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2019-10-07 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 1

4장. 발효공정과 장치

경북대학교 미생물공학연구실KNUmbl

발효공학 4장 : 발효공정과 장치


4-1. 미생물의 배양형식

1. 배양 형식

가. 배지의 특성에 따라

1) 액체배양 : 표면배양(surface culture), 심부배양(submerged culture)

2) 고체배양 : 밀기울 등의 고체 배지 사용

가) 정치배양 : 공기의 자연환기 또는 표면에 강제통풍

나) 내부 통기배양(강제통풍배양, 퇴적배양) : 금속 망 또는 다공판을 통해 통풍

나. 기질의 공급 방법에 따라

1) 회분배양 (batch culture) : 제한된 기질로 1회 배양

2) 유가배양 (fed-batch culture) : 기질을 수시로 공급하면서 배양

3) 연속배양 (continuous culture : 기질의 공급 및 배양액 회수가 연속적 진행

–steady state(정상상태): 기질 및 산물 농도, 균체량, 균체 증식 단계 등 동일

기질 배양액 기질 배양액

배양 산물생산

단단형(single stage) 다단형(multistage)

- 1 -

회분배양

적응과정

정상과정

균체

기질

배양시간

연속배양



2. 연속배양 kinetics

1) t시간 배양 후의 전체 세포량

세포의 증식 속도 (세포량의 증가속도) : 초기 세포의 양에 비례

dx / dt = µx

(dx / dt : 세포량의 증가속도, µ : 비증식속도, x : 세포량---g/l or 개/l)

dx / x = µdt t에 대하여 적분 t : 0---t, xt : x0---xt

(x0 : 초기 cell mass, xt : t 시간 후의 cell mass)

2) mass doubling time(td)= generation time(h)

ln xt / x0 = µt 에서 xt가 x0의 2배가 될 때 소요된 시간

td = ln 2x0 / x0 = ln2 /µ = 0.693 /µ



3) 비증식속도 µ (specific growth rate)ln xt / x0 = µt xt, x0 : 실험적으로 구하여 t에 대한 ln xt / x0 를 semilog graph에 plot

4) D: 희석율 (dilution rate, h-)D = F/V = 1/RTF: flow rate (l/h), V: reactor volume (l), RT: retention time (h) = V/F

5) 희석율과 µ와의 관계배양조 내의 세포 증가속도 = 0배양조 내 dx / dt = growth - output = 0

µx - Dx = 0 µ = D 비증식속도는 D에 의해 조절

t

ln xt / x0

slope = μ



4-2. 발효공정

1. 발효공정 개요 -94페이지, 그림4-5

장치 살균 ------ 종모 배양 ---------------------- 발효 ----- 생산물 회수, 제품화

(원료주입-살균-접종-증식) (원료주입-살균-접종-증식 및 발효)

* 종모 (starter) : 발효를 위한 미생물 균주를 배양한 것

-술의 경우 주모(밑술, 술밑), 식초 경우 종초, 발효유제품 경우 유산균 균체



2. 발효경과의 유형 : primary, secondary metabolites와 약간 관련

Type I : 증식관련형 --에너지대사 기질의 1차대사경로--분해경로A --- B --- C ---- --- P

-trophophase(영양증식기)와 idiophase(특이생산기) 구별 무(균의 1차대사와 관련)

-균체생산, 에탄올 발효, gluconic acid 발효 등

Type II : 중간형 –에너지대사-기질로부터 1차대사와는 다른 경로로 생성A --- B --- C --- --- 1차대사

│ X --- Y --- --- P(산물) : 2차대사산물--합성경로

-영양증식기와 특이생산기 약하게 구별-증식관련형 대사물질 중 대사조절 -유기산, 아미노산, 핵산관련물질

Type III : 증식비관련형 --균의 증식이 끝난 후 산물의 생성-균의 1차대사와 산물의 생성이 완전히 따로 진행-주로 합성경로의 중간산물로부터 생산-항생물질, 비타민, glucoamylase 등

* 불명확 : 젖산 - I와 II의 중간어떤 항생물질 - II와 III의 중간

균체

산물

t

양

균체

산물

t

양



4-3. 발효조 (배양조, fermentor, bioreactor )

* 발효조 기본형식

-대부분이 호기성 배양 -공기공급, 배양액 순환 및 동력절감 문제 착안

-공기분산방법 - 교반, 펌프, 고압공기, 기상 이용(미생물 피막 위에 공기 순환)

비교) 혐기성 배양 경우 밀폐(산소차단), 공기제거(편성 혐기성)

1. 표준형 발효조 : 통기교반형 발효조(STF, stirred tank fermentor

1) 충돌판(baffle): 용액의 회전 방지-용액 혼합 유도

2) 교반기(agitator=impeller): 혼합, 공기세분, 분산-paddle, propeller, turbine형

3) 공기취입장치(sparger): 공기 액내 분산 주입 - 교반기 바로 밑에 부착

4) 기타: 미생물 접종구, 온도조절, pH 전극, 산과 알칼리 첨가구, 시료채취구



2. Waldhof형: 통기회전원판을 통해 공기 주입 -액의 순환 및 거품의 파괴 유도

-기포의 기계적 처리로 동력비 절감, 산소의 이용 효율 증가

3. Acetator와 cavitator: 독일의 Frings가 고안 – 공기의 자연적 흡입 유도

1) Acetator 형 : 통기교반조의 변형

- aerator 회전으로 액과 공기 흡입 및 혼합 방출

: 축으로부터 공기 흡입 + 터빈으로부터 액 흡입 –혼합 방출

2) Cavitator 형: Waldhof의 변형 - 소형날개 고속회전으로 cavitation 유도

Cavitator 형

Waldhof 형



4. 기포탑형 (air lift fermentor): 공기의 공급으로 기포와 배양액이 위로 상승-공기 및 배양액의 순환 용이 -SCP생산에 유리

5. 탑발효조(단탑형, tower fermentor): 배지 및 공기가 상승하며 발효 계속-기질 소비율 향상 - 산물생성기와 증식기가 다른 경우 유리

기포탑형

탑발효조



4-4. 산소공급

대부분 발효 과정 : 호기적 즉 미생물 증식 및 발효에 산소 요구

영양분 + 산소 ------------------ 균체 + 산물

6.67CH2O + 2.1O2 --------------- C3.92H6.5O1.94 + 2.75CO2 + 3.42H2O

7.14CH2 + 6.135O2 ------------- C3.92H6.5O1.94 + 3.22CO2 + 3.89H2O

(미생물균체)

1. 미생물의 호흡속도 : QO2 = 호흡에 의한 산소의 소비속도

O2의 낮은 용해도 (10 ppm), 배양액과 접촉면에서만 공기 용해

- 산소가 증식 제한인자로 작용

- 호기적 배양 경우 미생물 호흡속도 = 미생물 증식속도

- 세균, 효모: 점성 무, 방선균, 곰팡이: 점성(발효조건 따라 변화)

* QO2 : 용존산소(DO) DO 증가에 따라 증가, 일정 범위 이상의 DO에서는 일정

- 그 DO 농도를 임계산소 분압 (critical DO)

QO2

DO

critical DO

DO＞임계산소분압 - 동력비↑

DO＜임계산소분압 - 증식속도↓

DO=임계산소분압 - 가장 유리



* 용존 산소와 미생물의 호흡속도 관계식 : QO2 = Qm· CL / (Ko + CL)

Monod 식 : 제한 기질과 미생물 증식속도 관계 식 - 산소가 제한 기질로 작용

μ = μm·S / (Ks + S)에서 (효소의 경우 v = Vmax·S / [Km + S])

u - QO2 비호흡속도 (specific O2 uptake rate)로 하면

um - Qm (최대 QO2)

S - CL (액체의 DO 농도)

Ks - Ko (O2에 대한 Michaelis-Menten 상수)- 최대 호흡량 1/2 호흡 시 액체 DO 농도

2. 산소 이동 : 산소 물에 용해 – 용액 중 확산 (교반) - 세포 흡착 (액상-세포)

step1 step2 step3

○│-----------------------│◎

air bubble O2 DO O2 in cell

기상-기상은 무시, 기상 - 액상이 가장 결정적 (산소의 용해)

* 산소의 용해속도 : 기포 표면적에 비례, 용액의 DO와 포화 DO차에 비례

dCL/dt ∝ a(CS - CL) (CL: DO 농도, CS: 포화 DO 농도, a : 기포 표면적)

dCL/dt = KL·a(CS - CL) = OTR(oxygen transfer rate, mM O2/l.hr)

KL : 액경막의 산소이동계수 - 기경막의 산소 이동계수(Kg) 무시

* KL·a : 산소이동 용량계수 (Volumetric oxygen transfer coefficient)

- 기포에서 용액으로 산소가 용해될 때 두 변수 KL 과 a를 합쳐서 고려한 것



4-5. 무균기술

1. 살균

가. 배지 : 증기살균 (배지 성분 변화 위험) – 보통 120℃, 15~20분이 적합

1) 비연속 살균 : 소형 발효조 내에서 살균

– 승온과 냉각에 긴 시간 소요 – 배지 성분 파괴 위험 – 살균조건 매우 중요

2) 연속살균 : 연속살균 장치 (continuous sterilizer)

– 배지를 연속적으로 공급하면서 살균 - 열교환형, 증기취입형 연속살균기

나. 장치 : 증기살균, 가스살균 (ethylene oxide : -10.7℃에서 비등)

연속살균장치

Plate exchanger type Steam injector-flash cooler type -열교환형 연속살균기 -증기취입형 연속살균기

예열 및 예냉



[살균이론] 살균속도 -dN/dt = kN

[k : 비사멸상수(specific death rate), N : 생세포 수 또는 양]

1/N · dN = -k · dt t : 0---t, N : No---Nt

∫ 1 / N·dN = -∫ k·dt [ln N] = -[kt]

ln Nt - lnN0 = -kt

-kt = ln Nt/No

* Determination of kln Nt / No = -kt (일정 살균과정 중 시간에 대한 N 수 실험적 측정)

NtN0

NtN0

t

0

t

0

slope = -K

t

Ln Nt/N0

고온: K 증가

t

N

온도증가



2. 여과: 공기

가. Depth filter : 주로 공기 처리 -99.99% 제균

충진층: 섬유상 매트릭스(유리섬유, 합성수지) - φ수십μ 이하 1ｍ 이상 설치)

살균효과: 관성 충돌, 접촉(섬유간격), 확산(브라운 운동)

나. MF(microfiltration) : pore : φ0.22, 0.45 μ – 완전 제균 가능-주로 membrane filter 사용 : cellulose acetate, cellulose nitrate, -압력손실 증가 -먼저 일반적 여과 후 사용(depth filter)

4-6. 무균조작 : 주입기 (밀폐, 무균), 세병기 (NaOH 및 열수), 병 (고온상태 병입)

4-7. 발효공정의 계측온도 : 온도계pH : 복합유리전극 – 은, 염화은 전극에 염화칼륨을 전해액으로 사용DO : DO meter – 용존 산소 전극 사용공기유량 : flowmeter (유량을 전기적신호로 변환)

유리섬유

압축공기

여과공기



4-8. 발효공정 제어

* 발효공정제어 : 자동화 - 각 탱크가 computer와 연결

- 원료 공급, 살균, 접종, 발효, 통기 등 자동 조절



* Rapid sampling system

*** Rapid sampling system : ..\zrapid sampling.mpeg

../zrapid sampling.mpeg



1. 국개법 (누룩상자, 국상자) : 발효접시에 수동식 배양 – 표면의 자연 공기 이용

2. 다단표면 통풍식 : 국개법을 개량한 정치배양- 다단의 국개 표면에 온도와 습도 조절된 공기 공급하면서 배양

3. 회전드럼식 : 배양상자를 회전원통 안에 장치 – 원통의 회전에 의한 혼합 효과- 내부로 온도 습도 조절된 공기를 공급하면서 배양

국개

4-9. 고체배양 장치


4. 고체내부 통풍식 : 고체 통기배양 장치- 다공판 배양조 아래로 온도, 습도 조절된 공기가 공급되어 위로 배지 층 통과

5. 밀폐식 배양장치 : 원료 증자와 미생물 배양을 하나의 장치 안에서 수행- 선반식, 통기식, 회전드럼식 등


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