(19)대한민국특허청(KR)

(12) 등록특허공보(B1)

(51) 。Int. Cl.

C12N 1/00 (2006.01)

C12N 1/16 (2006.01)

(45) 공고일자

(11) 등록번호

(24) 등록일자

2006년10월16일

10-0634867

2006년10월10일

(21) 출원번호 10-2004-0102683 (65) 공개번호 10-2006-0063493

(22) 출원일자 2004년12월07일 (43) 공개일자 2006년06월12일

(73) 특허권자 충남대학교산학협력단

대전광역시 유성구 궁동 220번지 충남대학교

(72) 발명자 안길환

대전 유성구 지족동 열매마을5단지 510-1202

(74) 대리인 권오식

박창희

(56) 선행기술조사문헌

JP06319531 A

JP08000257 A *

WO8808025 A1

JP08000182 A

KR1020040098886 A

* 심사관에 의하여 인용된 문헌

심사관 : 양인수

(54) 미생물 분쇄방법 및 이로부터 색소의 추출방법

요약

본 발명은 색소를 함유한 미생물의 분쇄방법과 색소 추출방법에 관한 것으로, 색소를 함유한 미생물을 배양하는 단계와;

상기 배양된 미생물을 건조기에 넣고 건조하는 단계; 및 상기 건조된 미생물을 밀(mill)에 분쇄하는 단계를 포함하여 이루

어지는 미생물 분쇄방법과 상기 방법에 의해 분쇄된 미생물을 용매로 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 건조하는 단계를

포함하여 이루어지는 색소의 추출방법을 제공하여 식품 및 식품 첨가제 또는 사료 또는 사료 첨가제의 기능성 소재로 사용

한다.

본 발명은 천연색소를 함유한 미생물의 세포벽을 간단하고 효과적으로 파괴하여, 천연색소를 효율적으로 추출할 수 있게

되었으며, 상기 방법을 이용하여 사료 및 사료 첨가제로 또는 식품 및 식품 첨가제의 저장성 및 인체에 유익한 기능성 소재

로 사용할 수 있으며 저렴하고 용이하게 적용할 수 있어 동종업계 진출 시 파급효과가 클 것으로 예상된다.

대표도

도 4

색인어

등록특허 10-0634867

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색소, 미생물, 분쇄, 추출, 세포벽

명세서

도면의 간단한 설명

도 1은 본 발명에 따라 효모를 건조하여 에탄올과 디메틸 술폭시드 용매로 추출한 아스타잔틴의 함량을 실험실 규모(A)와

플랜트 규모(B)의 처리 횟수별로 나타낸 그래프,

도2 는 본 발명에 따라 건조 규모별로 건조한 파피아 로도지마의 건조입자를 나타낸 SEM 사진,

도 3은 대조군(a), 분무 건조기군(b), 드럼 건조기군(c), 분무 건조 후 분쇄(d)의 건조 방식에 따라 효모의 세포벽 파괴 효

과를 나타낸 SEM 사진,

도 4는 본 발명의 건조된 효모를 사료에 첨가하여 닭에 급여하고 도살 후, 닭다리 부분에서 아스타잔틴의 축적정도를 나타

낸 사진.

발명의 상세한 설명

발명의 목적

발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술

본 발명은 색소를 함유한 미생물의 분쇄방법과 색소 추출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 간편하게 분무건조기나 드

럼 건조기를 사용하여 건조한 다음, 밀(mill)로 분쇄하여 미생물의 세포벽을 효율적으로 파괴함으로써, 기능성 색소의 추출

효과를 증가시키는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 해조류(algae)나 미생물(microorganism), 갑각류 등에 있는 카르테노이드 색소(cartenoid)는 통상적으로 항

산화 효과를 가지고 있는 색소로 알려져 있다.

이 중, 아스타산틴(Astaxanthin)은 새우나 가재의 갑각류, 해마토코커스(Haematococcus sp.)에 속하는 해조류, 파피아

(Phaffia sp.)에 속하는 미생물, 조류의 부리, 난황 등에 주홍색을 띄는 색소로 색상의 증진, 풍미효과, 면역기능, 비타민 A

의 전구체, 항산화 효과, 노화 및 항암효과 등이 있는 것으로 알려져 있다.

그러나, 갑각류나 해조류, 미생물 등에서의 아스타산틴 색소 추출은 색소함량이 적고 추출과정이 복잡하기 때문에 상업화

되지 못하고 있는 실정이다.

이는 아스타산틴의 색소가 세포 내에 주로 침착되어, 아스타산틴을 효과적으로 추출하기 위해서는 세포벽을 효율적으로

파괴해야 하기 때문이다.

일례로 아스타산틴을 함유한 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma, 이명 잔고토필로마이세스 덴드러스;

Xanthophyllomyces dendrorhous)를 사료에 첨가하여 제조하고 이를 동물에 급여시,astaxanthin을 효율적으로 생체 내

에서 활용하지 못해 여러 동물의 껍질, 알에 신선하게 저장되지 못해 사료 첨가제로서의 역할을 충분히 하지 못하고 있다

(Johnson, E. A.등, 1977).

이의 문제를 해결하기 위해, 종래에는 세포벽을 파괴하는 여러가지 방법들이 개발되어 왔는데, 화학적 처리방법으로서는

산 가수분해를 통해 효모의 세포벽을 부순 후 중화하여 아스타산틴을 추출하는 방법이 알려져 있으며[Bacteriol. Rev.,

39. 197-231(1975); 미국특허 제5,210,186호; 유럽특허 EP 0 553 814호], 물리적인 방법으로는 프레치 프레서(French

pressure), 호모저나이저(Braun homogeniger), 균질기(Microfluidiger)와 같은 기계를 이용하여 세포벽을 깨뜨린 후 용

매로 추출하는 방법이 있고[Enzyme Microb. Technol., 8. 194-203(1986); J. Appl. Bacteriology 70. 181-191(1991)

], 생물학적 처리방법으로는 세포벽을 분해하는 효소인 셀룰라아제, 헤미세룰라아제, 펙틴나아제 등을 사용하여 처리하는

방법이 공지되어 있다[Appl. and Environ. Microbiol. 35(6). 1155-1159(1978)].

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- 2 -

하지만, 상기 방법들 중 화학적 처리방법은 세포벽 파괴와 함께 추출하고자 하는 색소도 파괴함으로 효율이 낮고, 기계적

인 방법으로는 색소 추출율에 비하여 장치비, 노동력 등의 처리비용이 많이 소요되고, 생물학적인 방법으로는 장치 비용은

물론 시약 및 운영비 등의 처리 비용이 높아지는 등 대량화를 위한 상업화에 적용하기 어려운 문제점이 있어 왔다.

그러나, 최근 우리나라에서는 효모균주인 파피아 로도지마로부터 아스타잔틴의 에탄올 추출물이 식품첨가물 중 천연색소

로 허가를 받게됨에 따라, 사료에 첨가하거나 식품첨가물에 적용시에 균체 자체의 아스타산틴의 함량을 높이는 것 못지않

게, 이의 추출방법에 관련되는 세포벽을 효과적으로 파쇄하는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

발명이 이루고자 하는 기술적 과제

이에, 본 발명자는 색소함유 미생물로부터 간편하면서 처리비용은 저렴한 세포벽 파괴방법 및 이로부터 색소의 추출방법

을 개발하고자 하였으며, 건조방식과 롤링 드럼 밀(roller drum mill)을 사용하여 본 발명은 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 색소를 함유한 미생물을 배양하고, 상기 배양된 미생물을 건조기에 넣고 건조하여 세포벽을 파

괴한 후, 상기 건조된 미생물을 밀(mill)에 분쇄하는 단계를 포함하여 이루어지는 미생물 분쇄방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 분쇄방법으로부터 분쇄된 미생물과 이를 용매로 추출한 추출물을 함유한 사료 및 사료 첨가제 또는

식품 및 식품 첨가제의 제공을 목적으로 한다.

발명의 구성 및 작용

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 색소를 함유한 미생물을 배양하는 단계와; 상기 배양된 미생물을 건조기

에 넣고 건조하는 단계; 및 상기 건조된 미생물을 밀(mill)에 분쇄하는 단계를 포함하여 이루어지는 미생물 분쇄방법을 제

공한다.

또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 의해 분쇄된 미생물을 용매로 추출하는 단계; 및 상

기 추출물을 건조하는 단계를 포함하여 이루어지는 미생물 색소의 추출방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 분쇄방법에 의해 분쇄된 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 미생물을 함유한 사료 및 사료 첨가제를 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 추출방법에 의해 추출된 색소 추출물을 제공한다.

더 나아가, 본 발명은 상기 색소 추출물을 함유한 식품 및 식품 첨가제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가

진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명은 아스타산틴을 포함하는 카로테노이드 색소를 추출하기 위해, 상기 색소를 생산하는 미생물을 대량 배양하고, 상

기 배양된 미생물을 건조기에 넣고 건조하여 세포벽을 파괴하며, 상기 세포벽이 파괴된 건조 미생물을 롤러 드럼 밀(roller

drum mill)에 분쇄하여, 용매를 사용하여 색소를 효율적으로 추출할 수 있는 미생물 가루를 제조한다.

이때, 본 발명에서 상기 미생물은 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma) 및 이의 돌연변이주로 이루어진 군에서 선택된 적

어도 1종 이상의 파피아(Phaffia sp.)속 균주를 사용하는 것이 바람직한 데, 이는 배양시 성장이 빠르며, 오염이 잘 되지 않

는 균주이기 때문이다.

그리고, 본 발명에서 세포벽을 파괴하기 위해 사용되는 건조기는 분무건조기(spray dryer) 또는 드럼 건조기(drum

dryer)를 사용하는 것이 바람직하다.

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그리고, 상기 분무 건조기와 드럼 건조기는 본 발명의 분야에서 통상적으로 사용되고 있는 분무건조기와 드럼건조기라면

어느 것을 사용해도 무방하다.

또한, 본 발명에서 사용되는 롤러 드럼 밀은 볼밀, 로드밀 및 롤러밀로 이루어진 군에서 선택된 1종의 밀을 사용하는 것이

바람직하다.

이때, 상기 밀은 종류에 따라 다음과 같은 특징을 가지나, 본 발명에서는 상기 특징으로 이용하여 세포벽을 효과적으로 파

괴할 수 있기 때문에, 본 발명에서 사용해도 무방하다.

(1) 볼밀(ball mill)

가장 대표적인 것으로, 광석류.시멘트원료.시멘트클링커 등의 대량 미분쇄를 비롯하여 요업원료나 화학공업원요 등의 미

분쇄∼극미분쇄에 널리 이용된다. 볼밀은 수평축의 주위를 회전하는 원통형 용기에 그 용적의 약 1/3을 채운 양의 철구을

넣은 것이다. 용기(shell)를 회전시키면 그에 따라서 볼이 어느 정도 올라갔다가 낙하한다. 이와 같은 볼의 운동에 의해서

셸에 공급되는 원료입자가 분쇄작용을 받아 차례로 미세하게 된다.

(2) 로드밀(rod mill)

볼 대신에 원통형 셸의 길이보다도 작고 짧은 특수강 또는 탄소강의 봉(rod)을 분쇄매체로 사용하는 분쇄기이다. 로드의

지름은 75㎜전후가 일반적이다. 로드밀은 볼밀에 비하여 거친 분쇄작업에 적당하다.

(3) 롤러밀(roller mill)

몇 개의 롤러가 중력·원심력·탄성력등에 의해서 회전하는 테이블 또는 사발모양의 분쇄용기에 눌러서 붙이는 구조이며, 그

사이에 넣어서 원료입자를 압축분쇄한다. 분쇄된 미세한 입자는 기류에 의해서 배출되는 데, 주로 시멘트공장에서 원료를

분쇄할 때나 발전소에서 석탄을 분쇄할 때 이용된다.

그리고, 본 발명에서는 상기 세포벽을 파괴한 건조된 미생물에 용매를 첨가하여 색소를 추출하고, 상기 추출된 색소를 건

조하여 색소 추출물을 제조한다.

이때, 색소 추출물에 사용할 수 있는 용매는 에탄올, 메탄올, 아세톤, 디메틸 술폭시드 및 이들의 혼합용매에서 선택된 적

어도 1종 이상의 유기용매를 사용하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 식품의약안정청의 기준으로 식품 및 식품 첨

가물에 사용할 수 있도록 에탄올을 사용한다.

또한, 본 발명에 따른 색소 추출물이나 건조된 미생물을 식품 및 식품 첨가제 또는 사료 및 사료 첨가제로 사용한다.

이때, 본 발명의 색소 추출물은 필요에 따라 첨가량을 한정하지 않고 조절하여 식품 및 식품 첨가제에서 식용유류 제품, 드

레싱류 제품, 마요네즈류 제품, 크림류 제품, 쵸코렛과 감자칩과 같은 제과류 제품, 음료 제품, 캡슐 제품, 타블렛 제품, 분

말 제품, 빵과 쿠키와 같은 제빵 제품 등에 사용한다.

또한, 본 발명의 색소 추출물은 고체, 분말, 입자, 캡슐, 알약, 정제 형태 또는 분산, 유화 등의 액체 형태 등의 건강보조식품

에 첨가하여 사용한다.

또한, 저장성 식품(소시지 또는 통조림 제품)에 사용하여 저장안정성, 기호성, 유화 안정성 향상을 위해 사용하는 데, 동식

물 가공 식품의 안정성, 기호성 및 유화 안정성 향상을 시키는 목적으로 특별한 사용 농도를 두지 않고 범용적으로 사용한

다.

뿐만아니라, 본 발명의 색소 추출물과 건조된 미생물은 유기 영양소, 무기 영양소 등의 재료와 혼합하여 색소 자체가 가진

기대되는 효과와 육류나 육가공품의 저장 안정성을 목적으로 하여 양계용·양돈용·낙농용·비육우용 동물 사료 및 사료 첨가

제의 소재로, 특별한 사용 농도를 두지 않고 범용적으로 사용한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예와 실험예를 제시하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 오로지 본

발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

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[실험예]

1. 카르테노이드(cartenoid) 총 함량 측정

배양한 미생물 1㎖를 취하여 원심분리하고, 상층액은 분리하고 펠렛(pellet)에 물을 첨가하여 1회 수세(wash)한 후 수분

을 최대한 제거한 다음, 1㎖의 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO, 55℃) 또는 에탄올을 가하고 균질기로 균일

하게 혼합(vortexing)한 후, 아세톤(acetone), 석유 에테르(petroleum ether), 20%(w/v) NaCl 용액을 차례로 1㎖ 씩 첨

가하고 혼합하여 석유 에테르층에 카르테노이드(Carotenoid)가 축적되도록 하였다.

그런 다음, 석유 에테르(Petroleum ether)층을 분리하고, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 474 nm에서 흡광

도(absorbance)를 측정하여 카로테노이드의 총함량을 정량분석하였다.

2. 카르테노이드 성분 분석

카로테노이드 색소를 포함하고 있는 시료를 박막층 크로마토그래피(thin layer chromatography)를 수행하여 분리한 다

음, 분리된 각 카르테노이드에 대한 고유의 파장에서 흡광도를 측정하여 정량분석하였다.

이때, 박막층 크로마토그래피는 실리카겔 TLC 판(Silica gel 60, 5×20cm, 0.25㎜ thickness; E. Merck, Darmstadt,

Germany)에서 색소층 분리를 하였고, 색소층들의 띠는 긁어내고 1㎖의 아세톤에 희석시켜 시료로 사용하였다.

그리고, TLC를 사용할 때의 이동상 용매는 아세톤: 석유 에테르를 20:80(v/v)으로 혼합하여 사용하였으며, 각각의 카로테

노이드 함량(%)은 「각 카로테노이드 양 × 총 카로테노이드 양(mg/g yeast)로 계산하였으며, 카로테노이드 %는 모든 카

로테노이드들의 흡광도의 합과 아스타잔틴(Astaxanthin)의 카로테노이드 흡광도의 비에 기초하여 계산하였다.

3. 아스타잔틴(Astaxanthin) 함량 측정

건조한 미생물(cell)에 에틸알콜을 첨가한 다음, 상기 실험방법 1과 동일한 방법으로 아스타잔틴을 추출하고, 에탄올에 추

출된 아스타잔틴 시료는 분광광도계를 이용하여 476nm 에서 흡광도를 측정하여 정량분석하였다.

4. 건조된 아스타잔틴의 잔존에탄올 함량 측정

에탄올에 추출하여 건조한 아스타잔틴에 남아있는 잔존에탄올 함량은 먼저, 0.1M의 인산칼륨 완충용액(potassium

phosphate buffer; pH 9.0)를 제조하고, NAD 용액(nicotinamide adenine dinucleotide, sigma-aldrich사, 미국)과 알코

올 탈수소효소(Alcohol dehydrogenase; ADH, sigma-aldrich사, 미국)용액을 준비한 다음, NAD 용액 100㎕와 ADH 20

㎕와 인산칼륨 완충용액을 혼합하여 총부피가 10㎖이 되게 하였다. 이용액을 cuvette에 1ml 첨가하고 카이네틱(kinetic)

을 이용하여 ΔAbs(흡광도 변수)를 측정하고, 표준곡선(Standard curve)을 이용하여 정량분석을 하였다.

5. 균주의 세포량(Cell mass) 측정

효모 균주의 세포량은 80℃의 진공 오븐에 효모가 포함된 10㎖의 용액을 건조하여 중량을 측정였다.

6. 색소의 착색도 측정

실험이 완료된 닭은 반복별로 3수씩 총 45수를 방혈(防血), 탈모(脫毛)하고 제1경추골 상단과두개골 하단간을 절단하여

머리를 제거하였으며, 경골 하단과 중족골 관절부위를 절단하여 다리를 제거한 후 식도, 기관, 폐, 간 및 내장을 적출한 후

(이상의 방법은 축산기술연구소 가금과 관행; 이하 가금과 관행이라 함), 냉동체 상태에서 2시간 운반 후 피부가 계육에 부

착된 상태에서 피부의 착색도와 계육의 착색도는 피부의 착색도를 측정한 후 피부를 제거한 상태에서 계육의 착색도를 측

정하였다.

이때, 착색도는 색도기(chroma meter; Minolta Co. Cr 301)로 명도(L; lightness), 적색도(a; redness), 황색도(b;

yellowness)를 국제조명위원회의 CIE (Commision Internationale de Leclairage)값으로 측정하였고, 표준판은

Y=92.40, x=0.3136, y=0.3196의 백색 타일을 사용하였다.

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7. 혈액의 카로테노이드 색소 농도

실험이 완료된 닭의 익하 정맥에서 4㎖씩 채혈한 혈액을 EDTA(disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid)가 첨

가된 채혈병에 넣고, 냉동실에 보관한 후 HPLC(high pressure liquid chromatography)를 사용하여 카로테노이드

(carotenoids)의 함량을 분석하였다.

이때, 칼럼(Column)은 메타켐(MetaChem; Nucleosil 100Å, 5micron), 검출기(Detector)는 M730D(UV/VIS Detector,

영린기기)를 사용하였으며, 이동상(Mobile Phase)은 tBME:Hexane:IPA:MeOH=30:65:2.5:2.5의 조건으로 하였고, 흐름

속도(flow Rate)는 1.5㎖/min, 파장(Wavelength)은 476㎚였으며, 시료 주입량(injection)은 20㎕로 하였다.

8. 시료 피부에서 산화방지력을 측정하기 위한 TBA가 측정

시료 약 2.5g을 채취한 후 여기에 4℃의 TCA (Trichloroacetic acid) 6㎖을 첨가하고, 균일하게 혼합(Vortex mixing)한

후, 증류수(D.W)로 용액의 총 부피가 12.5㎖가 되도록 적정하였다.

그리고, 상기 용액을 거름종이(Filter paper; Whatman No.1)로 여과한 후, 수집된 여과액 3㎖에 TBA (Thiobarbituric

acid) 3㎖를 첨가하고, 뚜껑으로 밀폐하고 균일하게 혼합한 후 암소에서 상온으로 15시간 정치하였다.

그리고, 상기 시료를 530nm에서 흡광도를 측정하여 TBA가를 산출하였다.

[실시예 1] 균주 및 배양 실험

본 실시예에서는 아스타산틴 색소를 생산하기 위해 야생형(wildtype)인 파피아 로도지마(이명:잔토필로마이세스 덴드로

스, Xanthophyllomyces dendrorhous) 67-385를 돌연변이(mutant)화하여 아티마이신(antimycin) 유도에 의해 카르테

노이드(cartenoid)를 초과 생산할 수 있는 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma strain) 2A2N의 효모 균주를 사용하였다.

그리고, 상기 효모 균주를 30㎖ YM 배지가 포함된 300㎖ 플라스크(baffled flask)에서 종배양(seed culture)하고, 상기

종 배양물을 2ℓ 발효기(fermentor)에서 배양한 다음, 이를 대량 배양기에 공급하고 20℃에서 3∼5일동안 배양하였다.

이때, 임펠러(Impeller)속도는 용해 산소가 꾸준히 공급되어 공기순환이 될 수 있도록 200∼600 rpm으로 조절하였다.

[실시예 2] 배양된 미생물의 건조 및 분쇄

본 실시예는 본 발명의 분쇄방법의 효과를 알아보고자, 배양한 미생물을 건조하고 분쇄한 다음, 본 발명에 따른 분쇄방법

에 의한 미생물의 세포벽 분쇄 효과를 카르테노이드의 총 함량, 카르테노이드의 성분분석, 전자현미경 관찰 및 아스타산틴

함량을 측정하여 분석하고자 하였다.

먼저, 상기 실시예 1에서 배양된 파피아 로도지마(잔토필로마이세스 덴드로스; 이하, 효모로 칭함)를 분무건조기와 드럼

건조기를 사용하여 건조하였다.

이때, 상기 분무건조기의 건조조건은 실험실 규모(pilot scale)일 경우 이옐라사(Eyela Co. Japan)의 분무 건조기를 분사

하여 인입구(inlet) 온도는 180℃, 출구(outlet) 온도는 80℃로 1리터를 건조하였고, 플랜트 규모(plant scale)일 경우에는

삼영화학의 분무건조기를 인입구 온도 190℃, 출구 온도는 90℃로 하여 시간당 200리터를 분사하여 총 30톤을 건조하였

다.

그리고, 드럼 건조인 경우에는 단해사의 드럼 건조기를 사용하여 150℃에서 분당 210rpm의 회전속도로 하여, 이를 처리

횟수로 기준하면서 건조하였다.

그 후, 밀(로울러밀, 광농기계공사)로 건조된 효모를 분쇄하여 분말의 평균입경이 3㎜ 이하가 되게 준비하였다.

이때, 밀은 flat roller(평판 롤러)로서 210rpm, 5HP의 조건하에서 1회에서 10회까지 단계별로 반복하여 파쇄하였다.

[실시예 3] 건조 변수에 따른 미생물의 분쇄 효과

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(1) 분무 건조기 사용에 따른 색소 추출 효과

본 실시예는 분무 건조기를 사용하면서 건조 규모와 횟수에 따른 카르테노이드 색소의 추출효과를 알아보고자, 상기 실시

예 2의 동일한 방법으로 수행하였다.

그리고, 건조된 효모를 평면 롤러 밀(flat roller mill)을 사용하여 분쇄하고, 상기 분쇄된 미생물에 추출용매인 에탄올

(EtOH)과 디메틸 술폭시드(DMSO)을 사용하였다.

이의 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 실험실 규모에서 추출된 색소의 함량은 처리횟수가 1∼3회까지 증가한 후 그 이후에

큰 변화가 없는 반면 플랜트 규모는 10회까지 꾸준히 증가함을 알 수 있었다.

(2) 드럼 건조기 사용에 따른 색소 추출 효과

본 실시예에서는 건조기에 따른 색소 추출 효과를 알아보고자, 분무 건조기와 드럼 건조기를 이용한 카로티노이드의 총함

량과 아스타잔틴의 추출효과를 비교/분석하였다.

이때, 배양과 분쇄 및 추출은 상기 실시예 1, 2와 동일하게 수행하였으며, 추출용매는 에탄올을 사용하였다.

이의 결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 드럼 건조기로 분쇄한 효모는 분무건조기를 사용한 것보다 초기 색소추출이 높

으나 총 색소함량이 낮음을 알 수 있었다.

[표 1]

구분 카로테노이드 함량[㎎/g(효모)] 아스타산틴[㎎/g(효모)]

분무 건조 처리전 0.02 0.01

처리후 2.01 1.31

드럼 건조 처리전 0.31 0.18

처리후 1.26 0.73

이와같은 차이는 건조 시, 열판에 의한 세포벽의 손상이 드럼 건조기가 더 크기 때문인 것으로 판단된다.

(3) 건조 입자 크기

상기 실시예 3-1과 3-2에서 분쇄된 효모의 건조입자의 크기를 알아보고자, SEM(Scanning electron microscope)을 사

용하여 육안으로 형상 및 크기를 측정하였다.

이의 결과, 도 2에 도시된 바와 같이 건조입자 크기가 실험실 규모는 8.5∼ 10㎛, 플랜트 규모는 25∼30㎛로 나타남으로

써, 건조규모에 따라 크기가 2∼3배 차이가 있음을 확인할 수 있었다.

(4) 건조 방식에 따른 세포벽의 파괴효과

건조 방식에 따라 효모의 세포벽 파괴 효과를 SEM을 통해 육안으로 확인하고자 하였다.

도 3에 도시된 바와 같이 (a)는 대조군(스케일바 5㎛), (b)는 분무 건조기군(스케일바 10㎛), (c)는 드럼 건조기군(스케일

바 20㎛), (d)는 분무 건조 후 분쇄(스케일바 5㎛)를 나타내었으며, 이의 결과 분무 건조 후 밀(mill)에 의한 분쇄는 세포벽

을 파괴하는 데 효과가 우수함을 알 수 있었다.

[실시예 4] 세포벽 파쇄 효모의 동물에의 실체 이용 실험

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본 실시예는 본 발명의 방법에 따라 세포벽을 분열시킨 효모를 실험동물에 급여하여 미생물이 가지고 있는 아스타잔틴의

생체 활용 효과를 확인하고자 기간및 첨가별 수준에 따른 산란계의 착색도를 측정하여 생체 내 흡수되는 정도를 비교/분석

하였다.

실험방법은 다음과 같이 수행하였다.

180마리 이사브라운 암탉(ISA 갈색암탉)을 실험대상으로 선정하고, 6주간 사육을 하였으며, 사육조건은 공시축에 닙플이

장착된 2수용 3단 철제케이지에 2수씩 수용하였고, 사료와 음수는 자유 채식하도록 하였으며, 점등은 새벽 4시부터 오후

9시까지 17시간 고정 점등하였다.

그리고, 사료는 60개의 닭장(닭장당 1마리)에 임의적으로 동일한 양을 실험대상 닭에게 급여되도록 하였으며, 하기 표 2에

보는 바와 같이, 78주령 이사브라운 갈색산란계 225수를 공시하여 대조군(control) 닭의 사료는 아스타잔틴이 전혀 포함

되지 않게 조제하고(무첨가군 C), 실험군은 아스타잔틴을 0.05%, 0.1%, 0.2% 및 0.3%를 추가하여 제조하고, 이를 급여한

5개의 군으로 나누어 수행하였다.

[표 2]

구분 추가량(%)

무첨가군 0.05 0.1 0.2 0.3

반복수 3 3 3 3 3

반복당 마리수 15 15 15 15 15

총마리수 45 45 45 45 45

그리고 사료는 하기 표 3에 보는 바와 같이, 황색옥수수와 대두박 위주의 배합사료를 사용하였는데, 조단백질과 에너지 함

량이 각각 16%와 2,800㎉/㎏이었다.

[표 3]

성분 함량 비율(%)

옥수수 68.33

대두분 17.82

옥수수 글루텐 가루 3.60

대두유 -

석회석(limeston) 8.40

0.93

DL-메티오닌50 0.09

L-리신80 0.08

비타민-미네랄 복합체 0.50

식염 0.25

총 합 100

화학적 조성

물질대사에너지(ME), ㎉/㎏ 2,800

조단백질(CP) 16.00

칼슘(Ca) % 3.40

유용한 인산(P) % 0.275

메티오닌 % 0.76

리신 % 0.33

비타민-미네랄 복합체 사용량(사료 1㎏기준)

비타민A 1,600,000 IU, 비타민 D3 300,000IU, 비타민 E 800IU, 비타민K3 132㎎,

비타민B2 1,000㎎, 비타민B12 1,200㎎, 니아신 2,000㎎, 판토네이트 칼슘 800㎎,

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엽산 60㎎, 염화콜린 35,000㎎, DL-메티오닌 6,000㎎, 철 4,000㎎, 구리 500㎎,

마그네슘 12,000㎎, 아연 9,000㎎, 코발트 100㎎, BHT 6,000㎎, 요오드 250㎎

[실시예 5] 본 발명에 따른 사료 첨가제 효과

본 실시예는 본 발명에 따라 건조된 효모를 첨가한 사료를 닭에게 급여한 다음, 닭의 혈액과 피부에 함유된 아스타잔틴의

양을 측정하여 아스타잔틴 활용 효과를 알아보고자 하였다.

이때, 상기 건조된 효모는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 드럼 건조기를 사용하여 건조한 것을 사료 1㎏ 당 100g을 첨

가하여 닭에게 6주동안 일정량을 동일하게 급여하였으며, 대조군은 분쇄하지 않는 효모를 그대로 첨가한 사료를 사용하였

다.

그런다음, 사료공급 후에 닭의 혈액과 피부 및 계란에 함유되거나 침착된 아스타잔틴양을 측정하였다.

이때, 통계분석은 본 시험에서 얻어진 피부착색도와 계육착색도은 SPSS 11.0 프로그램(program)을 사용하여 분산분석을

실시하였으며, 처리간의 유의차 검정은 세프테 방법(Sefte's method)를 이용하였으며 신뢰수준은 모두 95% 수준에서 분

석을 실시하였다.

이의 결과, 닭의 혈액은 세포벽이 손상시키지 않은 효모(이하 대조군)를 사료에 첨가하여 급여한 경우 아스타잔틴 양이 2

주령은 530ng/㎖, 4주령은 830ng/㎖, 6주령은 1310ng/㎖ 이었으며, 드럼 건조기로 건조한 효모(이하 실험군)에서는 2주

령은 744ng/㎖, 4주령은 1030ng/㎖, 6주령은 2264ng/㎖ 으로 측정되었다.

그리고, 닭 피부의 착색도는 대조군과 실험군이 각각 2주령 554과 1073ng/g, 4주령 684과 1696ng/g, 6주령 784과

1863ng/g으로 나타났으며, 도 4에서 보는 바와 같이 육안으로도 색소의 착색도가 뚜렷이 구분됨을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명에 따른 미생물의 분쇄방법은 미생물에 축적된 색소의 추출 효과와 이를 섭취하여 이용할 수 있는 생체 활

용도를 증가시켜 아스타잔틴을 피부 뿐만 아니라 체내의 지질부분에도 축적시키는 것을 확인할 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 분쇄된 효모는 세포벽의 파괴정도가 우수하고, 이에 따른 색소추출 효율이 증가

되기 때문에, 생체 활용도가 높아서 사료 및 사료 첨가제 또는 식품 및 식품 첨가물로 사용할 시, 유효성분을 효율적으로

이용할 수 있어 기능성 소재로 활용될 수 있을 것으로 판단된다. 급여한 동물들의 astaxanthin축적은 명백하였다.

astaxanthin은 피부뿐만 아니라 체내의 지질 부분에도 축적되었다.

발명의 효과

이상과 같이, 본 발명은 천연색소를 함유한 미생물의 세포벽을 간단하고 효과적으로 파괴하여, 천연색소를 효율적으로 추

출할 수 있게 되었으며, 상기 방법을 이용하여 사료 및 사료 첨가제로 또는 식품 및 식품 첨가제의 저장성 및 인체에 유익

한 기능성 소재로 사용할 수 있으며 저렴하고 용이하게 적용할 수 있어 동종업계 진출 시 파급효과가 클 것으로 예상된다.

(57) 청구의 범위

청구항 1.삭제

청구항 2.삭제

청구항 3.삭제

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청구항 4.삭제

청구항 5.

(1) 아스타잔틴을 함유하는 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma) 및 이의 돌연변이주로 이루어진 군에서 선택되는 1종

이상의 파피아속 균주를 배양하는 단계;

(2) 상기 배양된 균주를 드럼건조기에서 건조하는 단계;

(3) 상기 건조된 균주를 롤러 밀에서 분쇄하는 단계;

(4) 상기 분쇄된 균주를 에탄올로 추출하는 단계; 및

(5) 상기 추출물을 건조하는 단계:

를 포함하는, 아스타잔틴의 추출방법.

청구항 6.삭제

청구항 7.삭제

청구항 8.삭제

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도면

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도면1

도면2

도면3

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도면4

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문서서지사항요약대표도색인어명세서도면의 간단한 설명발명의 상세한 설명발명의 목적발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술발명이 이루고자 하는 기술적 과제

발명의 구성 및 작용발명의 효과

청구의 범위도면도면1도면2도면3도면4

문서서지사항 1요약 1대표도 1색인어 1명세서 2 도면의 간단한 설명 2 발명의 상세한 설명 2 발명의 목적 2 발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술 2 발명이 이루고자 하는 기술적 과제 3 발명의 구성 및 작용 3 발명의 효과 9청구의 범위 9도면 10 도면1 11 도면2 11 도면3 11 도면4 12