2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
-
Upload
elinabeth-swann -
Category
Documents
-
view
215 -
download
0
Transcript of 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
1/30
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
2/30
• DNA bermuatan negatif.
!
Po"er
DNA
• #ika diletakan pada medan listrik$ DNA bergerak ke kutub positif
%anode&.
'
()
• *el agarose digunakan untuk memperlambat memperlambat gerakan DNAdan terpisah berdasarkan ukurannya.
+canning Electron ,icrograph of
Agarose *el %-- /m&
• *el agarose berpori!pori$ DNA
bergerak mele"ati
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
3/30
!
Po"er
DNA
+eberapa cepat DNA migrasi0
Kekuatan medan listrik$ bufer$ konsentrasi gel agarose
ukuran DNA1
2DNA berukuran kecil bergerak lebih cepat daripada DNA yg pan3ang
elektroforesis memisahkan DNA berdasarkan ukurannya
kecil
besar
Dalam gel agarose$ DNA linier migrasi berbanding
terbalik dengan log-4 ukuran molekular.
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
4/30
Agarose
Agarose merupakan polimer linier diekstrasi dari rumput laut.
D!galactose 5$6!anhydro
7!galactose
• +"eetened agarose gels ha8e
been eaten in the 9ar East
since the -:th century.
• Agarose "as first used inbiology "hen Robert Koch2
used it as a culture medium for
;uberculosis bacteria in -
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
5/30
Membuat Gel Agarose
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
6/30
*el agarose dibuat dengan
mendidihkan serbukagarose dalam larutan
bufer.
Agarose
=ufer
7abu utk mendidihkan
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
7/30
Casting tray
+isir *el
Po"er supply
;angki *el ;utup
Kabel
Electrophoresis E>uipment
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
8/30
*el casting tray ? combs
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
9/30
+eal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting
tray on a le8el surface. None of the gel combs should be touching thesurface of the casting tray.
Preparing the Casting ;ray
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
10/30
Agarose 7arutan bufer
Campur serbuk agarose dan larutan bufer. @se a flask that is
se8eral times larger than the 8olume of buffer.
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
11/30
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
12/30
Diamkan larutan agarose mendingin %64BC& dan kemudian
tuangkan dalam cetakan. #angan sampai ada gelembung udara.
,enuangkan gel
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
13/30
Each of the gel combs should be submerged in the melted agarose solution.
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
14/30
Ketika dingin$ agarose polimerisasi$ membentuk gel yg fleksibel.
+etelah dinging %54! minute& gel ber"arna agak putih. 'ati!hati copotsisir dan selotape.
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
15/30
7etakkan gel dalam alat elektroforesis.
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
16/30
buffer
;uangkan bufer sehingga diatas gel ! - mm. Cak setiap
sumuran terisi bufer.
Cathode
%negati8e&
Anode
%positi8e&
wells
DNA
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
17/30
6F 7oading =ufferG
• =romophenol =lue %for color&
• *lycerol %for "eight&
Preparasi +ample
Campur sample DNA dengan bufer sampel. Hni memudahkan sampel
masuk kedalam sumuran$ karena adanya gliserol yg memperberatsampel.
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
18/30
,emasukkan sampel ke *el
Carefully place the pipette tip o8er a "ell and gently eIpel the sample.
;he sample should sink into the "ell. =e careful not to puncture the
gel "ith the pipette tip.
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
19/30
7etakkan penutuo$ hubungkan dengan kabel$ hubungkan dengan po"er
supply. Cek kabel terhubungkan dengan benar ! DNA migrasi ke anode
%merah&. #ika dihidupkan$ terbentuk gelembung pada elektrode
Running the *el
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
20/30
"ells =romophenol =lue
Cathode
%!&
Anode
%&
*el
+etelah dihidupkan$ cek bah"a "arna bergerak pada arah yg benar.
=romophenol blue bergerak serah dg DNA.
DNA
%!&
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
21/30
-44
)44 544
-$64
-$444
44
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
22/30
As an alternati8e to purchasing costly DNA ladders$ one can be created
using meal "orm %Tenebrio molitor & DNA and a restriction enJyme.
httpGpeople.uis.edurmosh-DNAeIerciseLHHa4).pdf
P * l
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
23/30
Pe"arnaan *el
222PERHATIAN1 Etidium bromide merupakanl mutagen kuat
dan toksik. arung tangan harus di!akai setia! waktu"
• Etidium bromide interkalasi pada DNA dan berfluoresensi pada
sinar @L$ menyebabkan DNA terlihat pada *el.
• Etidium bromide dapat ditambahkan pada gel atau pada buf
elektroforesis sebelum atau sesudah elektroforesis.
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
24/30
Pewarna lain #g lebih aman
•
,ethylene =lue• =ioRAD ! =io!+afe DNA +tain
• Mards ! O@HKLie" DNA +tain
• Carolina BLU Stain
others
keuntungan;idak mahal
Kurang toksik
;idak perlu sinar @L
;idak ada sisa bahan berbahaya
kerugianKurang peka
diperlukan DNA lebih banyak pada gel
Perlu "aktu pe"arnaan lebih lama
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
25/30
Pe"arnaan *el
• 7etakan gel pada nampan yang berisi larutan pe"arna hangat.
• Diamkan gel selama )!54 minute.
• untuk menghilangkan kelebihan pe"arna$ diamkan gel dalam air.
• *anti air beberapa kali supaya efisien.
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
26/30
Etidium =romide sumber sinar ultra8iolet untuk dapat dilihat
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
27/30
Lisualisasi DNA %etidium bromide&
-44 )44 544
-$64 -$444
44
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
28/30
Lisualisasi DNA %OuikLHEM &
)4
-$44 -$444
44 :4
)$444 bp
DNA ladder
PCRProduct
"ells
! ! ! ! ! ! !
March 12, 2006
+amples Q -$ 6$ :$ -4 ? -) "ere positi8e for Molbachia DNA
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
29/30
-
8/18/2019 2a. DNA Gel Electorphoresis 2007
30/30