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file:///C|/Documents%20and%20Settings/ltorres/Desktop/tesis%20daysi/Tesis%20Daysi%20G.%20R..htm (1 of 37)12/8/2005 1:44:26 PM


La sabiduría tiende a crecer a medida que crece también la conciencia de la propia ignorancia. Cuando consigues comprender que no eres hoy tan sabio como ayer creías serlo, resulta que hoy eres aún más sabio. (Anónimo)



DEDICATORIA

A ti, mamá, por haberme dado lo mejor de ti, por tus noches de desvelo, tus preocupaciones, por ayudarme a llegar hasta aquí, por tu infinito amor maternal, por ser compañía inseparable en mi vida, porque te quiero.

A mi papá, por tanto batallar en mi camino de crecimiento, por la confianza que me ha tenido, por quererme tanto.

A mis abuelitos, por expresar y derrochar tanto amor cada día, por su intachable solidaridad para conmigo, por ser apoyo indetenible.

Los quiero

AGRADECIMIENTOS

A Dios, porque sin Él no hubiera sido posible mi vida, por seguir cada paso y cada tropiezo que en mi camino se antepone, por levantarme en cada caída, por hacer de mí su discípulo.

A mis padres, por su ayuda incondicional, por ayudarme a crecer, por su amor.

A mi hermana Danairy y a Rafael, por apoyarme todo el tiempo.



A mis abuelitos, por ser instrumentos de amor en mi vida.

A mis tutores Lili, Dulce y Luis, porque sin ellos no hubiera sido posible realizar mi tesis.

A Geidy y a su mamá, por su ayuda desinteresada.

A Yeni, por su constante amistad y ayuda.

A Eduardo, por haber soportado todas mis molestias y por brindarme su apoyo, y a todas aquellas personas que de una forma u otra han colaborado en la realización de este trabajo.

A todos, de todo corazón,

muchísimas gracias

RESUMEN

En el trabajo se desarrolló una metodología para obtener dos crudos de saponinas C1 y C2 partiendo de la droga cruda y

de un extracto liofilizado de hojas de Capraria biflora L., obteniendo un 0.8 % de rendimiento para el crudo #1 (C1) y un 30

% de rendimiento para el crudo #2 (C2). Se realizó un modelo de predicción de la actividad antinflamatoria de las

saponinas, escogiéndose para ello 732 compuestos para la serie de entrenamiento y 155 compuestos para la serie de predicción, obteniendo como por cientos de buena clasificación 93. 30 % y 90.32 % respectivamente.



INDICE

Pág.

Introducción………………………………………………………………….. 1

Capítulo I: Revisión Bibliográfica.

1.1. Monografía de la Capraria biflora L. ……………………………………... 3

1.1.1. Nombres vernáculos……………………………………………………….. 3

1.1.2. Ubicación taxonómica……………………………………………………… 3

1.1.3. Antecedentes del estudio farmacológico………………………………… 3

1.1.4. Composición química………………………………………………………. 4

1.1.5. Usos reportados…………………………………………………………….. 5

1.2. Saponinas……………………………………………………………………. 7

1.2.1. Clasificación…………………………………………………………………. 7

1.2.1.1. Saponinas esteroidales…………………………………………………….. 8

1.2.1.2. Saponinas triterpenoides…………………………………………………... 9

1.2.2. Propiedades…………………………………………………………………. 9

1.2.3. Métodos de identificación………………………………………………….. 101.2.4. Métodos de extracción, aislamiento y caracterización de saponinas…. 111.2.4.1. Extracción y caracterización de saponinas esteroidales……………….. 121.2.4.2. Extracción y caracterización de saponinas triterpenoides……………... 131.2.5. Actividad farmacológica. Aplicaciones…………………………………… 141.2.6. Toxicidad de las saponinas………………………………………………... 161.2.7. Síntesis de saponinas……………………………………………………… 171.3. Modelación molecular……………………………………………………… 171.3.1. Métodos QSAR……………………………………………………………… 171.3.2. Métodos que emplean índices topológicos………………………………. 171.3.3. ToSS MoDe………………………………………………………………….. 181..3.3.1. El ToSS MoDe como método QSAR…………………………………….. 18

Capitulo II: Materiales y Métodos.

2.1. Preparación del material vegetal…………………………………………. 192.1.1. Recolección y selección……………………………………………………. 192.1.2. Secado y molinado…………………………………………………………. 19



2.2. Metodología para la obtención del crudo de saponinas #1……………. 202.3. Pruebas de identificación de saponinas al crudo #1……………………. 202.4. Obtención del extracto acuoso……………………………………………. 212.5. Liofilización…………………………………………………………………... 212.6. Obtención del crudo de saponinas a partir del liofilizado………………. 222.7. Análisis cromatográfico de ambos crudos……………………………….. 222.8. Análisis espectroscópico de ambos crudos……………………………… 232.9. Métodos QSAR. Modelación molecular………………………………….. 23 Capitulo III: Resultados y discusión. 3.1. Obtención de los crudos de saponinas…………………………………... 253.2. Pruebas de identificación al crudo #1……………………………………. 263.3. Análisis cromatográfico de los crudos……………………………………. 273.3.1. Cromatografía en capa delgada…………………………………………... 273.3.2. Cromatografía en columna del crudo #1…………………………………. 273.4. Análisis espectroscópico de los crudos………………………………….. 283.4.1. Espectroscopía UV…………………………………………………………. 283.4.2. Espectroscopía IR…………………………………………………………... 293.5. Predicción de la actividad antinflamatoria de las saponinas…………… 30 Conclusiones………………………………………………………………… 33 Recomendaciones…………………………………………………………... 34 Bibliografía…………………………………………………………………… 35

INTRODUCCION

La Fitoterapia es el uso de plantas -o partes de ella- con fines curativos y es tan antigua como el hombre mismo. Ya en la Prehistoria, cuando la Tierra estaba plagada de plantas, flores y hierbas, nuestros antepasados acudieron a ellas -probablemente tras observar las costumbres de los animales y decidir imitarles- a fin de aliviar sus dolencias. Y así, gracias a la experiencia acumulada al presenciar tanto intoxicaciones como curaciones provocadas por la ingestión -en ocasiones accidental- de distintas especies vegetales, el hombre fue aprendiendo las virtudes curativas de algunas de ellas y las acciones tóxicas de otras. El hombre llegó así a poseer una gran intuición y capacidad de selección -que nosotros hemos perdido- para escoger justamente aquella planta para neutralizar el veneno de una serpiente, aquella flor para detener la hemorragia de una herida o aquella raíz que al masticarla calma los dolores cólicos. A partir de estos conocimientos, la ciencia comenzaría a investigar las virtudes curativas o terapéuticamente aprovechables reales de las plantas, averiguar su composición química y separar sus distintos principios activos, porque la actividad de una droga depende, en primer lugar, del principio o principios activos mayoritarios que contiene, pero éstos suelen ir acompañados de otros principios que potencian, o mejor, modulan la acción de los primeros.Las industrias farmacéuticas, para sintetizar en el laboratorio un medicamento nuevo, suelen pues partir de estos principios activos y posteriormente proceden a "mejorar" su actividad, modificando su fórmula química o acompañándolos



de otros principios sinérgicos (que potencian la acción), reguladores o correctores, así como otras sustancias -naturales o no- cuyas características ya dependen de la forma de dosificación a utilizar (la llamada forma farmacéutica). En general, la tendencia actual hoy de las industrias es fabricar los denominados fitofármacos, que pueden llegar a ser mezclas muy complejas de principios activos de fuentes naturales (plantas) de similar o diferente acción farmacológica destinados al tratamiento de determinadas patologías. Y es esperanzador que actualmente, ante el mal uso y abuso de los fármacos de síntesis, de sus efectos adversos y de las contraindicaciones e interacciones con otros medicamentos (aunque también muchas plantas poseen estos inconvenientes que no son tan frecuentes a las dosis terapéuticas), se opte cada vez más por una medicina que utiliza los agentes naturales basándose en el principio hipocrático "Primum non nocere" (ante todo, no hacer daño) y por estimular la

fuerza vital del individuo, la Vis Medicatrix Naturae. (1) El Departamento de Farmacia de nuestra Universidad, desde hace algunos años viene estudiando la Capraria biflora L., más conocida como esclaviosa; planta medicinal de gran importancia terapéutica tanto desde el punto de vista farmacológico como fitoquímico. Con la realización de este trabajo pretendemos profundizar en el estudio fitoquímico de esta planta, para lo cual nos planteamos los siguientes objetivos:Objetivos:

1. Obtener dos crudos de saponinas a partir de la droga seca y de un extracto liofilizado de hojas de Capraria biflora L. 2. Evaluar los crudos de saponinas mediante un estudio de identificación preliminar.

3. Predecir la actividad antinflamatoria de las saponinas, empleando una aproximación ToSS MoDe.

CAPITULO IREVISION BIBLIOGRAFICA

1.1. Monografía de la Capraria biflora L. 1.1.1. Nombres vernáculos. La Capraria biflora L. es conocida con varios nombres en diferentes partes del mundo: esclaviosa, escabiosa, magüiro,

majuito, viuda (Cuba) (2) ; te del país (Puerto Rico); escobo (Colombia); claudiosa (México); coat- weed (EUA) (3) ; fregosa (Venezuela); the d´ Amerique (Martinica); the du pays (Guadalupe); chá-de-Calcada (Brasil) (4).

1.1.2. Ubicación taxonómica. Según Cronquist (5) , esta planta debe ubicarse de la siguiente forma: División: Spermatophyta. Subdivisión: Magnoliophytina



Clase: Magnoliatae. Orden: ScrophulariaceaeGénero: Capraria. Especie: Capraria biflora L. 1.1.3. Antecedentes del estudio farmacológico.Investigaciones reportadas por Nii y Reinoso (1999), demostraron que un extracto acuoso de dicha planta posee efectos antinflamatorios a dosis de 200 mg/kg de peso comparable a la indometacina 10 mg/kg de peso. También mostró efectos analgésicos aunque en una menor medida, a una dosis de 100 mg/kg, comparándolo con el ácido acetilsalicílico. Un ensayo de toxicidad límite evidencia que el extracto acuoso de esta planta no posee efectos tóxicos graves a dosis menores a 2000 mg/kg de peso. (6)

El aislamiento y la evaluación farmacológica de un crudo de flavonoides obtenido del extracto hidroalcohólico de las hojas secas de la Capraria biflora L., son reportados por Medillina y Ramos en el año 2000. La extracción del material vegetal fue realizado por maceración a través de mezclas hidroalcohólicas (etanol/ agua), en proporciones (9:1) y (1:1), a una temperatura ambiente, lavando con cloroformo y acetato de etilo. Mediante este método se logro el fraccionamiento de los componentes, obteniéndose los flavonoides concentrados en una fracción de acetato de etilo. El crudo así obtenido mostró actividad antinflamatoria a dosis de 150 y 200 mg/ kg de peso, pudiendo ser responsables del efecto antinflamatorio los flavonoides contenidos también en el extracto acuoso evaluado anteriormente.(7)

1.1.4. Composición química. En 1998, Tejeda Pérez realizó un tamizaje fitoquímico para las hojas desecadas a la sombra y obtuvo una composición variada de metabolitos, de donde pudo inferir la presencia de: lípidos, esteroides, saponinas, aminoácidos, alcaloides, quinonas, flavonoides, antocianidinas, taninos, compuestos fenólicos y azúcares reductores. En las raíces de la planta se reporta la existencia de un compuesto color rosa llamado biflorina al cual se le atribuyen propiedades antibacterianas por su acción sobre la mayoría de los gérmenes infecciosos. Se clasifica como una naftoquinona muy soluble en acetona y un poco menos en alcohol especialmente cuando es diluido con agua. Sin embargo, la aplicación de Capraria biflora L. en la medicina popular no se corresponde necesariamente con las propiedades antimicrobianas de la biflorina.(8, 9)

Morais y colaboradores, cuantificaron a través del Método de Folin-Denis, por espectrofotometría UV- visible, los taninos presentes en el te obtenido por infusión de la planta completa, reportando un valor de 335.17 mg/ 100 g de droga (10). Estos metabolitos son compuestos polifenólicos aromáticos, con acción astringente y antinflamatoria, reforzada esta última por sus propiedades antirradicálicas y capacidad antiproteasas. Los medicamentos elaborados a partir de taninos a bajas concentraciones actúan superficialmente y protegen los tejidos vivos en caso de inflamación de membranas y mucosas, y a los pulmones de la ocurrencia de catarros y bronquitis.(11, 12)

La planta es rica en potasio, sodio, magnesio y calcio, lo cual fue determinado en muestras del te y en solución ácida de las cenizas por espectrofotometría de absorción atómica (Ca y Mg) y fotometría de llama (Na y K). Además se aplicó la espectrofotometría de absorción molecular, para cuantificar la presencia de aluminio y hierro. También en la planta se destacan valores relativamente elevados de iones cloruro y en número menos significativo se muestran los iones fosfato. Algunos de estos elementos pudieran ser responsables de parte de la actividad farmacológica de la Capraria biflora L., como es su efecto diurético, el cual en muchas plantas se atribuye, además de los flavonoides, a las sales de potasio presentes en las mismas. También se encontraron altos valores de hierro y zinc. Todo ello resulta ventajoso si tenemos en cuenta que estos son cationes muy comunes y se requieren para muchas reacciones enzimáticas en el organismo.(13,



14)

Los valores encontrados para el cadmio y el plomo resultan inferiores a los valores tóxicos y sin lugar a dudas estos resultados limitan la posibilidad de reacciones colaterales indeseables por este concepto.(14, 15)

1.1.5. Usos reportados. Las plantas del género Capraria fueron utilizadas como bebida por los aborígenes americanos al igual que por los pobladores europeos en todo su alcance natural. La Capraria biflora L. es extensamente usada como una planta medicinal, como un te de hierbas y en lugar del te de China, logrando una acción análoga en dosis regulares.(10, 16)

La medicina natural le ha atribuido muchos usos a esta planta así, por ejemplo, la infusión de las hojas se le reconoce como tónico neurasténica, teniendo como acciones derivadas la de estimulante digestivo (estomáquica) y sudorífica, por lo que puede ser usada en indigestiones y diarreas.[4] Se emplea en los estados febriles y como diurético.(3)

Una de sus aplicaciones más interesantes resulta ser su utilización en dolores menstruales, recuperación post- parto, en duchas y lavados vaginales y en inflamaciones pélvicas.(4)

Se le reportan otros usos en el dolor de oído, hemorroides, tos, reumatismo, problemas hepáticos y con acción tónico fortificante general. Además se aplica en la pneumatosis y como astringente en las heridas.(2)

En Panamá y Colombia la toman como te nacional; en Yucatán la utilizan en baños o loción en las afecciones ováricas y uterinas, en la leuco y gonorrea, y en la diabetes. En Perú se emplea para el tratamiento del asma bronquial como planta sintomática por su acción descongestionante local y disminución del estado de ansiedad, permitiendo un mejor efecto terapéutico de otras plantas curativas o de sostén. En Brasil a partir de la raíz, se preparan tinturas antisépticas que se aplican en forma de compresas y lavados como tratamiento local y preventivo (8), además se utiliza en forma de pomada en el tratamiento de heridas infectadas.(10, 17)

Se reporta que esta planta ayuda a áreas alteradas y proporciona protección al suelo así como a la vida silvestre, y constituye el origen del néctar para las mariposas. El te preparado a partir de las hojas es usado como lavado ocular, alivia la comezón (picazón) en la piel. Los alcaloides, biflorina, presentes en las hojas, se les atribuyen propiedades antibióticas, y sesquiterpenoides, caprariolides A y B procedentes de las partes aéreas de la planta, han demostrado una gran actividad insecticida contra gorgojos adultos de la papa, Cylas formicarius elegantutus.(18)

1.2. Saponinas. Las saponinas son metabolitos secundarios, ampliamente distribuidos en las plantas superiores, en las que se presentan en forma de glucósidos. Sus soluciones acuosas al ser agitadas forman una espuma estable y abundante, hecho este que dio origen etimológicamente, al nombre genérico de estas sustancias provenientes del latín sapon (jabón). Reducen la tensión superficial del agua y son unos excelentes emulsivos. (19, 20)

Desde el punto de vista químico, las saponinas al ser hidrolizadas rinden de dos a seis residuos de monosacáridos y una porción carbonada policíclica que es la aglicona del glicósido, a la cual se le denomina genéricamente sapogenina. (19)



El peso molecular de las saponinas oscila entre 1000 y 1500 daltons. (21)

1.2.1. Clasificación.Desde el punto de vista estructural las saponinas pueden tener un esqueleto tipo esteroidal (de base gonano) o de tipo triterpenoide (derivados del escualeno), las cuales dan lugar a las dos grandes familias de estos metabolitos: las saponinas esteroidales y las saponinas triterpénicas. En ambas familias de saponinas el enlace glicosídico se establece a través del hidroxilo en posición 3 del anillo A de la aglicona. (19)

1.2.1.1. Saponinas esteroidales.Las saponinas esteroidales, se localizan en monocotiledóneas principalmente de las familias de las liliáceas, amarilidáceas, dioscoreáceas y agaváceas (género Yucca y Smilax). También en las dicotiledóneas como en la familia Leguminosas y en especies de los géneros Digitales de la familia Scrophulariáceas y Strophantus de las Apocináceas. (19,

22)

Estas saponinas responden al núcleo del espirostano que adiciona los anillos E y F al esqueleto carbonado tetracíclico de los esteroides, donde los anillos A/B están en configuración trans. Los extractos que contienen estas saponinas tienen un pH aproximadamente neutro. Otra característica es que el metilo como sustituyente en la posición 25, puede tener dos posiciones estereoquímicas: β- axial, que define las neosapogeninas, y α- ecuatorial que define las isosapogeninas. (22)

Figura 1. Saponina esteroidal.Las sapogeninas esteroidales siempre se encuentran en la naturaleza formando parte de una saponina, a pesar de la presencia de saponasas, en muchas de las plantas que sintetizan estos compuestos. Entre las saponinas esteroidales, cabe destacar aquellas que tienen como aglicona a la hecogenina y la diosgenina, compuestos vegetales que sirven de base para la industria de hormonas esteroidales. (19)

1.2.1.2. Saponinas triterpenoides.Las saponinas triterpénicas están ampliamente distribuídas en el reino vegetal y animal y se presentan en tres estructuras químicas diferentes (30-45 carbonos): acíclicas como el escualeno, considerado como el precursor natural de esta familia; tetracíclicas como el panaxadiol y pentacíclicas como la estallogenina. Estas sustancias pueden presentarse en sus fuentes naturales: en forma libre, formando esteres, o como parte de un glicósido (saponina). Las sapogeninas pentacíclicas se subdividen a su vez en tres grupos: tipo lupane, tipo ursane (derivado de la α- amirina), ambos no están presentes en los forrajes, y los de tipo oleanane (derivado de la β- amirina) presentes en estos últimos.(19)

alfa- amirina beta- amirina lupeolFigura 2. Saponinas triterpénicas.Los extractos que contienen estas saponinas tienen un pH ácido.(22) Fuentes ricas de saponinas triterpenoidales y sus geninas son el ginseng, la alfalfa, la avena, la quinua y la soya, entre otras. (23)



1.2.2. Propiedades.Son solubles en agua, pueden extraerse fácilmente en frío o en calor con agua o con alcoholes de bajo peso molecular. (23) Dicha solubilidad en agua esta facilitada por su alto peso molecular y la presencia de los residuos de monosacáridos y de otros grupos polares en la aglicona. (19)

Los extractos se degradan por agitación de los concentrados, con éter, benceno o diclorometano y en algunos casos se separan las saponinas por enfriamiento como sólidos que deben ser purificados por cristalización o por precipitación con mezcla de solventes (clorobutanol y acetona). (23)

Dan sabor amargo y tienden a formar jabones estables en solución acuosa (24), siendo esto último consecuencia de sus propiedades surfactantes, las cuales son causa de su estructura. (25)

1.2.3. Métodos de identificación.Las dos familias de saponinas referidas presentan un grupo de características generales que sirven de base para su identificación rápida:

v Producción de espuma al ser agitadas sus soluciones acuosas, lo cual es la base de la reacción de selivoflo

empleada en el tamizaje fitoquímico. (19)

v Producción de hemólisis de los glóbulos rojos por la mayoría de ellas, propiedad que se aprovecha en las técnicas en que se cuantifica la potencia de estas sustancias.(19)

v Toxicidad en animales poiquilotérmicos, en especial los peces (sapotoxinas), a los cuales provocan parálisis de las agallas (se emplean en formas destructivas de pesca “pescar embarbascado”). (19)

v Producción de una reacción positiva en la prueba de Liebermann- Burchard al extracto etanólico, el cual puede detectar la presencia de triterpenos y/o esteroides, incluso puede diferenciar una estructura triterpénica de una esteroidal. (26)

v Ensayo de pseudosapogeninas donde una muestra se trata con ácido acético y cloroformo, se le adiciona bromo al 2% en cloroformo, y al cabo de media hora nuevamente ácido acético. Una reacción positiva se indica por el desarrollo de un color azul. (22)

v Ensayo de Molish cuya reacción positiva esta dada por la aparición de un anillo violáceo en la interfase. (22)

v La aparición de colores variables en el ensayo de vainillina nos indica igualmente la presencia de saponinas. (22)

v El ensayo de Antrona con formación de un anillo azul en la interfase detecta también la presencia de saponinas. (22)

v Otro de los ensayos es el de Woller para determinar saponinas triterpenoides indicando una reacción positiva el cambio de color durante 1 hora. (22)

1.2.4. Métodos de extracción, aislamiento y caracterización de saponinas.Para la extracción de saponinas se llevan acabo metodologías que difieren poco entre si. Se parte del material vegetal seco, pulverizado y se degrada con benceno o éter de petróleo (este paso no es imprescindible) y se macera 48 horas con metanol, etanol o mezcla hidroalcohólica. (26, 27, 28)

Seguidamente se fracciona el extracto alcohólico con n-butanol y agua, se utiliza la fracción butanólica, a partir de la cual se obtiene el crudo de saponinas. (27)

Esta fracción butanólica (que contiene la mayoría de las saponinas) es tratada con éter dietílico provocando la precipitación de la mezcla de saponinas puras. (28)

Después de extraídas las saponinas, estas se pueden separar por varias técnicas, ya sea desde el punto de vista analítico como preparativo. Las saponinas se separan en cromatografía de papel o cromatografía de capa delgada. Las placas, generalmente de gel de sílice, se utilizan para saponinas puras y extractos crudos, resultan muy baratas, ofrecen el resultado con rapidez y no requieren equipamiento especializado. (27)



Se requiere de una serie de reactivos de visualización para revelar las placas, tales como vainillina: ácido sulfúrico; p-hidroxibenzaldehído; cloruro de antimonio (III); entre otros. (28)

En CCD los sistemas de solventes a utilizar son muy variados, para las agliconas en sílicagel se usan, cloroformo: etanol (19:1), benceno: acetona (17:3), benceno: metanol (23:2), hexano: acetona (4:1), benceno: etanol (17: 3). Un solvente muy frecuente utilizado para esta cromatografía es el cloroformo: metanol: agua (65:35:10). (27)

Otros métodos de separación son la cromatografía en columna (CC) empleando como fase estacionaria la silicagel y como fase móvil una mezcla de solventes constituida por cloroformo: metanol: agua a diferentes proporciones. También tenemos la separación con Sephadex LH 20 como fase estacionaria y usando mezcla de metanol: agua, esta última usada en varias proporciones también. (29)

Existen otras técnicas de separación moderna como la cromatografía de destello (flach), la cromatografía contra corriente a la gota, la cromatografía liquida de baja presión (LPLC), la cromatografía liquida de media presión (MPLC) y la cromatografía liquida de alta presión (HPLC). (28)

Para la derivatización de saponinas se puede emplear la detección ultravioleta, índice refractivo, detección por masa o derivatización. (28)

1.2.4.1. Extracción y caracterización de saponinas esteroidales. Debido a la gran cantidad de grupos polares que poseen las saponinas esteroidales en su estructura son insolubles en solventes orgánicos, sin embargo, son muy solubles en alcohol por eso se hace la extracción alcohólica del glicósido. Una vez hidrolizadas se obtienen las agliconas o sapogeninas que son insolubles en agua pero solubles en solventes orgánicos, por ejemplo: n- heptano y fracciones de petróleo, por lo que se filtra el residuo de la hidrólisis y se extrae con solventes orgánicos. Luego de concentradas estas fracciones, se obtienen las sapogeninas crudas que se cristalizan en metanol, acetona, etc. (30)

En cuanto a la caracterización, las sapogeninas esteroidales permiten un reconocimiento particular por espectroscopia infrarroja. Debido a que los anillos E y F no los contiene ningún otro tipo de producto natural conocido, esto hizo posible que Wall y colaboradores dieran un método de análisis muy rápido y especifico para determinar la presencia de estas saponinas, basado en cuatro bandas en la región de 850- 1000 cm-1. (22)

Las cuatro bandas aparecen en la zona de 860; 900; 920 y 985 cm -1, además, si la banda de 900 es mas intensa que la de 920, la estructura corresponde a una isosapogenina y si la relación es inversa, corresponda a una neosapogenina. (22)

1.2.4.2. Extracción y caracterización de saponinas triterpenoides.Existe un método reportado en la literatura en el cual, a partir del material seco, se realiza la extracción con mezcla hidroalcohólica a diferentes proporciones; el extracto obtenido es evaporado y suspendido en agua caliente posteriormente. Se extrae con n-butanol saturado en agua, donde la fase orgánica obtenida es concentrada y redisuelta en metanol. Esta dilución se adiciona sobre éter dietílico obteniéndose un precipitado floculento, el cual es lavado con éter dietílico para finalmente obtener mezcla de un crudo de saponinas. (29)

Las sapogeninas triterpenoides carecen de las absorciones características descritas para las saponinas esteroidales, por lo que a pesar de la coincidencia del comportamiento tensoactivo, hemolítico y cambios de color, la ausencia de estos detalles en el infrarrojo pueden confirmar que una sustancia pertenece a este grupo de sapogenina triterpenoide. (23)

Se reportan bandas de absorción en el espectro IR en pastilla de Bromuro de Potasio (KBr) a 3400 (OH), 2950 (CH), 1705 (ácido C=O), 1730 (éster C=O), y otras a 1740, 1460, 1385, 1250, 1160 y 1075 cm -1. (31, 32)

1.2.5. Actividad farmacológica. Aplicaciones.Ø Reporte de referencias bibliográficas en las que en varias especies vegetales se considera que un mínimo contenido en saponinas genera un efecto diurético beneficioso, a la vez que desinfectante de las vías urinarias. (33)

Ø Tienen acción hemolítica, al interaccionar con el colesterol de la membrana de los eritrocitos, sobre todo las saponinas con núcleo esteroidal (vía oral esta incidencia es mínima debido a su pequeña absorción por el tubo digestivo, al contrario de lo que ocurre vía endovenosa). (34)



Ø Son irritantes celulares, aprovechándose en dosis medicinales como expectorantes y diuréticos. (34)

Ø Sus propiedades antifúngicas y antibacterianas son importantes en aplicaciones cosméticas. (25)

Ø Nuevas aplicaciones de saponinas en animales de agricultura, especialmente por sus efectos en enfermedades protozoarias. Muchos protozoos entran al cuerpo a través del tracto digestivo o por causa de efectos patológicos en el intestino. Las saponinas reaccionan con el colesterol de la membrana de la célula protozoaria, causando ruptura y lisis de la célula. La giardiasis, por ejemplo, es una enfermedad con síntomas de diarrea severa asociada con el protozoo Giardia lamblia. (25)

Ø El secuestro de ácidos biliares por las saponinas es otra importante aplicación. Los ácidos biliares son excretados por la bilis y se denominan ácidos biliares primarios. Estos son metabolizados por las bacterias en el colon, produciendo ácidos biliares secundarios, siendo algunos de estos últimos, promotores del cáncer en el colon. Con el secuestro de ácidos biliares primarios, las saponinas reducen la formación de ácidos biliares secundarios. Investigaciones en la Universidad de Toronto han demostrado que alimentos con saponinas en el laboratorio de animales redujeron el número de lesiones preneoplásicas en el colon en ratones. Descubrimientos canadienses hallaron que saponinas tuvieron efecto inhibitorio a dosis dependiente en el crecimiento de carcinomas celulares en humanos. (25)

Ø A las quillaja saponinas se les confieren efectos en el sistema inmune. Fracciones purificadas de dichas saponinas como Quil A, son usadas como adyuvantes para vacunas (adyuvantes son sustancias que incrementan la efectividad de las vacunas). Quillaja saponinas incrementan la efectividad tanto en vacunas orales como inyectables. En el caso de las inyectables, Quil A es usada para preparar complejos inmunoestimulantes (ISCOM). ISCOMs son preparados por unión de una porción de proteína viral a Quil A , facilitando el transporte a través de membranas celulares. ISCOMs basados en quillaja saponinas son evaluados en el desarrollo de vacunas experimentales contra el VIH, el virus responsable del SIDA. (25)

Ø El efecto directo estimulatorio del sistema inmune es aprovechado también en el pretratamiento de ratones, mejorando la resistencia a enfermedades. Las saponinas son efectivas en vacunas orales por el mejoramiento de la absorción como resultado del incremento de la permeabilidad de la mucosa, facilitando la absorción de moléculas grandes contenidas en vacunas. (25) Ø Reducen enfermedades del corazón al disminuir el colesterol de la sangre. (35)

Ø Existen grandes evidencias de que algunas formas de artritis son causadas o empeoradas por substancias toxicas en el intestino y estos tóxicos son absorbidos por el cuerpo. Las saponinas no absorben en la sangre, pero trabajan a nivel del intestino delgado. (36)

Ø Las saponinas tienen efecto favorable en la flora intestinal, fomentando el desarrollo de bacterias no dañinas y no dejando crecer a las que causan daño. (36)

Ø La industria farmacéutica emplea saponinas esteróidicas en la hemisíntesis de corticoides. (34)

1.2.6. Toxicidad de las saponinas.Si bien algunas saponinas producen hemólisis, ello no ocurre ordinariamente en la intoxicación por estas plantas, puesto su absorción intestinal es escasa. Priman, por el contrario, sus efectos inflamatorios sobre la mucosa digestiva, y en caso de absorberse en cantidades significativas, provocan principalmente trastornos nerviosos y depresión de la funcionalidad cardíaca. Por otra parte, algunas saponinas poseen propiedades oxitócicas y pueden causar aborto. (37)

Las saponinas resultan especialmente tóxicas en animales de sangre fría (peces, caracoles, anfibios). Los síntomas más característicos en veterinaria causados por plantas ricas en saponinas son: estomatitis, vómitos, enteritis, hemorragias intestinales, congestión pulmonar, insuficiencia renal con nefritis, albuminuria, hematuria, poliuria, convulsiones, excitabilidad, reducción de la fertilidad, parálisis, aborto (en el ganado vacuno por hipocalcemia) y cojera, lesiones del



sistema nervioso y posible muerte por parálisis respiratoria con detención del corazón en sístole. El mecanismo de acción de las saponinas consiste en su poder antiATPasa, merced al cual modifica este sistema en la membrana, perturbando el transporte de sodio a través de ella (descompensación iónica); el estímulo nervioso queda paralizado manifestándose una parálisis de las células musculares quedando la musculatura respiratoria paralizada causando la muerte del animal por asfixia. Las saponinas irritan el tracto gastrointestinal, incrementando la permeabilidad de las células del epitelio permitiendo su entrada en el torrente circulatorio y su acción hemolítica. Reducen la absorción del colesterol (al interaccionar con los ácidos biliares), disminuyen la funcionalidad intestinal e influyen en la digestión y absorción de distintos componentes de la dieta. Es por lo que a las aves de granja se les incluye colesterol en la dieta para que forme complejos insolubles con las saponinas e inactiven su acción tóxica que inhibiría su crecimiento y la producción de huevos. (34)

1.2.7. Síntesis de saponinas.Las saponinas son sintetizadas por una vía metabólica muy común, comienza desde Acetilcoenzima A. El ácido mevalónico y el escualeno son productos intermediarios tanto para las saponinas esferoidales como para las triterpénicas. En el punto de formación del escualeno, la síntesis del colesterol (y otros esteroides) y las saponinas, proceden de la misma línea. (21)

1.3. Modelación molecular.

1.3.1. Métodos QSAR.Los denominados modelos QSAR han agrupado históricamente a todas las técnicas que han intentado establecer modelos de comportamiento de compuestos o familias de ellos en cuanto a actividad biológica se refiere, a partir de datos de un número limitado de productos.Los métodos que relacionan la estructura química con la actividad biológica pueden dividirse en dos grandes categorías:

1. Topológico estadísticos: Sólo tienen en cuenta la estructura química plana de la molécula y se utilizan técnicas estadísticas o de reconocimiento de patrones para encontrar las QSAR.2. Modelado Molecular: Se consideran las propiedades de las moléculas en tres dimensiones y son importantes:

1.3.2. Métodos que emplean índices topológicos.La Topología estudia las posiciones e interconexiones de los elementos dentro de un conjunto (38- 41). Aplicada a las moléculas a dado lugar a la Topología Molecular. Desde este punto de vista no se aborda directamente el estudio de aspectos tales como: estructura tridimensional del compuesto, tipos de enlaces, ángulos de enlaces, ángulos diedro ni la naturaleza de los átomos enlazados, aunque no se puede descartar que un porcentaje significativo de esta información quede registrada subyacentemente en el tratamiento topológico de la estructura molecular, sólo importa la interconexión de los átomos entre sí.

1.3.3. ToSS MoDe.El ToSS MoDe (siglas del inglés Topological SubStructural Molecular Design) es un método de diseño molecular con una base grafo-teórica. Por ser de corte fenomenológico necesita para llegar a relaciones cuantitativas el uso de datos muéstrales, que son procesados estadísticamente. Esto lo convierte en un método general, que no necesita del conocimiento de los mecanismos que intervienen en un proceso dado para describirlo. Aunque se debe reconocer que la dependencia de una muestra constituye su desventaja principal, ya que no siempre se dispone de ésta. 1.3.3.1. El ToSS MoDe como método QSAR.



Una vez descrito el basamento teórico del método diremos que su desarrollo práctico a la hora de aplicarlo al diseño molecular es análogo al de todos los métodos QSAR y sigue el esquema de la figura 3 (Ver anexos).

CAPITULO II

MATERIALES Y METODOS

2.1. Preparación del material vegetal.

2.1.1. Recolección y selección.

El material vegetal se recolecto en zonas urbanas en la ciudad de Santa Clara y en lugares cercanos a la Universidad Central “Marta Abreus” de Las Villas, en los meses de Diciembre y Enero de este curso. Se realizó en horas tempranas de la mañana tomando las partes aéreas de la planta. Se procuró dejar ramas suficientes para no afectar el desarrollo normal de las plantas, teniendo en cuenta que esta es una especie perenne. Comprendió ejemplares que se encontraban en estado de floración y fructificación. Posteriormente se trasladaron en sacos de nylon hasta el laboratorio de Química Farmacéutica y Farmacognosia, donde se procedió a la selección de las hojas como material de interés, eliminando las materias extrañas y otras especies de plantas o impurezas mecánicas que pudieran presentarse.

2.1.2. Secado y molinado.

El secado fue realizado mediante calor artificial, utilizando estufa marca MLW WSU 100 alemana, y extendiendo las hojas sobre bandejas metálicas a una temperatura de 30 °C, tal y como se especifica por Fernández y González en el 2001. Después de secado el material vegetal fue triturado en un molino de cuchillas marca Retsch 6 mbh 5657 tipo SR-2 con un tamiz de 2.0 mm.



2.2. Metodología para la obtención del crudo de saponinas.

Para la obtención del crudo de saponinas se siguió la metodología desarrollada por Larhsini, Marston y Hostettmann en el año 2003.

Procedimiento

Se tomaron 100 g de droga seca y triturada obtenida a través de 2.1.2 pesada en balanza marca OWA Labor, se sometieron a una extracción sucesiva en aparato soxhlet con etanol al 95% y luego con etanol al 50% por tres días, empleando 600 ml de cada mezcla hidroalcohólica. El extracto obtenido se concentró a sequedad en baño de agua y el residuo se suspendió en agua destilada caliente, el cual fue extraído posteriormente con n- butanol saturado en agua (90:10) mediante reflujo en soxhlet nuevamente durante 2 1/2 horas. La fracción orgánica se concentró a vacío utilizando

rotoevaporador marca IKA RV 05- ST, y se calculó el peso. Dicha fracción fue redisuelta en 10 ml de metanol y se adicionó sobre 200 ml de éter etílico con la aparición sucesiva de un precipitado, el cual posteriormente fue lavado con éter etílico obteniéndose un crudo de saponinas, al que denominamos Crudo #1 (C1).

El diagrama de flujo seguido por esta metodología se muestra en la figura 4 (Ver anexos).

2.3. Pruebas de identificación de saponinas al crudo.

Para este ensayo se emplearon pequeñas porciones del crudo obtenido y se disolvió en agua destilada procediéndose a su identificación a través de las reacciones cualitativas correspondientes a los ensayos de espuma, Molish y Vainillina, los cuales se describen a continuación:

o Ensayo de espuma: 1ml de la solución acuosa es agitada. La formación de espuma y su estabilidad por un período de 1 minuto indica una reacción positiva.

o Ensayo de Molish: A 1ml de su solución acuosa se le adiciona 0.5 ml de una de una solución de α- naftol al 5% en etanol. Se mezcla y por la pared del tubo de ensayos se deja caer 2 o 3 gotas de ácido sulfúrico concentrado. La aparición de un anillo violáceo en la interfase indica una reacción positiva.

o Ensayo de Vainillina: A 1 ml de la solución acuosa se le adiciona 0.5 ml de una solución de vainillina al 1% en etanol y se acidifica con ácido clorhídrico o sulfúrico concentrado. La aparición de colores variables indica una reacción positiva.

2.4. Obtención del extracto acuoso.

Para la obtención del extracto acuoso a partir del material vegetal seco y molinado se empleó el aparato soxhlet tradicional, realizándose la extracción hasta agotamiento total de la droga. Este extracto fue obtenido una semana antes de su liofilización con el objetivo de evitar la aparición de hongos en el mismo, además de refrigerarse y de protegerse de la luz para no alterar su composición.



2.5. Liofilización. El extracto acuoso obtenido se procedió a liofilizar utilizando una temperatura de congelación de -40 °C durante 5 horas en bandejas de 250 ml a granel, aplicando posteriormente vacío por 31 ½ horas en un equipo marca Edwards Hight vacuums MODEZ EFG. 2.6. Obtención del crudo de saponinas a partir del liofilizado.

Para la obtención del crudo de saponinas a partir de un extracto liofilizado se siguió el mismo procedimiento descrito para la droga cruda, utilizando una masa de liofilizado de 3.00 g y 130 ml de cada mezcla hidroalcohólica. El crudo obtenido se denominó Crudo #2 (C2).

2.7. Análisis cromatográfico de ambos crudos. Al crudo #1 se le realizó un fraccionamiento en columna cromatográfica (CC) utilizando como fase estacionaria silicagel, eluyendo con una mezcla de cloroformo: metanol: agua (30:10:2), variando las proporciones de cada solvente hasta eluir con 100% de metanol para producir nueve fracciones.La fracción 7 (F7) fue separada sucesivamente en columna de Sephadex LH-20 eluyendo con metanol: agua (7:3) y la

fracción obtenida se pasó por una columna de silicagel utilizando como fase móvil cloroformo: metanol: agua (65:35:5). También se le realizó un análisis en cromatografía de capa delgada (CCD) empleando las siguientes condiciones: Materiales y equipos:

● Placa● Cámara cromatográfica.● Micropipeta.

Sistemas de solventes:

● n- butanol: ácido acético: agua (12:3:5)● cloroformo: metanol (6:3)

Revelador:

● Cámara de yodo.

Al crudo #2 se le realizó solamente un análisis en cromatografía de capa delgada utilizando las mismas condiciones descritas para el crudo #1.

2.8. Análisis espectroscópico de ambos crudos. Se tomaron muestras de cada crudo de saponinas y se analizaron mediante espectroscopía UV, disolviéndolas en



metanol y empleando un equipo Ultrospec III User' s Referente Guide. Se tomaron otras dos muestras de ambos crudos y se analizaron por espectroscopía IR, utilizando un equipo Vector 22 Broker, alemana, en pastilla de Bromuro de Potasio (KBr).

2.9. Métodos QSAR. Modelación molecular.

Para la búsqueda de modelos de clasificación se seleccionó una serie de entrenamiento, formada por dos componentes fundamentales: en primer lugar, un conjunto de compuestos químicos con una actividad farmacológica común a los cuales se les denomina compuestos activos, en segundo lugar un conjunto de compuestos con actividades farmacológicas diversas pero diferente a los compuestos activos, a este segundo grupo de compuestos se ha dado el nombre de compuestos inactivos. Debe destacarse que los compuestos pertenecientes tanto al primer conjunto como al segundo, se ha tenido en cuenta que tengan la mayor variabilidad posible desde el punto de vista estructural.Para esta serie de entrenamiento se le calculó los momentos espectrales a cada uno de los compuestos que la componen ponderando los grafos moleculares con el momento dipolo estándar de enlace, se obtuvo una matriz de datos que contiene los momentos espectrales desde µ0 hasta µ15 para cada uno de los compuestos, los que fueron tomados de

base de datos (Martin negwer). Los momentos espectrales empleados en este trabajo fueron calculado, con el programa ToSSMoDe (42), el cual genera los datos en ficheros de extensión .txt compatibles con el Microsoft Office.El procesamiento de los datos para crear nuevas variables se realizó con el tabulador electrónico Microsoft Excel versión 7.0 para Window 2000. (43)

Los ficheros generados por Excel fueron procesados con el software STATISTICA para Window 95 .En la que se empleó el análisis discriminante lineal para buscar los modelos de clasificación Todos los software fueron corridos sobre una computadora personal IBM Compatible Pentium a 200 MHz con 256 MB de memoria RAM .



CAPITULO IIIRESULTADOS Y DISCUSION

3.1. Obtención de los crudos de saponinas. v Crudo #1 (C1).

Utilizando la metodología descrita en Materiales y Métodos a partir de la droga cruda, se obtuvo un sólido carmelita oscuro con un peso de 0.8 g para un rendimiento de 0.8 %. v Crudo #2 (C2).

Del mismo modo, utilizando el método descrito, obtuvimos partiendo del extracto liofilizado, un sólido carmelita oscuro muy intenso, cuyo peso es de 0.9 g representando un 30 % de rendimiento.

Durante la realización de la extracción del crudo de saponinas #1, después de reflujar con n- butanol, se obtuvo un sólido de color negro al cual se le denomino sólido A, con un peso de 0.095 g. Se le realizaron algunas pruebas de solubilidad, de fusión y de ignición con el objetivo de identificar el tipo o los tipos de sustancias presentes en el mismo. Los resultados fueron los siguientes: Tabla #1. Solubilidad del sólido A.

Solventes Resultados

Tetracloruro de carbono -1,2- propanodiol -

Éter dietílico -Dimetilsulfóxido +

Leyenda: § + …… positivo§ - …… negativo

Al realizarle la prueba de ignición colocando una muestra del sólido a la llama, este no presentó cambio alguno en su estado físico por lo que resultó negativa. En la prueba de fusión tampoco sufrió cambios físicos resultando también negativa dicha prueba. Estos resultados sugieren que el sólido A se trata de un compuesto inorgánico. 3.2. Pruebas de identificación al crudo #1 (C1).

Al crudo #1 obtenido se le realizaron algunas pruebas de identificación con el objetivo de determinar la presencia de saponinas en el mismo, cuyos resultados fueron los siguientes:



Tabla #2. Identificación de saponinas en el crudo #1.

Reacción cualitativa

ResultadosEnsayo de espuma +++Ensayo de Molish +

Ensayo de Vainillina + Leyenda:

■ +++ …… muy positivo■ + …… ligeramente positivo

Como se puede observar en lo antes expuesto, se probó la presencia de saponinas en el crudo mediante varios ensayos cualitativos, resultando positivo para las tres pruebas señaladas sugiriendo la existencia de estos metabolitos. 3.3. Análisis cromatográfico de los crudos. 3.3.1. Cromatografía en capa delgada.Los crudos de saponinas fueron evaluados mediante la cromatografía en capa delgada (CCD) sobre silicagel 60 empleando como fases móviles: A) n- butanol: acido acético: agua (12:3:5) y B) cloroformo: metanol (6:3), utilizando como revelador una cámara de yodo.Los cromatogramas que se obtuvieron se muestran en la figura 5 (anexos). Para el caso de la fase móvil A, en el crudo #1 (C1) se muestra una mancha amarilla, muy bien definida con valor de Rf de 0.81. En el crudo #2 (C2) se aprecia una

mancha amarilla, de mayor tamaño y muy bien definida, cuyo valor de Rf es de 0.76. Con el empleo de la fase móvil B, en el C1 se observa una mancha de color carmelita claro y opaco, bastante definida con un valor de Rf de 0.65. El C2 mostró

una mancha alargada de color carmelita que se va haciendo mas oscura a medida que se va redondeando, cuyo valor de Rf es de 0.48, además se observa claramente una mancha en el sitio de aplicación, lo que evidencia que algunos compuestos han quedado retenidos en el mismo.Los resultados obtenidos en ambas fases móviles sugieren la presencia de otros compuestos acompañando al crudo, ya que los Rf resultantes no se corresponden con los reportados en la literatura para las saponinas, pero son muy similares a los referidos para los alcaloides en sistemas de solventes cloroformo: metanol con valores de 0.44; 0.6 y 0.68 (44, 45). En el caso de la fase móvil A, no se encontraron reportes bibliográficos de Rf que nos permitan comparar con los obtenidos en nuestro trabajo. 3.3.2. Cromatografía en columna del crudo #1 (C1).

El crudo de saponinas #1 se le realizó un fraccionamiento en columna cromatográfica utilizando silicagel como fase estacionaria y eluyendo con mezcla de cloroformo: metanol: agua (30:10:2) variando las proporciones de los tres solventes hasta eluir con 100 % de metanol, obteniendo 9 fracciones. La fracción 7 (F7) fue escogida para ser separada

sucesivamente en columnas de Sephadex LH 20 utilizando como sistema de solventes metanol: agua (7:3) y



posteriormente la fracción obtenida se pasó por una columna de silicagel fluyendo con cloroformo: metanol: agua (65:35:5), para obtener un sólido de color amarillo tenue, al cual no se le pudieron realizar estudios espectroscópicos para su identificación, pues no se contaba con suficiente muestra del sólido.Aunque no se lograron resultados posteriores del sólido obtenido, debemos señalar que el análisis cromatográfico en columna forma parte de la purificación de estos metabolitos. 3.4. Análisis espectroscópicos de los crudos. 3.4.1. Espectroscopía UV.Ambos crudos de saponinas fueron evaluados mediante espectroscopía UV cuyos resultados se muestran en las figuras 6 y 7 (Ver anexos). v Crudo de saponinas #1 (C1).

Mediante el análisis del espectro correspondiente a una muestra de este crudo, se puede observar que el pico máximo de absorción, 210 nm, se encuentra en el UV cercano. Esta es la zona donde absorben los productos naturales.Estos resultados se encuentran dentro de los rangos reportados en informes bibliográficos para otros metabolitos como los alcaloides, con picos máximos de absorción a 214 nm y 220 nm (46, 47). v Crudo de saponinas #2 (C2).

Al realizar el análisis del espectro, podemos apreciar que el mismo presenta tres picos máximos de absorción, 220, 270 y 330 nm en el rango UV- VIS. El primer pico de absorción, 220 nm, nos muestra como en el espectro del crudo #1, la zona donde absorben los productos naturales. Las restantes bandas, una a 270 nm y otra a 330, sugieren la presencia de flavonoides tipo flavonoles presentes en el crudo, si comparamos con ciertas bandas características de estos metabolitos referidos en la literatura a 271 nm y a 328 nm (48), pues no debía esperarse una absorción en el rango UV- VIS dada la estructura de las saponinas.

3.4.2. Espectroscopía IR.Los espectros IR de los crudos C1 y C2 aparecen reflejados en las figuras 8 y 9 (Ver anexos) respectivamente. Al realizar

el análisis de los mismos podemos observar lo siguiente: v Crudo de saponinas #1 (C1).

- Señal en 3418.19 cm-1, banda ancha y alargada que sugiere OH asociado. Estas bandas aparecen entre 3800 cm-1 y 3500 cm-1 según reporta la literatura.- Señal en 2926.97 cm-1, banda pequeña y puntiaguda que sugiere la presencia de enlaces Csp3- H. Estas bandas

aparecen en la literatura entre 3000 cm-1 y 2800 cm-1.- Señal en 1652.02 cm-1, banda alargada que sugiere la presencia de C=C no conjugado y/o C=O conjugado. - Señal en 1384.25 cm-1, banda pequeña y puntiaguda que sugiere la presencia de grupos CH3. Estas bandas aparecen

aproximadamente a 1380 cm-1.- Señal en 1070.46 cm-1, banda que sugiere la presencia de C-O. Según lo reportado en la literatura, estas bandas aparecen a 1050 cm-1 aproximadamente. v Crudo de saponinas #2 (C2).



- Señal en 3423.38 cm-1, banda ancha y alargada que también indica la probable presencia de grupos OH asociados.- Señal en 1607.00 cm-1, banda puntiaguda que sugiere la presencia de C=C no conjugado.- Señal en 1384.29 cm-1, banda pequeña y puntiaguda sugiriendo la presencia de grupos CH3.

- Señal en 1069.81 cm-1, banda puntiaguda y alargada que sugiere la presencia de C-O.Estos resultados espectroscópicos son similares con los reportados en la bibliografía para saponinas triterpénicas si analizamos las bandas que indican la presencia de un grupo OH y enlaces Csp3- H, así como señales de otras bandas

cercanas a 1385 cm-1 y 1075 cm-1 según reporta la literatura. También podemos observar que el grupo OH señalado en los espectros, sugieren que dicho grupo puede ser primario, secundario o terciario presentes en flavonoides, alcaloides y triterpenos. El análisis de estos resultados no nos permiten afirmar la presencia de saponinas en las fracciones de los crudos analizados, pues solo sugieren la existencia de determinados grupos que pueden estar presentes en otros tipos de metabolitos, incluyendo las saponinas. 3.5. Predicción de la actividad antinflamatoria de las saponinas. El primer paso para encontrar un modelo teórico que permita descubrir nuevos fármacos es diseñar una serie de entrenamiento representativa y aleatoria. En este trabajo se ha contado con una amplia data de 732 compuestos que comprenden compuestos activos e inactivos y estos últimos divididos en varios grupos farmacológicos. Esta data fue dividida en dos subseries, una conteniendo 273 compuestos activos y otra de 459 inactivos. Se utiliza el Análisis Discriminante Lineal ( LAD) empleando forward stepwise como estrategia de selección de variables para encontrar la función discriminante. Los compuestos utilizados en la serie de predicción externa nunca fueron empleados en la serie de entrenamiento. El modelo de clasificación así como los parámetros estadísticos son mostrados a continuación: λ = 0.42 D2 = 2.08 F = 15.32 Donde es la lamda de Wilks’, D2 es la distancia de Mahalanobis y la F es la razón de Fisher.La de Wilks’ puede tomar valores entre 0 (discriminación perfecta) y 1 (no discrimina). La selección de los modelos se realizó en base a la calidad estadística de los mismos, los estadígrafos de comparación multivariada tenidos en cuenta para este fin fueron, en primer lugar la lambda (λ) de Wilks. De un conjunto elevado de modelos obtenidos se seleccionaron sólo aquellos cuyo valor de λ es el más pequeño posible, ya que permite evaluar la hipótesis de que dos o más grupos provienen de poblaciones con medias significativamente diferentes para un conjunto de variables. Debido a que valores pequeños de (λ) indican diferencias entre las medias de grupos, este se considera uno de los mejores criterios de comparación multivariada. Otro criterio estadístico importante a la hora de decidir qué modelo se debía seleccionar para realizar clasificaciones de calidad en el proceso de diseño de fármacos fue el cuadrado de la distancia de Mahalanobis (D2 ), la cual es una especie de distancia entre los centroides de cada uno de los supuestos grupos, por lo tanto su valor indicará, de una manera proporcional, la diferencia entre ambos, para grupos idealmente separados entre si la D2 como estimador insesgado de la F de Fisher debe ser mayor o igual a esta para demostrar significación estadística en la prueba de hipótesis, ninguno de los modelos encontrados cumplió este requisito lo cual indica que no hay una separación total entre los grupos sino que existe cierta superposición (49, 50), en este caso D2 es menor que F, indicando que existe un sobrelapamiento entre los grupos reales, este hecho puede ser explicado por la existencia de moléculas con un comportamiento dual pero no reportado en el grupo de los inactivos en la serie de entrenamiento. Para ello se tuvo en cuenta los resultados de la matriz de clasificación, para asegurar la alta calidad del modelo sólo se tomaron aquéllos en los cuales el porcentaje de casos bien clasificados no fuera inferior al 78%, en este sentido se tuvo en cuenta que el



porcentaje de casos bien clasificados para el grupo de sustancias inactivas fuera alto, para evitar la aparición de “falsos activos” a la hora de la predicción, lo cual muestra la calidad de los modelos ya que evita la mala selección de un compuesto en el momento de realizar un diseño racional de fármacos. Además de esto, se prestó especial atención como criterio final de selección, a la capacidad predictiva de los modelos, caracterizada por el porcentaje de buena clasificación en la serie de predicción.Para la discriminación de compuestos activos/inactivos estudiados en este trabajo el modelo clasifica correctamente el 93.04 % de los activos y el 93.46 de los inactivos en la serie de entrenamiento para una buena clasificación global del 93.3 %. Uno de los criterios más importante para la aceptación o no de un modelo discriminante tal como se muestra en este trabajo está basado en los estadísticos de la serie de predicción externa. El modelo clasifica el 90.76 y el 90 % de los activos e inactivos respectivamente, para una clasificación global del 90.32 %.

CONCLUSIONES

ü La metodología de extracción desarrollada a partir del extracto liofilizado resultó la idónea, ya que se obtuvo mayor rendimiento del crudo representando un 30 %.ü Los estudios cromatográficos y espectroscópicos sugieren la posibilidad de la presencia de otros compuestos acompañando al crudo obtenido.ü Se obtuvo un modelo matemático que permite una buena clasificación total del 93.3 %.ü Se validó el modelo con una serie de predicción externa, lográndose el 90.32 % de buena clasificación total.



RECOMENDACIONES

ü Profundizar en los estudios de identificación preliminar de los crudos de saponinas con el objetivo de purificarlos para eliminar estructuras de otros compuestos que parecen estar interfiriendo.ü Desarrollar modelos cuantitativos para la predicción de la actividad antinflamatoria.



BIBLIOGRAFIA 1. María José Valcárcel. La Fitoterapia. URL disponible en: http://www.dsalud.com/fitoterapia_numero17.htm

2. Roig. Mesa, J.T; Diccionario Botánico de Nombres Vulgares Cubanos/ J.T. Roig Mesa. III Edición. La Habana;

Edición Científico – Técnica; T.2. 1984.

3. Morais, N.M.T; Nogueira, C.M.D ; López, M.F.G ; Vasconselos, N.M.S. y SA, M.I: Inorganic analytical study of medicinal plants. An Assoc. Bras Quim.. 44 (4): 14- 19, 1999.

4. Roig Mesa J.T: Plantas Medicinales, Aromáticas o Venenosas de Cuba/ J.T. Roig Mesa. III Edición. La Habana;

Edición Científico – Técnica; T.2. 1984. 5. Croquist, A.: En integrated system of Classification of flowering plants Columbia University Press. New York. 1981.

Pág. 132.

6. Nii y Reinoso. Evaluación del efecto antinflamatorio y analgésico del extracto acuoso de la Capraria biflora L. 1998.

7. Medillina, M. y Ramos, Asnaldo : Aislamiento y evaluación farmacológica de un crudo de flavonoides de Capraria biflora L., como posible responsable del efecto antinflamatorio. Trabajo de Diploma. UCLV. 2000.

8. Matos, F.L.: Farmacias vivas. Editorial EUFC, Pág. 210 Fortaleza. 1994.

9. Beschia, M.; Leonie, A.; Oaencea, J.: Chem. Abst. 101 Pág. 167005, 1984.

10. Ideker, 1: Capraria Mexicans (Scraphuliariaceae) endangered addition to the United States flora, Sida. 17(2); 523,

1996.

11. Pérez L.; Rodríguez, M.: Estandarización de la droga de Rizophora mangle L. Y del fitofármaco del Aseptan. Trabajo de Diploma. UCLV. 1994.

12. Pathak, D., et… al: Flavonoides as medicinal agent recent. Advances Fitoterapia. Vol LXII, No. 5: Pág. 371- 378,

1991.

13. Tejeda, Y. “Trabajo de Diploma: Evaluación farmacognóstica y botánica preliminar de la Capraria biflora L “. Departamento de Farmacia. Facultad de Química. Universidad Central de Las Villas. 1998.

14. Goodman and Gilman, A.; Goodman, L.S. y Gilman, A.: Los metales pesados y sus antagonistas. En Glima, A.: Las

bases farmacológicas de la terapéutica. Edición revolucionaria. Pág. 1574, 1588. 1994.

15. Flores, J.: Farmacología Humana. Ediciones Científico y Técnica, S.A Masson Salvat Medicina. Pág. 296. España 1994.

16. Edwin, G.: Flora of Perú. Field museum of natural history botanic.. Vol XIII: Pág. 654. 1971.

17. Villar, M.; Villavicencio, O.: Plantas medicinales peruanas en el asma bronquial. Naturas Medicatrix. 1994 No. 37- 38: 61- 67.


http://www.dsalud.com/fitoterapia_numero17.htm


18. URL disponible en: http://www.fs.fed.us/global/iitf/pdf/shrubs/Capraria%20biflora.pdf

19. Hernández Royero, R.: Obtención de crudos de saponinas hipocolesteromizantes del Chenopodium quinoa Willd.

Rev. Cubana Med Milit 1997; 26(1):55-62. URL disponible en: http://www.infomed.sld.cu/revistas/mil/vol26-1-97/mil08197.htm 20. URL disponible en: http://www.iespana.es/natureduca/med sustanc glucosidos.htm

21. Therapeutic Application of Saponins. URL disponible en: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sciarttext&pid=S0074- 02762003000500022&lng=en&nrm=iso&tlng=en

22. Miranda Martínez, Migdalia.; Cuéllar Cuéllar, Armando. Saponinas. En: Farmacognosia y productos naturales. La Habana, 2001. Págs. 252- 261.

23. Lock de Ugaz, Olga. Métodos en el estudio de productos naturales. En: Investigación Fitoquímica. Pontificia

Universidad Católica del Perú, Fondo Editorial 1988. Primera Edición, julio de 1988. Págs. 63- 80.

24. Alfalfa Henificada. URL disponible en: http://www.etsia.upm.es/fedna/fibra/alfalfahenificada.htm

25. Peter R. Cheeke, Ph.D. Saponins: Suprising benefits of desert plants. URL disponible en: http://lpi.oregonstate.edu/sp-su98/saponins.html

26. Marcano, Deanna; Haseqawa, Malasia. Triterpenos. Fitoquímica Orgánica. Pág. 233- 274.

27. García Fuentes, Lázaro. Continuación del Estudio Fitoquímico de la Portulaca olerácea L. con fines farmacéuticos.

Tesis para optar por el grado de Licenciado en Ciencias Farmacéuticas. 2000.

28. Hostettman Kart, Hostettman Maryse and Marston Andrew. Saponins. Methods in plant Biochemistry. Capitulo 12. Vol 7, 1991.

29. M. Larhsini a , A. Marston b , K. Hostettman b, * . Triterpenoid saponins from the roots of Silene cucubalus. Revista

Fitoterapia, Vol 74, No. 3, Abril 2003. Págs. 237- 241.

30. Evans, W.C.: Farmacognosia. Trase- Evans/ W.C. Evans. 3ra edición. Editorial Interamericana, S.A..Pag. 139- 142, 1991 16. Farmacopea Internacional, 3ra edición, pág. 135.

31. Maria de Rosário Daros1, Francisco José de Abreu Matos2, and José Paz Parente1, 3. A new Triterpenoid Saponin,

Bredemeyeroside B, from the Roots of Bredemeyera floribunda. Revista Planta Medica, Vol 62, Diciembre 1996, pags. 523- 527.

32. B.M.R. Pereira, M.R. Daros, J.P. Parente, F.J.A. Matos. Bredemeyeroside C, a new saponin from Bredemeyera

floribunda. Revista Fitoterapia, No. 4, 1996, págs. 323- 328.

33. Chifa, Carlos; Ricciardi, Armando I. A. URL disponible en: http://www.unne.edu.ar/cyt/2001/7- Tecnologicas/T-066.pdf

34. Mulet Pascual, Luis. Principios tóxicos y síntomas de intoxicación. URL disponible en: http://www.fitoterapia.net/vademecum/art.html

35. Clarke, Mary. Saponins for Health. URL disponible en: http://www.oznet.ksu.edu/dp fnut/ timely/SAPONIN.HTM


http://www.fs.fed.us/global/iitf/pdf/shrubs/Capraria%20biflora.pdf

http://www.infomed.sld.cu/revistas/mil/vol26-1-97/mil08197.htm

http://www.iespana.es/natureduca/med%20sustanc%20glucosidos.htm

http://www.etsia.upm.es/fedna/fibra/alfalfahenificada.htm

http://lpi.oregonstate.edu/sp-su98/saponins.html

http://lpi.oregonstate.edu/sp-su98/saponins.html

http://www.unne.edu.ar/cyt/2001/7-%20Tecnologicas/T-066.pdf

http://www.fitoterapia.net/vademecum/art.html

http://www.fitoterapia.net/vademecum/art.html


36. Bingham, Robert. Strengthen The Inmune System. Arthritis News TODAY Vol. 4, No. 9. URL disponible en: http://www.saponins.com/the_immune_system.cfm

37. Parada N., Roberto. Saponinas. URL disponible en:

http://www.robertoparada.cl/sapon.htm 38. Estrada, E., J. Chem. Inf. Comput. Sci., 36 (1996) 844.39. Estrada, E., J. Chem. Inf. Comput. Sci., 37 (1997) 320.

40. Estrada, E., J. Chem. Inf. Comput. Sci., 38 (1998) 27.41. Estrada, E., J. Chem. Inf. Comput. Sci., 35 (1995) 31.

42. Rodríguez, L.,Estrada, E.,Gutiérrez, Y. Topological Substructure Molecular Design. UCLV (1997)

43. Microsoft Excel for Windows 95 Ver. 7.0 Copyright

85-9544. Yili Bai 1, Michael Benn 2, and Walter Majak 1, 3. Pyrrolizidine Alkaloids of Three Species of Senecio in British

Columbia. Revista Planta Médica, Vol 62, Febrero 1996. Pág. 71- 72.45. Jih- Jung Chen 1, Tsutomu Ishikawa 2, Chang- Yih Duh 3, Ian- Lih Tsai 1, and Ih- Sheng Chen 1, 4. New Dimeric

Aporphine Alkaloids and Cytotoxic Constituents of Hernandia nymphaeifolia. Revista Planta Medica, Vol 62, Diciembre 1996. Pág. 528- 533.

46. M. Tripathi a, M.B. Pandey a, R.N. Jha a, V.B. Pandey a, *, P.N. Tripathi b, J.P. Singh c. Cyclopeptide alkaloids from Zizyphus jujube. Revista Fitoterapia, Vol 72, No. 5, Junio 2001. Pág. 507- 510.

47. S.D Sarker *, B. Bartholomew, R.J. Nash. Alkaloids from Balanites aegyptiaca. Revista Fitoterapia, Vol 71, No. 3, Junio 2000. Pág. 328- 330.

48. Mohammed Ali *, Earla Ravinder, Ramidi Ramachandram. A new flavonoid from the aerialparts of Tridax procumbens. Revista Fitoterapia, Vol 72, No. 3, Marzo 2001. Pág. 313- 315.

49. Krishnaiah, P. R. Handbook of Statistics. NORTH-Holland Publishing company. 198250. Linares, G. Análisis de Datos. UH. 1990


http://www.saponins.com/the_immune_system.cfm

http://www.saponins.com/the_immune_system.cfm

http://www.robertoparada.cl/sapon.htm


Figura 3. Procedimiento de Trabajo en el diseño empleando una metodología TOSS- MOD

100 g de la droga cruda o 3.00 g de liofilizado.



Se desecha



Figura 4: Metodología general de extracción de saponinas.



■ Fase Móvil: cloroformo: metanol (6:3)■ Placa de silicagel 60.■ Revelador: cámara de yodo.

Leyenda:

o C1: crudo #1.o C2: crudo #2.

C1 C2

Figura 5. Resultados cromatográficos de los crudos de saponinas C1 (a partir de la droga cruda) y C2 (a partir del

liofilizado).



Pico máximo de absorción:

Ø λ (longitud de onda) = 210 nmØ Absorbancia = 1.598

Figura 6: Espectro UV del crudo de saponinas #1 (a partir de la droga cruda).



Picos máximos de absorción:Primer pico.

Ø λ = 220 nmØ Absorbancia = 2.664

Segundo pico:


Tercer pico:


Figura 7: Espectro UV del crudo de saponinas #2 (a partir del liofilizado)



Picos máximos de absorción:Primer pico.


Segundo pico:


Tercer pico:


Figura 7: Espectro UV del crudo de saponinas #2 (a partir del liofilizado)



Figura 8. Espectro IR del crudo de saponinas #1 (a partir de la droga cruda).



Figura 9. Espectro IR del crudo de saponinas #2 (a partir del liofilizado).


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