1Determinación de la actividad de la enzima DyP producida...

Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 6(13): 44-56 2015

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1Determinación de la actividad de la enzima DyP producida por Pleurotus ostreatus y

su capacidad oxidativa de colorantes textiles.

Activity determination of the DyP enzyme produced by Pleurotus ostreatus and

evaluation of their oxidative capacity on several textile dyes.

1Jorge Luis Cuamatzi Flores, 2Soley Berenice Nava Galicia, 3Rubén Díaz Godínez, 2Veronica

Garrido Bazán, 1Saúl Tlecuitl Beristain, 2Martha Dolores Bibbins Martínez.

1Ingeniería en Biotecnología-UPTlax, Av Universidad Politécnica No. 1, C.P. 90180, Tlaxcala,

México, Tel. (246) 465 1300.

2Centro de Investigación en Biotecnología Aplicada (CIBA-IPN), Carretera Estatal Tecuexcomac-

Tepetitla km 1.5, C.P. 90700, Tlaxcala, México, Tel (248) 487 0765.

3Centro de Investigación en Ciencias Biológicas (CICB-UATx), Carretera San Martin Texmelucan

km 10.5, C.P. 90120, Tlaxcala, México, Tel (248)481 5482.

RESUMEN. El hongo Pleurotus ostreatus es un basidiomiceto de pudrición blanca que

hoy día tiene un gran potencial biotecnológico debido a su amplia gama de metabolitos que

secreta.

En este trabajo se determinó el efecto de un colorante textil (amarillo azo) sobre la cinética

de crecimiento y actividad de la enzima dye peroxidasa (DyP) producida por Pleurotus

ostreatus en fermentación sumergida. En la fermentación con colorante se obtuvo una

ligera disminución en la biomasa producida (Xmáx) 7.217 gL-1 y en la velocidad específica

de crecimiento () 0.034 h-1 esto en comparación con la fermentación basal sin colorante en

donde la Xmáx fue de 8.4 gL-1 y la de 0.055 h-1.

Respecto a la actividad de la enzima DyP, se determinó que el pH y temperatura óptimos de

actividad fueron 3.0 y 45 °C. Se observó un claro efecto de inducción del colorante en la

actividad obteniéndose una actividad máxima de 1576 UI/L en comparación con la

actividad máxima alcanzada en la fermentación basal la cual fue de 852 UI/L.

Por otra parte, el extracto enzimático crudo se utilizó para determinar la cinética de

oxidación de 5 colorantes sintéticos en un rango de concentración de 150 ppm a 900 ppm

Recibido: Abril, 2015.

Aprobado: Junio, 2015


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utilizando IFT-IR. Los resultados muestran que los 5 colorantes fueron oxidados en el

rango de concentraciones evaluadas, sin embargo el tiempo de oxidación fue directamente

proporcional a la concentración y complejidad en la estructura química del colorante.

ABSTRACT. Pleurotus ostreatus is a white rot basidiomycete fungus that nowadays have

a great biotechnological potential due to its broad range of secreted metabolites.

It was determined that the dye affects the fungi growth kinetics parameters, being the

maximal biomass (Xmax) and the specific growth rate () smaller than Xmax and obtained

in the basal fermentation.

The highest dye peroxidase (DyP) activity was determined al pH 3.0 and temperature of 45

°C. The maximal activity observed was in the fermentation with dye (1576 UI/L) while in

the basal fermentation was (852 UI/L).

On the other hand, the crude enzyme extract was used to determine the oxidation kinetics of

five synthetic dyes in a concentration range of 150 to 900 ppm ppm using IFT-IR. The

results shown that all dyes were oxidized, however the time of oxidation was directly

proportional to the concentration and complexity in the chemical structure of the dye.

Palabras clave: Biorremediación, DyP, oxidación, Pleurotus

Key words: bioremediation, DyP, oxidation, Pleurotus

INTRODUCCIÓN

El problema de contaminación de ríos y lagos se ha incrementado de manera considerable

en los últimos años, compuestos xenobióticos y recalcitrantes tales como los colorantes son

los principales contaminantes. Las fuentes de las que provienen dichos contaminantes son

principalmente industrias de la rama textil, pues ellas emplean en sus procesos colorantes

fenólicos. Se conocen una gran variedad de técnicas físicas y químicas para el tratamiento

de agua, sin embargo, éstas resultan bastante costosas además de que posterior al


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tratamiento de los colorantes se generan moléculas más tóxicas, razones por las cuales no

son totalmente efectivas.

Las ventajas que ofrece la biorremediación enzimática son grandes (Arabaci y Usluoglu,

2014), y por ello es muy importante caracterizar genética y bioquímicamente nuevas

enzimas que puedan tener potencial para ser aplicadas en el desarrollo de métodos de

biorremediación efectivos.

Los objetivos del presente trabajo fueron, estudiar el efecto del colorante amarillo azo sobre

la cinética de crecimiento y la producción de la enzima DyP de Pleurotus ostreatus en

fermentación sumergida, evaluar la actividad enzimática a diferentes pH para obtener las

condiciones más adecuadas de catálisis de la enzima y determinar la cinética de oxidación

de cinco colorantes utilizando el extracto enzimático crudo obtenido de la fermentación.

METODOLOGIA

Condiciones de cultivo

La fermentación sumergida basal y la fermentación sumergida en presencia del colorante

amarillo azo se realizó por cuadriplicado en matraces Erlenmeyer de 125 mL que contenían

50 mL de medio de cultivo (Tabla 1), para la fermentación con colorante se adicionó 1 mL

de amarillo azo, la concentración final de éste fue de 500 ppm (p/v), el pH inicial se ajustó

a 6.5. Los matraces fueron incubados en un agitador orbital a 120 rpm a 25 °C durante 19

días con el fin de obtener muestras a las 175 h, 199 h, 223 h, 247 h, 384 h y 499 h de

iniciada la fermentación.

Tabla 1. Medio de cultivo para P. ostreatus (Téllez-Téllez y col. 2008).

Nutriente

Concentración (gL-1)

Glucosa (C6H12O6) 10

Extracto de levadura 5

Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4) 0.4

Sulfato de zinc (ZnSO47H2O) 0.001

Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 0.6

Sulfato de hierro (FeSO47H2O) 0.05

Sulfato de manganeso (MnSO4H2O) 0.05


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Sulfato de magnesio (MgSO47H2O) 0.5

Sulfato de cobre (CuSO45H2O) 0.25

Extractos crudos enzimáticos y biomasa

De cada punto seleccionado para el análisis se separó la biomasa del caldo de fermentación

con filtración al vacío empleando papel Whatman #1, el extracto se almacenó en tubos

eppendorf a -20 °C.

Las curvas de crecimiento microbiano fueron establecidas por la ecuación logística:

𝐝𝐗

𝐝𝐭= μ (

1−X

Xmax) X Ec. 1

donde, (h-1) es la velocidad especifica de crecimiento, y Xmáx (g/L) es la biomasa máxima

producida cuando dX/dt = 0 para X > 0. La solución a la ecuación 1, es la siguiente:

𝐗 = Xmax

(1+C∙e−μ∙t) Ec. 2

donde, C = (Xmax – X0/X0), cuando X = X0 es el valor inicial de la biomasa.

La estimación de los parámetros de la ecuación 2, se obtuvieron mediante la minimización

de la sumatoria de los errores residuales entre los valores experimentales y teóricos, usando

la herramienta “Solver” presente en la hoja electrónica de Excel (Microsoft Office, 2013)

(Díaz-Godínez y col.2001; Viniegra-González y col.2003).

Efecto del pH sobre la actividad de DyP

Se evaluó la actividad enzimática siguiendo la técnica modificada de Salvachúa (2013) que

consiste en la oxidación de 2.5 mM de ATBS (preparado en amortiguador de tartratos, 0.1

M) en presencia de 0.1 mM de H2O2. La mezcla de reacción consistió en 980 L de sustrato

y 20 L de E.C.E, la actividad fue medida a 7 valores distintos de pH (1.4, 2.5, 3.0, 3.5,

4.5, 5.0 y 5.5), la reacción ocurrió durante un minuto a 45 °C. Se determinó la absorbancia

a 436 nm (Linde y col.2014) en un espectrofotómetro GENEYSIS UV-Vis.


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Cinéticas de oxidación

Se realizaron con el extracto enzimático obtenido a las 499 h (mayor actividad enzimática),

para ésto se prepararon soluciones STOCK a 2000 ppm en amortiguador de tartratos (0.1

M, pH 3.0) de los colorante amarillo azo, azul remazol brillante R, azul ácido 129 y

reactivo negro 5. A partir de estas últimas se hicieron diluciones para tener concentraciones

finales de 150, 300, 450, 600, 750 y 900 ppm en un volumen de 1 mL.

Todas las mezclas de reacción consistieron en 30 L de ECE, 770 L de amortiguador de

tartratos (0.1 M y pH 3.0) y 200 L de colorante a cada concentración anteriormente

indicada y con el factor de dilución apropiado. Las reacciones se incubaron durante 30 min

a 45 °C monitoreando la reacción a 1, 5 10, 15, 20, 25 y 30 min con espectrofotometría de

UV Vis (190 a 900 nm). Como línea base se empleó 30 L de ECE y 970 L de

amortiguador de tartratos.

RESULTADOS

Cinética de crecimiento

En la Figura 1 se presenta la cinética de crecimiento de P. ostreatus en ambas condiciones

de fermentación, se observa una disminución en la biomasa producida en la fermentación

adicionada con colorante amarillo azo (Xmáx = 7.21 gL-1) respecto a la que ocurrió en medio

basal (Xmáx = 8.4 gL-1), de igual forma la presencia del colorante causa una disminución en

la velocidad especifica de crecimiento en la fermentación con colorante (= 0.034 h-1)

respecto a la que se obtuvo en la fermentación basal (= 0.055 h-1)


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Figura 1. Cinética de crecimiento de P. ostreatus en ambas condiciones de fermentación.

Efecto del pH sobre la actividad de DyP

En la Figura 2 se muestra el efecto del pH sobre cada extracto obtenido de la fermentación

basal, se observa que el pico máximo de actividad es 852 UI/L y se presentó a pH 3.0 a las

247 h de iniciada la fermentación.

Figura 2. Efecto del pH sobre la actividad de la enzima DyP producida en la fermentación basal.


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En la Figura 3 se muestra el efecto del pH sobre cada extracto recuperado de la

fermentación que ocurrió en presencia del colorante amarillo azo, se observa que el valor

máximo es 1576 UI/L y se presentó a pH 3.0 a las 499 h de iniciada la fermentación.

Figura 3. Efecto del pH sobre la actividad de la enzima DyP producida en la fermentación con

amarillo azo.

Cinéticas de oxidación

En la Figura 4 se presenta la gráfica de oxidación del colorante AYG. Se puede observar la

disminución del pico correspondiente al enlace N = N a 382 nm presente en la molécula del

colorante AYG, en todas las concentraciones del colorante, la señal del enlace N=N va

disminuyendo conforme aumenta el tiempo de reacción. Sugiriendo que la enzima DyP

presente en el extracto enzimático obtenido de la fermentación puede actuar sobre altas

concentraciones del colorante, favoreciendo su oxidación.


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Figura 4. Cinética de oxidación del colorante AYG a concentraciones de A) 150 ppm, B) 300 ppm,

C) 450 ppm, D) 600 ppm, E) 750 ppm y F) 900 ppm.

De igual forma en la Figura 5 se muestra la disminución de los picos generados por el

colorante ARBR en un intervalo de longitud de onda de 560 a 650 nm, mismos que se

asocian a los dos enlaces S=O de la molécula. Se aprecia que los espectros generados por

éste son menos intensos que los del colorante AYG, así mismo se visualiza que conforme al

tiempo ninguno de los dos picos es atenuado en su totalidad, lo cual sugiere que debido a su

estructura molecular más compleja resulta más difícil la oxidación de este compuesto a

través de la enzima presente en el extracto.


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Figura 5. Cinética de oxidación del colorante ARBR a concentraciones de A) 150 ppm, B) 300

ppm, C) 450 ppm, D) 600 ppm, E) 750 ppm y F) 900 ppm.

En la Figura 6 se presentan los espectros generados por el colorante AA129 a diferentes

concentraciones, se aprecian dos picos en un intervalo de longitud de onda de entre 560 y

700 nm, mismos que conforme transcurre el tiempo de la reacción van disminuyendo su

intensidad. Se observa que en las concentraciones más bajas de colorante después del

tratamiento enzimático, la intensidad de los espectros es cercana a 0, cosa que no ocurre en

las concentraciones restantes, lo que indica que la mayor complejidad estructural del

colorante hace más laboriosa la tarea de oxidación del mismo.


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Figura 6. Cinética de oxidación del colorante AA129 a concentraciones de A) 150 ppm, B) 300

ppm, C) 450 ppm, D) 600 ppm, E) 750 ppm y F) 900 ppm.

Finalmente en la Figura 77 se presentan los espectros que generó el colorante NR5 a cada

concentración evaluada, se detecta un pico entre 560 y 600 nm que es causado por el enlace

N = N, se observa que en la concentración de 150 ppm la oxidación es efectiva obteniendo

una disminución considerable del pico. La oxidación es menos efectiva conforme se va

aumentando la concentración del colorante. Lo cual al igual que en el colorante anterior

sugiere que debido a la aún mayor complejidad de la molécula de este compuesto se torna

más compleja la oxidación a través del extracto enzimático.


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Figura 7. Cinética de oxidación del colorante NR5 a concentraciones de A) 150 ppm, B) 300 ppm,

C) 450 ppm, D) 600 ppm, E) 750 ppm y F) 900 ppm

DISCUSION Y CONCLUSIONES

En esta investigación se evaluó el efecto del colorante amarillo azo sobre el crecimiento de

P. ostreatus, la producción de enzima DyP y la cinética de oxidación de oxidación de cinco

colorantes textiles utilizando el extracto crudo generado de dicha fermentación.

Para el crecimiento de P. ostreatus en medio basal se obtuvo una Xmáx de 8.408 gL-1 y una

de 0.055 h-1, mientras en que en presencia del colorante AYG se obtuvo una disminución

en la Xmáx y en la que fueron de 7.219 gL-1 y 0.034 h-1 respectivamente. Estas ligeras

disminuciones nos indican que el hongo en presencia de colorante pudo haber sufrido algún

estrés abiótico que hizo que éste destinara más energía para la producción de enzimas que

para la producción de biomasa. El aumento en la producción de enzimas sería con el

objetivo de que éstas le ayudaran a metabolizar o degradar los compuestos que le generan

estrés. Los datos obtenidos en esta investigación se comparan con lo reportado por Díaz-

Godínez (2013) quien creció P. ostreatus en medio basal a pH 6.5 y tomando muestras

diarias por 22 días obteniendo una Xmáx de 9.64 gL-1 y una de 0.018 h-1.


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Se ha reportado que la enzima DyP tiene una gran capacidad para actuar en condiciones

extremas de pH y temperatura (Liers y col. 2010) y la enzima DyP de P. ostreatus no es la

excepción, pues se encontró que su mayor actividad es a pH de 3.0 y 45 °C. Liers (2010)

reporta que las mejores condiciones de pH para la catálisis de la DyP del basidiomiceto A.

auricula-judae es a 1.4 siendo esta DyP la que reporta las condiciones más extremas de pH,

hay que mencionar que también se evaluó la DyP de P. ostreatus a ese pH obteniendo una

actividad mínima pero que indica que ésta tolera dicho pH.

En comparación a la fermentación basal (852 UI/L), se observó una mayor actividad de

enzima DyP en la fermentación con AYG (1576 UI/L), lo cual hace evidente que la

presencia del colorante induce la expresión de los genes de DyP. Y también respalda lo

sugerido sobre que la disminución en la biomasa se debe a que el hongo destino más

energía para la producción de enzima.

Respecto a la oxidación de los colorantes evaluados se obtuvo resultados favorables pues se

registraron oxidaciones casi completas de los colorantes amarillo azo y azul remazol

brillante R que a comparación del colorante azul ácido 129 y negro reactivo 5 tienen

estructuras más sencillas, estos dos últimos fueron oxidados de manera parcial por el

complejo enzimático. Estos ensayos de eficiencia oxidativa se comparan con lo reportado

por Juárez-Hernández (2008) quien evaluó el potencial oxidativo de una lacasa comercial a

través de espectroscopia de FTIR sobre 100 mM de ARBR, obteniendo una oxidación del

34.8% después de 238 h de incubación. De igual forma Novotný (2001) evaluó los índices

de decoloración de complejos enzimáticos producidos por P. ostreatus sobre 4 mM de

ARBR, Azul de bromofenol, Rojo metil y Rojo congo obteniendo oxidaciones del 93%,

100%, 56% y 58% para cada uno.

Esto nos indicaría que el complejo enzimático tiene un alto potencial oxidativo sobre

colorantes de estructura sencilla ya sean azo (AYG) o antroquinonas (ARBR) y un

potencial medio para colorantes más complejos.

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