5 Spectroscopy generalfizika.unios.hr/~ilukacevic/dokumenti/materijali... · Daleki IR (FIR): 25000...
Transcript of 5 Spectroscopy generalfizika.unios.hr/~ilukacevic/dokumenti/materijali... · Daleki IR (FIR): 25000...
Sadrzaj
Reference Ciljevi Spektroskopija
Sto je spektroskopija ? Osnove: opci principi i pojmovi
Energija molekule Procesi
Apsorpcija Emisija Rasprsenje
Kratak pregled nekih vrsta (ne svih) spektroskopija Apsorpcijska spektroskopija Fluorescencijska spektroskopija Raman spektroskopija
Sadrzaj nast.
Spektroskopska oprema Komponente
Izvori Laseri Lampe (“broad band”)
Spektrografi i resetke Vezanje Fizika opticke resetke
difrakcija redovi ucinkovitost disperzija i razlucivost
Detektori “Array detection” i CCD-ovi
Reference
Spektroskopijahttp://www.chem.vt.edu/chem-ed/spec/spectros.html
Internet Journal of Vibrational Spectroscopyhttp://www.ijvs.com/archive.html
The Optics of Spectroscopyhttp://www.jyinc.com/systems/theory/oos/oos.htm
Oriel: TUTORIAL (pdf) http://www.oriel.com/tech/tutori.htm
Resetkehttp://cord.org/cm/leot/course06_mod09/mod06_09.htm
Ostali izvori http://www.spectroscopymag.com/ http://directory.google.com/Top/Science/Chemistry/
Analytical/Instruments/
Primjeri biomedicinske spektroskopije
Ne-invazivno promatranje glukoze Near-Infrared Absorption Spectroscopy
http://www.rgmt.com/
Fluorescence Spectroscopy http://www.argose.com/
Raman Spectroscopy http://www.lightouchmedical.com/
Pre-Cancer/Cancer detection Fluorescence Spectroscopy
http://www.spectrx.com/ http://www.medispectra.com/ http://www.lifespex.com/
Ciljevi
Uvod u spektroskopiju Sto je to?
Energijski nivoi Osnovni procesi Vrste spektroskopija
Pregled primjena
Uvod u spektroskopsku opremu Koje su glavne komponente i koja je njihova
uloga ? Osnove fizike/optike u pozadini Osnovna razmatranja o sastavljanju opreme
Spectroscopy
Definicija:Proucavanje strukture i dinamike tvari putem njihovogmedudjelovanja s elektromagnetskim zracenjem.
Valna duljina (energija) odreduju medudjelovanjes tvarima Apsorpcija Emisija Rasprsenje
Ova medudjelovanja su “probe” za dobivanje informacija o uzorcima
Kvantifikacija sastavnih dijelova Identifikacija (“spektralni potpis”)
Dinamicke promjene u sastavu (kinetika reakcija, itd.)
Spectroscopy
Definicija:Proucavanje strukture i dinamike tvari
putem njihovogmedudjelovanja s elektromagnetskim
zracenjem. Valna duljina (energija) odreduju
medudjelovanje s tvarima Apsorpcija Emisija Rasprsenje
Ova medudjelovanja su “probe”za dobivanje informacija o uzorcima
Kvantifikacija sastavnih dijelova Identifikacija (“spektralni potpis”)
Dinamicke promjene u sastavu(kinetika reakcija, itd.)
Spectroscopy
Definicija:Proucavanje strukture i dinamike tvari
putem njihovogmedudjelovanja s elektromagnetskim
zracenjem. Valna duljina (energija) odreduju
medudjelovanje s tvarima Apsorpcija Emisija Rasprsenje
Ova medudjelovanja su “probe”za dobivanje informacija o uzorcima
Kvantifikacija sastavnih dijelova Identifikacija (“spektralni potpis”)
Dinamicke promjene u sastavu(kinetika reakcija, itd.)
Spectroscopy
Definicija:Proucavanje strukture i dinamike tvari
putem njihovogmedudjelovanja s elektromagnetskim
zracenjem. Valna duljina (energija) odreduju
medudjelovanje s tvarima Apsorpcija Emisija Rasprsenje
Ova medudjelovanja su “probe”za dobivanje informacija o uzorcima
Kvantifikacija sastavnih dijelova Identifikacija (“spektralni potpis”)
Dinamicke promjene u sastavu(kinetika reakcija, itd.)
Spectroscopy
Definicija:Proucavanje strukture i dinamike tvari
putem njihovogmedudjelovanja s elektromagnetskim
zracenjem. Valna duljina (energija) odreduju
medudjelovanje s tvarima Apsorpcija Emisija Rasprsenje
Ova medudjelovanja su “probe”za dobivanje informacija o uzorcima
Kvantifikacija sastavnih dijelova Identifikacija (“spektralni potpis”)
Dinamicke promjene u sastavu(kinetika reakcija, itd.)
Energija molekule
Emolecule =Eelectronic + Evibrational + Erotational + Espin + Etranslational
Nas zanimaju: Eelectronic
Evibrational
Erotational
Energy of a Molecule (ubaciti slike!!!!!!!)
Eelectronic → 105 – 106 kJ/mol → UV-Vis UV-Vis podrucje: 200 – 700 nm
Evibrational→ 10 – 40 kJ/mol → IRBlizu IR (NIR): 800 – 2500 nm (5000 nm)Srednji IR (MIR): 5000 nm – 25000 nm (5 µm – 25 µm)Daleki IR (FIR): 25000 nm – 350000 nm
Erotational→ 10 kJ/mol → mikrovaloviMikrovalno podrucje: 10-3 – 1 m
Espin→ 10-3 J/mole → radiovaloviEtranslational→ kontinuirani spektar
Energy of a Molecule (ubaciti slike!!!!!!!)Eelectronic → 105 – 106 kJ/mol →
UV-VisUV-Vis podrucje: 200 – 700 nm
Evibrational→ 10 – 40 kJ/mol → IRBlizu IR (NIR): 800 –2500 nm (5000 nm)Srednji IR (MIR): 5000 nm – 25000 nm (5 µm – 25 µm)Daleki IR (FIR): 25000 nm – 350000 nm
Erotational→ 10 kJ/mol →mikrovaloviMikrovalno podrucje: 10-3 – 1 m
Espin→ 10-3 J/mole → radiovaloviEtranslational→ kontinuirani spektar
Energy of a Molecule (ubaciti slike!!!!!!!)Eelectronic → 105 – 106 kJ/mol →
UV-Vis UV-Vis podrucje: 200 – 700 nm
Evibrational→ 10 – 40 kJ/mol → IRBlizu IR (NIR): 800 –2500 nm (5000 nm)Srednji IR (MIR): 5000 nm – 25000 nm (5 µm – 25 µm)Daleki IR (FIR): 25000 nm – 350000 nm
Erotational→ 10 kJ/mol →mikrovaloviMikrovalno podrucje: 10-3 – 1 m
Espin→ 10-3 J/mole → radiovaloviEtranslational→ kontinuirani spektar
Energy of a Molecule (ubaciti slike!!!!!!!)Eelectronic → 105 – 106 kJ/mol →
UV-Vis UV-Vis podrucje: 200 – 700 nm
Evibrational→ 10 – 40 kJ/mol → IRBlizu IR (NIR): 800 –2500 nm (5000 nm)Srednji IR (MIR): 5000 nm – 25000 nm (5 µm – 25 µm)Daleki IR (FIR): 25000 nm – 350000 nm
Erotational→ 10 kJ/mol →mikrovaloviMikrovalno podrucje: 10-3 – 1 m
Espin→ 10-3 J/mole → radiovaloviEtranslational→ kontinuirani spektar
Procesi(sto nam govori prethodna slika?)
Apsorpcija: iz osnovnog u pobudeno stanje (10-15 s)
Relaksacija: iz pobudenog u osnovno stanje Unutarnja konverzija (IC)
relaksacija vibracijskih stanja bez zracenja (10-12 - 10-14
s) Emisija
fluorescencija (spontana emisija: 10-10 - 10-8 s) fosforescencija (10-3 - 10-0 s)
zahtjeva intersystem crossing (promjena elektronskogspina) osnovno stanje – singlet pobudeno stanje – singlet promjena spina – triplet intersystem crossing potrebna jos jedna promjena spina kako bi prijelaz u
singletno osnovno stanje bilo moguce
Fluorescencija, fosforescencija i“intersystem crossing”
Opcenito, elektroni u molekulama su spareni –po dva u svaki orbital
Osnovno stanje vecine molekula je singletno rezultat dozvoljenih apsorpcija je, takoder,
singletno stanje, jer je promjena spina elektrona, tehnicki, “zabranjen” proces
“zabranjen” treba shvatiti u smislu vjerojatnosti, a ne apsolutno
fotoni ne nose spin
Pobudenjem elektron prelazi u prazni orbital, cime se oslobada nuznosti sparenih spinova
Fluorescencija, fosforescencija i“intersystem crossing”
Struktura se moze relaksirati direktno u osnovno stanje fluorescencija
Moguc je, medutim, ISC, koji dopusta pobudenom singletnom stanju da prijede u odgovarajuce pobudeno tripletno stanje pobudeno elektronsko stanje moze biti ili singletno (svi
spinovi spareni) ili tripletno (dva spina nesparena)
IC se dogada bez zracenja (sudari, toplina)
jednom u tripletnom stanju, vracanje u osnovno singletno stanje je “zabranjeno” (opet u smislu vjerojatnosti) zbog toga, molekula ostaje u tripletnom stanju zantno
duze nego inace. Kada se emisija konacno dogodi, naziva se fosforescencija
Apsorpcijska spektroskopija
Ako se mjeri u UV-Vis (optickom) dijelu emgspektra Apsorpcija: prijelaz iz
nizeg u vise stanje s prijenosom energije od polja zracenja k apsorberu (molekuli)
ukljucuje prijelaze izmedu elektronskih stanja
spektar atoma ili molekule ovisi o strukturi energijskih nivoa, sto apsorpcijske spektre cinikorisnima za identifikaciju sastava
Mjerenje koncentracije apsorbera u uzorku se postize primjenom Beer-Lambertovog zakona
Credit: NASA, Bernard Schmitt, and UKIRT.
Apsorpcija
Ground state
Excited state
Absorption
Loss of energy as
radiation, heat, etc ...
Apsorpcija duzzrake zracenja
Beerov zakon (Beer-Lambertov zakon)
Empirijska relacija izmedu intenziteta transmitiranog zracenja i broja apsorbera – A. Beer, 1852. Vidite → H. G. Pfeiffer and H. A. Liebhafsky, J. Chem. Ed. 1951, 28, 123-125, “The origins of Beer’s law.”• upadno zracenje je monokromatsko• jedinice apsorbera (atomi, molekule, ioni) djeluju medusobno nezavisno• apsorpcija je ogranicena na volumen uniformnog presjeka
0
Absorbing medium
abc
TA
e
I
IT
eI
eI
eII
bx
kIdx
dI
abc
bck
bn
bck
kb
=−===
=
==
=
−=
−
−
−
−
−
log
10
to0 from over gIntegratin
'
0
0
'0
0
σ
k = absorption coefficient, cm-1
b = path length, cm c = concentration, g L-1, moles L-1
a = absorptivity, cm-1 (concn.)-1
= absorption cross section, cm2
n = absorbers cm-3
b
• Nota: apsorpcija= Opticka gustoca
II0dx
x transmisija
apsorpcija
Beerov zakon (Beer-Lambertov zakon)
Za odstupanja vidite:http://www.files.chem.vt.edu/chem-ed/spec/beerslaw.html
Eksponencijalno smanjenje intenziteta s koncentracijom debljinom uzorka (duljina optickog puta)
Pretpostavke u uzorku nema rasprsenja
utjecaj rasprsenja: stvara gubitke na stranama uzorka
prividna apsorpcija tada veca od stvarne
opticki put nije vise samo debljina kuvete (fantomi nasumicnohodaju kroz uzorak
stvara zahtjev za teorijom sirenja svjetlosti (teorija difuzije, itd.)
Beerov zakon – primjer
Path length / cm 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
%T 100 50 25 12.5 6.25 3.125
Absorbance 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5
Apsorpcijski spektar: hemoglobin
•Hemoglobin (lysed blood)
0
5
10
15
20
25
300 350 400 450 500 550 600 650
Wavelength (nm)
ua(c
m-1
)
Hemoglobin (lysed blood)
Spektroskopija
NIR apsorpcijska spektroskopija gleda vibracijske prijelaze unutar jednog elektronskog
stanja valne duljine: 800 nm - 2.5 µm
obicno se koristi skala valnih brojeva :12,500 - 4000 valni broj je broj valova po jednom centimetru
• valni broj (cm-1): ν' = 1 / λ
• ne zaboravite konverziju λ (nm) → λ (cm)
• npr. 800 nm = 12,500 cm-1
zasto? valni broj se povecava kako se povecava energija
Fluorescencija: dijagram energijskih nivoa
Zracenje od fluorescencije je pomaknuto prema crvenom u odnosu na apsorbirano zracenje (“Stokesov pomak”). Zasto?
Fluorescencija: dijagram energijskih nivoa
Zracenje od fluorescencije je pomaknuto prema crvenom u odnosu na apsorbirano zracenje (“Stokesov pomak”). Zasto?
Ef = Eaps – Evib.relax. – Esolv.relax.↓ ↓
visak energije – disipacija(~10-12 s)
↓
Kashaino pravilo (Vavilov1926.): fluorescencijski spektar ne ovisi o valnoj
duljini pobudenja
Fluorescencijska spektroskopija
Vrsta UV-Vis (opticke) spektroskopije Fluorescencija: molekule koje su pobudene u visa
stanja mogu pasti na niza stanja emisijom
zracenja ukljucuje prijelaze izmedu elektronskih nivoa
Intenzitet emitiranog zracenja je linearno srazmjerno koncentraciji analiziranog uzorka (pri niskim koncentracijama)
Molekularna fluorescencija je korisna za odredivanje kolicine tvari koja emitira
Fluorescencijska spektroskopija
EEMDil ij -→ fluorescencija (intenzitet) EEM razrjedene otopine i oznacava valnu duljinu pobudenja j oznacava valnu duljinu pobudenja
N = broj fluorofora (k = 1 do N) detektirani dio ukupnog intenziteta fluorescencije, STotal(λi, λj) (Ω/4π) intezitet pobudenja, I(λi), debljina uzorka, Ldil svaki fluorofor se moze okarakterizirati s:
koncentracijom, Ck koef. molarne apsorpcije, εk(λi) fluorescencijski kvantni doprinos, φk(λj)
“…a measure of the efficiency with which absorbed light produces some effect and the quantum yield can bedefined by the equation:
Here, quantum yield is essentially the emission efficiency of a given fluorochrome.”
=Ω4π
µak λ i( )
k=1
N∑ φk λ j( )
(1) EEM Dil ij=
Ω4π
STotal λ i,λ j( )I λ i( )Ldil
=Ω4π
2.3Ck εk λ i( )
k =1
N
∑ φ k λ j( )
fotonaih apsorbiran broj
fotona emitiranih broj=φ
Fluorescencijska spektroskopija*
UV-Vis (opticka) spektroskopija (neki, ne svi) dijelovi fluorescencijske spektroskopije
spektar pobudenja fiksirana λ emisije, snimano pobudenje daje podatke o strukturi apsorpcije
dobivamo koef. molarne apsorpcije, εk(λi)
spektar emisije fiksirana λ pobudenja, snimana emisija
dobivamo fluorescencijski kvantni doprinos, φk(λj)
zajedno: matrica pobudenja – emisije vrijeme zivota fluorescencije
kako se pobudena stanja depopuliraju vremenom karakterizira molekule dobivamo molekularnu dinamiku i okolinu
*Dobra referenca: J. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York, 2nd edition (July 1999)
Fluorescencijska spektroskopija
Problemi u fluorescencijskoj spektroskopiji relativno sirok spektar bez jasnih vrpci - otezana
interpretacija (npr. mjesavine fluorofora) potrebno razviti i primijeniti modele sirenja svjetlosti
kako bi dobili kvantitativne informacije zamucenihuzoraka (tj. uzoraka koji rasprsuju i apsorbiraju; npr. tkiva)
mora se minimizirati vjerojatnost promjena uzorka zbog procesa mjerenja (npr. preveliki intenzitet svjetlosti →“photobleaching”)
komponente instrumentarija ne smiju oneciscavatiuzorak (npr. kod fluorescencije stakala)
zracenje pobudenja se mora u potpunosti izbaciti iz detekcije minimizacija “zalutalog” zracenja ili ce preplaviti signal koji nas
zanima
Fluorescencijski spektrometar
1 Lamp housing 2 IR filter 3 Adjustable slits 4 Sample compartment 5 Baffle 6 Filter holders 7 Excitation/emission optics 8 Cuvette holder 9 Emission port shutter 10 PMT detector
In-vivo Fluorescencijski sustavNitrogen Laser
Polychromator
ControllerGatePulser
Computer
IntensifiedDiodeArray
Probe
coupling lenses
excitation fiber(s)
collection fibers
coupling lens
quartz shield
Pumped DyeLaser
emission collection fiberexcitation fiber
Spektar pobudenja: koza
0
10
20
30
40
50
60
240 260 280 300 320 340
Data 1
NormalTumor
Wavelength (nm)
Em
@ 3
45 n
m
----- Normal----- Tumor
Spektar emisije: koza
0
0.5
1
1.5
2
2.5
400 450 500 550 600 650
NormalTumor
Wavelength (nm)
Ex
@ 3
80 n
m
----- Normal----- Tumor
Fluorescencijska spektroskopija
Koje tvari fluoresciraju*? Endogeni fluorofori
amino kiseline strukturni proteini enzimi i ko-emzimi vitamini lipidi porfirini
Egzogeni Fluorofori fotosensitizeri
opcenito, tvari koje fluoresciraju… aromatske, organske
molekule mnostvo dvostrukih veza
*http://www.engr.wisc.edu/bme/faculty/ramanujam_nimmi/0102-_a.pdf
Rasprsenje
Promjena smjera, obicno bez promjene frekvencije zracenja
Ovisnost o λ i prostornoj raspodjeli rasprsenja ovisi o: velicini cestice prema λ zracenja
razlici indeksa loma izmedu tvari koja rasprsuje i okruzujuceg medija
Elasticno rasprsenje (nema promjene frekvencije rasprsenogzracenja) Rayleighevo rasprsenje; cestice puno manje od λ zracenja. Intenzitet
rasprsenja pada kao 1/λ4 (zato je nebo plavo)
Mieovo rasprsenje: cestice usporedljive velicine s λ zracenja
Neelasticno rasprsenje (male promjene frekvencije) Ramanovo rasprsenje: frekvencija zracenja je pomaknuta u odnosu na
frekvenciju pobudenja, no iznos pomaka ne ovisi o frekvenciji pobudenja.Ovaj "Ramanov pomak" je, stoga, intrinzisno svojstvo uzorka
Raman spektroskopija
Looks at vibrational transitions within a single electronic state, but by scattering light of the molecule and looking at how the wavelength of the scattered light is changed (shift in energy). Stokes shift:
small loss in photon energy corresponding to energy lost to vibrational state
shift to longer λ
Anti-stokes shift: small gain in photon energy corresponding to energy gained
by photon from vibrational energy
shift to shorter λ
Raman spektroskopija
Basis of interaction with light is molecular polarizability Probes the polarizability of a molecule
polarizability is the ease with which the electron cloud around a molecule can be distorted (induced dipole)
Raman requires high purity monochromatic source (laser)
Raman requires gratings with large angular dispersion (to resolve small shifts in wavelength)
Intensity ~ concentration (so you can use Raman as a quantification tool under certain circumstances)
Can produce very “information rich” spectra Wavelength range: UV to Infrared
Raman Spektrometar
789nm25 mW
Resolution: 11 cm-1
Range: 500-2000 cm-1
Integration: 15 min
LASER BPFILTER
HN FILTER
SPECTROGRAPH
LN-CCD
CONTROLLER
COMPUTER
CUVETTE
Raman spektroskopija
Raman spectrum of natural diamond (type IIa), showing the main Raman active mode at ~1332 cm-1 (Taken using 514.5 nm laser excitation wavelength). The Raman signal intensity is in arbitrary units (a.u.).
Raman spektroskopija
The trouble(s) with Raman “information rich” spectra can sometimes be difficult to
interpret Raman scattering is a very inefficient process
Only 1 in 108 to 10 10 scattered photons is a Raman scattered photon Often requires long integration times (seconds to minutes) and
high powers... Make sure that you don’t damage your sample
scattering efficiency decreases with increasing wavelength ~ 1/λ4
Tradeoffs try in increase efficiency by going to shorter
wavelengths signal of interest is tiny, sometimes riding on large
fluroescence background can stimulate Raman signal in optical fibers that
interferes with signal of interest
Raman spektroskopija
Typical Raman spectrum obtained from a CVD diamond film, deposited using MWCVD from a 0.5% CH4/H2 gas mixture, 1000 W microwave power, 700°C substrate temperature for 6 hours. Raman spectrum taken using 514 nm laser excitation.
Raman spektroskopija
Note: Raman and NIR spectroscopy are complementary techniques (often people will ask which is “better”).
NIR requires broadband sources measure of change in dipole moment
Raman requires high purity monochromatic source (laser) to
minimize broadening of features Probes the polarizability if a molecule particularly good for samples containing lots of water
Water absorption can swamp NIR absorption signal of interest
Water Raman is weak: opportunity to see components dissolved in water matix