7/27/2019 1990 - Mittelbach - Lipase Catalyzed Alcoholysis Of

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168Lipase C ata lyze d Alcoholysis of Sunflower Oi lM a r t i n M R t e l b a c h "Insti tu te for Orga nic Chem ist ry , K ar l F ranzens Univers ity o f G raz , Heinr lchst ra /~e 28 , A-8010 Graz (Aust r ia )

L i p a s e - c a t a l y z e d a l c o h o l y s i s o f s u n f l o w e r o i l u n d e ra n h y d r o u s c o n d i t i o n s w a s e x a m i n e d . L i p a s e s f r omPseudomonasf luorescens a n d 2 i m m o b i l iz e d e n z y m e sf r o m M ucor miehei a n d a Can di da sp. g a v e s u f f i c i e n tc o n v e r s i o n w i t h p e t r o l e u m e t h e r a s t he s o l v e n t , e v e nw h e n m e t h a n o l a n d e t h a n o l w e r e u s e d . T h e o v e r a llc o n t e n t o f t ri- , d i- a n d m o n o g l y c e r i d e s , a s w e l l a s t h ec o r r e s p o n d i n g a l k y l e s t e r s , w a s m e a s u r e d . B e c a u s ePseudomonas l i p a s e l e d t o a l m o s t q u a n t i t a ti v e e s t e r -i f ic a t i o n , f u r t h e r s t u d i e s w e r e c a r r i e d o u t w i t h t h a te n z y m e v a r y in g t h e a m o u n t s o f e n z y m e o r t h e a l c o h o l s.A c c e p t a b l e c o n v e r s i o n s w e r e a c h i e v e d e v e n w i t h o u ts o l v e n t . R e a c t i o n r a t e s o f a l c o h o l y s i s w i t h 5 h o m o l o -g o u s a l c o h o l s , w i t h o r w i t h o u t t h e a d d i t i o n o f w a t e r ,w e r e m e a s u r e d , a n d i n a l l c a s e s t h e r e a c t i o n r a t e si n c r e a s e d w i t h h i g h e r c h a i n l e n g t h o f t h e a l c o h o l . I nt h e c a s e o f m e t h a n o l t h e h i g h e s t r a te w a s o b t a i n e dw i t h o u t a n y a d d i t i o n o f w a t e r , b u t a s i g n i f i c a n t l yh i g h e r r a t e w a s o b s e r v e d w i t h 9 6% e t h a n o l a s o p p o s e dt o a b s o l u t e e t h a n o l . T h e m a i n a d v a n t a g e s o f l i p a se -c a t a ly z e d , n o n a q u e o u s a l c o h o ly s i s a s c o m p a r e d t oc l a s s i c a l p r o c e d u r e s a r e t h e m i l d r e a c t io n c o n d i t i o n s ,t h e i s o l a t i o n o f g l y c e ri n w i t h o u t f u r t h e r p u r i f i c a t i o na n d w i t h o u t t h e f o r m a t i o n o f c h e m i c a l w a s t e , a n d t h ea b i l it y o f l i p a s e s t o c a t a l y z e t h e e s t e r i f i c a t i o n o f fr e ef a t t y a c i d s .

A l c o h o l y s i s o f v e g e t a b l e o i l s a n d a n i m a l f a t s i s a n i m p o r -t a n t r e a c t i o n t h a t p r o d u c e s f a t t y a ci d a lk y l e s t e r s t h a ta r e v a lu a b l e i n t e r m e d i a t e s i n o le o c h e m i s tr y , a n d m e t h y la n d e t h y l e s t e r s , w h i c h a r e e x c e l l e n t s u b s t i t u t e s f o r D ie s e lf u e l ( 1 ,2 ) . T h e r e f o r e , m a n y p r o c e d u r e s a r e d e s c r i b e d i nt h e l i t e r a t u r e t h a t u s e v a r i o u s c a t a l y s ts u n d e r d i f fe r e n tr e a c t i o n c o n d i t i o n s ( 3 ) . T h e m o s t c o m m o n l y u s e d c a t a -l y s ts a r e a l k a li h y d r o x i d e s a n d a l c o h o l a t e s , b o t h o f w h i c hg u a r a n t e e s h o r t r e a c t i o n t i m e s a n d h i g h y ie l d s. F o r o il sa n d f a t s w i t h a h i g h c o n t e n t o f f r e e f a t t y a c i d s , h o w e v e r ,a n a d d i t i o n a l s t e p i s n e c e s s a r y . S i m u l t a n e o u s a l c o h o l y s isa n d e s t e r i f i c a ti o n i s p o s s i b l e u n d e r a c i d ic c o n d i t i o n s , b u tt h i s p r o c e s s r e q u i re s h i g h e r r e a c t i o n t e m p e r a t u r e s . A d i s -a d v a n t a g e o f b o t h a l k al i a n d a c id c a t a l y z e d p r o c e d u r e s ist h a t t h e h o m o g e n o u s c a t a l y s t s a r e r e m o v e d w i t h t h e g ly -c e r o l l a y e r a f te r t h e r e a c t i o n a n d c a n n o t b e re u s e d . M o r e -o v e r , a m a j o r e c o n o m i c f a c t o r i n t e c h n i c a l a l c o h o l y s i s i st h e p u r i f i c a t i o n o f g l y c e r o l a s a s e c o n d a r y p r o d u c t ; t h i sp u r i f i c a t i o n i s m o r e d i f f ic u l t w h e n l a r g e a m o u n t s o f i n o r -g a n i c m a t e r i a l h a v e t o b e r e m o v e d .F o r m o s t te c h n i c a l a p p l i c a t i o n s , m e t h y l e s t e r s a r e p r o -d u c e d b e c a u s e m e t h a n o l i s e a s i ly a v a i l a b l e a s a n a b s o l u t ea l c o h o l . B u t , e s p e c i a l l y f o r D i e s e l f u e l s u b s t i t u t e s , i t isp r e f e r a b l e to p r e p a r e e t h y l e st e r s b e c a u s e e t h a n o l c a n b ep r o d u c e d f r o m b i o m a s s a n d i t is l es s t o x i c t h a n m e t h a n o l .C o n v e n t i o n a l a l c o h o l y s is w i t h 9 6 % e t h a n o l g i v es l o wy i el d s, h o w e v e r , e s p e c i a l l y u n d e r b a s i c c o n d i t i o n s .

*To who m co rrespond ence should be addressed.

I n r e c e n t y e a r s t h e u s e o f l i p a s e s a s c a t a l y s t s f o r t r a n s -f o r m a t i o n s o f f a t t y a c i d s h a s b e e n w i d e l y i n v e s t i g a t e d ( 4 ) .S o f a r , t h e m a i n t e c h n i c a l a p p l i c a t i o n o f l i p a s e s is t o m o d -i fy t h e f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n s o f t r i g l y c e ri d e s b y i n t e r e s -t e r i f i c a t i o n ( 5 ) . B u t t h e h y d r o l y s i s o f t r i g l y c e r i d e s , a s w e l la s t h e d i r e c t s y n t h e s i s o f e s t e r s , h a v e a l s o b e e n d e s c r i b e d( 6 , 7 ) . S u r p r i s i n g l y , l i t t l e a t t e n t i o n h a s b e e n d i r e c t e d t ot h e u s e o f l i p a s e s f o r t h e a l c o h o l y s is o f t ri g l y c e ri d e s . T h em e t h a n o l y s i s o f t a l lo w u s in g a 2 - p h a s e s y s t e m ( a c e t a t e -b u f f e r / h e x a n e ) a n d a l a rg e e x c es s o f m e t h a n o l h a s b e e np u b l i s h e d ( 7 ) , a n d i n a B r ! t i sh p a t e n t a p p l i c a t i o n ( 8 ) t h em e t h a n o l y s i s o f v a r i o u s v e g e t a b l e o i ls u s i n g l ip a s e f r o mCandida cylindracea w a s p e r f o r m e d b u t l ar g e a m o u n t so f c a t a ly s t , m e t h a n o l a n d w a t e r w e r e n e c e s s a r y . B e c a u s et h e r e c o v e r y o f g l y c e r o l f o r m a n a q u e o u s s o l u t i o n i s d if fi -c u l t a n d t h e a c t i v i ty o f t h e e n z y m e q u i ck l y d e c r e a s e s i na q u e o u s e n v i r o n m e n t , a l co h o ly s is s h o u l d b e p e r f o r m e d i na w a t e r - f r e e m e d i u m . T h e i n s o l u b i l i t y , a n d t h e r e f o r e t h eh i g h e r s t a b i li t y , o f e n z y m e s i n o r g a n i c m e d i a s h o u l d e n a -b l e a n e a s y r e c o v e r y a n d r e u s e o f t h e s e c a t a l y s t s . S u c he n z y m e - c a t a l y z e d p r o c e s s e s i n e n t i re l y n o n a q u e o u s s ol -v e n t s w e r e d e s c r i b e d b y K l ib a n o v et al. ( 9 , 1 0 ) , w h o i n v e s -t i g a t e d v a r i o u s t r a n s e s t e r i f i c a t i o n r e a c t i o n s u s i n g d i f fe r -e n t l i p a s es i n p o l a r a n d n o n p o l a r o r g a n i c s o lv e n t s. T h e yo b s e r v e d h i g h r e a c t i o n r a t e s d u r i n g t h e a l c o h o l y s is o f t r i-b u t y r i n w i t h h e p t a n o l i n n o n p o l a r s o l v e n t s. T h e c a t a l y t i cp o w e r e x h i b i t e d b y t h e l ip a s e s in o r g a n i c s o l v e n t s w a sc o m p a r a b l e t o t h a t d i s p la y e d i n w a t e r .I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e l i p a s e - c a t a l y z e d a l c o h o l y s i s o fs u n f l o w e r o i l w a s i n v e s t i g a t e d i n o r d e r t o o p t i m i z e c o n d i -t i o n s f o r t h e s y n t h e s i s o f m e t h y l a n d e t h y l e s te r s .

M A T E RIA L S A N D M E T H O D SA r e f i n e d a n d e d i b l e g r a d e o f s u n f l o w e r o il w a s u s e d a n dt h e f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n w a s : p a l m i t i c a c i d 7 %, s t e a r i ca c i d 4 % , o l e i c a c i d 2 5% a n d l i n o l ei c a c i d 6 4 % . F r o m t h a tc o m p o s i t i o n a n a v e r a g e m o l e c u l a r m a s s o f 8 7 6. 4 w a sd e t e r m i n e d .A l c o h o l y s is w a s p e r f o r m e d w i t h t h e f o l l o w in g h p a s es :Pseudomonas fluorescens l i p a s e b y R S h m G . m . b. H .( D a r m s t a d t , F e d e r a l R e p u b l ic o f G e r m a n y ) , S P 3 8 2 a n dL i p o z y m e l i p a s es b y N o v o L a b o r a t o r i e s I n c. ( D a n b u r y ,C T ) . S P 3 8 2 is b a s e d o n a li p a s e p r e p a r a t i o n p r o d u c e d b ya s e l e c t e d s t r a i n o f a Candida sp. a n d i s i m m o b i l i z e d o na b e a d - s h a p e d , a c r y l ic r e s in . L i p o z y m e is a l ip a s e f r o mM u c o r m / e h e / i m m o b i l iz e d o n a m a c r o p o r o u s a n i o ne x c h a n g e r e s i n. A s s o l v e n t, w e u s e d p e t r o l e u m e t h e r ( b .p .4 0 -6 0 ~ b e c a u s e i t g a v e t h e h i g h e s t e n z y m e a c t iv i t y.E n z y m a t i c r e a c t i o n s w e r e i n i t i a t e d b y a d d i n g a l i p a s ep o w d e r o r a n i m m o b i li z e d p r e p a r a t i o n t o a m i x t u r e o fs u b s t r a t e s a n d s o lv e n t. T h e s u s p e n s i o n w a s p l a c e d i n as t o p p e r e d f l as k a n d s h a k e n o n a n I K A - V i b r a x s h a k e r a t2 0 0 r p m a t d i f f e r en t t e m p e r a t u r e s .Analy sis of alcoholysis mixtures. T h e o v e r a l l c o n t e n to f t r i- , d i - a n d m o n o g l y c e r i d e s , a s w e l l a s f a t t y a c i d a l k y le s t e r s, w a s d e t e r m i n e d b y i s o c r a t i c H P L C w i t h d e n s i t yd e t e c t i o n , w h i c h e n a b l e s t h e s i m u l t a n e o u s q u a n t i f i c a t i o no f a l c oh o l y si s p r o d u c t s w i t h o u t s e p a r a t i o n o f i n d iv i d u a l

JAOCS, Vol. 67, no. 3 (Ma rch 1990)