8/7/2019 1967--Growth Inhibition by Hexoses of a Temperature-

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J o u R N A L O F B A C T E R I O L O G Y , S e p t . 1 9 6 7 , p . 7 0 7 - 7 1 1C o p y r i g h t 1 9 6 7 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y V o l . 9 4 , N o . 3P r i n t e d i n U . S . A .

G r o w t h I n h i b i t i o n b y H e x o s e s o f a T e m p e r a t u r e -S e n s i t i v e T h i a z o l e l e s s M u t a n t o fS a l m o n e l l a t y p h i m u r i u mJOSE L . PARADA AmN MANUEL V . ORTEGA

D e p a r t a m e n t o d e B i o q u i m i c a , C e n t r o d e I n v e s t i g a c i o ' n y d e E s t u d i o s A v a n z a d o s d e l 1 . P . N . , A p a r t a d o P o s t a l1 4 - 7 4 0 , M e x i c o 1 4 , D . F . , M e x i c oR e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 2 J u n e 1 9 6 7

A S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m m u t a n t s h ow i n g i m p a i r m e n t i n t h e u t i l i z a t i o n o fh e x o s e s was i s o l a t e d a f t e r t r e a t m e n t w i t h N - m e t h y l - N ' - n i t r o - N - n i t r o s o g u a n i d i n e .A t 3 0 C , i t grew w i t h h e x o s e s ( g l u c o s e , f r u c t o s e , g a l a c t o s e , m a n n i t o l ) , g l y c e r o l ,s u c c i n a t e , or a c i d - h y d r o l y z e d c a s e i n . A t 3 7 C , i t f a i l e d t o grow w i t h any o f t h e h e x o -s e s . E n z y m a t i c d e t e r m i n a t i o n s d e m o n s t r a t e d , h o w e v e r , t h a t t h e enzymes o ft h e g l y c o l y t i c p a t h w a y ( u p t o t h e f o r m a t i o n o f t r i o s e p h o s p h a t e s ) were p r e s e n ta n d a c t i v e a t 2 5 a n d 3 7 C . A t 4 2 C , t h e m u t a n t d i d n o t grow w i t h any o f t h ec a r b o n sources u s e d . A t b o t h 3 7 a n d 4 2 C , t h e m u t a n t grew p e r f e c t l y well w i t h h e x o -s e s i f y e a s t e x t r a c t was p r e s e n t . T h e m e t a b o l i t e r e q u i r e d f o r g r o w t h was t h i a m i n eo r , s p e c i f i c a l l y , i t s t h i a z o l e m o i e t y . I f g l u c o s e was a d d e d t o a c u l t u r e g r o w i n g i ng l y c e r o l , a t 3 7 C , g r o w t h was i n h i b i t e d . T h i s i n h i b i t i o n was r e l i e v e d b y t h e a d d i t i o no f t h i a m i n e or t h i a z o l e . T h u s , a t 3 7 C a n d o n l y i n t h e presence o f h e x o s e s , t h e mu-t a n t m a n i f e s t s a r e q u i r e m e n t f o r t h i a z o l e . T h i s a u x o t r o p h y i s a b s o l u t e a t 4 2 C .T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t , i n t h i s m u t a n t , so me d e r i v a t i v e o f h e x o s e s i n h i b i t s t h e syn-t h e s i s o f t h i a z o l e , a n d t h a t t h i s i n h i b i t i o n i s a l s o d e p e n d e n t on t h e t e m p e r a t u r e o fi n c u b a t i o n . T h e p o s i t i o n i n t h e b a c t e r i a l c h r o m o s o m e o f t h e g e n e t i c l o c u s o f t h i sl e s i o n ( t h z - ) was d e t e r m i n e d b y c o n j u g a t i o n a n d f o u n d t o c o i n c i d e w i t h t h e o n l yt h i a m i n e ( t h i ) l o c u s so f a r r e p o r t e d .

A l t h o u g h t h e b i o c h e m i c a l p o t e n t i a l o f a n o r -g a n i s m i s d e t e r m i n e d b y i t s g e n e t i c c o m p o s i t i o n ,t h e f i n a l p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n o f a g i v e n c h a r a c -t e r i s t i c c a n b e m o d i f i e d b y t h e e x i s t i n g e n v i r o n -m e n t a l c o n d i t i o n s .T h i s i s t h e c a s e , f o r i n s t a n c e , i n t h e a d e n i n e -s e n s i t i v e m u t a n t s o f S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u ms t u d i e d b y D a l a l e t a l . ( 2 ) . T h e s e m u t a n t s a r ep r o t o t r o p h i c i n t h e i r g r o w t h r e q u i r e m e n t s , b u t ,i n t h e p r e s e n c e o f a d e n i n e , t h e r e i s i n h i b i t i o n o fg r o w t h . T h e a d e n i n e i n h i b i t i o n i s r e l i e v e d n o n -c o m p e t i t i v e l y b y t h e p y r i m i d i n e m o i e t y o f t h i a -m i n e , b y p a n t o y l l a c t o n e , a n d b y m e t h i o n i n e .K i n e t i c a n a l y s i s o f t h i s p h e n o m e n o n d e m o n -s t r a t e d t h a t a d e n i n e i n h i b i t s t h e s y n t h e s i s o f t h er e v e r s i n g a g e n t s a t t h e l e v e l o f t h e b i o s y n t h e s i s o ff o l i c a c i d c o e n z y m e s , common f a c t o r s r e q u i r e df o r t h e s y n t h e s i s o f t h e t h r e e m e n t i o n e d m e t a b o -l i t e s .We h e r e r e p o r t a t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e m u t a n to f S . t y p h i m u r i u m w i t h a t h i a z o l e l e s s g e n o t y p e .T h i s g e n o t y p e w a s made a p p a r e n t b o t h b y t h e

t e m p e r a t u r e o f i n c u b a t i o n a n d b y t h e c a r b o n

s o u r c e u s e d i n g r o w i n g t h e c e l l s . A t 3 7 C , i n t h ea b s e n c e o f h e x o s e s , t h e m u t a n t b e h a v e d a s ap r o t o t r o p h . H e x o s e s i n h i b i t e d g r o w t h ; t h i s i n -h i b i t i o n w a s r e l i e v e d , e x c l u s i v e l y , b y e i t h e r t h i -a m i n e o r i t s t h i a z o l e m o i e t y . A t 4 2 C , t h e r e q u i r e -m e n t f o r t h i a z o l e w a s a b s o l u t e .M A T E R I A L S AND METHODSB a c t e r i a l s t r a i n s . S . t y p h i m u r i u m L T - 2 w a s k i n d l y

p r o v i d e d b y t h e l a t e M. D e m e r e c . M u t a n t A - 3 3 w a si s o l a t e d a f t e r t r e a t m e n t o f t h e p a r e n t a l s t r a i n w i t hN - m e t h y l - N ' - n i t r o - N - n i t r o s o g u a n i d i n e ( K & K L a b -o r a t o r i e s , I n c . ) , b y t h e m e t h o d o f A d e l b e r g e t a l . ( 1 ) .A t 3 0 C , i t g r e w i n m i n i m a l m e d i a w i t h a n y o f t h ef o l l o w i n g c a r b o n s o u r c e s : g l u c o s e , f r u c t o s e , g a l a c t o s e ,m a n n i t o l , g l y c e r o l , s u c c i n a t e , o r a c i d - h y d r o l y z e dc a s e i n . A t 3 7 C , i t f a i l e d t o g r o w w i t h a n y o f t h ea f o r e m e n t i o n e d h e x o s e s . I t w a s m a i n t a i n e d o n n u t r i e n tb r o t h - g l y c e r o l - a g a r s l a n t s . T h e H f r s t r a i n s u s e d w e r e :S . a b o n y S W 1 4 4 4 ( m e t - a r o - s r r ; o b t a i n e d f r o mE . L e d e r b e r g ) , S . a b o n y S W 1 4 5 2 ( t r p - ) , a n d S . t y p h i -m u r i u m S R 3 0 5 ( h i s - g a l - ; o b t a i n e d f r o m K . E . S a n -d e r s o n ) .C u l t u r e m e d i a . T h e m i n i m a l medium u s e d w a s t h a to f D a v i s a n d M i n g i o l i ( 3 ) , c i t r a t e o m i t t e d . T h e c a r b o n

7 0 7

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PARADA AND ORTEGAs o u r c e s w e r e a d d e d a t a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 4 % 0( w / v ) ; y e a s t e x t r a c t , a t 0 . 0 4 % ( w / v ) . F o r s o l i d m e d i a ,a g a r ( D i f c o ) w a s a d d e d ( 1 . 5 % w / v ) . P u r i n e a n dp y r i m i d i n e b a s e s a n d v i t a m i n s w e r e u s e d a t t h e c o n -c e n t r a t i o n s s u g g e s t e d b y G u i r a r d a n d S n e l l ( 5 ) . F o rt h e f i n a l e x p e r i m e n t s i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h eg r o w t h r e q u i r e m e n t , t h i a m i n e , t h i a z o l e , a n d p y r i m i -d i n e w e r e u s e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 m g g / m l .( B o t h t h i a z o l e a n d p y r i m i d i n e w e r e g i f t s o f K . P f i s t e r ,M e r c k S h a r p & D o h m e ) . 5 - ( 2 - H y d r o x y e t h y l ) - 4 -m e t h y l t h i a z o l e a n d 4 - a m i n o - 5 - h y d r o x y m e t h y l - 2 - m e t h -y l p y r i m i d i n e , t h e m o i e t i e s o f t h i a m i n e , a r e c a l l e d ,t h r o u g h o u t , t h i a z o l e a n d p y r i m i d i n e , r e s p e c t i v e l y .G r o w t h i n l i q u i d m e d i a . C e l l s w e r e g r o w n o v e r n i g h ta t 3 7 C , a e r o b i c a l l y , i n l i q u i d g l y c e r o l - m i n i m a l m e -d i u m . T h e y w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n , w a s h e dw i t h s t e r i l e s a l i n e s o l u t i o n , r e s u s p e n d e d i n s t e r i l es a l i n e , a n d u s e d t o i n o c u l a t e 5 0 - m l p o r t i o n s o f t h em i n i m a l m e d i u m , w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g c a r b o ns o u r c e s a n d a d d i t i o n s , i n 3 0 0 - m l B e l l c o f l a s k s e q u i p p e dw i t h s i d e a r m s ( d i a m e t e r , 1 9 m m ) . T h e c u l t u r e s w e r ei n c u b a t e d a e r o b i c a l l y , a t t h e r e q u i r e d t e m p e r a t u r e , i na New B r u n s w i c k r o t a t o r y s h a k e r . G r o w t h w a s f o l -l o w e d b y r e a d i n g , e v e r y h o u r , t h e o p t i c a l d e n s i t y o ft h e c u l t u r e s , a t 6 6 0 m u , u s i n g a C o l e m a n J u n i o rs p e c t r o p h o t o m e t e r .C o n j u g a t i o n . C o n j u g a t i o n e x p e r i m e n t s w e r e d o n ef o l l o w i n g t h e i n s t r u c t i o n s o f S a n d e r s o n a n d D e m e r e c( 7 ) . A p p r o p r i a t e d i l u t i o n s o f s a m p l e s o f t h e m a t i n gm i x t u r e , t a k e n a t v a r i o u s t i m e s a n d v i g o r o u s l y s h a k e nf o r 1 m i n , w e r e p l a t e d , i n t r i p l i c a t e , i n m i n i m a l -g l u c o s e p l a t e s . T h e p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 4 2 C , a n dt h e r e c o m b i n a n t s w e r e c o u n t e d a f t e r 3 6 h r o f i n c u b a -t i o n . I t s h o u l d b e p o i n t e d o u t t h a t , w i t h s t r a i n s SW-1 4 5 2 a n d S R 3 0 5 , t h e " d e a d t i m e " n e c e s s a r y b e f o r ea n y c h r o m o s o m a l m a r k e r s c a n b e d e t e c t e d i n t h er e c i p i e n t c e l l b y t h e i n t e r r u p t e d - m a t i n g t e c h n i q u e w a s5 t o 6 m i n a f t e r t i m e z e r o , a s d e f i n e d b y S a n d e r s o na n d D e m e r e c ( 7 ) . We v e r i f i e d t h e s e r e s u l t s b y i n t e r -r u p t e d - c o n j u g a t i o n e x p e r i m e n t s , u s i n g , a s r e c i p i e n t s ,d i f f e r e n t m u t a n t s t r a i n s w i t h w e l l - l o c a t e d c h r o m o s o -m a l l e s i o n s . T h e r e i s a d i f f e r e n c e , e s p e c i a l l y i n s t r a i nS W 1 4 5 2 , i n t h e " d e a d t i m e " v a l u e s g i v e n b y S a n d e r s o na n d D e m e r e c a n d t h o s e f o u n d b y u s . We d o n o t k n o wt h e r e a s o n f o r t h i s ; h o w e v e r , s i n c e o u r r e s u l t s w e r er e p r o d u c i b l e , w e u s e d , f o r t h e m a t i n g e x p e r i m e n t sd o n e w i t h a n y o f t h o s e s t r a i n s , a " d e a d t i m e " o f 5 t o 6m i n .

R E S U L T SC h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e t h i a z o l e l e s s g e n o t y p e o ft h e m u t a n t . A s s t a t e d b e f o r e , m u t a n t A - 3 3 w a si s o l a t e d a s a t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e m u t a n t t h a t ,

a t 3 7 C , w a s u n a b l e t o u t i l i z e h e x o s e s f o r g r o w t h .A l e s i o n i n t h e e a r l y s t e p s o f t h e u t i l i z a t i o n o fg l u c o s e w a s s u s p e c t e d . I t was f o u n d , h o w e v e r ,t h a t c e l l - f r e e e x t r a c t s o f g l y c e r o l - g r o w n b a c t e r i a ,b o t h o f t h e p a r e n t a l a n d t h e m u t a n t s t r a i n s ,p r e s e n t e d , a t 2 5 a n d 3 7 C , s i m i l a r e n z y m e s :g l u c o k i n a s e , p h o s p h o g l u c o i s o m e r a s e , p h o s p h o -f r u c t o k i n a s e , a l d o l a s e , a n d g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e .

When t h e g r o w t h r e s p o n s e o f t h e m u t a n t a t4 2 C w a s i n v e s t i g a t e d , i t w a s f o u n d t h a t t h e mu-t a n t d i d n o t g r o w a t t h i s t e m p e r a t u r e w i t h a n y o ft h e c a r b o n s o u r c e s u s e d ( h e x o s e s , g l y c e r o l , s u c -c i n a t e , a n d a c i d - h y d r o l y z e d c a s e i n ) , u n l e s s y e a s te x t r a c t w a s a d d e d t o t h e m e d i u m . T h e s a m e r e -s u l t s w e r e f o u n d w h e n t h e m u t a n t w a s g r o w n a t3 7 C i n t h e p r e s e n c e o f h e x o s e s .G r o w t h i n m i n i m a l - g l u c o s e l i q u i d m e d i a , w i t ha d d e d v i t a m i n s a n d p u r i n e a n d p y r i m i d i n e b a s e s ,w a s s t u d i e d . I t w a s f o u n d t h a t t h e m u t a n t g r e wo n l y w h e n t h i a m i n e w a s p r e s e n t ; n o n e o f t h eo t h e r s u b s t a n c e s t e s t e d h a d a n y e f f e c t ( F i g . 1 ) .When t h e p y r i m i d i n e a n d t h i a z o l e m o i e t i e s o ft h i a m i n e w e r e t e s t e d , a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n ,g r o w t h o c c u r r e d o n l y w h e n t h i a z o l e w a s p r e s e n t ;i t d i d n o t m a t t e r w h e t h e r t h e e x p e r i m e n t w a sc a r r i e d o u t a t 3 7 o r 4 2 C ( F i g . 2 ) . I n l i q u i d m e d i a ,a t 3 0 C , t h e r e w a s no r e q u i r e m e n t w h a t s o e v e r ;t h e m u t a n t g r e w a t t h e s a m e r a t e w i t h g l u c o s e o rg l y c e r o l , w i t h o r w i t h o u t t h i a z o l e .

HOURS O F I N C U B A T I O NF I G . 1 . G r o w t h o f m u t a n t A - 3 3 i n m i n i m a l g l u c o s em e d i u m , a t 3 7 C , i n t h e p r e s e n c e o f v i t a m i n s . ( 0 ) Noa d d i t i o n s ; ( A ) w i t h a l l o f t h e v i t a m i n s ; ( O ) w i t h a l lv i t a m i n s e x c e p t t h i a m i n e ; ( @ ) w i t h o n l y t h i a m i n e .

7 0 8 J . B A C T E R I O L .

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V O L . 9 4 , 1 9 6 7 HEXOSES AND INHIBITION OF A SALMONELLA MUTANTw a s a d d e d t o t h e c u l t u r e a t t h e t i m e o f t h e t e m -p e r a t u r e c h a n g e , g r o w t h c on t i n u e d u n a r r e s t e d( F i g . 4 ) . T h e i n h i b i t i o n o b s e r v e d b y a t e m p e r a t u r es h i f t d i s a p p e a r e d w h e n t h e i n h i b i t e d c u l t u r e w a si n c u b a t e d a g a i n a t 3 0 C ( F i g . 5 ) .T h e s a m e i n h i b i t i o n p h e n o m e n o n w a s o b -s e r v e d w h e n t h e m u t a n t w a s g r o w i n g i n a g l y -c e r o l - m i n i m a l m e d i u m a n d t h e s h i f t i n t e m p e r a -t u r e w a s f r o m 3 0 t o 4 2 C ; w h e n t h e c h a n g e w a sf r o m 3 0 t o 3 7 C , t h e r e w a s n o d e l a y i n g r o w t h .

L o c a t i o n o f t h e a f f e c t e d l o c u s o n t h e b a c t e r i a lc h r o m o s o m e . T a b l e 1 s h o w s t h e r e s u l t s o f s e v e r a li n t e r r u p t e d - m a t i n g e x p e r i m e n t s , d o n e t o l o c a t et h e a f f e c t e d l o c u s o n t h e b a c t e r i a l c h r o m o s o m e .From t h e s e r e s u l t s , i t a p p e a r s t h a t t h e m u t a t i o ni s l o c a t e d a t 1 2 9 m i n f r o m t h e z e r o p o i n t o f t h eb a c t e r i a l c h r o m o s o m e , a c c o r d i n g t o t h e map o fS a n d e r s o n a n d D e m e r e c ( 7 ) . I t i s o f i n t e r e s t t h a tt h e s e i n v e s t i g a t o r s l o c a t e d a l o c u s f o r t h i a m i n ea t t h i s p o i n t , a l t h o u g h t h e y d i d n o t t e s t t h e r e -s p o n s e o f t h e i r m u t a n t t o t h e i s o l a t e d m o i e t i e s o f

O 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0HOURS OF INCUBATION

F I G . 2 . T h i a z o l e r e q u i r e m e n t o f mutant A - 3 3 g r o w i n gi n m i n i m a l g l u c o s e m e d i u m a t 3 7 C ( 0 ) No a d d i t i o n s ;( A ) w i t h t h i a m i n e ; ( O ) w i t h t h i a z o l e ; ( 0 ) w i t h p y r i m i -d i n e .I n h i b i t i o n o f g r o w t h b y g l u c o s e a t 3 7 C . When

g l u c o s e was a d d e d t o a c u l t u r e g r o w i n g i n g l y -c e r o l - l i q u i d m e d i u m a t 3 7 C , g r o w t h was i n -h i b i t e d . T h i s i n h i b i t i o n was r e l i e v e d b y t h e a d d i -t i o n o f t h i a m i n e or t h i a z o l e , b u t n o t b y p y r i m i -d i n e ( F i g . 3 ) .T h e i n h i b i t i o n o f g r o w t h was a l s o o b s e r v e dwhen g l u c o s e was p r e s e n t , a t t h e b e g i n n i n g o f t h ee x p e r i m e n t , i n a g l y c e r o l m e d i u m . I f t h i a m i n e ort h i a z o l e were a l s o p r e s e n t , no i n h i b i t i o n o c c u r r e d .W h e n , a f t e r s e v e r a l h o u r s o f i n c u b a t i o n , t h i a m i n eor t h i a z o l e was a d d e d t o a g l y c e r o l - g r o w n c u l t u r ei n h i b i t e d b y g l u c o s e a t z e r o - t i m e , t h e i n h i b i t i o no f g r o w t h d i s a p p e a r e d ( F i g . 3 ) .I n h i b i t i o n a n d r e - e s t a b l i s h m e n t o f g r o w t h b yt e m p e r a t u r e s h i f t s . When t h e i n c ub a t i on t e m p e r a -t u r e o f t h e m u t a n t , g r o w i n g i n a g l u c o s e - m i n i m a lm e d i u m , was c h a n g e d f r o m 3 0 t o e i t h e r 3 7 or4 2 C , t h e r e was a d e c r e a s e i n t h e r a t e o f g r o w t h ;a f t e r a f e w h o u r s , g r o w t h c e a s e d . When t h i a z o l e

HOURS OF INCUBATIONF I G . 3 . I n h i b i t i o n o f g r o w t h o f mutant A - 3 3 b y g l u -

c o s e . C e l l s g r o w i n g a t 3 7 C i n m i n i m a l g l y c e r o l m e d i u m .( 0 ) No a d d i t i o n s ; ( A ) g l u c o s e added a t t i m e A ; ( - )g l u c o s e a d d e d a t t i m e A and t h i a m i n e a d d e d a t t i m e B ;( O ) g l u c o s e added a t z e r o - t i m e ; ( U ) g l u c o s e added a tzero t i m e a n d t h i a m i n e a d d e d a t t i m e C .

o .

0 .

7 0 9. 0

. 8

1 . 7

i . 5 -

i . 4 -

1 . 3

1 . 2

0

E0t 01 -U )zC ]- J

I - .a. o0

0 O

0 .

C

L i

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4/5

PARADA AND ORTEGAi n h i b i t e d , a t 3 7 C , b y a h e x o s e m e t a b o l i t e . A t4 2 C , t h e enzyme ceases t o f u n c t i o n , a n d t h es y n t h e s i s o f t h i a z o l e s t o p s c o m p l e t e l y ; g r o w t h c anp r o c e e d o n l y i f t h e c e l l s are p r o v i d e d w i t h t h i a z o l eor t h i a m i n e .A t p r e s e n t , n o t h i n g i s k n o w n a b o u t t h e enzy-m a t i c s t e p s l e a d i n g t o t h e b i o s y n t h e s i s o f t h i a z o l ei n b a c t e r i a l s y s t e m s , a n d very l i t t l e i s k n o w n a b o u tt h e precursors o f t h i s c o m p o u n d . D . J . H o w e l l s

! Ef-u)zwa

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F - O . "zJ

0 . ;0

a .O 2 3 4 5 6 7 O 9 10

HOURS OF I N C U B A T I O NF I G . 4 . E f f e c t o f t h e a d d i t i o n o f t h i a z o l e on t h e i n -h i b i t i o n o f g r o w t h p r o d u c e d b y a t e m p e r a t u r e s h i f t .C e l l s g r o w i n g a t 3 0 C in m i n i m a l g l u c o s e m e d i u m . ( 0 )No a d d i t i o n , no t e m p e r a t u r e s h i f t ; ( A ) no a d d i t i o n ,

t e m p e r a t u r e s h i f t ( 4 2 C ) a t t i m e i n d i c a t e d b y arrow;( 0 ) a d d i t i o n and t e m p e r a t u r e s h i f t ( 4 2 C ) a t t i m e i n d i -c a t e d b y arrow.t h i s v i t a m i n ( K . E . S a n d e r s o n , p e r s o n a l c o m m u n i -c a t i o n ) .

D I s c u s s I o NT h e b i o c h e m i c a l a n d g e n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s o f

S. t y p h i m u r i u m m u t a n t A - 3 3 i n d i c a t e t h a t i t i s as i n g l e - l e s i o n , t e m p e r a t u r e - s e n s t i t i v e , t h i a z o l e l e s sm u t a n t a n d t h a t t h e m a n i f e s t a t i o n o f i t s g e n o t y p ed e p e n d s on e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s . At 3 0 C ,t h e m u t a n t b e h a v e s as a p r o t o t r o p h ; a t h i g h e rt e m p e r a t u r e s ( 3 7 a n d 4 2 C ) , i t s response t o t h ee n v i r o n m e n t i s d i f f e r e n t . A t 3 7 C , w h e n s u c c i n a t e ,g l y c e r o l , or a c i d - h y d r o l y z e d c a s e i n i s u s e d as ac a r b o n s o u r c e , t h e b e h a v i o r i s s t i l l t h a t o f ap r o t o t r o p h ; i f h e x o s e s are u s e d , t h e a u x o t r o p h yf o r t h i a z o l e i s made a p p a r e n t . At 4 2 C , i t d o e sn o t m a t t e r w h i c h c a r b o n source i s u s e d ; t h em u t a n t b e h a v e s as a t h i a z o l e - e x a c t i n g a u x o t r o p h .I t t h u s appears t h a t , i n t h i s m u t a n t , some en-zyme i n t h e b i o s y n t h e t i c p a t h w a y o f t h i a z o l e i st e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e a n d t h a t i t s a c t i v i t y c an b e

0

4 -

- 1 1 a7

2

[. . . . ..A. . .O3691 2 4 ' 7 ' 9 0

H OU RS OF I N C U B A T I O NF I G . 5 . E f f e c t o f t e m p e r a t u r e s h i f t s o n g r o w t h o fm u t a n t A - 3 3 . C e l l s g r o w i n g a t 3 0 C i n m i n i m a l g l u c o s em e d i u m . ( 0 ) No t e m p e r a t u r e s h i f t s ; ( A ) s h i f t t o 3 7 Ca t t i m e A ; ( - ) s h i f t t o 3 7 C a t t i m e A , t h e n s h i f t t o3 0 C a t t i m e B ; ( 0 ) s h i f t t o 4 2 C a t t i m e A ; ( U ) s h i f tt o 4 2 C a t t i m e A , t h e n s h i f t t o 3 0 C a t t i m e C .

T A B L E 1 . M ap p o s i t i o n o f t h e t h z l o c u sd e t e r m i n e d b y c o n j u g a t i o nT m o f A p p a r e n tD o n o r H f r s t r a i n C r o s s n o . T i m e o f m a pc o r r e c t i o n p o s i t i o no ~ f 1 h zmin m i n

S a l m o n e l l a t y p h i m u - 1 1 4 1 2 8r i u m S R 3 0 5 2 1 5 1 2 93 1 5 1 2 9S . a b o n y S W 1 4 5 2 1 7 1 2 92 8 1 2 83 7 1 2 9S . a b o n y S W 1 4 4 4 1 NRa2 NR3 NR

N o r e c o m b i n a n t s .

7 1 0 J . B A m - R i o L .

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V O L . 9 4 , 1 9 6 7 HEXOSES AND I N H I B I T I O N OF A SALMONELLA M U T A N T[ P h . D . T h e s i s , U n i v e r s i t y o f W a l e s , 1 9 6 2 , a sq u o t e d b y G o o d w i n ( 4 ) ] f o u n d t h a t g r o w i n gc u l t u r e s o f B a c i l l u s s u b t i l i s i n c o r p o r a t e t h e m e t h y lc a r b o n o f m e t h i o n i n e i n t o t h e t h i a z o l e m o i e t y o ft h i a m i n e .More i s k n o w n a b o u t t h e p r e c u r s o r s o f t h i a z o l ei n b a k e r s ' y e a s t . T h e r e c e n t c o m m u n i c a t i o n o fJ o h n s o n e t a l . ( 6 ) i n d i c a t e s t h a t , i n t h i s m i c r o -o r g a n i s m , a t l e a s t t h e m e t h y l c a r b o n a n d t h e s u l -f u r o f m e t h i o n i n e a r e i n c o r p o r a t e d , t o t h e s a m ee x t e n t , i n t h e t h i a z o l e s t r u c t u r e . T h e t w o c a r b o n so f a c e t a t e a n d t w o c a r b on s o f a l a n i n e ( b o t h c o m -p o u n d s p r o b a b l y a s a c e t a l d e h y d e ) a r e a l s o i n -c o r p o r a t e d .I f b a c t e r i a l s y s t e m s u s e t h e s a m e p r e c u r s o r s f o rt h i a z o l e s y n t h e s i s a s y e a s t , i t c o u l d b e p o s t u l a t e dt h a t t h e f i v e - c a r b o n c h a i n p r e s e n t i n t h i a z o l e i sf o r m e d f r o m a c e t a l d e h y d e a n d a t h r e e - c a r b o nc o m p o u n d , b y m e a n s o f a n a l d o l a s e - o r t r a n s -a l d o l a s e - t y p e r e a c t i o n , g i v i n g a p e n t o s e - l i k ec o m p o u n d . T h e t h e o r e t i c a l e n z y m e r e q u i r e d f o rt h i s c o n d e n s a t i o n c o u l d r e p r e s e n t t h e l e s i o n i nm u t a n t A - 3 3 . A t 3 7 C , i t s a c t i v e c e n t e r w o u l d b ed e f o r m e d a n d c o u l d a c c e p t a m ol e c ul e o f s o m ed e r i v a t i v e o f h e x o s e t h a t w o u l d b l o c k i t f r o mc a r r y i n g o u t i t s f u n c t i o n . I n t h a t c a s e , b o t h t h eo b s e r v e d i n h i b i t i o n b y h e x o s e a n d t h e r e l i e v i n ge f f e c t o f t h i a z o l e c o u l d b e e a s i l y e x p l a i n e d .I n a n y c a s e , a s o u n d e x p l a n a t i o n o f t h e h e x o s ei n h i b i t o r y e f f e c t o b s e r v e d w i t h t h i s t h i a z o l e l e s sm u t a n t w i l l h a v e t o w a i t u n t i l more k n o w l e d g ea b o u t t h e p r e c u r s o r s o f t h i a z o l e a n d t h e e n z y -m a t i c s t e p s o f i t s s y n t h e s i s , i n b a c t e r i a l s y s t e m s ,i s o b t a i n e d .T h e f a c t t h a t t h e c h r o m o s o m a l l e s i o n r e s p o n -s i b l e f o r t h e t h i a z o l e r e q u i r e m e n t o f m u t a n t A - 3 3i s l o c a t e d a t t h e s a m e p o i n t a t w h i c h S a n d e r s o na n d D e m e r e c ( 7 ) r e p o r t e d a l o c u s c on c e r n e d w i t ht h i a m i n e b i o s y n t h e s i s c a n h a v e t w o e x p l a n a t i o n s .A s t h e s e i n v e s t i g a t o r s d i d n o t t e s t t h e r e s p o n s e o ft h e i r t h i a m i n e - r e q u i r i n g m u t a n t t o t h e t h i a z o l ea n d p y r i m i d i n e m o i e t i e s , i t c o u l d b e t h a t t h e t h il o c u s i s r a t h e r a t h z l o c u s . T h e o t h e r p o s s i b i l i t yi s t h a t t h e r e a r e t w o l o c i , t h i a n d t h z , c l o s e l y

l i n k e d , t h a t map a t t h e p o i n t i n d i c a t e d b y S a n d e r -s o n a n d D e m e r e c a n d b y o u r e x p e r i m e n t s . F u r -t h e r w o r k w i t h s o m e o t h e r t h i a m i n e l e s s a n dt h i a z o l e l e s s m u t a n t s w i l l c l e a r u p t h i s p o i n t .ADDENDUM I N P R O O FA t t h e s u g g e s t i o n o f K . E . S a n d e r s o n , a n d t om a i n t a i n a c o h e r e n t n o m e n c l a t u r e o f S . t y p h i m u r i u mm u t a n t s , m u t a n t A - 3 3 w i l l i n t h e f u t u r e b e d e s i g n a t e da s S M 3 3 .ACKNOWLEDGMENTS

T h a n k s a r e d u e t o J o s e C h a v e z f o r t e c h n i c a l a s -s i s t a n c e .O n e o f u s ( J . L . P . ) w a s s u p p o r t e d b y a P r e d o c t o r a lF e l l o w s h i p , O r g a n i z a t i o n o f t h e A m e r i c a n S t a t e s( 1 9 6 5 - 1 9 6 6 ) a n d a CIEA L a t i n - A m e r i c a n F e l l o w s h i p( 1 9 6 7 ) .L I T E R A T U R E C I T E D

1 . A D E L B E R G , E . A . , M. M A N D E L , AND G . C . C H I N GC H E N . 1 9 6 5 . O p t i m a l c o n d i t i o n s f o r m u t a g e n e -s i s b y N - m e t h y l - N ' - n i t r o - N - n i t r o s o g u a n i d i n e i nE s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s .Commun. 1 8 : 7 8 8 - 7 9 5 .2 . D A L A L , F . R . , R . E . G O T S , AND J . S . Gos. 1 9 6 6 .M e c h a n i s m o f a d e n i n e i n h i b i t i o n i n a d e n i n e -s e n s i t i v e m u t a n t s o f S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m . J .B a c t e r i o l . 9 1 : 5 0 7 - 5 1 3 .3 . D A v i s , B . D . , AND E . S . M I N G I O L I . 1 9 5 0 . M u t a n t so f E s c h e r i c h i a c o l i r e q u i r i n g m e t h i o n i n e o rv i t a m i n B 1 2 . J . B a c t e r i o l . 6 0 : 1 7 - 2 8 .4 . G O O D W I N , T . W. 1 9 6 3 . T h e b i o s y n t h e s i s o f v i t a -m i n s a n d r e l a t e d c o m p o u n d s , p . 1 0 . A c a d e m i cP r e s s , I n c . , New Y o r k .5 . G U I R A R D , B . M . , AND E . E . S N E L L . 1 9 6 2 . N u t r i -t i o n a l r e q u i r e m e n t s o f m i c r o o r g a n i s m s , p . 3 3 -9 4 . I n I . C . G u n s a l u s a n d R . Y . S t a n i e r [ e d . ] ,T h e b a c t e r i a , v o l . 4 . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , NewY o r k .6 . J O H N S O N , D . B . , D . J . H O W E L L S , AND T . W . G O O D -W I N . 1 9 6 6 . O b s e r v a t i o n s o n t h e b i o s y n t h e s i s o ft h i a m i n e i n y e a s t . B i o c h e m . J . 9 8 : 3 0 - 3 7 .7 . S A N D E R S O N , K . E . , A N D M. D E M E R E C . 1 9 6 5 . T h el i n k a g e m a p o f S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m .G e n e t i c s 5 1 : 89 7 - 9 1 3 .

7 1 1