Markeri genetici si proteomici in ADTehnici de genetica moleculara si proteomicaGenele critice in AD si repartitia lor cromozomalaCromozomii purtatori ai genelor critice in ADCariotipare clasica- nu este relevanta in analiza indivizilor suspectati ADCitogenetica moleculara Citogenetica moleculara si fluorescenta obtinuta in urma hibridizarii in situ acromozomilor (FISH-Fluorescent in situ hybridization) ofera informatii despre organizarea genelor; ajuta cercetatorii sa localizeze si detecteze alterarile cromozomale, cum arfi rearanjamentele, deletiile; acestea altereaza morfologia cromozomalacare insa nu e vizibila prin metoda de cariotipare clasica; informatiile referitoare la aceste aspecte de instabilitate genomica suntutile in diagnosticul unor boli de reproducere, oncologie etcMetode de genetica molecularaA. RESTRICTIA ADNSouthern blotting(hibridizarea ADN cu sonde marcate formate din fragmente ADN)Southern blotting. DNA este tratat cu enzime de restrictie; fragmentele ADN rezultate sunt fragmentate printr-ungel de agaroza; dupa separarea electroforetica se poate marca ADN cu bromura de etidiu; probele ADNnemarcate se denatureaza in catene separate. Gelul astfel tratat se amplaseaza pe un suport cu hartie de filtrusaturat cu tampon avand tarie ionica mare (se supune fortelor de suctiune prin cpilarele h de filtru, pentrublotarea fragmentelor ADN in dreptul pozitiei de migrare in gelul initial). Pe gel se plaseaza h de nitrocelulozasau un filtru de nylon, peste care se aseaza un tesut pentru a initia procesul de adsorbtie. Catenele de ADN suntstopate de h de nitroceluloza. Pozitia fragmentelor ADN pe hartie reflecta pozitia ADN in gel, dupa fractionaareainitiala prin electroforeza. Aceste fragmente sunt analizate prin hibridizarea cu sonde marcate (monocatenare,care complementeaza secventa omoloaga infragmentul ADN de nalizat)B. Amplificarea ADN, metoda PCRPrincipiul metodei PCRCurbele tipice in RTPCRRezultatele RTPCRSecventierea ADN: marcare si amplificare,electroforezaMicroarrayChip de detectie fluorescenta a secventei ADNC. Analiza ADN/ARN/Proteine: western blottingD. Metode biochimice-metabolomicehplcEchipamente si etape in desfasurarea analizei HPLCE. Proteomica:Principiul MSSpectrometria de masa este o tehnica utila in analiza structurilorchimice subtile ale moleculelor si compusilor bioactivi.Are valoare de validare a secventei in aminoacizi a proteinelor,peptidelor/oligopeptidelor si in acelasi timp in validarea modificariilor postranslationale (epigenetice) precum atasarea grupeimetil/acetil/ubiquitil, sumoil etc in resturi de aminoacizi specialipentru definirea unui genotip represiv/activ transcriptionalMALDI- TOF principiul de detectie a proteinelor fractionate prin HPLCAbordari actuale proteomiceVizeaza utilizarea metodelor high-throughputprin utilizarea chip-urilor cu aranjamente de proteine marcate (array)in vederea studiului structurii si functiilor proteinelor si identificarea unor proteine noi intr-un material biologic prin spectrometrie de masa;In acest mod se realizeaza activitati de cercetare, iar proteinele candidat pentru un diagnostic potfi validateDetectia de rutina se poate realiza ulterior prin metode genetice, chimice sau imunochimiceMetode si tehnici de proteomica in sistem microarrayactualmente se distingprin capacitatea deautomatizare,computerizare,miniaturizare,dispunere a sondelor inaranjamente de tiparray-pe chipuriProfil proteomic obtinut prin western-blottingin studiile bolilor neurodegenerativeVizualizarea formelor Abeta agregate si solubile prin tehnici imagistice (A) si prin tehnici imunochimice (hibridizare de tip Western blotting (B)ABMicroarrayPrincipiul microarrayCopyright restrictions may apply.Britschgi, M. et al. Arch Neurol 2009;66:161-165.Expression patterns of Alzheimer disease (AD) signature proteins discriminate between plasmasamples from patients with AD and controlsMETODE EPIGENETICEMSPCR-PCR specific de metilare-estimeaza gradul de metilare in situ-intr-o gena sau fragment reglator de gena (promotor)GENOTIPARE de susceptibilitate(SNP-single nucleotide polimorfism)personalizareSNP-mutatia punctiforma intr-o alela care se regaseste mai frecvent (peste 1%)la nivel populational (o mutatie familiala are frecventa mai mica decat 1%)Asigurarea stabilitatii genomice/metilomuluiin functie de aportul nutritional/stil de viata/genotipul personalizat (SNP-uricare controleaza activitatea enzimelor implicate in metabolismul grupei metil) Influenta dietei bogate/sarace in folati (donori de grupe metil)si a activitatii enzimei critice MTHFR asupra proceselor de metilare ADN si implicit asupra stabilitatii genomiceUtilitatea markerilor genetici polimorficiSNPSNP pot fi indicative pentru raspunsul unei populatii purtatoare a uneialele specifice fata de:stimuli ambientali si anumiti patogeni sau susceptibiltati la diverse boli.Sunt markeri utili in dezvoltarea de scheme de diagnostic in algoritmi siin scheme de tratamente personalizateMetabolismul colineiMetabolismul colinei. Enzimele sunt reprezentate prin coduri numerice EC : 1.1.99.1, colin dehidrogenaza 1.2.1.8, betaina-aldehid dehidrogenaza; 2.1.1.5, betaina-homocisteina S-metiltransferaza; 2.1.1.13, metionin sintaza 2.1.1.17, fosfatidiletanolamina N-metiltransferaza; 2.1.1.37, ADN (citozina-5-)-metiltransferaza 2.3.1.6, colina O-acetiltransferaza 2.5.1.6, metionina adenosiltransferaza 2.7.1.32, colin kinaza 2.7.7.15, colin-fosfat citidiltransferaza cytidylyltransferase; 2.7.8.2, diacilglicerol colinfosfotransferaza3.1.1.4, phospholipase A2; 3.1.1.5, lizofosfolipaza 3.1.4.2, glicerofosfocolin fosfodiesteraza 3.1.4.3, fosfolipaza C 3.1.4.4, fosfolipaza D; 3.3.1.1, adenozilhomocisteinaza THF, tetrahidrofolat; PtdEtn, fosfatidiletanolaminaDeficienta in colina afecteaza dezvoltarea creeruluiGena MTHFR Locus cromozomal 1p36.3 DNA codificator: 2,2kb , 11 exoni Produsul genei: enzima MTHFR 656AA;74,5kDa Forma activa este un dimer cu 2 domeniimajore- N-terminal (catalitic) si C- terminal(reglator)Polimorfismul C677T in gena MTHFR Lxooul 4 . 677 C - - - 1, alaoloa - - - valloa LfecLul. forma Lermolablla, locLablla, a eozlmel HomozlgoLll 11 . prezloLa o acLlvlLaLe mal claba V1HFP -J6-6O faLa de cea oormala aceacLa forma ecLeacoclaLa cu cooceoLraLle mare de HomoclcLeloaPollmorflcmul 1298C polymorpHlcm lo geoa Lxooul 7. 1298 A ---C, gluLamaL ---alaoloaHomozogoLll CC - prezloLa o ccadere claba a acLlvlLaLll 6O)-Nu ecLe acoclaL cu crecLerea HooceoLraLlel lo Hclc-LfecLul. de oblcel ecLe lo combloaLle cu efecLul pollmorflcmululC6771-HeLerozlgoLll cu ambele pollmorflcme. prezloLa o crecLerecemolflcaLlva a Hclc, lo parLlcular- lo coodlLllle uoel cooceoLraLllccazuLe de folaLlMetoda-Reverse hybridization - pentru analizapolimorfismelor in gena pentru MTHFR C677 si A1298A- homozigota pentru MTHFR 1298C MutB- heterozigota pentru MTHFR C677 WT si MTHFR 677T MutC- heterozigota pentru MTHFR A1298 WT si MTHFR 1298C MutD- homozigota ptr MTHFR 1298C MutE- homozigota ptrMTHFR C677 WTF- homozigota ptr MTHFR A1298SNP-MTHFR-C677T estefoarte comun.-Cca 40% din populatie estehomozigota pentru tipul salbaticC677,-45% este heterozigota pentruambele alele C677 si T677; iar --cca 15% sunt homozogotipurtatori ai alelei cu mutatiaT677.Factorii epigenetici studiati: procesele de metilare ADN. La nivel global, unproces de instabilizare genomica este frecvent asociat cu hipometilarea ADN.La nivel local, in gene critice, procesul de metilare ADN aberant este asociatcu hipermetilarea promotorilor.Metoda de estimare a hipometilarii globale ADN utilizeaza perechi de enzimeisoschizomereex. (MspI/HpaII) si este abordata pentru estimareacomparataiva a profilelor de restrictie a ADN genomic.Hipometilarea aberanta ADN global este frecvent asociata cu aneuploidii si cufenomene de anafaze timpurii sau disocieri promature de cetromeri (cromatidesurori)-PCD.Metoda de estimare a hipermetilarii (methylation specific PCR-MSPCR) estedeseori asociata cu silentierea aberanta a unor gene critice precum cele caresunt implicate in metabolismul si activitatea hormonala. O astfel de genacritica in cancerogeneza si in imbatranire este gena pentru receptorul deestrogen (ESR). Hipermetilarea promotorului acestei gene a fost asociata cucancerul mamar, endometrial si cu imbatranirea.ACE- angiotensin converting enzyme (peptidyl-dipeptidase A)1 Locuc cromozomal . 17q2J.J Pegluoea A0N codlflcaLa. 21 kb -26exool Producul geoel ACL. eozlma ACL,,cooLloe1JO6 aa,, ecLe o pepLlda cu rol decemoallzare lo axa raacooLloe doua domeoll caLallLlceC-Lermloal reprezloLa approxlmaLlv 76dlo capaclLaLea caLallLlca N-Lermloal-ecLe foloclL lo loacLlvareaLbradykloloel, oeuroLeocloel cl acubcLaoLel-PPol.ecLe o eozlma proLeollLlca cooverLecLeforma loacLlva a aogloLeocloel ll loLr-oforma acLlva vacocoocLrlcLoare) ,loacLlveaza bradykloloa cl kallldloavacodllaLaLoare)ACE-structura 3DA. Titia Lely2007 Polimorfismul genei ACE: insertie-deletie(I/D) a unui segment de baze dedimensiunea 287 pb in intronul 16Genotipul ACE DD a fost asociat cu concentratia crescuta in plasma aenzimei ACE circulante, ceea ce determina conversia mai eficienta aangiotensinei I la IIPattern-ul electroforetic al polimorfismelor ACEI/DL- LadderID- heterozigot (insertie/deletie)DD- homozigot (deletie)II- homozigot (insertie)Bolile neurodegenerative, precum boala Alzheimer nu potfi inca diagnosticate pe baza abordarilor standardizategenetice, biochimice, epigenetice, metabolomiceMetoda gold-standard- imunohistochimia aplicata tesutuluide creer postmortemPreventia, monitorizarea progresiei bolilorCercetare/validare gene-proteine candidatAbordarea GWAS:Genome wide association screeningMulte gene/multifactorial/complex/algoritmic/modele matematiceAbordari microarray