50566864-NTC5732

NORMA TÉCNICA NTC COLOMBIANA 5732

2009-12-16

DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS QUÍMICOS. ENSAYO CUANTITATIVO DE SUSPENSIÓN PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD BACTERICIDA DE PRODUCTOS PARA EL TRATAMIENTO POR FROTACIÓN Y LAVADO HIGIÉNICO Y QUIRÚRGICO DE LAS MANOS. MÉTODO DE ENSAYO. REQUISITOS (FASE 2/ETAPA 1) E: CHEMICAL DESINFECTANTS AND ANTISEPTICS-

QUANTITATIVE SUSPENSION TEST FOR THE EVALUATION OF BACTERICIDAL ACTIVITY OF PRODUCTS FOR HYGIENIC AND SURGICAL HANDRUB AND HANDWASH USED IN HUMAN MEDICINE –TEST METHOD AND REQUIREMENTS (PHASE 2/STEP1).

CORRESPONDENCIA: esta norma es una adopción idéntica

(IDT) de la EN 12054:2001. DESCRIPTORES: investigación; desarrollo; innovación;

proyectos; requisitos; planificación; beneficios.

I.C.S.: 11.080.20 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC) Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435

Prohibida su reproducción Editada 2009-12-24

PRÓLOGO El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último caracterizado por la participación del público en general. La NTC 5732 fue ratificada por el Consejo Directivo de 2009-12-16. Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través de su participación en el Comité Técnico 81 Desinfectantes y productos afines para uso hospitalario. 3M DE COLOMBIA S.A. ALKAMEDICA B BRAUN MÉDICAL BIOCONTROL LTDA. CENTRO DE MEDICINA NAVAL CLÍNICA SHAIO COMPENSAR ELECTROQUÍMICA WEST, ELECTROWEST GRUPO CENTRALES DE ESTERILIZACIÓN HOSPITAL DE LA VICTORIA HOSPITAL SANTA CLARA INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS -INVIMA JOHNSON & JOHNSON DE COLOMBIA

JOHNSON DIVERSEY COLOMBIA LTDA. JONSON DIVERSEY COLOMBIA LAB EUFAR LABORATORIO SFC LTDA. LAOREM INTERNACIONAL LABORATORIO NULAB LTDA PRODUCTOS PERFEX LTDA Y FULLER MANTENIMIENTO S.A. QUIRUMÉDICAS SOPSALUD-SOCIEDAD DE PROFESIONALES DE LA SALUD LTDA. SOPSALUD-SOCIEDAD DE PROFESIONALES DE LA SALUD LTDA. TEJADA TRADING

Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las siguientes empresas: ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE ENFERMEROS EN CONTROL DE INFECCIONES-ACECI CLÍNICA DEL CAMPESTRE ELECTROWEST ELECTROQUÍMICA WEST S.A.

INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS -INVIMA- JOHNSON & JOHNSON DE COLOMBIA S.A. JOHNSON DIVERSEY COLOMBIA LTDA.

LABORATORIO SFC LTDA. LABORATORIOS EUFAR S.A. LAOREM INTERNATIONAL LTDA.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA SECRETARÍA DISTRITAL DE SALUD UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.

DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 5732

CONTENIDO

Página 1. ALCANCE ....................................................................................................................1 2. REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................1 3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES .....................................................................................2 4. REQUISITOS................................................................................................................2 4.1 GENERALIDADES.......................................................................................................2 4.2 FRICCIÓN HIGIÉNICA DE MANOS.............................................................................3 4.3 LAVADO HIGIÉNICO DE MANOS...............................................................................3 4.4 FRICCIÓN QUIRÚRGICA DE MANOS ........................................................................3 4.5 LAVADO QUIRÚRGICO DE MANOS ..........................................................................3 4.6 FRICCIÓN HIGIÉNICA DE MANOS Y LAVDO HIGIÉNICO DE MANOS...................... 5. MÉTODO DE ENSAYO 5.1 PRINCIPIO....................................................................................................................3 5.2 MATERIALES Y REACTIVOS .....................................................................................4 5.3 EQUIPOS Y MATERIALES DE VIDRIO ......................................................................7 5.4 PREPARACIÓN DE LAS SUSPENSIONES Y LAS SOLUCIONES

PARA ENSAYO............................................................................................................8 5.5 PROCEDIMIENTO......................................................................................................10 5.6 CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS .........................................................14 5.7 CONCLUSIÓN............................................................................................................17 5.8 INFORME DE ENSAYO .............................................................................................18


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ANEXOS ANEXO A (Normativo) MÉTODO DE ENSAYO PARA LA VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS DE DILUCIÓN-NEUTRALIZACIÓN Y FILTRACIÓN PORM MEMBRANA.................................20 ANEXO B (Informativo) NEUTRALIZADORES............................................................................................................26 ANEXO C (Informativo) LÍQUIDOS DE ENJUAGUE ...................................................................................................27 ANEXO D (Informativo) EJEMPLO DE UN INFORME DE ENSAYO TÍPICO..............................................................28 ANEXO E (Informativo) CEPAS DE REFERENCIA CORRESPONDIENTE EN OTRAS COLECCIONES DE CULTIVO..........................................................................................................................30 ANEXO F (Informativo) INFORMACIÓN SOBRE LA APLICACIÓN Y LA INTERPRETACIÓN DE LAS NORMAS EUROPEAS SOBRE LOS DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS QUÍMICOS..................31 Tabla 1. Tiempo de contacto para diferentes categorías de producto


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DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS QUÍMICOS. ENSAYO CUANTITATIVO DE SUSPENSIÓN PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD BACTERICIDA DE PRODUCTOS PARA EL TRATAMIENTO POR FRICCION Y LAVADO HIGIÉNICO Y QUIRÚRGICO DE LAS MANOS. MÉTODO DE ENSAYO REQUISITOS (FASE 2/ETAPA 1) 1. ALCANCE Esta norma establece un método de ensayo y los requisitos para determinar la actividad bactericida mínima de productos para fricción (sin agua) y lavado de las manos, para el tratamiento poscontaminación de las manos, o para la desinfección quirúrgica de las manos. Campo de aplicación: se emplea en las áreas y situaciones donde se indica médicamente la desinfección de las manos. Tales indicaciones se presentan en el cuidado del paciente, por ejemplo: - en hospitales, en instalaciones médicas comunitarias y en instituciones odontológicas - en clínicas de escuelas, jardines infantiles y hogares geriátricos. Es aplicable en los sitios de trabajo y del hogar. Igualmente se pueden incluir servicios como lavanderías y cocinas que suministran productos directamente a los pacientes. No es posible determinar la actividad bactericida del producto para FRICCION de manos no diluido usando esta norma , dado que siempre se produce algún grado de dilución al añadir el inóculo. Por lo tanto, no es posible el ensayo confiable de productos que contienen 5% de agua o menos. 2. REFERENCIAS NORMATIVAS Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicación de este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada. Para referencias no fechadas, se aplica la última edición del documento normativo referenciado. (incluida cualquier corrección). NTC 5150, Antisépticos y desinfectantes químicos. Actividad bactericida básica. Método de ensayo y requisitos (fase 1). (EN 1040) NTC 5593, Antisépticos y desinfectantes químicos. Conservación de las cepas microbianas utilizadas para la determinación de la actividad bactericida y fungicida. (EN 12353)


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EN 1499, Chemical Disinfectants and Antiseptics - Hygienic Handwash - Test Method and Requirements (phase 2/step 2). EN 1500, Chemical Disinfectants and Antiseptics - Hygienic Handrub - Test Method and Requirements (phase 2/step 2). prEN 12791, Chemical disinfectants and antiseptics- Surgical hand disinfectants - Test method and requirements (phase 2/step 2). 3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES Para los propósitos de esta norma, se aplican los siguientes términos y definiciones. 3.1 Producto (para desinfección y/o antisepsia química). Agente o formulación química que se utiliza como desinfectante o antiséptico químico (NTC 5150 ). 3.2 Bactericida. Producto que destruye las bacterias vegetativas bajo condiciones definidas. 3.3 Actividad bactericida (en esta norma). Capacidad de un producto para reducir la cantidad de células bacterianas viables de los organismos pertinentes bajo las condiciones definidas por esta norma (en concordancia con la NTC 5150). 3.4 Fricción higiénica de manos. Procedimiento poscontaminación que implica la frotación de las manos, sin adición de agua, utilizando un producto bactericida dirigido contra microorganismos transitorios para evitar su transmisión, sin tener en cuenta la flora residente en la piel ( UNE EN 1500). 3.5 Lavado higiénico de manos Procedimiento poscontaminación que implica el lavado de las manos con agua, utilizando un producto bactericida dirigido contra microorganismos transitorios para evitar su transmisión, sin tener en cuenta la flora residente en la piel (EN 1499) 3.6 Fricción quirúrgica de manos. Procedimiento prequirúrgico que implica la frotación de las manos sin la adición de agua, utilizando un producto bactericida dirigido a la reducción de la flora microbiana de las manos para evitar la transmisión de los microorganismos en procedimientos invasivos. 3.7 Lavado quirúrgico de manos. Procedimiento prequirúrgico que implica el lavado de las manos con agua, utilizando un producto bactericida dirigido a la reducción de la flora microbiana de las manos con el fin de evitar la transmisión de los microorganismos durante procedimientos invasivos . 4. REQUISITOS 4.1 GENERALIDADES El producto, cuando se somete a ensayo según lo indicado en el numeral 5, debe demostrar una reducción en los recuentos viables tal como se indica en los numerales 4.2, 4.3, 4.4 o 4.5 para cada uno de los siguientes organismos de ensayo: Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus hirae y Staphylococcus aureus.


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Este método corresponde a un ensayo de fase 2/etapa 1, por lo cual es necesario un ensayo adicional de fase 2/etapa 2 (EN 1499: año, UNE- EN 1500) antes de que se pueda cumplir la declaración del rótulo que indica desinfectante quirúrgico de manos de fricción higiénica de manos, o de lavado higiénico de manos. El producto debe cumplir con los requisitos que se indican en los numerales 4.2 a 4.6 de acuerdo con su aplicación. 4.2 FRICCIÓN HIGIÉNICA DE MANOS El producto debe demostrar una reducción de 105 en el recuento viable en 1 min ± 5 s. Además, si el fabricante recomienda una exposición inferior a 1 min, el producto debe demostrar una reducción similar en el recuento viable en 30 s ± 5 s. 4.3 LAVADO HIGIÉNICO DE MANOS El producto debe demostrar una reducción de 103 en el recuento viable en 1 min ± 5 s. Además, si el fabricante recomienda una exposición inferior a 1 min, el producto debe demostrar una reducción similar en el recuento viable en 30 s ± 5 s. 4.4 FRICCIÓN QUIRÚRGICA DE MANOS El producto debe demostrar una reducción de 105 en el recuento viable en 5 min ± 10 s. Además, si el fabricante recomienda una exposición inferior a 5 min, el producto debe satisfacer el requisito de la Tabla 1 para uno de los siguientes tiempos de contacto opcional: 1 min ± 5 s, 2 min ± 10 s, 3 min ± 10 s, 4 min ± 10 s. El tiempo adecuado de contacto no debe ser superior al tiempo de exposición recomendado por el fabricante. 4.5 LAVADO QUIRÚRGICO DE MANOS El producto debe demostrar una reducción de 103 en el recuento viable en 5 min ± 10 s. Además, si el fabricante recomienda una exposición inferior a 5 min, el producto debe satisfacer el requisito de la Tabla 1 para uno de los siguientes tiempos de contacto opcional: 1 min ± 5 s, 2 min ± 10 s, 3 min ± 10 s, 4 min ± 10 s. El tiempo adecuado de contacto no debe ser superior al tiempo de exposición recomendado por el fabricante. 4.6 FRICCIÓN HIGIÉNICA DE MANOS Y LAVADO HIGIÉNICO DE MANOS Los productos que cumplen con los requisitos según lo indicado en los numerales 4.2 o 4.3 y se van a utilizar adicionalmente para la desinfección quirúrgica de manos, no requieren de ensayo adicional en la fase 2/etapa 1 (para el ensayo de fase 2/etapa 1, véase Anexo F). Nota. Los requisitos de los numerales 4.4 y 4.5 se aplican a productos utilizados únicamente para desinfección quirúrgica de manos y que no se han sometido a ensayo previamente según lo indicado en los numerales 4.2 o 4.3. 5. MÉTODO DE ENSAYO 5.1 PRINCIPIO Una suspensión de bacterias para el ensayo se adiciona a una muestra preparada del producto que se somete a prueba. Únicamente para productos de lavado de manos, la muestra se prepara en agua dura (véase el numeral 5.2.2.7). La mezcla se conserva a una temperatura de


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20 °C. A intervalos de tiempo especificados, incluyendo todos los períodos indicados en las instrucciones del fabricante, pero siempre en los intervalos establecidos en la Tabla 1, se toma una porción alícuota; la acción bactericida de esta porción se neutraliza o suprime inmediatamente mediante un método validado. El método de elección es el de dilución-neutralización. Sin embargo, si no se puede establecer un medio de neutralización adecuado, se utiliza la filtración por membrana. Se determina la cantidad de bacterias sobrevivientes. La cantidad de bacterias en la suspensión de ensayo también se determina y se calcula la reducción en el recuento viable.

Tabla 1. Tiempo de contacto para diferentes categorías de producto

Procedimiento Tiempo de contacto recomendado por el

fabricante Tiempo de contacto “t” usado en el ensayo

Fricción higiénica de manos

1 minuto < 1 minuto

1 min ± 5 s 1 min ± 5 sy 30 s ± 5 s

Lavado higiénico de manos

1 minuto < 1 minuto

1 min ± 5 s 1 min ± 5 s y 30 s ± 5 s

Fricción quirúrgica de manos

5 minuto < 5 minuto

5 min ± 10 s 5 min ± 10 s y opcional: 1 min ± 5 s, 2 min ± 10 s, 3 min ± 10 s y/o 4 min ± 10 s

Lavado quirúrgico de manos

5 minuto < 5 minuto

5 min ± 10 s 5 min ± 10 s y opcional: 1 min ± 5 s, 2 min ± 10 s, 3 min ± 10 s y/o 4 min ± 10 s

El ensayo se lleva a cabo utilizando Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus hirae y Staphylococcus aureus. 5.2 MATERIALES Y REACTIVOS 5.2.1 Organismos de ensayo La actividad bactericida se debe evaluar utilizando cuatro cepas. Se deben utilizar las siguientes cepas: Escherichia coli (K12) NCTC1) 10538 Pseudomonas aeruginosa ATCC1) 15442 Staphylococcus aureus ATCC1) 6538 Enterococcus hirae ATCC1) 10541 1 5.2.2 Medios de cultivo y reactivos 5.2.2.1 Generalidades

1) NCTC 10538, ATCC 15442, ATCC 6538 y ATCC 10541 son los números de colección de la cepas

suministradas por la colección nacional de cultivos tipo y la colección estadounidense de cultivos tipo. Esta información se suministra para conveniencia de los usuarios de esta norma y no constituye una aprobación por parte de ICONTEC del producto mencionado. Las cepas correspondientes suministradas por otras colecciones se pueden utilizar si se puede demostrar que producen los mismos resultados.

1 NOTA Véase el Anexo E para el número de cepa correspondiente en algunas otras colecciones de

cultivos.


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Los reactivos deben tener grado analítico y deben ser apropiados para los propósitos microbiológicos. NOTA Para mejorar la reproducibilidad, se recomienda la utilización de material deshidratado disponible en el comercio para la preparación de los medios de cultivo. Se recomienda cumplir rigurosamente las instrucciones del fabricante relacionadas con la preparación de estos productos. 5.2.2.2 Agua El agua debe estar libre de sustancias que sean tóxicas o inhibitorias para las bacterias. El agua debe estar destilada en vidrio recientemente y no desmineralizada. Esterilice en autoclave (véase el numeral 5.3.1). NOTA 1 Si el agua se esteriliza durante la esterilización de los reactivos, este paso no es necesario. NOTA 2 Si el agua destilada con calidad adecuada no está disponible, se puede utilizar agua para preparaciones inyectables (véase la Farmacopea Oficial). 5.2.2.3 Agar tripticasa de Soya (TSA) Para la conservación de las cepas bacterianas y la realización de los recuentos viables. Triptona, digerido pancreático de caseína 15,0 g Peptona de soya, digerido papaínico de harina de soya 5,0 g NaCl 5,0 g Agar 15,0 g Agua (5.2.2.2) 1 000,0 ml Esterilice en autoclave (véase el numeral 5.3.1). Después de la esterilización, el pH del medio debe ser equivalente a 7,2 +/- 0,2 cuando se mide a 20 °C. 5.2.2.4 Diluyente Solución de cloruro de sodio y triptona: Triptona, digerido pancreático de caseína 1,0 g NaCl 8,5 g Agua (véase el numeral 5.2.2.2) 1 000,0 ml Esterilice en autoclave (véase el numeral 5.3.1). Después de la esterilización, el pH del medio debe ser equivalente a 7,0 +/- 0,2 cuando se mide a 20 °C. 5.2.2.5 Neutralizador El neutralizador se debe validar para el producto que se somete a ensayo, de acuerdo con lo indicado en el Anexo A. El neutralizador debe estar estéril. NOTA En el Anexo B se presenta información sobre los neutralizadores adecuados para algunas categorías de productos.


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5.2.2.6 Solución de enjuague (para filtración por membrana) La solución debe ser estéril, compatible con la membrana filtrante y con capacidad para la filtración a través de la membrana, bajo las condiciones de ensayo que se describen en el Anexo A. NOTA En el Anexo C se presenta información sobre las soluciones de enjuague adecuadas para algunas categorías de productos. 5.2.2.7 Agua dura para la dilución del producto de lavado de manos El agua dura para la dilución de los productos se debe preparar de la siguiente manera: Prepare: - Solución A:

Disuelva 19,84 g de cloruro de magnesio anhidro (MgCl2) o un cloruro de magnesio hidratado equivalente y 46,24 g de cloruro de calcio anhidro (CaCl2) o un cloruro de calcio hidratado equivalente en agua (véase el numeral 5.2.2.2) y diluya hasta completar 1 000 ml.

Esterilice en autoclave (véase el numeral 5.3.1). Almacene la solución a una temperatura entre 2°C y 8°C durante un período no superior a un mes.

- Solución B:

Disuelva 35,02 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3) en agua (véase el numeral 5.2.2.2) y diluya hasta completar 1 000 ml. Esterilice mediante filtración por membrana (véase el numeral 5.3.2.7). Almacene la solución a una temperatura entre 2 °C y 8 °C durante un período no superior a una semana.

- Agua dura:

Para la preparación de 1 litro, vierta por lo menos 600 ml de agua (véase el numeral 5.2.2.2) en un matraz volumétrico de 1 000 ml (véase el numeral 5.3.2.12) y adicione 6,0 ml de la solución A, luego 8,0 ml de la solución B.

Mezcle y diluya hasta completar 1 000 ml con agua (véase el numeral 5.2.2.2).

El pH del agua dura debe ser de 7,0 +/- 0,2.

Si es necesario, ajuste el pH utilizando una solución de aproximadamente 40 g/l (cerca de 1 mol/l) de hidróxido de sodio (NaOH) o aproximadamente 36,5 g/l (cerca de 1 mol/l) de ácido clorhídrico (HCl).

El agua dura debe ser de preparación reciente bajo condiciones asépticas y se debe utilizar en un período de 12 h. NOTA Cuando se preparan las soluciones de ensayo del producto (véase el numeral 5.4.2), la adición del producto a esta agua dura produce una dureza final del agua diferente en cada uno de los tubos de ensayo. En todo caso la dureza final es inferior a 300 mg/kg de carbonato de calcio (CaCO3) en el tubo de ensayo.


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5.3 EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO 5.3.1 Generalidades Esterilice el material de vidrio y las partes del equipo que tendrán contacto con el medio de cultivo y los reactivos o la muestra, excepto aquellos que se suministran estériles, mediante uno de los siguientes métodos: a) en un autoclave (véase el numeral 5.3.2.1) conservando una temperatura de 121+3

0 °C durante un tiempo continuo mínimo de 15 min;

b) en un esterilizador de calor seco (véase el numeral 5.3.2.1) conservando una

temperatura de 180 °C durante un tiempo continuo mínimo de 30 min, 170 °C para un tiempo continuo mínimo de 1 h o 160 °C para un tiempo continuo mínimo de 2 h.

5.3.2 Equipo microbiológico de laboratorio común2) y, en particular, el siguiente: 5.3.2.1 Equipos para esterilización a) Para esterilización con calor húmedo, un autoclave con capacidad para conservar una

temperatura de 121+30 °C para un tiempo continuo mínimo de 15 min;

b) Para esterilización con calor seco, un horno de aire caliente con capacidad para

conservar una temperatura de 180 °C durante un tiempo continuo mínimo de 30 min, 170 °C para un tiempo continuo mínimo de 1 hora o 160 °C para un tiempo continuo mínimo de 2 h.

5.3.2.2 Baños de agua o de maría, con capacidad para controlar la temperatura a 20 °C ± 1 °C y 45 °C ± 1 °C.2 5.3.2.3 Incubadora, con capacidad para controlar la temperatura a 36 °C ± 1 °C o 37 °C ± 1 °C. Se puede utilizar una incubadora a 37 °C ± 1 °C si no se dispone de una incubadora a 36 °C ± 1 °C. 5.3.2.4 Medidor de pH con una exactitud de calibración de ± 0,1 unidades de pH a 25 °C. 5.3.2.5 Cronómetro 5.3.2.6 Agitador (agitador electromecánico, como el mezclador Vortex ®.3 5.3.2.7 Equipo para filtración por membrana construido con un material compatible con el producto que se somete a ensayo, con un porta filtro de volumen utilizable mínimo de 50 ml y adecuado para utilizar con filtros de diámetro entre 47 mm y 50 mm, con tamaño de poro 0,45 μm (para el método de filtración por membrana) y tamaño de poro de 0,22 μm (para esterilización por filtración). La fuente de vacío utilizada debe suministrar una tasa de flujo de filtración uniforme. Con el fin de obtener una distribución uniforme de los microorganismos sobre la membrana en el método

2) El equipo desechable es una alternativa aceptable para el material de vidrio reusable. 3 VORTEX ® es un ejemplo de un producto adecuado que se encuentra en el comercio. Esta información se

suministra para conveniencia de los usuarios de esta norma y no constituye una aprobación de este producto por parte de ICONTEC.


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de ensayo de filtración por membrana y para evitar una filtración excesivamente prolongada, el dispositivo se debe ajustar de manera tal que se obtenga la filtración de 100 ml del líquido de enjuague en un período entre 20 s y 40 s. 5.3.2.8 Recipiente: tubos de ensayo, frascos o matraces de cultivo con capacidad adecuada. 5.3.2.9 Pipetas graduadas, con capacidades nominales de 10 ml, 1 ml y 0,1 ml, se pueden utilizar pipetas calibradas automáticas. 5.3.2.10 Cajas de Petri que tengan un diámetro entre 90 mm y 100 mm. NOTA Para el método de recuento de caja, por el método de dispersión, se pueden utilizar cajas de tamaño superior (140 mm). 5.3.2.11 Perlas de vidrio con diámetro entre 3 mm y 4 mm. 5.3.2.12 Matraces volumétricos calibrados a 20 °C. 5.3.2.13 Agitador mecánico 5.4 PREPARACIÓN DE LAS SUSPENSIONES Y LAS SOLUCIONES PARA ENSAYO 5.4.1 Suspensiones bacterianas 5.4.1.1 Cultivos iniciales de los microorganismos de ensayo Los cultivos iniciales se deben conservar de acuerdo con los requisitos de la NTC 5593:2008 5.4.1.2 Cultivo de trabajo de los microorganismos Con el fin de preparar el cultivo de trabajo de las cepas (véase el numeral 5.2.1), realice un subcultivo a partir del cultivo inicial (véase el numeral 5.4.1.1) mediante trazos en los cultivos inclinados de TSA (véase el numeral 5.2.2.3) e incube (véase el numeral 5.3.2.3). Después de un período entre 18 h y 24 h, prepare de la misma manera un segundo subcultivo a partir del primero y lleve a incubación durante 18 h a 24 h. A partir de este segundo subcultivo se puede producir de la misma manera un tercer subcultivo. Nota. El segundo y/o tercer subcultivos representan el cultivo de trabajo. Si no es posible preparar el segundo subcultivo en un día particular, se puede utilizar un subcultivo de 48 h para el cultivo posterior, siempre que el subcultivo se haya conservado en una incubadora durante un periodo de 48 h. En estas circunstancias, prepare un cultivo de 24 h adicionales después del procesamiento. No tome un cuarto subcultivo. 5.4.1.3 Suspensión bacteriana para ensayo Tome 10 ml del diluyente (véase el numeral 5.2.2.4) y colóquelo en un matraz de 100 ml con cinco gramos de perlas de vidrio (véase el numeral 5.3.2.11). Tome los cultivos de trabajo (véase el numeral 5.4.1.2) y transfiera con el asa redonda las células hacia el diluyente. Las células se deben suspender en el diluyente, sumergiendo el asa en éste y frotándola contra la pared lateral del matraz para desprender las células. Agite el matraz durante 3 min utilizando un agitador mecánico (véase el numeral 5.3.2.13). Aspire la suspensión de las perlas de vidrio y transfiera a otro tubo. Ajuste el número de células en la suspensiones hasta un


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valor entre 1,5 x 108 ufc/ml y 5 x 108 ufc / ml 4 utilizando el diluyente, estimando la cantidad de unidades mediante algún método adecuado. Conserve esta suspensión en el baño de agua o maría a 20 °C ± 1 °C y utilice dentro de las 2 h siguientes. Prepare cuatro suspensiones bacterianas para ensayo, una utilizando Escherichia coli, una con Pseudomonas aeruginosa, otra con Enterococcus hirae y otra con Staphylococcus aureus. Para el recuento de la suspensión bacteriana para ensayo, prepare diluciones de 10-6 y 10-7 de la suspensión de ensayo utilizando el diluyente (véase el numeral 5.2.2.4) y mezcle (véase el numeral 5.3.2.6). Tome una muestra de 1,0 ml de cada dilución en duplicado e inocule usando la técnica de siembra en caja o de dispersión en caja. (Siembra en superficie) Si se utiliza la técnica de siembra en caja, (siembra en profundidad) vierta con pipeta cada muestra de 1,0 ml en cajas de Petri (véase el numeral 5.3.2.10) independientes y adicione 12 ml a 15 ml de TSA (véase el numeral 5.2.2.3) fundido y enfriado a 45 °C ± 1 °C. Si se utiliza la técnica de dispersión en caja, disperse cada muestra de 1,0 ml sobre una cantidad adecuada de cajas secas que contengan TSA (véase el numeral 5.2.2.3). 5.4.1.4 Recuento de la suspensión bacteriana para ensayo Incube las cajas a temperatura de 36 ºC ± 1 °C (o 37 °C ± 1 °C) (véase el numeral 5.3.2.3.) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razón, no se puedan contar. Realice el recuento de las cajas y determine el número de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor número de colonias para cada muestra de 1,0 ml. Calcule el número de ufc/ml en la suspensión para ensayo (N) utilizando el método que se indica en el numeral 5.6.1.1. 5.4.2 Solución del producto para ensayo 5.4.2.1 Soluciones de ensayo para fricción de manos El producto para fricción de manos se utiliza sin diluir como solución del producto para ensayo. Se deben registrar los detalles de las muestras de producto tal como se reciben. 5.4.2.2 Solución de ensayo para lavado de manos Utilizando agua dura (véase el numeral 5.2.2.7.) como diluyente, prepare una dilución al 55 % (V/V) de la preparación del producto de lavado de manos para ensayo. La solución del producto para ensayo debe ser de preparación reciente y se debe utilizar durante un día de trabajo máximo (o menos si tiene baja estabilidad).

4 ufc/ml = unidades formadoras de colonias por mililitro


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5.5 PROCEDIMIENTO 5.5.1 Generalidades El método de elección es el de dilución-neutralización. Para determinar un neutralizador adecuado, se debe adoptar el siguiente procedimiento. La validación del método de dilución-neutralización (véase el literal A.4.1) se deben llevar a cabo utilizando un neutralizador adecuado, seleccionado de acuerdo con la experiencia del laboratorio y los datos publicados. Si este neutralizador no es válido, repita el ensayo de validación utilizando un neutralizador alterno que contenga una combinación de: polisorbato 80 (30 g/l), saponina (30 g/l), L-histidina (1 g/l), lecitina (3 g/l), tiosulfato de sodio (5 g/l) bien sea en diluyente (véase el numeral 5.2.2.4) o en 0,002 5 mol/l de solución amortiguadora de fosfatos. Si ambos neutralizadores no son válidos, se puede utilizar el método de filtración por membrana en lugar del método de dilución-neutralización. 5.5.2 Método de dilución-neutralización 5.5.2.1 Generalidades Antes del ensayo, equilibre todos los reactivos (solución del producto para ensayo, suspensión bacteriana para ensayo, neutralizador) a la temperatura de ensayo de 20°C ± 1°C utilizando el baño de agua o maría (véase el numeral 5.3.2.2). Verifique que la temperatura de los reactivos se estabilice en 20 °C ± 1 °C. 5.5.2.2 Procedimiento de ensayo para determinar la actividad bactericida de los

productos para fricción higiénica de manos o lavado higiénico de manos, usados para el tratamiento poscontaminación de las manos

Vierta con pipeta 9,0 ml de la solución de ensayo para fricción higiénica de manos (véase el numeral 5.4.2.1) o de la solución de ensayo para lavado de manos (véase el numeral 5.4.2.2) en un recipiente estéril con capacidad aproximada de 25 ml. Añada 1,0 ml de una de las suspensiones bacterianas para ensayo (véase el numeral 5.4.1.3). Ponga en marcha inmediatamente el cronómetro, mezcle y coloque el recipiente en un baño de agua o maría controlado a 20 °C ± 1. NOTA Al añadir las suspensiones bacterianas para ensayo a los recipientes se recomienda tener precaución para evitar tocar la parte superior de los lados del recipiente. La actividad del producto se debe determinar para un tiempo de contacto de 1 min ± 5 s. Si el fabricante recomienda una exposición inferior a 1 min, el producto también se debe ensayar en un tiempo de contacto de 30 s ± 5 s. Mezcle (véase el numeral 5.3.2.6) justo antes de finalizar el tiempo de contacto seleccionado. En el tiempo de contacto seleccionado, vierta con pipeta 1,0 ml de la mezcla para ensayo en un tubo que contenga 8,0 ml de neutralizador (véase el numeral 5.2.2.5) y 1,0 ml de agua (véase el numeral 5.2.2.2). Mezcle y coloque en el baño de agua o maría controlado a 20 °C ± 1 °C. a) Los productos de ensayo para fricción de manos: después del tiempo de neutralización

de 1 min ± 5 s, prepare una dilución de 10-1 de la mezcla neutralizada en el diluyente (véase el numeral 5.2.2.4). Tome una muestra de 1,0 ml de la mezcla y su dilución de 10-1 en duplicado e inocule utilizando la técnica de siembra en caja o dispersión en caja.

b) Los productos de ensayo para lavado de manos: después del tiempo de neutralización

de 1 min ± 5 s, prepare una dilución de 10-2 y 10-3 de la mezcla neutralizada en el


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diluyente (véase el numeral 5.2.2.4). Tome una muestra de 1,0 ml de las diluciones de 10-2 y 10-3 de la mezcla neutralizada en duplicado e inocule utilizando la técnica de siembra en caja o dispersión en caja ( siembra en superficie)

Si se utiliza la técnica de siembra en caja (siembra en profundidad), vierta con pipeta cada muestra de 1,0 ml en cajas de Petri (véase el numeral 5.3.2.10) independientes y adicione 12 ml a 15 ml de TSA fundido (véase el numeral 5.2.2.3) y enfriado a 45 °C ± 1 °C. Si se utiliza la técnica de dispersión en caja, disperse cada muestra de 1,0 ml sobre una cantidad adecuada de cajas secas que contengan TSA (véase el numeral 5.2.2.3). Realice este procedimiento utilizando las otras suspensiones bacterianas para ensayo. 5.5.2.3 Recuento de la suspensión bacteriana para ensayo Incube las cajas a temperatura de 36 °C ± 1 °C (o 37 °C ± 1 °C) (véase el numeral 5.3.2.3.) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razón, no se puedan contar. Realice el recuento en las cajas y determine el número de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor número de colonias para cada caja. Calcule el número de ufc/ml en la mezcla para ensayo (Na) utilizando el método que se indica en el numeral 5.6.1.2. Para calcular el recuento viable de la mezcla de ensayo, el factor de dilución es 10-1 (para fricción de manos) o 10-2 y 10-3 (para lavado de manos). 5.5.2.4 Procedimiento de ensayo para la actividad bactericida de los productos para

fricción quirúrgica de manos y lavado quirúrgico de manos Vierta con pipeta 9,0 ml de la solución de ensayo para fricción quirúrgica de manos (véase el numeral 5.4.2.1) o de la solución de ensayo para lavado quirúrgico de manos (véase el numeral 5.4.2.2) en un recipiente estéril con capacidad aproximada de 25 ml. Añada 1,0 ml de una de las suspensiones bacterianas para ensayo (véase el numeral 5.4.1.3). Ponga en marcha inmediatamente el cronómetro, mezcle (véase el numeral 5.3.2.6) y coloque el recipiente en un baño de agua o maría (véase numeral 5.3.2.2) controlado a 20 °C ± 1 °C. NOTA Al añadir las suspensiones bacterianas para ensayo a los recipientes se recomienda tener precaución para evitar tocar la parte superior de los lados del recipiente. La actividad del producto se debe determinar para un tiempo de contacto de 5 min ± 10 s. Si el fabricante recomienda una exposición inferior a 5 min, el producto también se debe ensayar para un tiempo de contacto de 1 min ± 5 s, 2 min ± 10 s, 3 min ± 10 s y/o 4 min ± 10 s. Mezcle justo antes de finalizar el tiempo de contacto seleccionado (véase numeral 5.3.2.6). En el tiempo de contacto seleccionado, vierta con pipeta 1,0 ml de la mezcla para ensayo en un tubo que contenga 8,0 ml de neutralizador (véase numeral 5.2.2.5) y 1,0 ml de agua (véase el numeral 5.2.2.2). Mezcle (véase el numeral 5.3.2.6) y coloque en el baño de agua o maría (véase el numeral 5.3.2.2) controlado a 20 °C ± 1 °C. a) Los productos de ensayo para fricción de manos: después del tiempo de neutralización

de 5 min ± 10 s, prepare una serie de diluciones decimales de la mezcla neutralizada en el diluyente (véase el numeral 5.2.2.4). Tome una muestra de 1,0 ml de la mezcla y su dilución de 10-1 por duplicado e inocule utilizando la técnica de siembra en profundidad en caja o siembra en superficie.


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b) Los productos de ensayo para lavado de manos: después del tiempo de neutralización de 5 min ± 10 s, prepare una serie de diluciones de decimales de a mezcla neutralizada en el diluyente (véase el numeral 5.2.2.4). Tome una muestra de 1,0 ml de las diluciones de 10-2 y 10-3 de la mezcla neutralizada por duplicado e inocule utilizando la técnica de siembra en profundidad en caja o siembra en superficie.

Si se utiliza la técnica de siembra en profundidad, vierta con pipeta cada muestra de 1,0 ml en cajas de Petri (véase el numeral 5.3.2.10) independientes y adicione 12 ml a 15 ml de TSA fundido (véase el numeral 5.2.2.3) y enfriado a temperatura de 45°C ± 1°C. Si se utiliza la técnica de siembra en superficie, disperse cada muestra de 1,0 ml sobre una cantidad adecuada de cajas secas que contengan TSA (véase el numeral 5.2.2.3). Realice este procedimiento utilizando las otras suspensiones bacterianas para ensayo. 5.5.2.5 Recuento de la suspensión bacteriana para ensayo Incube las cajas a temperatura de 36 °C ± 1 °C (o 37 °C ± 1 °C) (véase el numeral 5.3.2.3) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razón, no se puedan contar. Realice el recuento de las cajas y determine el número de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor número de colonias para cada caja. Calcule el número de ufc/ml en la mezcla para ensayo (Na) utilizando el método que se indica en el numeral 5.6.1.2. Para calcular el recuento viable de la mezcla de ensayo, el factor de diluciones es 10-1 (para fricción de manos) o 10-2 y 10-3 (para lavado de manos). 5.5.3 Método de filtración por membrana 5.5.3.1 Generalidades Antes del ensayo, lleve todos los reactivos (solución del producto para ensayo, suspensión bacteriana para ensayo, solución de enjuague) a la temperatura de ensayo de 20 °C ± 1 °C utilizando el baño de agua o maría (véase el numeral 5.3.2.2) y controle la temperatura a 20 °C ± 1 °C. Verifique que la temperatura de los reactivos se estabilice en 20 °C ± 1 °C. 5.5.3.2 Procedimiento de ensayo para la actividad bactericida de los productos para

fricción higiénica de manos o lavado higiénico de manos Vierta con pipeta 9,0 ml de la solución de ensayo para fricción higiénica de manos (véase el numeral 5.4.2.1) o de la solución de ensayo para lavado de manos (véase el numeral 5.4.2.2) en un recipiente estéril con capacidad aproximada de 25 ml. Añada 1,0 ml de una de las suspensiones bacterianas para ensayo (véase el numeral 5.4.1.3). Ponga en marcha inmediatamente el cronómetro, mezcle y coloque el recipiente en un baño de agua o maría controlado a 20 °C. NOTA 1 Al añadir las suspensiones bacterianas para ensayo a los recipientes se recomienda tener precaución para evitar tocar la parte superior de los lados del recipiente. La actividad del producto se debe determinar para un tiempo de contacto de 1 min ± 5 s. Si el fabricante recomienda una exposición inferior a 1 minuto, el producto también se debe ensayar en un tiempo de contacto de 30 s ± 5 s. Mezcle justo antes de finalizar el tiempo de contacto seleccionado (véase el numeral 5.3.2.6). En el tiempo de contacto seleccionado, vierta con pipeta dos muestras de 1,0 ml de la mezcla


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para ensayo y transfiera cada muestra hacia un equipo de filtración por membrana independiente que disponga de una membrana y que contenga 50 ml de la solución de enjuague (véase el numeral 5.2.2.6). Filtre inmediatamente. El tiempo necesario para transferir y filtrar no debería exceder 1 min. Si es superior a 1 min, este tiempo se debe registrar en el informe del ensayo. Enjuague con 150 ml como mínimo pero no más de 500 ml de solución de enjuague (véase el numeral 5.2.2.6). Luego transfiera las membranas sobre la superficie de dos cajas individuales de TSA (véase el numeral 5.3.2.10). NOTA 2 Al realizar la transferencia, se debe tener precaución para garantizar que las bacterias se encuentran en la cara superior de la membrana cuando se coloca sobre el TSA y que no quede aire atrapado entre la membrana y la superficie de agar. Realice este procedimiento utilizando las otras suspensiones bacterianas para ensayo. 5.5.3.3 Recuento de la mezcla de ensayo Incube las cajas a temperatura de 36 °C ± 1 °C (o 37 °C ± 1 °C) durante 24 h (véase el numeral 5.3.2.3). Deseche las cajas que, por cualquier razón, no se puedan contar. Realice el recuento en las cajas y determine el número de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor número de colonias para cada caja. Calcule el número de ufc/ml en la mezcla para ensayo (Na) utilizando el método que se indica en el numeral 5.6.1.2. 5.5.3.4 Procedimiento de ensayo para la actividad bactericida de los productos de

fricción quirúrgica de manos y lavado quirúrgico de manos Vierta con pipeta 9,0 ml de la solución de ensayo para fricción quirúrgica de manos (véase el numeral 5.4.2.1) o de la solución de ensayo para lavado quirúrgico de manos (véase el numeral 5.4.2.2) en un recipiente estéril con capacidad aproximada de 25 ml. Añada 1,0 ml de una de las suspensiones bacterianas para ensayo (véase el numeral 5.4.1.3). Ponga en marcha inmediatamente el cronómetro, mezcle (véase el numeral 5.3.2.6) y coloque el recipiente en un baño de agua o maría (véase el numeral 5.3.2.2) controlado a 20 °C ± 1 °C. NOTA 1 Al añadir las suspensiones bacterianas para ensayo a los recipientes se recomienda tener precaución para evitar tocar la parte superior de los lados del recipiente. La actividad del producto se debe determinar para un tiempo de contacto de 5 min ± 10 s. Si el fabricante recomienda una exposición inferior a 5 min, el producto también se debe ensayar para un tiempo de contacto de 1 min ± 5 s, 2 min ± 10 s, 3 min ± 10 s y/o 4 min ± 10 s. Mezcle justo antes de finalizar el tiempo de contacto seleccionado (véase el numeral 5.3.2.6). En el tiempo de contacto seleccionado, vierta con pipeta dos muestras de 1,0 ml de la mezcla para ensayo y transfiera cada muestra hacia un equipo de filtración por membrana independiente que disponga de una membrana y que contenga 50 ml de solución de enjuague (véase el numeral 5.2.2.6). Filtre inmediatamente. El tiempo necesario para transferir y filtrar no debería exceder 1 minuto. Si es superior a 1 minuto, este tiempo se debe registrar en el informe del ensayo. Enjuague con 150 ml como mínimo pero no más de 500 ml de solución de enjuague (véase el numeral 5.2.2.6). Luego transfiera las membranas sobre la superficie de dos cajas individuales de TSA (véase el numeral 5.3.2.10). NOTA 2 Al realizar la transferencia, se debe tener precaución para garantizar que las bacterias se encuentran en la cara superior de la membrana cuando se coloca sobre el TSA y que no quede aire atrapado entre la membrana y la superficie de agar. Realice este procedimiento utilizando las otras suspensiones bacterianas para ensayo.


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5.5.3.5 Recuento de la mezcla de ensayo Incube las cajas a temperatura de 36 °C ± 1 °C (o 37 °C ± 1 °C) (véase el numeral 5.3.2.3) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razón, no se puedan contar. Realice el recuento en las cajas y determine el número de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor número de colonias para cada caja. Calcule el número de ufc/ml en la mezcla para ensayo (Na) utilizando el método que se indica en el numeral 5.6.1.2. 5.5.4 Validación del método de dilución-neutralización y del método de filtración por

membrana Los métodos de dilución-neutralización y de filtración por membrana se deben validar para cada uno de los de los cuatro microorganismos de ensayo (véase el Anexo E), según se indica en el Anexo A. El ensayo de validación (véase el Anexo A) también se debe realizar al mismo tiempo que el procedimiento (véase el numeral 5.5) utilizando las mismas condiciones (suspensiones bacterianas para ensayo, solución del producto para ensayo, agua dura si se utiliza y neutralizador o solución de enjuague) usadas en el ensayo (Véanse los numerales 5.5.2 y 5.5.3). 5.6 CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS 5.6.1 Cálculo de los recuentos viables (ufc/ml) 5.6.1.1 Suspensión bacteriana para ensayo Los recuentos viables de la suspensión bacteriana para ensayo (véase el numeral 5.4.1.4) se deben calcular según los principios que se describen a continuación: a) Se deben tener en cuenta únicamente los recuentos de colonias inferiores a 300

ufc/caja para el cálculo de los recuentos viables. Para que un resultado sea válido, por lo menos una caja debe contener 15 o más colonias; es recomendable calcular los recuentos viables utilizando por lo menos un par de cajas, en las cuales una o ambas cajas contengan más de 15 colonias y ambas contengan menos de 300 colonias. Si las cajas provenientes de dos diluciones están dentro de este rango, se calcula el número de ufc/ml como el recuento recuento medio ponderado. Si las cajas provenientes de una sola dilución están dentro de este rango, se calcula la media aritmética.

Para el cálculo del recuento medio ponderado (en ufc/ml) se utiliza la fórmula (1):

dnn

c)1,0( 21 +

(1)

en donde

c es el número de colonias contadas en todas las cajas consideradas;

n1 es el número de cajas consideradas en la primera dilución;

n2 es el número de cajas consideradas en la segunda dilución; d es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución considerada.


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Los resultados calculados se aproximan hasta dos cifras decimales. Para ello, si la última cifra está por debajo de cinco, la cifra anterior no se modifica; si la última cifra está por encima de 5, la cifra precedente se incrementa en una unidad; si la última cifra es igual a cinco, se aproxima la cifra precedente hasta la cifra superior más próxima. Prosiga por pasos hasta obtener dos cifras decimales. a) como resultado, la cantidad de ufc/ml se expresa con un número entre 1,0 y 9,9

multiplicado por la potencia de 10 adecuada.

EJEMPLO:

)/(109,11082918,1102,2

422

610)21,02(

2514215168 86

mlufcenxx →=−

=−+

+++−− (1)

5.6.1.2 Procedimiento y validación del ensayo Para el procedimiento de ensayo (véanse los numerales 5.5.2.2, 5.5.2.4, 5.5.3.2 y 5.5.3.4) y el ensayo para la validación (véanse los literales A.2, A.4.1 y A.4.2) el recuento viable se debería calcular utilizando el siguiente método. Se recomienda utilizar únicamente los recuentos de colonias inferiores a 300 ufc por caja para el cálculo de los recuentos viables. Tales recuentos se deberían calcular utilizando las colonias provenientes de ambas cajas. Cuando por lo menos una caja contienen 15 o más colonias, se utiliza la siguiente fórmula (2) para el cálculo de los recuentos viables (en ufc/ml):

Vdnc−−

(2)

en donde:

c es la suma de las colonias contadas en ambas cajas; n es la cantidad de cajas consideradas; d es el factor de dilución que corresponde a la dilución considerada. Para el procedimiento de

ensayo de dilución-neutralización (véanse los numerales 5.5.2.3 y 5.5.2.5) y la suspensión bacteriana (véase el literal A.2) el factor de dilución es 10-1;

V es el volumen de la muestra. Para el método de dilución-neutralización y el procedimiento de

validación (véanse los numerales 5.5.2.2, 5.5.2.4 y Anexo A literal A.4.1) y la suspensión bacteriana (véase el Anexo A.2), el volumen de la muestra es de 1,0 ml. Para el método filtración por membrana y el procedimiento de validación (véanse los numerales 5.5.3.2, 5.5.3.4 y Anexo A.4.2) el volumen de la muestra es de 0,1 ml.

Para el procedimiento de ensayo (véase el numeral 5.5) cuando el número de ufc en todas las cajas contadas es inferior a 15, registre la cantidad de recuentos viables de la mezcla de ensayo como inferior a 1,5 x 101 ufc/ml (<1,5 x 101 ufc/ml). Cuando el número de ufc en todas las cajas contadas es superior a 300, registre el recuento viable de la muestra de ensayo como superior a 3 x 102 ufc/ml (> 3 x 102 ufc/ml).


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5.6.2 Verificación de la metodología 5.6.2.1 Método de dilución-neutralización Asegúrese de lo siguiente: a) ningún recuento de caja individual utilizado para calcular el valor de N, A y B debe ser

superior a 300 ufc/ml; b) N, A y B están entre 100 ufc/ml y 300 ufc/ml; c) B y A son iguales o superiores a 0,5 veces N; d) C es igual o superior a 0,5 veces B. en donde

N es el recuento promedio de la caja del control de la suspensión de ensayo (en ufc/ml) (véase el numeral 5.4.1.4);

A es el recuento promedio de la caja del control de la suspensión de ensayo para la validación de las

condiciones experimentales (agua dura) (en ufc/ml) (véase el Anexo A A.4.1.2); B es el recuento promedio de la caja de no toxicidad del control del neutralizador (en ufc/ml) (véase

el Anexo A A.4.1.3); C es el recuento promedio de la caja del control del método de dilución-neutralización (en ufc/ml)

(véase el Anexo A A.4.1.4) 5.6.2.2 Método de filtración por membrana Asegúrese de lo siguiente: a) ningún recuento de caja individual empleado para el cálculo de N y A es superior a 300 ufc/ml y

que N y A están entre 100 ufc/ml y 300 ufc/ml; b) ningún recuento de caja individual empleado para el cálculo de B es superior a 150 ufc/ml y

que B está entre 50 ufc/ml y 150 ufc/ml; c) C es igual o superior a 0,5 veces B. en donde

N es el recuento promedio de la caja del control de la suspensión de ensayo (en ufc/ml) (véase el numeral 5.4.1.4);

A es el recuento promedio de la caja del control de la suspensión de ensayo para la validación de las

condiciones experimentales (agua dura) (en ufc/ml) (véase el Anexo A literal A. 4.2.2); B es el recuento promedio del control de filtración (en ufc/ml) (véase el Anexo A literal A.4.2.3); C es el recuento promedio de la caja del control del método de filtración por membrana (en ufc/ml)

(véase el Anexo A literal A.4.2.4).


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5.7 CONCLUSIÓN 5.7.1 Se considera que los productos para la fricción higiénica de manos que demuestran una reducción de 105 en los recuentos viables en un periodo de 1 minuto ± 5 s a 20 °C en las condiciones definidas por este ensayo cuando los organismos de ensayo son Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus hirae y Staphylococcus aureus, se considera aprobado el ensayo. Si el fabricante recomienda tiempos de exposición inferiores a 1 minuto, se considera que el producto ha pasado la prueba si se logra una reducción similar en 30 s ± 5 s. Los productos que aprueban el ensayo se pueden describir como preparaciones bactericidas para desinfección higiénica de manos y se puede proseguir a la evaluación adicional para calificar su eficacia en las condiciones que simulan su uso sobre las manos –UNE- EN 1500). 5.7.2 Se considera que los productos para lavado higiénico de manos que demuestran una reducción de 103 en los recuentos viables en un periodo de 1 min ± 5 s a 20 °C en las condiciones definidas por este ensayo cuando los organismos de ensayo son Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus hirae y Staphylococcus aureus han aprobado el ensayo. Si el fabricante recomienda tiempos de exposición inferiores a 1 minuto, se considera que el producto ha aprobado el ensayo si se logra una reducción similar en 30 s ± 5 s. Los productos que aprueban el ensayo se pueden describir como preparaciones bactericidas para desinfección higiénica de manos y se puede proseguir la evaluación adicional para determinar su eficacia en las condiciones que simulan las prácticas rutinarias de uso (EN 1499) 5.7.3 Se considera que los productos para fricción quirúrgica de manos que demuestran una reducción de 105 en los recuentos viables en un periodo de 5 min ± 10 s a 20 °C en las condiciones definidas por este ensayo cuando los organismos de ensayo son Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus hirae y Staphylococcus aureus han aprobado el ensayo. Si el fabricante recomienda tiempos de exposición inferiores a 5 min, se considera que el producto ha aprobado el ensayo si logra una reducción similar en 1 min ± 5 s, 2 min ± 10 s, 3 min ± 10 s y/o 4 min ± 10 s. Los productos que aprueban el ensayo se pueden describir como preparaciones bactericidas para desinfección quirúrgica de manos y se puede proseguir la evaluación adicional para determinar su eficacia en las condiciones que simulan las prácticas rutinarias de uso (EN 12791). 5.7.4 Se considera que los productos para lavado quirúrgico de manos que demuestran una reducción de 103 en los recuentos viables en un periodo de 5 min ± 10 s a 20 °C en las condiciones definidas por este ensayo cuando los organismos de ensayo son Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus hirae y Staphylococcus aureus han aprobado el ensayo. Si el fabricante recomienda tiempos de exposición inferiores a 5 min, se considera que el producto ha aprobado el ensayo si logra una reducción similar en 1 min ± 5 s, 2 min ± 10 s, 3 min ± 10 s y/o 4 min ± 10 s. Los productos que aprueban el ensayo se pueden describir como preparaciones bactericidas para desinfección quirúrgica de manos y se puede proseguir la evaluación adicional para determinar su eficacia en las condiciones que simulan las prácticas rutinarias de uso EN 12791). 5.7.5 Se considera que los productos que han cumplido con los requisitos para ficción higiénica de manos ( véase el numeral 4.2) también han cumplido con los requisitos para fricción quirúrgica de manos (véase el numeral 4.4). Los productos que han cumplido con los requisitos para lavado higiénico de manos (véase el numeral 4.3) también se consideran conformes con los requisitos para el lavado quirúrgico de manos (véase el numeral 4.5).


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5.8 INFORME DE ENSAYO El informe debe hacer referencia a esta norma. El informe de ensayo debe indicar como mínimo la siguiente información: a) Identificación del laboratorio que realiza el ensayo. b) Identificación de la muestra: 1) nombre del producto; 2) número del lote; 3) fabricante; 4) fecha de entrega; 5) condiciones de almacenamiento; 6) principios activos y sus concentraciones ; 7) diluyente para usar con el producto recomendado por el fabricante. c) Método de ensayo y su validación:

- si se utilizó el método de dilución-neutralización, se deben suministrar detalles completos de los ensayos para la validación del neutralizador.

- si se utilizó el método de filtración por membrana, se deben suministrar detalles

completos de los ensayos para la validación del método. También se deben indicar todos los detalles de procedimiento que se realizaron para justificar el uso del método de filtración por membrana.

d) Condiciones experimentales: 1) período de análisis; 2) concentraciones del producto para ensayo; 3) temperatura de ensayo; 4) tiempos de contacto; 5) procedimiento de recuento; 6) temperatura de incubación. e) Resultados de ensayo: - ensayos de validación. - valuación de la actividad bactericida (véanse también las Tablas D.1 y D.2).


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f) Conclusión. g) Localidad, fecha y firma identificada. NOTA En el Anexo D se suministra un ejemplo de un informe de ensayo típico.


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ANEXO A (Normativo)

MÉTODO DE ENSAYO PARA LA VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS DE DILUCIÓN-

NEUTRALIZACIÓN Y FILTRACIÓN POR MEMBRANA A.1 PRINCIPIO Para cada producto se selecciona un neutralizador según las indicaciones de véase el Anexo A literal A.4.1 (véase el numeral 5.5). Si no se puede encontrar un neutralizador adecuado, se usa el método de filtración por membrana según las indicaciones de véase el Anexo A literal A.4.2. A.2 Preparación de la suspensión bacteriana Para preparar la suspensión bacteriana, diluya la suspensión bacteriana para ensayo (véase el numeral 5.4.1.3) con el diluyente (véase el numeral 5.2.2.4) para obtener la suspensión bacteriana de 4,5 x 102 ufc/ml a 3 x 103 ufc/ml. Para el recuento de la suspensión, prepare una dilución de 10-1 con el diluyente (véase el numeral 5.2.2.4) y mezcle (véase el numeral 5.3.2.6). Tome una muestra de 1,0 ml de la dilución de 10-1 en duplicado e inocule usando la técnica de siembra en profundidad o siembra en superficie. Si se utiliza la técnica de siembra en profundidad, vierta con pipeta cada muestra de 1,0 ml de la mezcla en cajas de Petri (véase el numeral 5.3.2.10) independientes y adicione 12 ml a 15 ml de TSA (véase el numeral 5.2.2.3) fundido y enfriado a 45 °C ± 1 °C. Si se utiliza la técnica de siembra en superficie, disperse cada muestra de 1,0 ml de la mezcla sobre una cantidad adecuada de cajas secas que contengan TSA (véase el numeral 5.2.2.3). Incube las cajas a temperatura de 36 °C ± 1 °C (o 37 °C ± 1 °C) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razón, no se puedan contar. Realice el recuento de las cajas y determine el número de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor número de colonias para cada caja. Calcule el número de ufc/ml en la suspensión bacteriana (Nv) utilizando el método que se indica en el numeral 5.6.1.2. A.3 PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DEL PRODUCTO PARA ENSAYO Véase el numeral 5.4.2. Para productos de fricción de manos, el producto se utiliza sin diluir como la solución de producto para ensayo. Para productos de lavado de manos, prepare una dilución al 55% (V/V) del producto de lavado de manos de ensayo en agua dura (véase numeral 5.2.2.7) como solución del producto para ensayo A.4 ENSAYO PARA VALIDACIÓN A.4.1 Método de dilución-neutralización A.4.1.1 Generalidades Antes del ensayo, equilibre todos los reactivos (solución del producto para ensayo, agua, suspensión bacteriana para ensayo, neutralizador) a la temperatura de ensayo de 20 °C ± 1 °C


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utilizando el baño de agua (véase el numeral 5.3.2.2) controlado a 20 °C ± 1 °C. Verifique que la temperatura de los reactivos se estabilice en 20 °C ± 1 °C. A.4.1.2 Validación de las condiciones experimentales (agua dura) seleccionadas (A) Este ensayo de validación se lleva a cabo para productos de lavado de manos únicamente, los cuales se deben someter a ensayo en una dilución de 55 % (V/V) en agua dura. Coloque 9,0 ml de agua dura (véase el numeral 5.2.2.7) en un tubo de ensayo estéril. Adicione 1,0 ml de una suspensión bacteriana diluida que contengan de 4,5 x 102 ufc/ml a 3 x 103 ufc/ml preparada según se indica en el Anexo A. literal A.2. Ponga en marcha inmediatamente el cronómetro y mezcle (véase el numeral 5.3.2.6) durante unos s. Deje en el baño de agua a 20 °C ± 1 °C durante un tiempo de contacto de 1 min ± 5 s (lavado higiénico de manos) o 5 min ± 10 se (lavado quirúrgico de manos. NOTA 1 Al añadir las suspensiones bacterianas a los recipientes se recomienda tener precaución para evitar tocar la parte superior de los lados del recipiente. NOTA 2 Los productos destinados para uso tanto en lavado higiénico de manos como lavado quirúrgico de manos se deberían someter a ensayo únicamente para el tiempo de contacto más prolongado de 5 min. Al final del tiempo de contacto mezcle (véase el numeral 5.3.2.6) durante unos s. Tome una muestra de 1,0 ml de la mezcla en duplicado e inocule utilizando la técnica de siembra en profundidad o de siembra en superficie, Si se utiliza la técnica de siembra en profundidad, vierta con pipeta cada muestra de 1,0 ml de la mezcla en cajas de Petri (véase el numeral 5.3.2.10) independientes y adicione 12 ml a 15 ml de TSA (véase numeral 5.2.2.3) fundido y enfriado a 45°C ± 1°C. Si se utiliza la técnica de siembra en superficie, disperse cada muestra de 1,0 ml de la mezcla sobre una cantidad adecuada de cajas secas que contengan TSA (véase el numeral 5.2.2.3). Incube las cajas a temperatura de 36 °C ± 1 °C (o 37 °C ± 1 °C) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razón, no se puedan contar. Realice el recuento de las cajas y determine el número de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor número de colonias para cada caja. Calcule el número de ufc/ml en el control de las condiciones experimentales (agua dura) (A) utilizando el método que se describe en el numeral 5.6.1.2. Repita el procedimiento anterior para cada organismo de ensayo. A.4.1.3 Validación de no toxicidad del neutralizador (B) Coloque 9,0 ml de neutralizador (véase el numeral 5.2.2.5) en un tubo de ensayo estéril. Adicione 1,0 ml de una suspensión bacteriana diluida que contengan de 4,5 x 102 ufc/ml a 3 x 103 ufc/ml preparada según se indica en el Anexo A literal A.2. Ponga en marcha inmediatamente el cronómetro y mezcle (véase el numeral 5.3.2.6) durante unos s. Deje en el baño de agua a 20 °C ± 1 °C durante un tiempo de contacto de 1 min ± 5 s (lavado higiénico de manos o fricción higiénica de manos) o 5 min ± 10 s (lavado quirúrgico de manos o fricción de manos quirúrgica). NOTA 1 Al añadir las suspensiones bacterianas a los recipientes se recomienda tener precaución para evitar tocar la parte superior de los lados del recipiente.


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NOTA 2 Los productos de fricción y lavado de manos destinados para uso tanto de tratamiento poscontaminación como para desinfección de manos quirúrgica se deberían someter a ensayo únicamente para el tiempo de contacto más prolongado de 5 min. Al final del tiempo de contacto mezcle (véase el numeral 5.3.2.6) durante unos s. Tome una muestra de 1,0 ml de la mezcla en duplicado e inocule utilizando la técnica de siembra en profundidad o de siembra en superficie. . Si se utiliza la técnica de siembra en profundidad, vierta con pipeta cada muestra de 1,0 ml de la mezcla en cajas de Petri (véase el numeral 5.3.2.10) independientes y adicione 12 ml a 15 ml de TSA (véase el numeral 5.2.2.3) fundido y enfriado a 45 °C ± 1 °C. Si se utiliza la técnica de siembra en superficie, disperse cada muestra de 1,0 ml de la mezcla sobre una cantidad adecuada de cajas secas que contengan TSA (véase el numeral 5.2.2.3). Incube las cajas a temperatura de 36 °C ± 1 °C (o 37 °C ± 1 °C) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razón, no se puedan contar. Realice el recuento de las cajas y determine el número de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor número de colonias para cada caja. Calcule el número de ufc/ml en el control de no toxicidad del neutralizador (B) utilizando el método que se describe en el numeral 5.6.1.2. Repita el procedimiento anterior para cada organismo de ensayo. A.4.1.4 Validación de la neutralización del método de dilución-neutralización (C) Coloque 1,0 ml de diluyente para la suspensiones bacterianas (véase el numeral 5.2.2.4) en un tubo estéril y luego, simultáneamente, encienda el cronómetro y adicione 9,0 ml de la solución del producto para ensayo (véase el numeral 5.4.2). Deje en el baño de agua a 20 °C durante 5 min ± 10 s. Después, transfiera 1,0 ml de la mezcla en un tubo de ensayo que contenga 8,0 ml de neutralizador (véase el numeral 5.2.2.5) que se ha mantenido previamente en un baño de agua a 20 °C ± 1 °C. Deje en el baño de agua durante 5 min ± 10 s. Adicione 1,0 ml de una suspensión bacteriana que contengan de 4,5 x 102 ufc/ml a 3 x 103 ufc/ml preparada según se indica en el Anexo literal A A.2. Ponga en marcha inmediatamente el cronómetro y mezcle (véase el numeral 5.3.2.6) durante unos s. Deje en el baño de agua a 20°C ± 1°C durante un tiempo de contacto de 1 min ± 5 s (lavado higiénico de manos o fricción higiénica de manos)) o 5 min ± 10 s (desinfección quirúrgica de manos). NOTA 1 Al añadir las suspensiones bacterianas a los recipientes se recomienda tener precaución para evitar tocar la parte superior de los lados del recipiente. NOTA 2 Los productos de fricción y lavado de manos destinados para uso tanto de tratamiento de las manos poscontaminación como para desinfección de manos quirúrgica se deberían someter a ensayo únicamente para el tiempo de contacto más prolongado de 5 min. Al final del tiempo de contacto mezcle (véase el numeral 5.3.2.6) durante unos s. Tome una muestra de 1,0 ml de la mezcla en duplicado e inocule utilizando la técnica de siembra en profundidad o de siembra en superficie Si se utiliza la técnica de siembra en profundidad, vierta con pipeta cada muestra de 1,0 ml de la mezcla en cajas de Petri (véase el numeral 5.3.2.10) independientes y adicione 12 ml a 15 ml de TSA (véase el numeral 5.2.2.3) fundido y enfriado a 45 °C ± 1 °C.


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Si se utiliza la técnica de siembra en superficie, disperse cada muestra de 1,0 ml de la mezcla sobre una cantidad adecuada de cajas secas que contengan TSA (véase el numeral 5.2.2.3). Incube las cajas a temperatura de 36 °C ± 1 °C (o 37 °C ± 1 °C) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razón, no se puedan contar. Realice el recuento de las cajas y determine el número de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor número de colonias para cada caja. Calcule el número de ufc/ml en el control del método de dilución-neutralización (C ) utilizando el método que se describe en el numeral 5.6.1.2. Repita el procedimiento anterior para cada organismo de ensayo. A.4.2 Método de filtración por membrana A.4.2.1 Generalidades Antes del ensayo, equilibre todos los reactivos (solución del producto para ensayo, agua, suspensión bacteriana para ensayo, líquido de enjuague) a la temperatura de ensayo de 20 °C ± 1 °C utilizando el baño de agua (véase el numeral 5.3.2.2) controlado a 20 °C ± 1 °C. Verifique que la temperatura de los reactivos se estabilice en 20 °C ± 1 °C. A.4.2.2 Validación de las condiciones experimentales (agua dura) seleccionadas (A) Este ensayo de validación se lleva a cabo para productos de lavado de manos únicamente, los cuales se deben someter a ensayo en una dilución de 55 % (V/V) en agua dura. Coloque 9,0 ml de agua dura (véase el numeral 5.2.2.7) en un tubo de ensayo estéril. Adicione 1,0 ml de una suspensión bacteriana diluida que contengan de 4,5 x 102 ufc/ml a 3 x 103 ufc/ml preparada según se indica en el Anexo A literal A.2. Ponga en marcha inmediatamente el cronómetro y mezcle (véase el numeral 5.3.2.6) durante unos s. Deje en el baño de agua a 20 °C ± 1 °C durante un tiempo de contacto de 1 minuto ± 5 s (lavado higiénico de manos) o 5 min ± 10 s (lavado quirúrgico de manos). Nota 1. Al añadir las suspensiones bacterianas a los recipientes se recomienda tener precaución para evitar tocar la parte superior de los lados del recipiente. Nota 2. Los productos destinados para uso tanto en lavado higiénico de manos como lavado quirúrgico de manos se deberían someter a ensayo únicamente para el tiempo de contacto más prolongado de 5 min. Al final del tiempo de contacto, mezcle (véase el numeral 5.3.2.6) durante unos segundos. Tome dos muestras de 0,1 ml de la suspensión bacteriana y transfiera cada muestra hacia un equipo de filtración por membrana independiente, que disponga de una membrana y que contenga 50 ml del líquido de enjuague (véase el numeral 5.2.2.5). Filtre y enjuague con 50 ml del líquido de enjuague (véase el numeral 5.2.2.6) y luego transfiera las membranas sobre la superficie de dos cajas individuales de TSA (véase el numeral 5.2.2.3). El tiempo necesario para transferir y filtrar no debería exceder 1 min. Si es superior a 1 min, este tiempo se debe registrar en el informe de ensayo. NOTA 3 Al realizar la transferencia, se debe tener precaución para garantizar que las bacterias se encuentran en la cara superior de la membrana cuando se coloca sobre el TSA y que no queda aire atrapado entre la membrana y la superficie del agar.


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Incube las cajas a temperatura de 36 C ± 1 °C (o 37 °C ± 1 °C) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razón, no se puedan contar. Realice el recuento recuento de las cajas y determine el número de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor número de colonias para cada caja. Calcule el número de ufc/ml en el control de las condiciones experimentales (agua dura) (A) utilizando el método que se describe en el numeral 5.6.1.2. Repita el procedimiento anterior para cada organismo ensayo A.4.2.3 Control del procedimiento de filtración (B) Tome dos muestras de 0,1 ml de una suspensión bacteriana diluida que contengan de 4,5 x 102 ufc/ml a 3 x 103 ufc/ml preparada según se indica en el literal A.2 y transfiera cada muestra hacia un equipo de filtración con una capacidad mínima de 50 ml, que disponga de una membrana independiente. Filtre y enjuague con 50 ml del líquido de enjuague (véanse los numerales 5.2.2.5 y 5.2.2.6) y luego transfiera las membranas sobre la superficie de dos cajas individuales de TSA (véase el numeral 5.2.2.3). El tiempo necesario para transferir y filtrar no debería exceder 1 minuto. Si es superior a 1 minuto, este tiempo se debe registrar en el informe de ensayo. Nota. Al realizar la transferencia, se debe tener precaución para garantizar que las bacterias se encuentran en la cara superior de la membrana cuando se coloca sobre el TSA y que no quede aire atrapado entre la membrana y la superficie del agar. Incube las cajas a temperatura de 36 °C ± 1 °C (o 37 °C ± 1 °C) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razón, no se puedan contar. Realice el recuento de las cajas y determine el número de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor número de colonias para cada caja. Calcule el número de ufc/ml en el control del procedimiento de filtración (B) utilizando el método que se describe en el numeral 5.6.1.2. Repita el procedimiento anterior para cada organismo de ensayo. A.4.2.4 Validación de la neutralización mediante el método de filtración por membrana

(procedimiento de filtración) Coloque 1,0 ml de diluyente para las suspensiones bacterianas (véase el numeral 5.2.2.3) en un tubo estéril y luego, simultáneamente, active el cronómetro y adicione 9,0 ml de la solución del producto para ensayo (véase el numeral 5.4.2). Mezcle y deje en el baño de maría a 20 °C durante 5 min ± 10 s. Al final del tiempo de contacto mezcle (véase el numeral 5.3.2.6) durante unos s. Tome dos muestras de 0.1 ml de la mezcla y transfiera cada muestra hacia un equipo de filtración con una capacidad mínima de 50 ml, que disponga de una membrana independiente , Filtre y enjuague la membrana con no menos de 150 ml y no más de 500 ml del líquido de enjuague (véanse los numerales 5.2.2.5 y 5.2.2.6). Luego cubra las membranas con 150 ml de líquido de enjuague y adicione 0,1 ml de la suspensión bacteriana diluida que contenga de 1 x 102 ufc/ml a 3 x 102 ufc/ml preparada según se indica en el literal A.2.


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Transfiera las membranas sobre la superficie de dos cajas individuales de TSA (véase el numeral 5.2.2.3). El tiempo necesario para transferir y filtrar no debería exceder 1 min. Si es superior a 1 minuto, este tiempo se debe registrar en el informe de ensayo. NOTA Al realizar la transferencia, se debe tener precaución para garantizar que las bacterias se encuentran en la cara superior de la membrana cuando se coloca sobre el TSA y que no queda aire atrapado entre la membrana y la superficie del agar. Incube las cajas a temperatura de 36 °C ± 1 °C (o 37 °C ± 1 °C) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razón, no se puedan contar. Realice el recuento de las cajas y determine el número de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor número de colonias para cada caja. Calcule el número de ufc/ml en el control del método de filtración por membrana (C) utilizando el método que se describe en el numeral 5.6.1.2. Repita el procedimiento anterior para cada organismo de ensayo. A.5 Validación Verifique que los resultados de ensayo cumplen con los requisitos correspondientes de los numerales 5.6.1.2 o 5.6.2.


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ANEXO B (Informativo)

NEUTRALIZADORES

Cuando se especifica un neutralizador, se puede utilizar cualquiera de los que se indican a continuación. NOTA La siguiente lista no es exhaustiva y se pueden probar otros medios.

Tabla B.1. Ejemplos de neutralizadores

Desinfectante Neutralizadores (concentración por litro de fluido o diluyente de muestreo)

Gluconato de clorhexidina polisorbato 80 a) (30 ml) + lecitina de huevo (3 g) + histidina (1 g) (puede ser necesario utilizar concentraciones superiores, hasta cinco veces, para la neutralización completa)

Compuestos de cloro y yodo povidona

polisorbato 80 a) (30 ml) + lecitina de huevo (3 g) + histidina (1 g) + tiosulfato de sodio (5 g) + albúmina de suero bovino, liofilizada (1 g)

Compuestos fenólicos polisorbato 80 a) (30 ml) + lecitina de huevo (3 g) + histidina (1 g) + tiosulfato de sodio (5 g)

Compuestos de amonio cuaternario

polisorbato 80 a) (30 ml) + saponina (30 g) + histidina (1 g) + cisteína (1 g)

a) Con grado analítico, no hidrolizado según el documento Farmacopea Europea volumen 1 TWEEN 80® es un ejemplo de un producto adecuado disponible en el comercio. Esta información se suministra para conveniencia de los usuarios de esta norma y no constituye una aprobación de este producto por parte de ICONTEC


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ANEXO C (Informativo)

LÍQUIDOS DE ENJUAGUE Se puede utilizar cualquiera de los siguientes líquidos de enjuague: - agua (véase el numeral 5.2.2.2); - diluyente (véase el numeral 5.2.2.4); - solución acuosa al 0,1 % (V/V) de polisorbato 80 5); - solución acuosa al 0,5 % (V/V) de polisorbato 80 5); - solución acuosa al 0,5 % (V/V) de polisorbato 805) 5) y 0,07 % de lecitina; - neutralizador (véase el numeral 5.2.2.5); - soluciones amortiguadoras. NOTA Esta lista no es exhaustiva y se pueden probar otros líquidos de enjuague.

5) Con grado analítico, no hidrolizado según el documento Farmacopea Europea volumen 1 TWEEN 80® es un

ejemplo de un producto adecuado disponible en el comercio. Esta información se suministra para conveniencia de los usuarios de esta norma y no constituye una aprobación de este producto por parte de ICONTEC


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ANEXO D (Informativo)

EJEMPLO DE UN INFORME DE ENSAYO TÍPICO

Actividad bactericida de un producto de lavado higiénico de manos destinado para el tratamiento postcontaminación de las manos 1. Identificación del laboratorio de ensayo Besson Test House 2. Identificación de la muestra Nombre del producto......................................................... Lavado de manos Bacticen Número de lote ................................................................. 96-71-51 Fabricante ......................................................................... Centipede Formulations Inc. Fecha de entrega .............................................................. 1996-05-11 Condiciones de almacenamiento ..................................... aquellas del fabricante Sustancias activas y sus concentraciones (opcional) ........ no se indican Diluyente para uso con el producto recomendado por el fabricante ................................................................. agua dura 3. Método de ensayo y su validación Método ............................................................................... dilución-neutralización Neutralizador ..................................................................... 30 g/l, lecitina, esterilizada en autoclave 4. Condiciones experimentales Período de análisis ............................................................ 1996-02-20 a 1996-03-12 Concentración del producto para ensayo........................... producto diluido al 55 % (V/V) en agua dura Temperatura de ensayo .................................................... 20 °C ± 1 °C Tiempo de contacto .......................................................... 1 minuto Procedimiento de recuento ........................................ siembra en superficie Temperatura de incubación .............................................. 36 °C ± 1 °C 5. Resultados de ensayo Véanse las Tablas D.1 y D.2. 6. Conclusión Según el documento EN 12054, el lote 96-71-51 del producto "lavado de manos Bacticen" tiene una actividad bactericida para las cepas indicadas de Escherichia coli (K 12) NCTC 10538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Enterococcus hirae ATCC 10541 en un tiempo de contacto de 1 minuto acorde con los requisitos para un producto de lavado higiénico de manos. 7. Localidad, fecha y firma identificada NOTA El producto, el número de lote y el fabricante se suministran únicamente como ejemplos imaginarios.


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Tabla D.1. Verificación de la metodología y la validación del método de dilución-neutralización

A) validación del método de dilución-neutralización

Recuentos de colonias por caja (cantidad promedio de ufc)

Validación de la neutralización

Organismo de ensayo

Suspensión bacteriana para ensayo (véase el

numeral 5.4.1.4) Control Ensayo Staphylococcus aureus 149, 147

(N = 148) 135, 143 (B = 139)

129, 121 (C = 125)

Pseudomonas aeruginosa 143, 149 (N = 146)

134, 140 (B = 137)

128, 131 (C = 130)

Escherichia coli 142, 150 (N = 146)

135, 139 (B = 137)

120, 124 (C = 122)

Enterococcus hirae 149, 141 (N = 145)

133, 140 (B = 137)

143, 131 (C = 137)

Para las cepas sometidas a ensayo: N y B están entre 100 ufc y 300 ufc; B es mayor a 0,5 veces N; C es mayor a 0,5 veces B. La neutralización se valida con el neutralizador que se ensaya. B) Validación de las condiciones experimentales (agua dura)

Recuentos de colonias por caja (cantidad promedio de ufc)

Organismo de ensayo

Suspensión bacteriana para ensayo (véase el numeral

5.4.1.4)

Ensayo experimental con agua dura

Staphylococcus aureus 149, 147 (N = 148)

142, 148 (A = 145)

Pseudomonas aeruginosa 143, 149 (N = 146)

139, 147 (A = 143)

Escherichia coli 142, 150 (N = 146)

146, 142 (A = 144)

Enterococcus hirae 149, 141 (N = 145)

139, 145 (A = 142)

Para las cepas sometidas a ensayo: N y A está entre 100 ufc y 300 ufc; A es mayor a 0,5 veces N. El método se valida para la condiciones experimentales de la dilución del producto al 55 % (V/V) en agua corriente.

Tabla D.2. Resultados de ensayo para el producto de lavado de manos

diluido al 55% en agua dura

Organismo de ensayo

Muestra de ensayo

Recuento de colonias por caja después de 1 min de contacto ufc/ml de la mezcla de ensayo

Recuento inicial (N)

En tiempo de contacto de 1 min (C)

Staphylococcus aureus

dilución 10-2 dilución 10-3

110 ; 98 2 ; 0

1,48 x 107 1,04 x 103

Pseudomonas aeruginosa

dilución 10-2 dilución 10-3

>300 ; >300 29 ; 29

1,46 x 107

2,8 x 1 03

Escherichia coli dilución 10-2 dilución 10-3

114 ; 110 10 ; 9

1,46 x 107 1,12 x 103

Enterococcus hirae dilución 10-2 dilución10-3

143 ;139 19 ; 11

1,45 x 107 1,41 x 103


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ANEXO E (Informativo)

CEPAS DE REFERENCIA CORRESPONDIENTE EN OTRAS COLECCIONES DE CULTIVO

Pseudomonas aeruginosa: ATCC 15442

CIP 103467 DSM 939 NCIMB 10421

Escherichia coli: ClP 54.117 NCTC 10538 NCIMB 10083

Staphylococcus aureus: ATCC 6538 CIP 4.83 DSM 799 NCTC 10788 NCIMB 9518

Enterococcus hirae: ATCC 10541 CIP 58.55 DSM 3320 NCIMB 8192


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ANEXO F (Informativo)

INFORMACIÓN SOBRE LA APLICACIÓN Y LA INTERPRETACIÓN DE LAS NORMAS

EUROPEAS SOBRE DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS QUÍMICOS El comité CEN/TC 216 quiere llamar la atención del lector de esta norma a los acuerdos logrados con respecto a la relación entre esta norma y normas futuras. Se recomienda tener en cuenta esta información cuando se utilizan las Normas Europeas sobre desinfectantes y antisépticos químicos. F.1 GUÍA GENERAL PARA LA APLICACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS MÉTODOS

DE ENSAYO SEGÚN LAS NORMAS EUROPEAS PARA DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS QUÍMICOS

a) Todas las "recomendaciones de uso" para los productos desinfectantes y antisépticos

químicos deberán estar sustentadas por los resultados de ensayos bactericidas, fungicidas, esporicidas y virucidas de EN que sean adecuados para el campo y el método de aplicación previstos.

b) Para tal fin, los productos desinfectantes y antisépticos químicos se deberían someter

a un programa específico de ensayo que incluya ensayos de fase 1, fase 2/etapa 1 y fase 2/etapa 2, excepto para las situaciones que se indican en los ítems e), f) y g).

c) “Las recomendaciones de uso” deben estar soportadas por los resultados de los

ensayos en fase 3, los cuales son apropiados para el campo de aplicación y el método de aplicación.

d) Las diversas fases y etapas se definen así: - ensayo de suspensión de fase 1 para la actividad básica del producto;

- ensayo de suspensión de fase 2/etapa 1 bajo las condiciones representativas del uso práctico;

- otros ensayos de laboratorio de fase 2/etapa 2, por ejemplo ensayos de

superficies, de lavado y fricción de manos que simulen las condiciones prácticas; - ensayos de campo de fase 3 bajo condiciones prácticas. e) Se acepta que para algunas aplicaciones, los ensayos de fase 2/etapa 1 y fase 2/etapa 2

pueden suministrar suficiente información para la aplicación particular y que los ensayos adicionales de fase 1 pueden no ser pertinentes.

Para las aplicaciones en las que se utilizan los ensayos de fase 2/etapa 1 y fase 2/etapa 2 sin ensayos de fase 1 para sustentar las recomendaciones de uso, se recomienda indicar la justificación para omitir los ensayos de fase 1. Tales aplicaciones estarán indicadas en la propia norma o en la norma adicional que especifica las directrices para la aplicación e interpretación de los ensayos.


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f) Se acepta que para algunas aplicaciones, los ensayos de suspensión de fase 2/etapa 1 pueden suministrar suficiente información para la aplicación particular y que los ensayos adicionales de fase 2/etapa 2 pueden no ser pertinentes.

Para las aplicaciones en las que se utilizan los ensayos de fase 2/etapa 1 sin ensayos de fase 2/etapa 2 para sustentar las recomendaciones de uso, se recomienda indicar la justificación para omitir los ensayos de fase 2/etapa 2. Tales aplicaciones estarán indicadas en la propia norma o en la norma adicional que especifica las directrices para la aplicación e interpretación de los ensayos.

g) Se acepta que para algunas aplicaciones los ensayos de fase 2/etapa 2 junto con

ensayos de fase 1 pueden suministrar suficiente información para la aplicación particular y que los ensayos adicionales de fase 2/etapa 1 pueden no ser pertinentes.

Para las aplicaciones en las que se utilizan los ensayos de fase 2/etapa 2 sin ensayos de fase 2/etapa 1 para sustentar las recomendaciones de uso, se recomienda indicar la justificación para omitir los ensayos de fase 2/etapa 1. Tales aplicaciones pueden estar indicadas en el "método estandar" o en la norma para la aplicación e interpretación de los ensayos.

h) Todas las declaraciones de bactericidas, fungicidas, esporicidas como "sustancias

bioactivas" deben estar sustentadas por ensayos de fase 1 adecuados. F.2 Guía para la interpretación de los ensayos para desinfectantes y antisépticos químicos Se elaborará una norma (o normas) independiente que será utilizada como "guía para la interpretación de los ensayos para desinfectantes y antisépticos químicos" después de que se pacten los métodos de ensayo normales; el propósito de esta norma será especificar en detalle la relación entre los diversos ensayos entre sí y con las recomendaciones de uso.


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DOCUMENTO DE REFERENCIA EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION. EUROPEAN STANDARD, Chemical Disinfectants and Antiseptics. Quantitative Suspension Test for the Evaluation of Bactericidal Activity of Products for Hygienic and Surgical Handrub and Handwash Used in Human Medicine. Test Method and Requirements (Phase 2/step 1). Bruselas, Bélgica. 2001, 31 p. (prEN 12054:2001 E)

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