(19) 대한민국특허청(KR) (12) 등록특허공보(B1) · 2017. 11. 6. · r) 인...
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(19) 한민 특허청(KR)
(12) 등 특허공보(B1)
(45) 공고 2013 12월16
(11) 등 10-1341591
(24) 등 2013 12월09
(51) 특허 (Int. Cl.)
G01N 30/72 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01)
C12Q 1/34 (2006.01) G06F 17/10 (2006.01)(21) 원 10-2012-0108011
(22) 원 2012 09월27
심사청 2012 09월27
(56) 행 사문헌
KR1020070017676 A
KR100611313 B1
(73) 특허
한 과학지원연 원
역시 과학 169-148 (어 동)
(72)
건욱
청 도 청원 창 각리 우림2차 603동 1203
신
울특별시 강남 도곡동 462 개포럭키아 트1-701
(뒷 에 계 )
(74) 리
원
체 청 항 : 16 항 심사 : 도헌
(54) 칭 N―연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리
(57) 약
본 고 해 질량 얻 질량 트럼 결과 하여 티드에 비해 상 낮
감도 또 낮 도 재하 당 티드 고 동 량 하여, 질병 지 (Biomarke
r) 당 티드 견하여 과 암 측 진단할 에 하게 사 다.
도 - 도1
등록특허 10-1341591
- 1 -
(72)
진
청 도 청원 창 각리 우림2차 607동 1804
주연
역시 갈마2동 344-9 지 J.S. vil 301
경
역시 갈마동 갈마아 트 306동 702
안 주
역시 학 99 과학과
재한
역시 학 99 과학과
지원한 가연 개 사업
과 고 2012K001501
처 과학
연 사업 신 합 동 사업
연 과 질량 신 합 진단 개
여 80/100
주 한 과학지원연 원
연 간 2012.07.01 ~ 2013.06.30
지원한 가연 개 사업
과 고 -
처 과학
연 사업 특 문 학원 연계학연 지원사업
연 과 과학 문 학원 연계학연 지원사업
여 20/100
주 한 과학지원연 원
연 간 2012.03.01 ~ 2013.02.28
등록특허 10-1341591
- 2 -
특허청
청 항 1
1) 시료 내 당단 질 가 해 처리하여 득한 폴리 티드 질량 하여 질량 트럼
얻 단계;
2) 상 단계 1)에 얻 질량 결과에 MS1 탄 트럼 변 하 단계;
3) 상 단계 2)에 변 MS/MS 트럼에 피크 량 129.06, 138.06, 145.05, 147.07, 163.06,
168.07, 186.08, 204.08, 274.09, 292.10, 350.15, 366.14, 454.16, 528.19 657.24 (Oxonium
ion peaks) 하여 각각 탄 트럼에 M- 어 계산하 단계;
4) 상 단계 3)에 얻 M- 어 하여 당 티드 트럼 택하 단계;
5) 상 단계 4) 택 당 티드 트럼 MS1에 동 원 포 득한 후,
비 하여 S- 어 계산한 다 계산 S- 어 하여 당 티드 후보 동 하 단계;
6) 상 단계 5)에 동 당 티드 후보들 탄 트럼에 Y- 어 Y'- 어 하여
한 당 티드 평가하 단계;
7) 상 단계 6)에 동 당 티드들 량 행하 단계 포함하 액 시료 N-연결 당
티드 동 량 한 생물 보처리 .
청 항 2
1항에 어 , 상 단계 1) 가 해 트립신(Trypsin), 아 닌 C(Arg-C), 아 트산 N(Asp-
N), 루탐산 C(Glu-C), 라 신 C(Lys-C), 키 트립신(Chymotrypsin), 프 나아 K(Proteinase k) 프
나아 (Pronase) 택 것 특징 하 액 시료 N-연결 당 티드
동 량 한 생물 보처리 .
청 항 3
1항에 어 , 상 단계 2) 질량 LTQ-FT, Orbitrap, Triple-Tof, Q-Tof, Tof-Tof Q Exactive
얻어진 것 특징 하 액 시료 N-연결 당 티드 동 량 한
생물 보처리 .
청 항 4
3항에 어 , 상 질량 질량 해 10,000 상 질량 도 50 ppm 하 고 해 질량
것 특징 하 액 시료 N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리
.
청 항 5
1항에 어 , 상 단계 3)에 탄 트럼 CID 또 HCD 트럼 고, M- 어 계산 하 [
학식 1]에 해 행 것 특징 하 액 시료 N-연결 당 티드 동 량 한 생물
보처리 :
등록특허 10-1341591
- 3 -
[ 학식 1]
(N: 할 당피크 ;
n: 한 당피크 ;
Ii: 복 에 i 째 강도;
C: 상 값).
청 항 6
1항에 어 , 상 단계 5)에 S- 어 계산 하 [ 학식 2]에 해 행 것 특징 하
액 시료 N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리 :
[ 학식 2]
(X1: 동 원 피크들 n 째 피크 질량;
Y1: 실험 동 원 피크들 n 째 피크 질량;
X2: 동 원 피크들 n 째 피크 상 강도;
Y2: 실험 동 원 피크들 n 째 피크 상 강도;
C1: 상 값;
C2: 상 값).
청 항 7
1항에 어 , 상 단계 5)에 당단 질 당 티드들 동 원 포 하여
한 다 , N-연결 당 티드 동 량 에 하 것 특징 하 액 시료
N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리 .
등록특허 10-1341591
- 4 -
청 항 8
6항에 어 , 상 S- 어 계산할 동 원 질량 포 클리드 거리 강도 포 피어 상
하여 사도 측 하 것 특징 하 액 시료 N-연결 당 티드 동 량
한 생물 보처리 .
청 항 9
1항에 어 , 상 단계 6)에 탄 트럼 CID 또 HCD 트럼 고, Y- 어 계산 하 [
학식 3]에 해 행 것 특징 하 액 시료 N-연결 당 티드 동 량 한 생물
보처리 :
[ 학식 3]
(N: 할 당 티드 단편 ;
n: 한 당 티드 단편 ;
Ii: 복 에 I 째 강도).
청 항 10
1항에 어 , 상 단계 6)에 탄 트럼 HCD 트럼에 Y'- 어 계산 하 [ 학식 4]에
해 행 것 특징 하 액 시료 N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리
:
[ 학식 4]
.
청 항 11
1항에 어 , 상 단계 7) 당 티드 량 MS1 트라에 S- 어 하 것 특징
하 액 시료 N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리 .
청 항 12
1항에 어 , 상 단계 7) 당 티드 량 MS1 트라에 택 당 티드 강도 나타
내 동 원 피크 에 가 강도가 강한 것 3개 피크 강도 합쳐 나타내 것 특징
등록특허 10-1341591
- 5 -
하 액 시료 N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리 .
청 항 13
1항에 어 , 상 시료 청, , 액, 변, 뇌척 액, 양 , 액 (synovial fluid), 또 척액
(lavage fluid) 것 특징 하 액 시료 N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리
.
청 항 14
1) 시료 내 당단 질 트립신(Trypsin) 처리하여 득한 폴리 티드 Orbitrap 하여 질량 트
럼 얻 단계;
2) 상 단계 1)에 얻 질량 RAW RawExtractor v1.9 하여 ms1(TXT) 변 그리고
MM File Conversion Tools v3.9 하여 ms2(MGF) 변 하 단계;
3) 상 단계 2)에 변 ms2(MGF) 각 HCD(High energy Collision Dissociation) 트럼
M- 어 계산하 단계;
4) 상 단계 3)에 얻 M- 어 1.0 상 트럼 당 티드 트럼 택하 단계;
5) 상 단계 4) 택 당 티드 트럼 MS1에 동 원 포 얻고, 비
하여 S- 어가 98.0 상 당 티드 후보 동 하 단계;
6) 상 단계 5)에 동 당 티드 후보들 해당 HCD 트럼에 Y' 어 CID(Collision
Induced Dissociation) 트럼에 Y- 어 하여 한 당 티드 평가하 단계;
7) 상 단계 6)에 동 당 티드들 량 행하 단계 포함하 액 시료 N-연결 당
티드 동 량 한 생물 보처리 .
청 항 15
1) 시료 내 당단 질 트립신(Trypsin) 처리하여 득한 폴리 티드 LTQ-FT 하여 질량 트럼
얻 단계;
2) 상 단계 1)에 얻 질량 RAW RawExtractor v1.9 하여 ms1(TXT) 변 그리고
MM File Conversion Tools v3.9 하여 ms2(MGF) 변 하 단계;
3) 상 단계 2)에 변 ms2(MGF) 각 CID 트럼 M- 어 계산하 단계;
4) 상 단계 3)에 얻 M- 어 0.5 상 트럼 당 티드 트럼 택하 단계;
5) 상 단계 4) 택 당 티드 트럼 MS1에 동 원 포 얻고, 비
하여 S- 어가 98.0 상 당 티드 후보 동 하 단계;
6) 상 단계 5)에 동 당 티드 후보들 해당 CID 트럼에 Y- 어 하여 한 당 티
드 평가하 단계;
7) 상 단계 6)에 동 당 티드들 량 행하 단계 포함하 액 시료 N-연결 당
티드 동 량 한 생물 보처리 .
청 항 16
1) 시료 내 당단 질 트립신(Trypsin) 처리하여 득한 폴리 티드 Triple-Tof 하여 질량 트
럼 얻 단계;
등록특허 10-1341591
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2) 상 단계 1)에 얻 질량 WIFF AB Science MS Data Convert v1.3 ProteoWizard
v2.1(http://proteowizard.sourceforge.net/) 하여 ms1(TXT) ms2(MGF) 변 하 단계;
3) 상 단계 2)에 변 ms2(MGF) 각 CID 트럼 M- 어 계산하 단계;
4) 상 단계 3)에 얻 M- 어 1.0 상 트럼 당 티드 트럼 택하 단계;
5) 상 단계 4) 택 당 티드 트럼 MS1에 동 원 포 얻고, 비
하여 S- 어가 98.0 상 당 티드 후보 동 하 단계;
6) 상 단계 5)에 동 당 티드 후보들 해당 CID 트럼에 Y- 어 하여 한 당 티
드 평가하 단계;
7) 상 단계 6)에 동 당 티드들 량 행하 단계 포함하 액 시료 N-연결 당
티드 동 량 한 생물 보처리 .
야
본 질량 트럼 결과 N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리 에 [0001]
한 것 다.
경
간 액 시료 많 단 질들 합체 , 에 50% 상 당단 질 라고 알 다. 하지만[0002]
당단 질 당 다양 과 복 문에 , 량 단 체 또 체 에 비하여 상 어
다. 하지만 고 해 질량 도 당 당단 질 빠 도 하고 다. 그럼에도
하고 당단 질 동 (Identification) 그리고 량(Quantitation) 할 생물 보처리 아
직 지 상당 미약하다. 재 많 치료 단 질들 다양한 태 그리고 복 하게 당쇄 (glycosylatio
n)가 어 다고 알 다. 러한 당 단 질 당쇄 , 그리고 량 근하 에 크
게 가지 나 어 살펴 볼 다. 하나 PNGase F(peptide-N-glycosidase F) 또 합물 한
단(chemical cleavage) 사 하여 당(Glycan) 량 하 고, 다 하나 당 티드
(Glycopeptide) 동 량하 다. 그러나 리(Released) 당 하 것에 당쇄 가 어
나 특 치(Glycosylation site-specific information) 알 없다 문 안고 다. 라
당단 질 당 티드 그 동 , 그리고 량 하 것 암 재 진행 할 , 한
당단 질뿐만 아니라 당쇄 치 그리고 N-연결 당쇄 크 곁사슬 가 등 다양한 보
득할 것 단 다.
, 당단 질 당쇄 하 하여 단 질 에 당단 질 하 단계 거친다. 하지[0003]
만 본 연 에 당단 질 시료 사 하여 본 행하고, 하 다. 티드 단
(Trypsin) 하여, 상 당단 질 시료 가 해하여 티드 그리고 당 티드 득한 다 , 상
티드들 고 해 질량 하여 행하 다. 경우 체 탄 질량 트럼(MS/MS) 그
리고 질량 트럼(MS) 하여, 당 티드 (Database) 비 하여 당 티드 동 량
하 다.
재 질량 트럼 또 탄 질량 트럼 하여 당 티드 검색하 프트웨어에[0004]
Peptoonist(David Goldberg., et.. al; Automated N-Glycopeptide Identification Using a Combination of
Single- and Tandem-MS. Journal of proteome research 2007, 6, 3995-4005),
SimGlycan(http://glycotools.qa-bio.com/SimGlycan), GlycoMiner(Oliver Ozohanics., et., al; GlycoMiner:
a new software tool to elucidate glycopeptide composition. Rapid Communications in Mass Spectrometry
2008, 22, 3245-3254), GlycoSpectrumScan(Nandan Deshpande., et., al; GlycoSpectrumScan: Fishing
등록특허 10-1341591
- 7 -
Glycopeptides from MS Spectra of Protease Digests of Human Colostrum slgA. Journal of proteome
research 2010, 9, 1063-1075), GlycoPep Grader(Carrie L. Woodin. et., al; GlycoPep Grader: A Web-Based
Utility for Assigning the Composition of N-Linked Glycopeptides. Analytical Chemistry, 2012)등 프
그램 개 어 사 고 다.
그러나 상 프 그램들 탄 질량 트럼만 하여 당 티드 동 하 문에 한 당 티들 프[0005]
링 하 어 고, 한 에 량 결과 같 보여주지 않 다 문 안고 다. 또한 다양한
고 해 질량 지원하지 않 문 다.
에, 본 들 질량 트럼 결과 티드에 비해 상 감도(또 도)가 낮 (Low[0006]
abundant) 당 티드들에 해 고 한 동 , 량할 하 다. 체
간 내에 상 도 재하 281개 당단 질들 (Terry Farrah., et., al.; A High-
Confidence Human Plasma Proteome Reference Set with Estimated Concentrations in PeptideAtlas.
Molecular Cell Proteomics, 2011) 당 티드들 한 다 에 상 당 티들 동 원 포
링하여 하 고 탄 질량 트럼(MS/MS) 뿐 아니라 질량 트럼(MS)에 당 티드 동
원 포 얻고 상 당 티드 비 하여 당 티드 동 하 크 마
그램(Ion Chromatograms)에 (Area) 계산하여 량 할 본
하 다.
내
해결하 과
본 액 시료 N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리 공하[0007]
것 다.
과 해결 단
상 달 하 하여, 본 [0008]
1) 시료 내 당단 질 가 해 처리하여 득한 폴리 티드 질량 하여 질량 트럼[0009]
얻 단계;
2) 상 단계 1)에 얻 질량 결과에 MS1 탄 트럼 변 하 단계;[0010]
3) 상 단계 2)에 변 MS/MS 트럼에 피크 량 129.06, 138.06, 145.05, 147.07, 163.06,[0011]
168.07, 186.08, 204.08, 274.09, 292.10, 350.15, 366.14, 454.16, 528.19 657.24 (Oxonium
ion peaks) 하여 각각 탄 트럼에 M- 어 계산하 단계;
4) 상 단계 3)에 얻 M- 어 하여 당 티드 트럼 택하 단계; [0012]
5) 상 단계 4) 택 당 티드 트럼 MS1에 동 원 포 득한 후, [0013]
비 하여 S- 어 계산한 다 계산 S- 어 하여 당 티드 후보 동 하 단계;
6) 상 단계 5)에 동 당 티드 후보들 탄 트럼에 Y- 어 Y'- 어 하여 [0014]
한 당 티드 평가하 단계;
7) 상 단계 6)에 동 당 티드들 량 행하 단계 포함하 액 시료 N-연결 당[0015]
티드 동 량 한 생물 보처리 공한다.
과
등록특허 10-1341591
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본 다양한 시료에 특 당쇄 갖 당 티드 양 변 고 한 통[0016]
하여, 시료 암 또 질병 마커 견하여 측, 진단할 에 하게 사 고
해 질량 하여 당단 질 약 당 티드 당 하고 하 사 들에게도 보다
과 다.
도 간단한
도 1 본 에 시료 N-연결 당 티드 동 량 한 새 운 생물 보처리 [0017]
도식 한 도 다.
도 2 본 당단 질 실시 에 N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리
단계 2에 티드 당 티드 M- 어 포도 나타내 도 다.
도 3 본 당단 질 실시 에 N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리
단계 2에 티드 당 티드 민감도 특 도 상 계 나타내 도 다.
도 4a 본 당단 질 실시 에 동 N-연결 당 티드 에 NLTK_5200 HCD
트럼 나타낸 도 다.
도 4b 본 당단 질 실시 에 동 N-연결 당 티드 에 NLTK_5200 CID
트럼 나타낸 도 다.
도 5 본 당단 질 실시 에 N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리
단계 7에 당 티드 NLTK_5200 량 도 다.
도 6 본 당단 질 실시 에 N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리
단계 7에 당 티드 NLTK_6200 량 도 다.
도 7 본 당단 질 실시 에 N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리
단계 7에 당 티드 NLTK_7200 량 도 다.
도 8 본 당단 질 실시 에 N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리
단계 7에 당 티드 NLTK_8200 량 도 다.
도 9 본 당단 질 실시 에 N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리
단계 7에 당 티드 NLTK_9200 량 도 다.
도 10 본 당단 질 실시 에 N-연결 당 티드 동 량 한 생물 보처리
단계 7에 량 한 당 티드 량 포 원 그래프 나타낸 도 다.
도 11 당 티드들 도에 량 값 도시 하여 나타낸 그래프 다.
실시하 한 체 내
본 하게 하 하여 본 에 재 어 아래 같 한다.[0018]
"가 해 (hydrolase)" 당단 질 당만 리하 당 단 말한다.[0019]
탄 질량 체 질량 트럼(MS) 심 또 상 감도가 들 택하[0020]
여 한 트럼(MS/MS) 질량 하 다.
"동 원 (Isotopic)" 원 가 같지만 원 량 다 학 원 말한다.[0021]
"동 원 그룹 (Isotope Grouping)" 실험 얻 피크 리 트 동 원 그룹 하 것[0022]
말한다.
"N-glycan Isotopic Modeling" 가 한 당 동 원 포 미한다. [0023]
"S- 어(Similarity Score)" 실험에 얻 동 원 피크 포 에 한 동[0024]
원 피크 포 사 도 치 나타낸 것 미한다.
등록특허 10-1341591
- 9 -
" 타(Delta)" 질량과 실험 한 질량 차 값 미한다.[0025]
하, 본 상 하게 한다.[0026]
본 [0027]
1) 시료 내 당단 질 가 해 처리하여 득한 폴리 티드 질량 하여 질량 트럼[0028]
얻 단계;
2) 상 단계 1)에 얻 질량 결과에 MS1 탄 트럼 변 하 단계;[0029]
3) 상 단계 2)에 변 MS/MS 트럼에 피크 량 129.06, 138.06, 145.05, 147.07, 163.06,[0030]
168.07, 186.08, 204.08, 274.09, 292.10, 350.15, 366.14, 454.16, 528.19 657.24 (Oxonium
ion peaks) 하여 각각 탄 트럼에 M- 어 계산하 단계;
4) 상 단계 3)에 얻 M- 어 하여 당 티드 트럼 택하 단계; [0031]
5) 상 단계 4) 택 당 티드 트럼 MS1에 동 원 포 득한 후, [0032]
비 하여 S- 어 계산한 다 계산 S- 어 하여 당 티드 후보 동 하 단계;
6) 상 단계 5)에 동 당 티드 후보들 탄 트럼에 Y- 어 Y'- 어 하여 [0033]
한 당 티드 평가하 단계;
7) 상 단계 6)에 동 당 티드들 량 행하 단계 포함하 액 시료 N-연결 당[0034]
티드 동 량 한 생물 보처리 공한다.
상 에 어 , 상 단계 1) 가 해 트립신(Trypsin), 아 닌 C(Arg-C), 아 트산[0035]
N(Asp-N), 루탐산 C(Glu-C), 라 신 C(Lys-C), 키 트립신(Chymotrypsin), 프 나아 K(Proteinase k)
프 나아 (Pronase) 택 것 택 것 람직하나
에 한 하지 않 다.
상 에 어 , 상 단계 2) 질량 LTQ-FT, Orbitrap, Triple-Tof, Q-Tof, Tof-Tof Q[0036]
Exactive 얻어진 것 람직하나 에 한 하지 않 다.
상 질량 질량 해 10,000 상 질량 도 50 ppm 하 고 해 질량 것 람[0037]
직하나, 에 한 하지 않 다.
상 에 어 , 상 단계 3)에 탄 트럼 CID 또 HCD 트럼 고, M- 어 계산 하[0038]
[ 학식 1]에 해 행 것 람직하나 에 한 하지 않 다:
학식 1
[0039]
(N: 할 당피크 ;[0040]
등록특허 10-1341591
- 10 -
n: 한 당피크 ;[0041]
Ii: 복 에 i 째 강도; [0042]
C: 상 값).[0043]
상 에 어 , 상 단계 5)에 S- 어 계산 하 [ 학식 2]에 해 행 것 람직하나[0044]
에 한 하지 않 다:
학식 2
[0045]
(X1: 동 원 피크들 n 째 피크 질량;[0046]
Y1: 실험 동 원 피크들 n 째 피크 질량;[0047]
X2: 동 원 피크들 n 째 피크 상 강도;[0048]
Y2: 실험 동 원 피크들 n 째 피크 상 강도;[0049]
C1: 상 값; [0050]
C2: 상 값).[0051]
상 단계 5)에 같 S- 어 하 당 티드 에 동 원 포도 실험에[0052]
동 원 포도 비 하여 한 당 티드 동 할 다. 상 S- 어 상 < 학식 2>
계산 다.
상 에 어 , 상 단계 5)에 당단 질 당 티드들 동 원 포 하여 [0053]
한 다 , N-연결 당 티드 동 량 에 하 것 람직하나 에 한 하지
않 다.
상 S- 어 계산할 동 원 질량 포 클리드 거리 강도 포 피어 상 하[0054]
여 사도 측 하 것 람직하나 에 한 하지 않 다.
상 에 어 , 상 단계 6)에 탄 트럼 CID 또 HCD 트럼 고, Y- 어 계산 하[0055]
[ 학식 3]에 해 행 것 람직하나 에 한 하지 않 다:
등록특허 10-1341591
- 11 -
학식 3
[0056]
(N: 할 당 티드 단편 ;[0057]
n: 한 당 티드 단편 ; [0058]
Ii: 복 에 I 째 강도).[0059]
상 단계 6)에 같 Y- 어 나타날 당 티드 단편 도 탄 트럼[0060]
(CID,HCD)에 하고 평가하 과 다. 상 Y- 어 상 [ 학식 3] 계산 다.
상 에 어 , 상 단계 6)에 탄 트럼 HCD 트럼에 Y'- 어 계산 하 [ 학식[0061]
4]에 해 행 것 람직하나 에 한 하지 않 다:
[0062]
학식 4
[0063]
상 에 어 , 상 단계 7) 당 티드 량 MS1 트라에 S- 어 하 것 [0064]
람직하나 에 한 하지 않 다.
상 에 어 , 상 단계 7) 당 티드 량 MS1 트라에 택 당 티드 강도 나[0065]
타내 동 원 피크 에 가 강도가 강한 것 3개 피크 강도 합쳐 나타내 것
람직하나 에 한 하지 않 다.
상 에 어 , 상 시료 청, , 액, 변, 뇌척 액, 양 , 액 (synovial fluid), 또 척[0066]
액(lavage fluid) 것 람직하나 에 한 하지 않 다.
본 실시 에 간 에 주 견 당단 질 281개에 하여 행하 나 [0067]
에 한 하지 않 다.
본 실시 에 당쇄 350개 당에 해 만 고 하 나 에 한 하지 않 다. [0068]
또한, 본 [0069]
1) 시료 내 당단 질 트립신(Trypsin) 처리하여 득한 폴리 티드 Orbitrap 하여 질량 트[0070]
럼 얻 단계;
2) 상 단계 1)에 얻 질량 RAW RawExtractor v1.9 하여 ms1(TXT) 변 그리고[0071]
MM File Conversion Tools v3.9 하여 ms2(MGF) 변 하 단계;
3) 상 단계 2)에 변 ms2(MGF) 각 HCD(High energy Collision Dissociation) 트럼[0072]
등록특허 10-1341591
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M- 어 계산하 단계;
4) 상 단계 3)에 얻 M- 어 1.0 상 트럼 당 티드 트럼 택하 단계; [0073]
5) 상 단계 4) 택 당 티드 트럼 MS1에 동 원 포 얻고, 비[0074]
하여 S- 어가 98.0 상 당 티드 후보 동 하 단계;
6) 상 단계 5)에 동 당 티드 후보들 해당 HCD 트럼에 Y'- 어 그리고 CID(Collision[0075]
Induced Dissociation) 트럼에 Y- 어 하여 한 당 티드 평가하 단계;
7) 상 단계 6)에 동 당 티드들 량 행하 단계 포함하 액 시료 N-연결 당[0076]
티드 동 량 한 생물 보처리 공한다.
또한, 본 [0077]
1) 시료 내 당단 질 트립신(Trypsin) 처리하여 득한 폴리 티드 LTQ-FT 하여 질량 트럼[0078]
얻 단계;
2) 상 단계 1)에 얻 질량 RAW RawExtractor v1.9 하여 ms1(TXT) 변 그리고[0079]
MM File Conversion Tools v3.9 하여 ms2(MGF) 변 하 단계;
3) 상 단계 2)에 변 ms2(MGF) 각 CID 트럼 M- 어 계산하 단계; [0080]
4) 상 단계 3)에 얻 M- 어 0.5 상 트럼 당 티드 트럼 택하 단계; [0081]
5) 상 단계 4) 택 당 티드 트럼 MS1에 동 원 포 얻고, 비[0082]
하여 S- 어가 98.0 상 당 티드 후보 동 하 단계;
6) 상 단계 5)에 동 당 티드 후보들 해당 CID 트럼에 Y- 어 하여 한 당 티[0083]
드 평가하 단계;
7) 상 단계 6)에 동 당 티드들 량 행하 단계 포함하 액 시료 N-연결 당[0084]
티드 동 량 한 생물 보처리 공한다.
아울러, 본 [0085]
1) 시료 내 당단 질 트립신(Trypsin) 처리하여 득한 폴리 티드 Triple-Tof 하여 질량 트[0086]
럼 얻 단계;
2) 상 단계 1)에 얻 질량 WIFF AB Science MS Data Convert v1.3 ProteoWizard[0087]
v2.1(http://proteowizard.sourceforge.net/) 하여 ms1(TXT) ms2(MGF) 변 하 단계;
3) 상 단계 2)에 변 ms2(MGF) 각 CID 트럼 M- 어 계산하 단계; [0088]
4) 상 단계 3)에 얻 M- 어 1.0 상 트럼 당 티드 트럼 택하 단계; [0089]
5) 상 단계 4) 택 당 티드 트럼 MS1에 동 원 포 얻고, 비[0090]
하여 S- 어가 98.0 상 당 티드 후보 동 하 단계;
6) 상 단계 5)에 동 당 티드 후보들 해당 CID 트럼에 Y- 어 하여 한 당 티[0091]
드 평가하 단계;
7) 상 단계 6)에 동 당 티드들 량 행하 단계 포함하 액 시료 N-연결 당[0092]
티드 동 량 한 생물 보처리 공한다.
본 에 어 , 티드에 비해 복 하고, 다양 고, 낮 도 당 티드 , [0093]
량 하 하여 고 해 질량 한다. 또한, 질량 결과 하고 빠 게
하 하여 M- 어, S- 어, Y- 어 y- 어 하여 당 티드 동 하고 량 하고
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한다.
본 에 어 , 상 단계 3에 같 M- 어 하 티드 트럼과 당 티드 트럼[0094]
리 가 하다 다. 상 M- 어 하 [ 학식 1] 계산 다.
[ 학식 1][0095]
[0096]
(N: 할 당피크 [0097]
n: 한 당피크 [0098]
Ii: 복 에 i 째 강도[0099]
C: 상 값)[0100]
당단 질 시료(RNaseB) HCD 트라 M- 어 포도 나타낸 것 다(도 2 참 ). 포도[0101]
공 평가 거쳐 티드 랑, 당 티드 M- 어 포도 나타낼 다.
M- 어 포도 상 티드 당 티드 민감도 특 도 상 계 ROC(Receiver Operating
Characteristic) 커브 한 AUC(Area Under Curve) 0.98 값 가진다(도 3 참 ).
본 에 어 , 상 단계 5)에 같 S- 어 하 당 티드 에 동 원[0102]
포도 실험에 동 원 포도 비 하여 한 당 티드 동 할 다. 상 S- 어 하
[ 학식 2] 계산 다.
[ 학식 2][0103]
[0104]
(X1: 동 원 피크들 n 째 피크 질량[0105]
Y1: 실험 동 원 피크들 n 째 피크 질량[0106]
X2: 동 원 피크들 n 째 피크 상 강도[0107]
Y2: 실험 동 원 피크들 n 째 피크 상 강도[0108]
C1: 상 값[0109]
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C2: 상 값)[0110]
본 에 어 , 상 단계 6)에 같 Y- 어 나타날 당 티드 단편 도[0111]
탄 트럼(CID HCD)에 하고 평가하 과 다. 상 Y- 어 하 [ 학식 3] 계산
다.
[ 학식 3][0112]
[0113]
(N: 할 당 티드 단편 [0114]
n: 한 당 티드 단편 [0115]
Ii: 복 에 I 째 강도)[0116]
본 에 어 , y- 어 티드 b, y 들 포도 계산 한 것 다. 그리고[0117]
Y'- 어 Y- 어 y- 어 합 나타낸다.
본 에 어 실시 당단 질 시료(RNase B) 당 티드 동 한 결과 하 [ 1]에[0118]
나타내었다.
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1
[0119]
상 단계 7)에 같 당단 질 시료(RNase B)에 동 당 티드에 하여 량 행[0120]
하 다. 량 각 당 티드 크 마 그램(Ion Chromatograms)에 (Area) 계산하여 행하
다(도 4 내지 도8 참 ). 계산하 한 각 포 ( 색원) 가 강도가 강한 피크 3개
동 원 피크 강도 합한 값 나타낸다. 또한 포 가 5개 상 경우에 가우시안 포 합
도 행하고, 상 포 계산하여 량 값 나타내었다. 상 당단 질 시료(RNase
B) 량 포도 다 어그램 나타내었다(도 9 참 ). NLTK_5200(5Hex 2HexNac) 42%,
NLTK_6200(6Hex 2HexNac) 31%, NLTK_8200(8Hex 2HexNac) 15%, NLTK_7200(7Hex 2HexNac) 7% 마지막
NLTK_9200(9Hex 2HexNac) 5% 하 다. 상 결과 참 문(Kathryn R. Rebecchi., et., al;
Label-Free Quantitation: A New Glycoproteomics Approach. J.Am.Soc.Mass.Spectrom, 2009,20,1048-1059)에
결과 같 량 포 보여 주었다. 상 당단 질 시료(RNase B)에 한 량 포 결
과 하 [ 2]에 나타내었다.
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2
[0121]
결과 , 본 에 라 당단 질 시료에 한 당 티드 동 하고, 그들 량[0122]
행할 알 다.
하, 본 실시 에 해 상 한다.[0123]
단. 하 실시 본 시하 것 뿐, 본 내 하 실시 한 것 아니[0124]
다.
<실시 1> 믹 시료 [0125]
당단 질 시료 시그마 알 리치 RNase B(Ribonuclease B), AGP(Alpha1-Acid Glycoprotein) [0126]
하 , 시료 믹 한 시료 하 [ 3]에 같 비하 다.
3
샘플 [0127] 1 2 3 4 5
RNase B 3.320 ㎍ 1.660 ㎍ 0.828 ㎍ 0.333 ㎍ 0.162 ㎍
AGP 3.320 ㎍ 3.320 ㎍ 3.320 ㎍ 3.320 ㎍ 3.320 ㎍
각 시료 트립신 사 하여 37℃에 새(overnight) 가 해시 다.[0128]
<실시 2> 당 티드 량 [0129]
상 <실시 1> 시료 과 에 폴리 티드 고 해 질량 Orbitrap(Thermo Finnigan)[0130]
에 연결하여 LC/ESI-MS/MS 행하 다. 각 시료 재 결과 검 하 하여 4 복
행하 다. 질량 결과 (RAW) 프리웨어 프 그램 RawExtractor v1.9(The Scripps Research
Institute, La Jolla, CA), MM File Conversion Tools v3.9 (http://www.massmatrix.net/mm-
cgi/downloads.py) 하여 ms1(TXT) ms2(MGF) 변 하 다. N-연결 당 티드 동 량
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한 새 운 생물 보처리 하여 각 질량 결과에 당 티드들 동 량
행하 다.
그 결과, 상 <실시 1>에 시료에 NLTK_5200, NLTK_6200, NLTK_7200, NLTK_8200 NLTK_9200 당[0131]
티드들 량 공 행 하 다(도 11).
산업상 가
본 새 운 암 진단 마커 검 하 마커 산업뿐만 아니라, 당단 질 약[0132]
당 티드 당 할 시 러 에 하게 사 다.
도
도 1
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- 18 -
도 2
도 3
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도 4a
도 4b
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도 5
도 6
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- 21 -
도 7
도 8
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- 22 -
도 9
도 10
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- 23 -
도 11
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