligaefetivamente o bico e, com auxílio de um isqueiro ou de palitos de fósforo,

acender o bico. A altura da chama pode ser controlada através do controle daentrada de ar. Para desligar: desligar a válvula do registro de gás (item 2),desligar o bico (item 4).



- Bureta: Serve para dar escoamento a volumes variáveis de líquidos. Não deve seraquecida. É constituída de tubo de vidro uniformemente calibrado, graduado emdécimos de mililitro. Na parte inferior possui uma torneira. É utilizada paratitulações.

- Cadinho de porcelana: Pequeno recipiente de porcelana que resiste a altastemperaturas (>1000ºC). Utilizado em calcinações, eliminação de substânciasorgânicas, secagens, aquecimentos e fusões.

- Dessecador: Recipiente de vidro ou porcelana, inteiramente fechado e vedado, quecontém em sua parte inferior uma substância capaz de absorver água. É usado paraconservação de sólidos ou mesmo líquidos, no estado seco, para preservá-los daumidade. Também é usado para resfriamento de substâncias em atmosfera contendobaixo teor de umidade.

- Erlenmeyer: Recipiente de vidro utilizado para aquecer e cristalizarsubstâncias, especialmente quando estas precisarem ser agitadas. É utilizadotambém em titulações e para recolher filtrados. Além dessas aplicações éamplamente utilizado em microbiologia, para o crescimento de microrganismos e parao preparo de meios de cultura.

- Espátula: Utilizada para retirar reagentes sólidos de frascos. Pode ser deporcelana, plástico ou metal.



- Mufa: Utilizada para prender, nos suportes universais, os agarradores que não ascontenham em seus cabos.

- Papel filtro: Papel poroso, que retém partículas sólidas, deixando passar apenasa fase líquida. Quando o líquido é corrosivo se substitui o papel por lã de vidroou amianto. Depois de colocado no funil o papel filtro deve ser umedecido, deforma que fique retido junto à parede.

- Pêra - Usada para pipetar soluções. - Pinça de madeira: Usada para prender tubosde ensaio durante o aquecimento direto no bico de Bunsen. - Pipeta graduada:Consiste de um tubo de vidro estreito geralmente graduado em 0,1 ml. É usada paramedir pequenos volumes variáveis de líquidos. Encontra pouca aplicação sempre quese deseja medir volumes líquidos com maior precisão. Não deve ser aquecida.

- Pipeta volumétrica: É constituída por um tubo de vidro com um bulbo na partecentral. O traço de referência é gravado na parte do tubo acima do bulbo. É usadapara medir volumes únicos de líquidos com elevada precisão. Não deve ser aquecida.- Placa de Petri: Recipiente de vidro que pode se apresentar em vários tamanhos,sua utilidade é muito variada. Tem grande emprego nas culturas de bactérias,culturas de fungos, protozoários, etc. - Provetas: Recipiente de vidro, decapacidade variável geralmente indicada em mL. Utilizada para medir volumes de

líquidos, para preparar soluções de concentração aproximada ou não conhecida.



- Suporte universal: Suporte de ferro utilizado como meio de prender argolas eagarradores.

- Tenaz: Empregada para segurar cadinhos, tubos e cápsulas quando aquecidos. Égeralmente de ferro ou níquel.

- Termômetro: Usado para medir a temperatura durante o aquecimento em operaçõescomo: destilação simples, fracionada, etc. - Triângulo de porcelana: Triângulo

construído de arame coberto por tubos de porcelana ou outro material refratário.Utilizado como suporte para cadinhos e cápsulas durante a calcinação.

- Tripé e tela de amianto: O tripé é o suporte para a tela de amianto. A tela tema propriedade de distribuir o calor, evitando que os frascos quebrem quandoaquecido no fogo.

- Tubo de ensaio: Tubos de vidro, cilíndricos, com tamanhos variados, usados emvários experimentos. Nele, efetuam-se reações simples. Podem sofre variações detemperatura. - Vidro de relógio: Peça de vidro de forma côncava. É usado paracobrir béqueres, em evaporações, pesagens de diversos fins. Não pode ser aquecidodiretamente na chama do bico de Bunsen. Equipamentos de proteção individual (EPIs)recomendados - Proteção para os olhos: para se proteger contra respingos,

aerossóis, combustíveis ou cacos de vidro, USE ÓCULOS DE PROTEÇÃO. - Máscara:algumas substâncias, especialmente voláteis, podem exigir o uso de máscaras respiratórias. - Luvas: o manuseio de algumas substâncias tóxicas exige o uso de luvas.Na maioria dos casos, uma luva de látex já é suficiente.



UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA DA UFRGS Curso deBiotecnologia Fundamentos de Laboratório Professores: Jane Caon e Júlio XandroHeck

Aula 3: MICROSCOPIA Conceito É a arte de empregar o microscópio. O que é ummicroscópio? A palavra tem origem grega – mikrós, pequeno, e skoppéoo, observar,ver através de – e significa um instrumento através do qual se observa coisaspequenas. Partes do microscópio a) Parte mecânica: pé (base); braço (estativa ou

coluna); platina (mesa); canhão (tubo); parafusos: macrométrico e micrométrico;revólver (tambor); charriot. Compõem o sistema de suporte e ajuste. b) Parteóptica: lente ocular; lente objetiva; condensador com diafragma; espelho ou fontede luz acoplada. Compõem o sistema de aumento e de iluminação. a) Parte MecânicaPé: É o local de apoio, dá estabilidade ao aparelho e serve de suporte para asdemais peças. Braço: Suporte pesado que sustenta os tubos, a mesa, o condensador,os parafusos macro e micrométrico. Platina: Redonda ou quadrangular, pode serfixa, móvel ou giratória no plano horizontal. Sobre ela fica a lâmina com omaterial a ser observado. Apresenta uma abertura no seu centro permitindo apassagem dos raios luminosos, coletados pelo espelho ou oriundos de fonte luminosaprópria e convergindo sobre o material da lâmina pelo condensador e diafragma. Osraios chegam através da lente objetiva do tubo e da ocular até o globo ocular(retina) do observador. A preparação sobre a lâmina é afixada à platina através de

duas presilhas móveis. Canhão: Nos microscópios monoculares (que possuem uma sóocular), o canhão representa um cilindro metálico, que pode ser reto ou oblíquo.Os microscópios binoculares (que possuem duas oculares) podem ser inclinados, comajuste para as distâncias entre os olhos de cada observador. Parafusomacrométrico: É o parafuso maior, de avanço rápido. Possui botões bilaterais,localizados acima ou abaixo da platina. Utiliza-se primeiro para atingir aaproximação da focalização grosseira do material. Possui um percurso vertical, comcerca de 7 cm. Parafuso micrométrico: É o parafuso menor, de avanço lento.Comandado, também por tambores laterais. Permiti o deslocamento do tubo a apenasdois milésimos de milímetro ou



menos, portanto seu emprego só é utilizado para acertar a focalização do materialjá visível. Emprega-lo antes não é indicado, pois perde-se muito tempo tentandoobter deslocamentos maiores. É utilizado para obter um enfoque perfeito dapreparação. Entretanto, quando a preparação já parecer estar perfeitamentefocalizada, devemos ter sempre a mão sobre o parafuso e proceder a pequenasoscilações, que permitam precisar certos detalhes, ou perceber novos elementos,ainda não vistos. Revólver: Fica acima da platina. As objetivas se encaixam numapeça rotatória e giram sempre no sentido do menor para o maior aumento. Charriot:

Peça reguladora localizada na platina e que serve para movimentar a lâmina nocampo. Um parafuso desloca a lâmina para frente e para trás e outro parafuso adesloca para a esquerda ou para a direita. b) Parte Óptica Lente ocular: Encaixadana extremidade superior do tubo, pode ser retirada e substituída facilmente.Juntamente com a objetiva fornece a imagem do objeto. As oculares fornecem,geralmente, ampliações iguais às obtidas por lentes ou lupas manuais. Com a ocularde maior aumento a parte visível da preparação é mais restrita. Ex. Se examinarmosuma preparação de glóbulos de sangue com a ocular de menor ampliação, os elementosserão menores, porém mais numerosos em cada campo do microscópio. Por outro lado,com a ocular de maior ampliação, os elementos serão maiores, mas em cada campover-se-á um número muito mais reduzido de elementos. Se o microscópio formonocular é conveniente fazer a observação com ambos olhos abertos, olhando-se comqualquer um dos dois. Quanto menos iluminada estiver a mesa mais fácil será

consegui-lo. Característica técnica da ocular: Aumento: O poder de aumento seencontra gravado na ocular. - a ocular X 4 aumenta 4 vezes a imagem produzida pelaobjetiva. - a ocular X 6 aumenta a imagem 6 vezes - a ocular X 10 aumenta a imagem10 vezes. Se a imagem do objeto aumentou 40 vezes mediante a objetiva de X 40 eapós 6 vezes mediante a ocular de X 6, o aumento total será de 6 x 40 = 240 X.Para calcular o aumento total da imagem do objeto que se observa, multiplicamos opoder de aumento da objetiva pelo da ocular. Lente objetiva: Fornece a imagemampliada do objeto. Há objetivas a seco e de imersão. As objetivas de maiorampliação têm as lentes terminais menores. a) Objetivas a seco – São as maiscorrentemente empregadas. Entre a lente frontal e a lamínula só existe ar. Asobjetivas, sem indicação específica, são destinadas aos exames a seco, isto é,nenhum líquido pode ser interposto entre a preparação e a objetiva. É claro queisto não quer dizer que com elas não se possa examinar um líquido, mas sim que,

neste caso é preciso que o líquido esteja coberto por uma lamínula e não emcontato direto com a objetiva. b) Objetiva de imersão - A objetiva de imersãopromove a maior ampliação do objeto em estudo, entretanto é menor a quantidade deraios luminosos que atravessam o tubo do microscópio, para corrigir essa situaçãoe aproveitar a maior quantidade de luz possível, coloca-se entre a objetiva deimersão e a preparação uma gota de óleo de imersão, evitando assim a interposiçãodo ar. O uso da objetiva de imersão requer grande luminosidade e o emprego docondensador. Nunca usar a seco uma objetiva de imersão.



Características técnicas das objetivas: 1. Aumentos: O poder de aumento de cadaobjetiva se indica por um número gravado no suporte da lente: a objetiva X 10aumenta 10 vezes a objetiva X 40 aumenta 40 vezes a objetiva X 100 aumenta 100vezes (A objetiva X 100 geralmente se encontra marcada com um anel para indicarque se deve usá-la com óleo de imersão). 2. Abertura numérica (NA): A AN também seacha gravada no suporte da lente, junto a indicação do poder de aumento. Ex. X 100/ 1.30 - 0,30 na objetiva X 10 - 0,65 na objetiva X 40 - 1,30 na objetiva X 100 Amedida que aumenta a AN é maior o poder de resolução (capacidade de perceber

detalhes adjacentes muito próximos, separando-os som nitidez). Ainda, a medida queaumenta a AN diminui a dimensão da lente frontal. A lente frontal da objetiva X100 tem o tamanho de uma cabeça de alfinete, por isso deve-se manejar com cuidado.3. No suporte da objetiva pode ter outros números: Ex. X 40 / 0.65 160 / 0,17 Aaltura recomendada em mm para o tubo do microscópio (entre a objetiva e a ocular),é geralmente de 160 mm. A espessura recomendada em mm para a lamínula utilizadasobre a lâmina, 0,17mm. 4. Distância de operação da objetiva: É a distância entrea lente frontal da objetiva e a lâmina quando a imagem se encontra focada. Amedida que o poder de aumento do objeto é maior diminui a distância de operação. -objetiva X 10: a distância de operação é de 5 – 6 mm - objetiva X 40: a distânciade operação é de 0,5 – 1,5 mm - objetiva X 100: a distância de operação é de 0,15– 0,20 mm 5. Poder de resolução: É a capacidade de distinguir dois pontos muitopróximos. A capacidade de resolução do olho humano é 0,25 mm. Quanto maior for o

poder de resolução da objetiva, mais clara será a imagem e maior a capacidade depor em evidência detalhes adjacentes muito próximos, separando-os com nitidez.Condensador com diafragma: Localizado abaixo da platina, sua função principal éfornecer bastante luz, tornando mais clara a preparação, indispensável nas grandesampliações (objetivas de grande aumento) do material a ser observado. Ao se elevaro condensador, através do parafuso de ajuste, a iluminação é máxima. Ao baixá-loobtemos uma iluminação mínima. Alguns microscópios têm filtros coloridos,principalmente azuis de baixo do condensador. Se pode deixar ou tirar segundo otipo de preparação que se vá observar. Pode haver três parafusos colocados aoredor do condensador: um na frente, um a esquerda e outro a direita. Usam-se paracentrar o condensador exatamente em relação ao objeto em observação. O diafragmaestá dentro do condensador. Utiliza-se para reduzir ou ampliar um ângulo,portanto, também a quantidade de luz que entra no condensador. Fecha-se o

diafragma quando se usam objetivas de pouco aumento, para eliminar os raioslaterais. Abre-se o diafragma na medida em que se aumentam as ampliações, emconseqüência aumenta a NA e se pode observar detalhes menores do objeto.



Espelho: É encaixado por baixo do condensador. É redondo e possui duas faces: umaplana e outra côncava. A face plana é usada nos pequenos aumentos, quandoquisermos obter um campo uniformemente iluminado e também para quando usamos aobjetiva de imersão. A face côncava é usada em grandes aumentos. Entretanto estasregras não são absolutas. É sugerido proceder por tentativas, quando a preparaçãoestá sob o microscópio, e experimentar sucessivamente uma e outra face assim comoas diferentes posições do espelho, até conseguir a visibilidade desejada.

Preparação do microscópio para uso Procedimentos para centrar corretamente ocondensador: 1. Coloque na platina uma preparação em lâmina, sem lamínula. Desça ocondensador. Abra o diafragma. Examine com a objetiva de menor aumento. Observe apreparação através da ocular e focalize. 2. Feche o diafragma. No campomicroscópico aparecerá um círculo borrado de luz rodeado por um anel escuro. 3.Elevar o condensador lentamente até que as bordas do círculo luminoso estejamclaramente focalizadas. 4. Ajuste, se necessário, a posição do espelho de maneiraque o círculo luminoso fique centrado exatamente ou sobreposto à área clara queestá rodeada pela zona escura. 5. Através dos parafusos para centrar o condensadorfaça os ajustes necessários até que o círculo luminoso se encontre exatamente nocentro do campo microscópico. Repita a operação quando usar as outras objetivas.Ajuste do diafragma Abra o diafragma completamente, Retire a ocular e observediretamente através do tubo do microscópio; a lente superior da objetiva aparecerá

cheia por um círculo luminoso. Feche o diafragma lentamente até que este círculoluminoso ocupe somente 2/3 da superfície. Repita esta operação até usar cadaobjetiva. Ajuste da ocular 1. Escolha da ocular: As oculares X 5 ou X 6proporcionam resultados satisfatórios no laboratório clínico. Se utilizarmosoculares de maior poder se intensificará o aumento, mas é provável que não seobserve melhor os detalhes. 2. Ajuste da distância interpupilar (distância entreas pupilas dos olhos): Segurar as bases das oculares com as duas mãos e regular adistância interpupilar até obter uma perfeita visão binocular. 3. Focalização dosolhos direito e esquerdo: Um dos suportes das oculares, quase sempre o esquerdo,está provido de um anel para focagem. Se este anel se encontra no suporte daocular esquerda, feche o olho esquerdo e, empregando a objetiva X 40, focalize aimagem para o olho direito pela ocular direita. A seguir feche o olho direito eobserve com o olho esquerdo através da ocular esquerda. Se a imagem se encontra

focalizada não é necessário ajuste. Se a imagem não é clara, faça girar o anel defocagem até obter nitidez de imagem. Neste momento o microscópio estará ajustadode acordo com a visão binocular própria do operador.



Focalização da objetiva 1. Emprego da objetiva de menor aumento ( X 5 ou X 10 ) Naobservação de uma preparação, inicie sempre pela objetiva de menor aumento. -Coloque a lâmina sobre a platina, fixe-a com a(s) presilha(s), mova a lâmina com ocharriot até que o objeto fique exatamente no centro do campo. - Desça ocondensador completamente - “Desça” a objetiva até encontrar-se imediatamenteacima da preparação - Utilizando o parafuso macrométrico de rápido avanço “eleve”a objetiva até observar uma imagem clara através da ocular - Faça ajustes com oparafuso micrométrico - Se a iluminação é insuficiente suba o condensador

ligeiramente 2. Emprego da objetiva de maior aumento ( X 40 ) - Sem olhar pelaocular, baixe o condensador até a metade da distância. - Ainda olhando por fora,“desça” a objetiva até colocá-la imediatamente por cima da preparação (a distânciade operação é muito pequena, cerca de 0,5mm). - Através do parafuso macrométricode rápido avanço, “eleve” a objetiva muito lentamente até que apareça uma imagemborrada no campo microscópico. - Busque o foco por meio do parafuso micrométricode avanço lento. - “Eleve” o condensador para obter suficiente iluminação. - Se omicroscópio não tiver condensador utilize o lado côncavo do espelho. 3. Emprego daobjetiva de imersão em óleo - Utilizar preparações completamente secas - Colocaruma pequena gota de óleo de imersão sobre a porção que se vai examinar (depreferência usar óleos sintéticos) - “Eleve” o condensador até onde possa chegar -Abra completamente o diafragma - “Desça” a objetiva X 100 até que entre em contatocom o óleo - Aproxime a objetiva da preparação até onde seja possível, mas evite a

pressão na lâmina (as objetivas modernas tem amortizador). - Observe através daocular e gire para cima, muito cuidadosamente, o parafuso micrométrico, de avançolento até que a imagem se encontre focalizada. Observação: Nos microscópiosmodernos a objetiva não “sobe nem desce”, e sim a platina que se move através docomando do parafuso macrométrico de avanço rápido e do parafuso micrométrico deavanço lento. Neste caso os parafusos devem girar em direção oposta para afocalização da imagem. Mudança das objetivas Os microscópios modernos sãoconstruídos de tal maneira que quando se muda a objetiva de menor aumento para ade maior aumento o objeto permanece mais ou menos focalizado sendo necessáriopequeno ajuste com o parafuso micrométrico. Se isso não acontecer, suba o revólverantes de fazer a mudança para a objetiva de maior aumento e após focalizenovamente. Antes de mudar a objetiva certifique-se que o objeto examinadoencontra-se no meio do campo microscópico (círculo luminoso que se observa através

da ocular), a fim de não perde-lo depois na troca de objetivas.



Cuidados no uso apropriado do microscópio 1. É essencial que você conheça aspartes ópticas e mecânicas do microscópio, tendo o cuidado de ler e absorver asinstruções contidas nos manuais que os acompanham, e/ou seguir as orientações doprofessor em classe. 2. Mantenha o microscópio livre de poeira, vapores ácidos edo contato com reagentes. Para mantê-lo seco, cubra com capa de flanela pois evitao pó e a multiplicação de fungos(Obs.: as capas devem ser lavadas periodicamente).3. Não manusear o equipamento com as mãos sujas ou molhadas. 4. Jamais comer oubeber próximo ao equipamento. 5. Na remoção do equipamento, segure-o firmemente

com uma das mãos no braço e outra na base. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa detrabalho de superfície plana, evitando qualquer movimentação brusca. Nuncadesloque o microscópio com a lâmpada acesa ou logo após ter sido apagada. 6. Muitaatenção é necessária quando se observa a preparação em meio líquido, pois hásempre o risco de molhar a lente frontal da objetiva, portanto o conselho éretirar o excesso de líquido com papel filtro, antes de colocar a lâmina sobre aplatina, em caso de acidente, enxugar imediatamente com lenço de papel absorventemacio. 7. Ao trabalhar com o colega no mesmo microscópio, após a focalização doobjeto, desatarraxar o parafuso para soltar as oculares, e deslocá-la para ocolega que deverá atarraxar suavemente, regulando o ajuste interpupilar. 8. Aoencerrar os trabalhos com o microscópio, desligue a luz, enrole o fio e posicionea objetiva de menor aumento sobre o orifício da platina. Limpeza:- Parte óptica

A nitidez das imagens depende diretamente do estado de limpeza das lentes. Istopode ser evitado pelo hábito de limpeza periódica. 1. Oculares Com a objetiva demenor aumento focalizado em uma preparação, gire as oculares e verifique seexistem partículas que acompanham o movimento: caso existam elas, podem estar nasduas superfícies e neste caso ambas devem ser limpas com um bulbo de borracha ecotonete. Para retirar eventuais manchas de óleo, dedos; umedecer um cotonete comsolvente apropriado (álcool a 70% ou éter), tomando cuidado para não inundar aslentes, e secar imediatamente com um lenço de papel. Freqüentemente basta projetaro hálito na superfície das lentes e limpa-las. Limpe freqüentemente as ocularescom lenço de papel fino; pois o contato com os cílios e mesmo poeira podem sujá-las. Nunca toque as lentes com os dedos, pois a gordura atrai poeira. Precauçãoespecial é requerida no uso de solventes hidrocarbonetos, como o xilol, pois podem

penetrar na área de fixação das lentes no suporte dissolvendo a cola, bem comoproduzir película sobre as lentes.



2. Objetivas Cada objetiva deve ser desatarraxada cuidadosamente do revólver eapós a limpeza recolocada na posição original, para tanto, usar a mesma técnicadescrita para as oculares. No entanto, como as superfícies das lentes são menoresque as das oculares, recomenda-se inspeciona-las com uma pequena lupa manual. Pararetirar poeira da face posterior da objetiva, usa-se um pincel de pêlo muitomacio. Após o uso da objetiva de imersão, retirar o excesso de óleo com um papelde filtro e terminar a limpeza com um cotonete levemente embebido de éter. Jamaisusar álcool na limpeza do óleo de imersão, pois este não é dissolvido pelo álcool,

mas forma com ele um precipitado branco. - Parte mecânica Evitar o acúmulo depoeira e areia. Antes de proceder a lubrificação, a sujeira deve ser retirada.Paralubrificar a cremalheira (peça dentada) do parafuso macro e micrométrico econdensador, coloque uma pequena quantidade de vaselina neutra e após move-se paracima e para baixo a fim de espalha-la. Nunca force o parafuso macro e micrométricoque esteja emperrado ou duro. Para as partes expostas, é suficiente lavá-lasusando tecido umedecido com água e sabão neutro.

TÉCNICAS BÁSICAS DE LIMPEZA Material de vidro: 1. 2. 3. 4. 5. Lavar com água esabão Enxaguar com água corrente Enxaguar com água ou álcool acidulado Deixarescorrer e lavar com água destilada Secar com pano limpo.

Álcool acidulado: Álcool 96%............................................3 partes

Ácido clorídrico ....................................1 parte Água acidulada: Águadestilada ......................................3 partes Ácido clorídrico ouacético..................... 1 parte Para o passo n. 4 também pode utilizar-se:Dicromato de K .........................................................5 g Ácidosufúrico a 5% em água destilada ................250 ml



Para lâminas e lamínulas 1. Deixar repousar durante 24 horas na seguinte soluçãoDicromato de K ............................................20 g Ácido sulfúricoconcentrado .........................20 ml Água destilada........................................... 250 ml 2. Lavar em Água com sabão edeixar em água corrente durante 24 horas 3. Colocar a água destilada durante 24 h4 Manter por tempo indefinido e, um recipiente fechado com álcool 70%

Para lâminas com corantes e bálsamo 1. Dissolver a quente 100 g de bicarbonato de

K em 1 litro de água 2. Deixar esfriar a solução e adicionar gota a gota com umbastão de vidro 100 ml de ácido sulfúrico concentrado. 3. Deixar as lâminas elamínulas submersas nesta mistura por 3 dias. 4. Após lavar com água corrente epassar a uma segunda diluição que se prepara como segue: Água corrente.....................................50 ml Soda (NaoH)......................................10 gotas (em diluição saturada) 5.Permanecer nesta mistura durante 24 horaas para após lavar em água corrente ecolocar em álcool a 70 %. Outra técnica: 1. Colocar o material na seguintemistura: Água da torneira ..........................................1 parte Álcool96 % ..................................................1 parte Xilol.............................................................1 parte 2. Permanecerna mistura por 24 horas Água atua nos corantes e resíduos Álcool atua na gordurado manejo e nos corantes alcoólicos Xilol separa a lâmina da lamínula




Aula 4: PESAGEM BANHO-MARIA

Pesagem A construção das balanças analíticas assinalou um notável progresso nasúltimas décadas. O aperfeiçoamento na construção das balanças analíticas foimarcado pelo esforço em aumentar a sensibilidade dos aparelhos e, ao mesmo tempo,

simplificar e abreviar a operação de pesagem. Em nosso laboratório dispomos debalanças eletrônicas de um prato em grau analítico (4 casas decimais) e em grausemi-analítico (2 e 3 casas decimais). Recomendações gerais para o bom uso dasbalanças: - As balanças eletrônicas devem estar localizadas em bancadasapropriadas, planas e construídas em concreto, para evitar oscilações. - É sempreaconselhável que as balanças sejam ligadas 15 minutos antes do uso paraambientação e auto-calibração. - As balanças analíticas são extremamente sensíveise deve-se ter o máximo cuidado no seu manuseio e manutenção. Eventuais sujidadesdevem ser imediatamente limpas. - Certifique-se da massa máxima que pode serpesada na balança em questão. Essa operação é muito importante, pois uma massaexcessiva pode danificar enormemente a balança. - Antes de iniciar o processo depesagem, verifique se o prato da balança está limpo e se ela está zerada(“tarada”). Tare a balança com o recipiente no qual vai ser colocado o material a

ser pesado. Adicione o material e faça a leitura diretamente no mostrador. Emhipótese alguma coloque o reagente diretamente no prato da balança. - Conserve-alimpa, tendo o cuidado para não deixar cair reagente sobre a balança. - Depois douso, desligue a balança e faça o registro do uso no espaço apropriado. Exercício:- Determine a massa de um objeto qualquer (anel, brinco, lápis, caneta, etc) nasduas balanças do laboratório e anote as massas. - Pese, em um vidro de relógio,0,250 g de açúcar.



Banho-maria Os aparelhos de banho-maria são utilizados em procedimentoslaboratoriais sempre que se deseja um controle fino de temperatura. Desta forma,inúmeras reações importantes devem ser conduzidas neste tipo de aparelho. Amaioria dos banhos-maria opera eficientemente em faixas de temperatura que variamentre a temperatura ambiente e 80ºC. Dicas importantes: - na maioria dos banhos,temperaturas menores que a ambiente não podem ser atingidas, uma vez que nãopossuem sistema de refrigeração. - a água usada no banho-maria deve,preferencialmente, ser do tipo destilada e deve ser trocada sempre que se tornar

opaca ou começar a cheirar. Alternativamente pode-se adicionar algum agenteantibacteriano a esta água. - para evitar evaporação, use sempre uma tampa.




Aula 5: PIPETAS CAPELA DE EXAUSTÃO Existem vários tipos de pipetas, todas com amesma finalidade: transferência de líquidos de um local para outro. Atransferência pode ser volumétrica, como na maioria das pipetas, ou não, como nocaso das pipetas de Pasteur. Os principais tipos de pipetas usadas embiotecnologia são: - pipetas sorológicas (graduadas): estas são as pipetas-padrão

de uso diário. Normalmente são de vidro, mas também podem ser de plástico. Podemser de vários volumes e são usadas rotineiramente na medida de líquidos. Aautoclavagem deve ser evitada, pois prejudica a calibração. A secagem também deveser cuidadosa, em temperaturas que não excedam 45ºC. Modo de usar: Depois deperfeitamente limpa e seca, a pipeta pode ser introduzida na solução a sertransferida, tendo o cuidado para evitar a formação de bolhas. A sucção deve serfeita com o auxílio de um pipetador* ou de uma pêra de sucção. Se a pipeta estiverúmida, deve-se “ambientar” a pipeta com o líquido a ser transferido e em seguidaproceder a transferência. A pipeta escolhida deve ser o mais próximo possível dovolume a ser medido. A parte externa da pipeta pode ser seca com o auxílio de umpapel filtro. Em seguida, o líquido pode ser escoado da pipeta para o recipientereceptor e a última gotinha pode ser removida encostando-se a mesma contra aparede do recipiente. Nunca deve-se soprar a porção do líquido que fica retido na

extremidade da pipeta. * Existem dezenas de pipetadores, portanto, você poderáencontrar aquele que sirva exatamente a sua necessidade. - pipetas volumétricas: omodo de utilização destas pipetas é o mesmo das pipetas sorológicas. Ao contráriodas anteriores, medem apenas um volume fixo. - pipetas de Pasteur: são de vidro oude plástico. Não são usadas para medir volumes, apenas para transferências maisgrosseiras. São boas para preencher tubos para balanceamento de centrífugas e pararemover e transferir sobrenadantes - micropipetas: são instrumentos que carregamvolumes em microlitros (µL, sendo 1000 µL= 1 mL) por ação da capilaridade ou porbulbos de sucção. São usadas para medir volumes pequenos e altamente precisos. Asmais comuns são as P1 (1 µL) P5 (até 5 µL,



P10 (entre 5 e 10 µL), P20 (entre 10 e 20 µL), P200 (entre 40 e 200 µL), P1000(entre 200 e 1000 µL) e P5000 (entre 1000 e 5000 µL). Modo de usar: - coloque aponteira (tip) adequada. - aperte o êmbolo da pipeta até o atingir o primeiroestágio. - coloque a ponteira dentro da solução a ser pipetada (segurando o êmboloapertado). Solte o êmbolo vagarosamente, certificando-se para que a ponteiraesteja sempre dentro da solução. Este movimento deve ser lento, para que a soluçãonão “suba” muito rapidamente. Jamais se deve permitir que o líquido atinja ointerior da micropipeta. Ele deve sempre ficar confinado na ponteira (ou tip). -

Descarte a solução, empurrando o êmbolo. Na maioria das micropipetas o êmbolo deveser empurrado duas vezes para liberar o conteúdo da ponteira. Empurre até que vocêsinta uma resistência e então empurre de novo, gentilmente. Esse empurrão finalexpele a última gotinha do volume e deve ser dado o mais suavemente possível paraevitar a formação de aerossóis. Estas pipetas devem sempre ser manipuladas comextremo cuidado, pois são relativamente caras e frágeis. Devem ser calibradas acada poucos meses durante o ano, dependo da freqüência de uso. Algumas podem sercalibradas no próprio laboratório, seguindo o procedimento sugerido pelofabricante; outras devem ser calibradas por profissionais. Este tipo de pipetaJAMAIS PODE SER AUTOCLAVADA. No entanto, as ponteiras podem, portanto, podem serutilizadas em operações que exijam esterilidade. Exercício: - praticar o empregode pipetas sorológicas e micropipetas, pipetando 6 mL de água destilada com oauxílio da pipeta sorológica de 10 mL e 500 µL de água (ou 150 µL) com uma

micropipeta (P1000 ou P200).

CAPELA DE EXAUSTÃO Os produtos químicos voláteis e aqueles que liberam vaporestóxicos devem ser manipulados, exclusivamente, em capelas de exaustão. Ascaracterísticas recomendáveis para a construção de capelas, dentro dos padrõesaceitáveis, são descritas a seguir: - as capelas devem ser construídas,preferencialmente, em aço inoxidável, porém é aceitável que sejam construídas emalvenaria com cúpula de aço inoxidável, para facilitar a limpeza. - a área máximado balcão deve ser de 3 m x 0,80 m e altura de 85 cm. - as janelas devem possuirmovimentação vertical e armação com contrapeso. - o sistema de escoamento deesgoto deve ser resistente a agentes corrosivos. - deve possuir uma entrada de arauxiliar ou secundária, para manter a mesma vazão de ar com a janela fechada. -deve possuir um sistema de filtros funcionando. - deve possuir peitoril, para

conter pequenos vazamentos. - o fluxo de ar de uma capela deve ser laminar epotente. Como usar uma capela de vapores químicos:



1.

2.

3. 4. 5.

Ligue a capela e verifique se a exaustão está funcionando (é possível ouvir ousentir). Nem o ar condicionado nem o ventilador devem estar funcionando perto da

capela, pois isso poderá interferir nas correntes de ar dentro da mesma. A janeladeve estar abaixo da altura do queixo do manipulador! Abaixe a janela até a alturaindicada na parte frontal da capela. Quanto mais baixa a altura, ou seja, quantomais fechada a janela, mais proteção haverá. Trabalhe, no mínimo, 20 cm dentro dacapela. Prenda os papéis e outros materiais leves. Eles podem ser sugados pelosistema de exaustão. Não bloqueie as fendas de exaustão traseiras ou o espaçoentre a borda dianteira de metal e a superfície de trabalho.




Aula 6: PREPARO DE SOLUÇÕES E DILUIÇÃO Soluções O preparo de soluções é umprocedimento extremamente importante para o Biotecnologista, pois do preparocorreto das soluções dependerá o sucesso de todos os experimentos realizados.Solução é uma dispersão homogênea de duas ou mais espécies de substâncias. Assoluções podem ser formadas por qualquer combinação dos 3 estados físicos da

matéria: gases, líquidos e sólidos, porém são sempre constituídas de uma únicafase. Nosso estudo se restringirá a soluções binárias líquidas, isto é, solutosólido ou líquido, dissolvido em solvente líquido. Existem várias classificaçõespara as soluções, a citar: - Classificação 1: solução saturada, não-saturada esuper-saturada, - Classificação 2: soluções diluídas e não diluídas, -Classificação 3: soluções moleculares e iônicas, - etc. No entanto, estudar osdiferentes tipos de soluções não é o objetivo deste componente e por issoficaremos restritos à parte prática. Informações teóricas úteis no preparo desoluções: - Concentração simples: é o quociente entre a massa do soluto (emgramas) e o volume de solução (em litros). C = m/V (em gramas/litro) - Molaridade:é o quociente entre o número de moles do soluto e o volume de solução (em litros).M = n/V (em moles/litro), sendo n = m/MM m = massa MM = massa molar



- Normalidade: quociente entre o número de equivalentes-grama (e1) do soluto e ovolume de solução, em litros. N = m/E1.V, sendo E=MM/valência (número de H ou OHionizáveis) E = Equivalente grama m = massa V = volume (litro) - Relação entremolaridade (M) e normalidade (N) N = M.x, sendo x o número de H ou OH ionizáveis.

- Soluções em porcentagem As soluções em porcentagem são baseadas em 100 mL (ou,ocasionalmente, em 100 g). Quase todas as soluções que você calcular serãosoluções (p/v), nas quais o peso em grama do pó é misturado com o volume em mL. No

entanto, existem 3 modos de de expressar a concentração em porcentagem: 1.porcentagem de peso por volume (p/v). Gramas do soluto por 100 mL do solvente.Exemplo: NaCl 20% (p/v) - dissolver 20 g de NaCl em um dado volume de água (aprox.60 mL) e completar o volume em balão volumétrico de 100 mL. 2. porcentagem porvolume (v/v). mL do solvente por 100 mL de solução. Usado para diluir uma soluçãoestoque concentrada. Diluir uma solução de SDS 10% até 1% (v/v) - 10 mL da soluçãoconcentrada + 90 mL de água. 3. porcentagem por peso (p/p). Gramas do soluto por100 g do solvente. Exemplo: Solução de sacarose a 10% (p/p) – pesar 10 g desacarose e adicionar 90 mL de água.

Modo de preparar soluções: 1. Faça os cálculos apropriados e descubra a massa dosoluto a ser pesada. 2. Pesar em balança analítica, em béquer de tamanho pequeno(40 – 80 mL), a massa calculada. 3. Dissolver o sólido com água destilada. Pode-se

utilizar um bastão de vidro para auxiliar nessa operação. IMPORTANTE: Não esquecerdo volume final da solução no momento de adicionar água ao béquer. Esse volumeadicionado deve estar distante do volume final da solução. 4. Transferir oconteúdo do béquer para o balão volumétrico apropriado. O bastão de vidro pode serutilizado com “direcionador de fluxo”. 5. Realizar a “lavagem” do béquer com águadestilada, sem exceder o volume final da solução, para assegurar que todo o sólidopesado seja transferido ao balão.



6. Ajustar o volume final com o menisco do balão volumétrico. Fechar o balãovolumétrico com a tampa apropriada e homogeneizar. 7. Estocar em recipienteadequado e devidamente identificado. Toda solução, uma vez preparada, deve serCORRETAMENTE identificada. Esta identificação deve ser feita com fica adesivaapropriada e em tamanho que permita uma fácil visualização. Nesta identificaçãodeve constar: - nome da solução (por exemplo, Hidróxido de sódio), - concentraçãoda solução (0,1 M; 20%, etc), - data em que foi preparada, - responsável pelopreparo (Fulano de Tal), - cuidados especiais (por exemplo, “manter sob

refrigeração”) OBS 1. Em alguns casos, dependendo do grau de precisão exigido pelasolução, pode-se utilizar uma proveta ao invés de balão volumétrico. OBS 2. Emoutros casos, como em meios de cultura para microbiologia, a solução pode serpreparada simplesmente adicionando-se o volume de água (medido em proveta) aobéquer contendo o material pesado.

Diluição Diluir uma solução significa adicionar a ela um solvente puro e inúmerasvezes essa operação será fundamental em procedimentos químicos, bioquímicos,microbiológicos, etc. Lei geral da diluição: C1V1 = C2V2 Sendo, C1= concentraçãoda solução inicial C2= concentração da solução final (nova solução) V1= volume dasolução inicial a ser medido (esta é a incógnita da equação!!!) V2= volume final(volume que se deseja preparar) Exercícios: 1. Preparar 100 mL de uma solução 0,1Mdo sal fictício XY, cuja massa molar é 30 g, utilizando balão volumétrico. 2.

Preparar 40 mL de uma solução 5% (p/v) do sal fictício XY, utilizando proveta paraaferição do volume. 3. Preparar 10 mL de uma solução 0,2 M do sal fictício XY apartir de uma solução concentrada a 1M.




Aula 7: UTILIZAÇÃO DE PROTOCOLOS, CATÁLOGOS E INTERPRETAÇÃO DE RÓTULOS DEREAGENTES. ARMAZENAMENTO DE PRODUTOS QUÍMICOS

Protocolos Os protocolos são as “receitas” que devemos usar para a realização deum experimento. Um protocolo pode ser obtido de: - outro pesquisador/aluno/colega

de laboratório: o melhor lugar para conseguir um protocolo é de outro investigadord laboratório, pois o protocolo será apropriado para os recursos e a especialidadedo laboratório, podendo conter detalhes importantes sobre os detalhes doexperimento. - um livro de protocolos: existem muitos manuais de laboratóriosdisponíveis comercialmente, com protocolos simples e claros para muitos campos dabiotecnologia. Os manuais do laboratório ou do curso também são uma boa fonte paraprotocolos simples. A desvantagem de protocolos comerciais é que você terá queadequá-lo ao seu laboratório. - seção de “materiais e métodos” dos artigoscientíficos: esse é o lugar menos confiável para achar um protocolo. Essas seçõessão notórias pela ausência de detalhes que são deixados de lado devido a problemasde espaço ou por “outros motivos”. Quando você for fazer um experimento a partirde um protocolo novo algumas considerações são importantes: - leia o protocoloatentamente para ver se ele faz sentido para você. Faça o experimento mentalmente,

passo a passo. Certifique-se que você está, de fato, entendo cada passo. - mude oprotocolo conforme suas necessidades e reescreva-o. Isso serve para tornar ospassos mais compreensíveis ou alterar algum equipamento conforme a necessidade.“Decodifique” a linguagem do protocolo para a sua linguagem. - prepare todos osreagentes listados no protocolo e certifique-se de ter tudo o que precisa.Certifique-se que todos os reagentes estão preparados e na concentração exigida.Assegure-se que os equipamentos que você precisará não estarão sendo usados quandovocê precisar deles! - siga o protocolo exatamente na primeira vez que fizer oexperimento. Se não der certo, repita, e só então, em não dando certo novamente,faça alterações. Tente não ser uma variável do experimento.



Interpretação de rótulos de reagentes Os rótulos de reagentes fornecem algumasinformações que orientam o biotecnologista no preparo do reagente. Fornecem umaquantidade menor de informações que o catálogo, mas na falta dele ofereceinformações básicas importantes (fórmula, peso molecular e densidade). Além disso,observando-se o rótulo pode-se ter uma idéia da toxicidade e dos cuidados que sedeve ter ao manusear o reagente. À seguir, alguns pictogramas normalmenteencontrados em rótulos de reagente

Armazenamento de produtos químicos Para armazenamento de produtos químicos, deve-se considerar as características de todas as substâncias, prevenindo, desta forma,a ocorrência de eventuais acidentes no laboratório. Estes produtos devem seragrupados por espécies químicas e não por ordem alfabética. Assim, é possívelsepara-los em categorias: - inflamáveis, - tóxicos, - explosivos, - corrosivos, -oxidantes, - gases.

Dicas gerais: - os solventes perigosos (clorofórmio ou éteres não estabilizados)ou inflamáveis (éteres, cetonas, ésteres) não devem ser estocados em grandesquantidades. - anotar a data de chegada de todos os reagentes e deixar apenas aquantidade mínima destas substâncias no laboratório, verificando a data devalidade de cada substância.



- armazenar sempre nos recipientes ou frascos originais. - armazenar os agentescorrosivos em uma prateleira baixa ou em armários especialmente separados paratais substâncias. - Os produtos químicos devem ser armazenados em área fria, secae ventilada. - Não transformar as bancadas em armários!!



UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA DA UFRGS Curso deBiotecnologia Fundamentos de Laboratório Professor: Charley Christian Staats Aula8: SEPARAÇÃO SÓLIDO/LÍQUIDO (decantação e filtração) LAVAGEM DE MATERIAIS DELABORATÓRIO Separação sólido líquido A – Decantação Um dos métodos mais simples deseparação de misturas heterogêneas em laboratórios é a decantação. A decantaçãoserve para a separação de misturas heterogêneas, sejam misturas heterogêneassólido-líquido ou misturas heterogêneas líquido-líquido. No caso da decantaçãosólido-líquido, deixa-se o sólido sedimentar no fundo do béquer e então,

cuidadosamente, verte-se a maior parte do líquido para outro béquer, com auxíliode um bastão de vidro, conforme a figura 1.

B- Filtração Um dos problemas comuns em laboratórios é separar um líquido de umsólido. Frequentemente utiliza-se a filtração para este fim. A filtração consistena separação de um



sistema bifásico fazendo-se passar a fase líquido (filtrado) através de um meioque retenha a fase sólida (precipitado). O filtro mais econômico é o de papel. Umadas maneiras de preparar o papel filtro é a seguinte: - o papel filtro cortado deforma circular é dobrado pela metade e depois esta metade é novamente dobrada,adquirindo aproximadamente um quarto do tamanho original. A segunda dobra deve serfeita de maneira que fique um intervalo de 5 mm entre as duas pontas, como nafigura 2.1.

- Em seguida, abre-se o papel de tal maneira que adquira a forma de um cone ecoloca-se no funil de modo que o corte no papel fique aderido ao vidro. Par umarápida filtração, o papel deve ser ajustado no funil de modo que o ar não penetreentre o papel e o funil. Para isso, coloca-se um pouco de água destilada sobre opapel para ajustá-lo às paredes do funil, conforme a figura 3. Quando o funilestiver bem selado, o líquido ficará retido na coluna do funil e o seu pesoajudará a puxar o líquido através do papel.

- A fim de não perder material, deve-se usar a técnica da figura 4. Cuide para quea superfície do líquido dentro do funil não alcance o topo do papel.



- O processo de filtração pode ser acelerado através de uma filtração por sucção,a chamada filtração a pressão reduzida. Como neste processo a sucção é forte, énecessário um funil especial, chamado funil de Büchner. Neste caso, o papel não édobrado. O papel, de forma circular, é cortado de maneira que fique a meiadistância entre a última linha de furos e a parede do funil, nunca podendo “subirpelas paredes” do mesmo, o que causaria vazamentos. Para a obtenção do vácuonecessário para este tipo de filtração pode se usar uma trompa d’água ou um bombade vácuo. (figura 5).

Lavagem de materiais de laboratório A lavagem de materiais (vidrarias e outrosinstrumentos) é um procedimento extremamente importante em qualquer laboratório.Desta operação, certamente, dependerá o sucesso de todos os experimentosfuturamente realizados com a vidraria em questão. Todo material utilizado em algumexperimento, depois de devidamente descartado o resíduo do experimento, deverá sercuidadosamente lavado com água corrente em abundância (água comum), detergente eescova/esponja. Depois disso, deverá ser extensivamente enxaguado com águadestilada. Só depois dessas operações é que o material poderá ser colocado nolocal de secagem.



- existem no mercado várias escovas próprias para lavagem de materiais delaboratório e você deverá escolher aquela que melhor se adaptar ao material a serlavado. - na lavagem dos materiais é comum a utilização de detergentes de cozinha(detergente comum), principalmente por estes serem de preços mais acessíveis. Noentanto, existem detergente próprios para a lavagem de materiais de laboratório.No mercado são encontradas várias marcas diferentes com os mais variados preços. Omais utilizado é o Extran , que pode ser encontrado na forma alcalina, ácida eneutra, a qual será escolhida conforme o tipo de material a ser lavado. - é

prática comum durante as operações de lavagem o laboratorista recorrer aoartifício de deixar o material “de molho”, ou seja, imerso em uma solução de águacom detergente por algum tempo, para facilitar a operação de lavagem. - em algunscasos, quando o material a ser lavado está com resíduos firmemente aderidos a suasuperfície, o laboratorista pode recorrer ao emprego de soluções extremamentecorrosivas, como a conhecida Solução Sulfocrômica. Essa solução é composta porácido sulfúrico concentrado e dicromato de potássio e é efetiva na limpeza demateriais que estejam sujos com matéria-orgânica (proteínas, açúcares, etc). Noentanto, o uso deste tipo de solução tem sido desaconselhado, principalmente pelospotencias efeitos carcinogênicos do cromo em humanos, o que torna a suamanipulação altamente arriscada. Além disso, essa solução é muito corrosiva eexige atenção redobrada durante a manipulação. - uma vez limpo o material, estedeverá ser abundantemente enxaguado com água destilada. Essa operação é crítica,

pois nenhum resíduo do material utilizado no experimento ou durante a lavagempoderá permanecer presente no material, sob risco de interferir nos futurosexperimentos. Portanto, não economize na água destilada. Quando trabalha-se comproteínas, é aconselhável, antes desta operação de enxágüe com água destilada,realizar um enxágüe preliminar com hidróxido de sódio 0,1 M. - em experimentos deBiologia Molecular é aconselhável, em sendo possível, não reutilizar os materiaisque são descartáveis, pois quantidades-traço de DNA poderão não ser devidamenteeliminadas pela lavagem e acabaram interferindo nas análises seguintes.




Aula 9: ESTERILIZAÇÃO E ASSEPSIA (autoclaves, capela de fluxo laminar, luz UV,estufas e gases) Em muitas operações utilizadas em Biotecnologia é estritamentenecessário que se trabalhe em condições estéreis, ou seja, sem a presença denenhum organismo contaminante, ou, no máximo, com a presença de apenas umorganismo (o seu organismo de trabalho). Autoclaves As autoclaves funcionam

submetendo o material a altas temperaturas (maiores que 100ºC), que são atingidasgraças ao aumento da pressão interna do equipamento. Se você não estiverfamiliarizado com a operação da autoclave em questão, peça auxilio a um colega quejá tenha trabalhado com a autoclave. IMPORTANTE: apesar de o princípio deutilização de todas as autoclaves ser o mesmo, cada autoclave possuicaracterísticas próprias e por isso, na primeira vez que você for usa-la, éimportante que alguém o acompanhe. Dicas de utilização: - Verifique se o frasco ourecipiente que você vai autoclavar é resistente à temperatura que será usada. Emgeral, utiliza-se temperatura de 121ºC por 15 – 30 minutos. - Deixe livre pelomenos, um quarto do volume do frasco ou do recipiente. Assim haverá espaço paraque os líquidos fervam e, mais do que isso, é o ar presente neste espaço oresponsável pela esterilização (o princípio pelo qual a autoclave eliminamicrorganismos é o calor úmido). - Certifique-se que as tampas estejam frouxas

para prevenir que o aumento da pressão interna quebre o frasco e para permitir aentrada do ar úmido. - Cole um pedaço de fita para autoclave (se o seu laboratóriotiver a fita) em cada item a ser autoclavado. Esta fita é sensível ao calor emostrará alteração de cor somente após o processo. Modo de uso da autoclave: -ligue a autoclave na rede elétrica, certificando-se da voltagem correta. - coloqueágua no interior da autoclave. A quantidade de água varia de equipamento paraequipamento, mas, em geral, existe uma indicação do nível mínimo de água que aautoclave deve conter. É fundamental que a resistência esteja toda coberta pelaágua. Essa



operação é fundamental, se ela não for corretamente realizada a resistência daautoclave será destruída durante o processo. - ligue a chave seletora da autoclaveno “no máximo” para que a água comece a aquecer. Essa operação pode ser feitaalguns minutos antes de o seu material estar pronto, para que no momento decolocar o material a água já esteja quente. Isso fará você ganhar alguns minutos.- coloque o material a ser autoclavado no cesto da autoclave, não esquecendo doscuidados que foram explicados acima. - feche e aperte bem a tampa da autoclave,mas não ao ponto de ter dificuldade na hora de abri-la novamente. Certifique-se

que a válvula lateral, responsável pelo controle da pressão ESTEJA ABERTA NESTEMOMEMENTO. - quando a saída de vapor d’água for perceptível, indicando que asaturação do ar interno com água foi atingida, feche a válvula lateral. Agora aautoclave está completamente vedada e a pressão e a temperatura internas começarãoa subir (isto pode ser acompanhado pelo manômetro. - quando a temperatura desejadafor atingida, coloque a chave seletora no médio e comece a contar o tempo. -passado o tempo devido, desligue a chave seletora e espere a autoclave retornar atemperatura ambiente naturalmente. NÃO ABRA VÁLVULA NENHUMA! - quando a pressãobaixar completamente a autoclave pode ser aberta. Mas tenha cuidado, pois omaterial estará extremamente quente. Use luvas termorresistentes. Estufas Aesterilização de alguns materiais também pode ser feita em estufas. Neste caso, emvirtude de o calor seco ser menos eficiente que o calor úmido, empregam-setemperaturas mais elevadas e tempos mais longos. O material a ser esterilizado, em

geral utensílios, deve ser recoberto com papel. Esterilização com gases Uma formade esterilizar materiais, principalmente em experimentos de cultura vegetal, éutilizar gases com atividade antimicrobiana. Utilizam-se pastilhas de formalina(formaldeído) que são colocadas em uma câmara fechada juntamente com o material aser esterilizado. Com a sublimação da pastilha libera-se o gás responsável pelaesterilização. Capelas de fluxo laminar Em virtude de o ar atmosférico estar cheiode poeira e de microrganismos é necessário trabalhar em um ambiente que estejalivre destes agentes contaminantes. Uma alternativa interessante contornar esteproblema é trabalhar em uma capela de fluxo laminar, que promove a filtração e arecirculação do ar no ambiente de trabalho. O fluxo de forma uma “cortina” queimpede a passagem de ar externo para dentro da capela e de dentro para fora. Issoprotege o manipulador do conteúdo da capela e protege o experimento do ambienteexterno. Modo de trabalho: - antes de iniciar o trabalho na capela de fluxo

laminar ligue a lâmpada ultravioleta que existe na capela. Este tipo de luz possuiatividade microbicida, ou seja, elimina os microrganismos que possam estarpresentes na capela (Nota: apesar de existirem



controvérsias quanto a eficiência deste procedimento, ele ainda é amplamenteutilizado). A lâmpada deve ficar acesa por aproximadamente 15 minutos, durante osquais você não deverá colocar as mãos dentro da capela, pois a luz UV provocasérias queimaduras. - Desligue a lâmpada UV e ligue a circulação de ar da capela.- Baixe o vidro da abertura da capela. - Limpe a superfície da capela com etanol70%. - Coloque o material para dentro da capela. - Inicie o trabalho. Dicasimportantes: - nunca obstrua o fluxo de ar da capela com papéis, instrumentos ouequipamentos. - se precisar colocar uma tampa estéril esterilizada na superfície

da capela, coloquea virada para vaixo. - evite movimentos com as mãos para dentroe para fora da capela. - evite usar fogo dentro da capela, apesar de isso, àsvezes, ser necessário.



UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA DA UFRGS Curso deBiotecnologia Fundamentos de Laboratório Professor: Charley Christian Staats Aula10: PURIFICAÇÃO DE ÁGUAS (água destilada, deionizada e ultra-pura) A água é umimportante componente das soluções e não simplesmente um líquido onde se dissolvemas coisas. A qualidade da água, a composição e o pH podem afetar drasticamente osexperimentos. Não faltam exemplos de experimentos que não apresentarem osresultados esperados em virtude da má qualidade da água utilizada. Existem váriasclassificações gerais da qualidade da água de acordo com seu grau de pureza: 1.

Água de torneira: a qualidade dessa água varia muito e sua composição depende dalocalização geográfica da fonte, da época do ano, da quantidade de chuva, dacomposição dos canos, etc. Alguns minerais podem inibir reações enzimáticas ouimpedir o crescimento celular. Por isso, ela não deve ser usada, a não ser paralavagem de vidrarias e utensílios de laboratório. 2. Água com grau de laboratório:esta é a água adequada para preparar soluções e fazer os experimentos. Ela foipreviamente tratada por algum dos métodos conhecidos, a citar: Água destilada: Adestilação é um processo há muito estabelecido para a purificação da água, no quala água é aquecida até evaporar e o vapor é condensado e recolhido. O equipamento érelativamente econômico, mas tem um grande consumo de energia – usa tipicamente1kW de eletricidade por litro de água produzida. Dependendo do design dodestilador, a água destilada pode ter uma resistividade de aproximadamente 1 MΩ-cme será estéril quando acabar de ser produzida se for utilizado equipamento

especificamente concebido para o efeito, mas não continuará estéril sem umarmazenamento muito cuidadoso. Além disto, impurezas voláteis como dióxido decarbono, sílica, amoníaco e uma variedade de compostos orgânicos passarão para aágua destilada. Quais são as desvantagens da destilação? A destilação produz águapurificada lentamente. Não é um processo de resposta a pedido. Por este motivo, énecessário destilar uma determinada quantidade de água e armazená-la para utilizarmais tarde. Este armazenamento da água destilada pode constituir um problema se oreservatório em que a água é armazenada não for fabricado num material



inerte. Os íons ou plastificantes serão lixiviados do reservatório e irãorecontaminar a água. Além disto, as bactérias desenvolvem-se muito bem em água queesteja arada durante algum tempo. Em áreas de água dura, os destiladores têm deser limpos frequentemente com ácido, devido à acumulação de incrustações, a nãoser que a água de alimentação seja pré-tratada. Água deionizada Neste sistemautilizam-se colunas de troca iônica, contendo tanto resinas trocadoras de cátionsquanto resinas trocadoras de ânions, as quais removem os íons inorgânicos da água(Ca+2, Mg+2, Cl-1). Em seguida efetua-se uma destilação normal, para remover os

íons restantes e materiais orgânicos. As colunas de troca iônica devem sertrocadas frequentemente. Água ultra-pura (“água Milli-Q ”) Alguns laboratóriostêm necessidades especiais em relação à água e exigem águas de alto grau depureza. Esta água é obtida pela combinação de processos de osmose reversa (a águapassa por uma membrana semipermeável por onde as impurezas não podem passar) comdeionização. A ultrafiltração, a adsorção em carvão ativo para eliminar matériaorgânica e a luz ultravioleta podem ser usados em alguns equipamentos paracomplementar a purificação deste tipo de água. Experimentos de Biologia molecular,Bioquímica e análises de traços de elementos são exemplos de aplicação deste tipode água. Princípios de osmose reversa A osmose reversa (OR) é um processo queresolve muitos dos problemas da destilação e da troca iônica. Para explicar aosmose reversa, vejamos primeiro a osmose. Este é um processo natural que ocorresempre que uma solução diluída é separada de uma solução concentrada por uma

membrana semi-permeável. A água, levada por uma força causada pela diferença naconcentração – a pressão osmótica – passa através da membrana para a soluçãoconcentrada. O fluxo de água continua até a solução concentrada ficar diluída e acontra-pressão impedir a continuação do fluxo através da membrana (equilíbrioosmótico). Quando é aplicada uma pressão superior à pressão osmótica no lado damembrana onde se encontra a maior concentração, o sentido normal do fluxo osmóticoé invertido, a água pura passa da solução concentrada através da membrana(impermeável às impurezas) e é assim separada dos seus contaminantes. Este é oprincípio básico da osmose reversa.



UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA DA UFRGS Curso deBiotecnologia Fundamentos de Laboratório Professor: Charley Christian Staats Aula11: CENTRIFUGAÇÃO A finalidade de uma centrífuga é separar substâncias imiscíveisem uma mistura heterogênea. E muitos experimentos realizados em Biotecnologiautilizam-se de centrífugas. São usadas para concentrar proteínas, extrair DNA eseparar péletes de células. Importante: a presença de centrífugas em todos oscantos do laboratório não deve ser motivo de descuido. Ela é um instrumentoimportante e complicado que pode ser facilmente danificado e causar ferimento

ferimentos no manipulador, quando for mal utilizada. Existem vários tipos decentrífugas e nos laboratórios elas são normalmente chamadas pelo nome dofabricante. As centrífugas de alta velocidade são construídas com unidade derefrigeração, necessárias devido ao calor gerado pela alta velocidade. Outrascentrífugas estão disponíveis tanto em modelos refrigerados como não refrigerados.O frio também serve para preservar a amostra que está sendo centrifugada. Osprincipais tipos de centrífugas são: - Centrífuga de bancada, - Microcentrífuga, -Centrífuga de alta velocidade, - Ultracentrífuga Regras gerais de trabalho nacentrífuga: - não coloque para centrifugar materiais radioativos, com riscobiológico ou infecciosos antes de ter certeza de que está usando o materialadequado. - Equilibre todos os tubos com seus suportes, tampas, proteção e pinos.Não equilibre somente os tubos e sim todo o sistema. Se for preciso usar um tubopara equilibrar encha- o com água. - Se houver folha de registros, seja meticuloso

ao anotar as informações. Isso é importante para manter um controle sobre o uso doequipamento. - Limpe a centrífuga toda vez que usa-la. Use um pano úmido. -Conheça as limitações de velocidade da centrífuga e do rotor e não ultrapasseesses limites. - Use os tubos e os suportes apropriados. Isso é especialmenteimportante em centrifugações de alta velocidade. Os tubos não devem ficar frouxosnem apertados demais nos suportes ou no rotor. - Preencha os tubos atéaproximadamente 2 cm da borda. Se você encher demais poderá ter vazamentos.



- Não use tubos com qualquer tipo de rachadura. Descarte estes tubosimediatamente. - Não se esqueça de tampar o rotor. - Feche a tampa das centrífugasrefrigeradas no intervalo de uso para evitar condensação. - Remova as amostrar dacentrífuga imediatamente. Nunca deixe as amostras paradas por muito tempo. Opélete pode se tornar disperso. Como centrifugar 1. escolha os tubos apropriadosao volume e à natureza do que você vai centrifugar. Use o menor número de tubospossível e procure usar aqueles de volume mais próximo ao do que você precisa. 2.escolha uma centrífuga e um rotor apropriados a sua amostra. Saiba a que

velocidade a amostra deve centrifugada e se deve ser refrigerada ou não. 3.Equilibre os tubos. Cada tubo deve ser centrifugado com um tubo do mesmo pesocolocado do lado oposto. O mesmo deve ser feito para todo rotor e toda centrífuga.Importante: somente os tubos colocados frente a frente devem ser de mesmo peso.Como equilibrar os tubos: - tubos de microcentrífuga podem ser ajustados pelovolume n não pelo peso. - tubos de ultracentrífuga e centrífugas de altavelocidade devem ser pesados individualmente em uma balança. 4. coloque os tubosna centrífuga, sempre na mesma orientação. Se ele tem uma assimetria, tal como umaaba na borda, coloque sempre cada tubo no suporte da mesma maneira. Dessa formavocê saberá onde procurar o pélete. 5. Coloque a cobertura no rotor. 6. Feche atampa da centrífuga. 7. Programe a centrífuga, ajustando a velocidade deaceleração, o tempo, a temperatura e velocidade de desaceleração. 8. Inicie oprocesso. Espere até que a centrífuga atinja a velocidade programada, só depois se

ausente da sala, pois se houver algum problema de desbalanço esse geralmenteaparece neste intervalo de tempo. 9. Quando a centrifugação terminar, remova ostubos cuidadosamente para não misturar o pélete novamente. 10. Remova osobrenadante. Isso pode ser feito vertendo-se o líquido cuidadosamente ou poraspiração com micropipeta ou pipeta de Pasteur.

Como determinar a velocidade da centrífuga A velocidade da centrífuga será dadacomo força gravitacional (g) ou rotações por minuto (rpm). A força g é tambémchamada RCF (relative centrifuge force- força centrífuga relativa). Os protocolosnormalmente determinam a velocidade em g, pois esta pode ser reproduzidafacilmente, ao contrário das rotações por minuto.



UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA DA UFRGS Curso deBiotecnologia Fundamentos de Laboratório Professor: Charley Christian Staats Aula12: Potenciometria (medida de pH) Em inúmeros casos, dentro da área deBiotecnologia, é fundamental conhecer o potencial Hidrogeiônico (pH) do materialem questão. E isso normalmente deve ser realizado de forma rápida e precisa. Paratanto, utiliza-se um aparelho chamado potenciômetro (pHmetro), que permite amedida direta do pH das soluções (materiais) em questão. A grande maioria dospHmetros utilizados em Biotecnologia utiliza eletrodos indicadores de vidro, de

forma combinada , ou seja, o eletrodo indicador e o eletrodo de referência estãocombinados em um única peça. Procedimentos para medida de pH utilizando pHmetrosequipados com eletrodos indicadores de vidro Antes da medição: 1. remover a capaplástica de vedação do orifício usado para enchimento do eletrodo de modo aestabelecer equilíbrio com a pressão atmosférica; 2. retirar a capa plástica queprotege o bulbo de vidro durante a estocagem, ela contém KCl 3M que garante ahidratação da membrana. Enxaguar o eletrodo com água destilada para retirarresíduos e eventuais cristalizações do sal no eletrodo; 3. Verificar a necessidadede completar o nível da solução interna com a solução de enchimento, normalmenteKCl 3M saturado com AgCl. 4. Calibrar o eletrodo com as soluções-tampão escolhidasconforme a faixa de trabalho desejada. Entre uma solução e outra, lavar o eletrodocom água destilada. A medida é direta e o valor de pH é aquele em que houverestabilização do valor apontado no display. IMPORTANTE: O eletrodo é uma peça

extremamente frágil e cara. Por isso manipule-o cuidadosamente. Use apenas osdedos na sua limpeza. Na medição: 1. mergulhar o eletrodo de modo que sua junçãofique abaixo do nível da solução a ser medida.IMPORTANTE: O pH varia em função da temperatura. E existe uma grande variaçãoentre os aparelhos no que diz respeito ao ajuste de temperatura, por isso procurese informar da forma com que o ajuste deve ser feito no aparelho que você iráutilizar.



UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA DA UFRGS Curso deBiotecnologia Fundamentos de Laboratório Professor: Charley Christian Staats Aula13: ESPECTROSCOPIA VISÍVEL/ULTRAVIOLETA A espectroscopia visível/ultravioleta éuma ferramenta amplamente utilizada em experimentos químicos, bioquímicos,microbiológicos, etc, uma vez que inúmeras metodologias analíticas se baseiam naabsorção da luz polarizada pelas espécies analisadas. FUNDAMENTO A Espectroscopiapode ser conceituada como um procedimento analítico através do qual se determina aconcentração de espécies químicas mediante a absorção de energia radiante (luz). A

luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatória,caracterizada pelos diversos comprimentos de onda ( , expressos em nm,normalmente) e que apresenta a propriedade de interagir com a matéria, sendo queparte de sua energia é absorvida por elétrons da eletrosfera dos átomosconstituintes das moléculas. Uma solução quando iluminada por luz branca,apresenta uma cor que é resultante da absorção relativa dos vários comprimentos deonda que a compõem. Esta absorção, em cada comprimento de onda, depende danatureza da substância, de sua concentração e da espessura da mesma que éatravessada pela luz.



Esquema simplificado de um sistema espectrofotométrico - a luz emitida por umafonte (normalmente uma lâmpada de tungstênio para comprimentos de onda no visívele de Deutério no ultravioleta) passa por um monocromador que seleciona apenas ocomprimento de onde desejado (luz monocromática). A luz atinge a amostra, decomprimento de onde b. Alguma quantidade de luz é absorvida de forma que I0 > I. Aluz que não é absorvida é detectada por uma célula fotoelétrica e medida em umgalvanômetro. Quando a luz (I0) é absorvida pela amostra a sua intensidade diminui(I).

b

Io

I



Relação entre cor observada e cor absorvida Comprimento de onda Cor absorvida (nm)380 – 440 Violeta 440 – 500 Azul 500 – 550 Verde 550 – 580 Amarelo 580 – 620Laranja 620 – 680 Vermelho 680 - 780 Roxo

Cor observada Amarelo Laranja/vermelho Roxo/violeta Violeta/azul Azul Azul/verdeAzul

A lei de Beer A Lei de Lambert-Beer é a lei que rege a espectroscopia e diz o

seguinte: a absorbância é proporcional à concentração da espécie químicaabsorvente, sendo constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelofeixe luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relação linear entre absorbânciaou densidade ótica e concentração, e de uma relação logarítmica entretransmitância e concentração. A lei de Beer: A = a.b.c sendo A= Absorbância(adimensional – sem unidade) a = coeficiente de extinção molar (constante) b=espessura atravessada pelo feixe luminoso c= concentração

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