Application Workstations

A P P L I C A T I O N N O T E

Authors Frank Vandenbussche, Ph DElise VandemeulebrouckeVeterinary and Agrochemical Research CentreGroeselenberg 99, 1180 Brussels, BELGIUM

Bart MinnoyeNavjot KaurGary ReznikPerkinElmer, Inc.Downers Grove, IL 60515 USA

JANUS 自動ワークステーションを用いた、獣医学的診断のための血液サンプルからのウイルス RNA 抽出の自動化

要旨ハイスループットな核酸抽出プラットフォームとしての JANUS™ 自動ワークステーションの性能を、ブルータングウイルス（BTV）陽性の血液サンプルを用いて評価しました。10倍希釈系列を用い、自動化抽出プロトコールの感度を調べたところ、手作業による抽出プロトコールとほぼ同じ感度が得られました（平均差：0.88、95% CI：0.65～1.12、P<0.0001）。自動化プロトコールにおけるばらつきは非常に小さく総変動係数は 1.47%から 8.96%でした。現地試料 42検体の比較分析を行った結果、手作業および自動化による抽出プロトコールには互換性があることが示されました。陰性サンプル 48検体と強陽性サンプル 48検体を混合して抽出してもクロスコンタミネーションは認められませんでした。自動化抽出プロトコールは非常に速く、92検体を約 2時間で抽

出できます。本アプリケーションノートでご紹介する結果は、JANUS 自動ワークステーションが、全血サンプルからのハイスループットな核酸抽出に適した、使いやすく用途の広いプラットフォームであることを明確に示しています。

はじめにブルータング（BT）は、家畜または野生の反芻動物に見られる昆虫媒介性の疾患であり、種および品種に応じてさまざまな臨床徴候を引き起こします（MacLachlan、1994；Verwoerd、2004）。本疾患は、レオウイルス科オルビウイルス属に分類されるブルータングウイルス（BTV）によって起こされます。（Mertens et al、2004）。BTV は 2006年夏に初めて欧州北西部に出現し、オランダ、ベルギー、ドイツ、ルクセンブルグ、スイス、フランス国土の半分、およびイギリス南東部へと急速に広がりました（Toussaint et al、2006；Wilson et al、2007）。

www.perkinelmer.co.jp

BTV の出現により多大な経済的損失が生じるため、高感度で再現性と安定性の高い手法によって本疾患を厳しく監視する必要があります。国際獣疫事務局（Office international des epizooties、OIE）では様々な試験を承認していますが、従来の PCR またはリアルタイム RT-PCR（RT-qPCR）がウイルスを確認の方法として選択されるようになっています。PCR 分析の前にサンプルからウイルス由来の核酸を抽出する必要があります。現在多くの検査機関では、そのスピード、効率および自動化の容易さから、シリカベースの精製法が使用されています。

本アプリケーションノートでは、JANUS 自動ワークステーション（PerkinElmer 社）を用いた、全血サンプルからの核酸抽出を目的としたハイスループットなシリカベースプロトコールをご紹介します。本アプリケーションノートに記載の研究は、ベルギーのVeterinary and Agrochemical Research Centre（VAR）で行われたものです。VAR は、世界動物保健機関（別名：国際獣疫事務局［Office international des epizooties、OIE］）が定めたリスト病原体 A を同定するベルギー連邦参照試験所として、欧州連合に認定されています。

材料と方法

機器8チャンネルピペッティングアームおよびグリッパーアームを 装着した JANUS 自動ワークステーションにより、核酸の抽出を行いました。VersaTip PLUS アダプターを取り付けることにより、ユーザーが操作しなくても、洗浄式チップおよびディスポーザ ブルチップを同一プロトコール内で使用できます。吸引ろ過のステップを行うため、PerkinElmer Vacuum Manifold（PVM）を設置しました。PVM は自動化に適したマニホールドおよびガスケットにより、ろ過ステップ中に自動でセルフシールおよびセルフベントを行います。また、様々な種類の実験器具に対応可能で、フィルタープレートの正確なポジショニングも可能です。その他に使用した機器にはバキュームポンプ（VACUUBRAND 社）および試薬・プレートヒーター（Inheco 社）を設置し、両機器とも Win-PREP ソフトウェアで制御しました。吸引の持続時間・強度およびヒーターの温度は、簡単に調節することがきます（表 2）。研究室内へのエアロゾル飛散を防ぐため、ワークステーション全体をバイオセーフティーキャビネット（Bigneat 社）内に収めました。

分子解析

抽出 – NucleoSpin® 8/96 Virus Core Kit（Macherey-Nagel 社）を用い、製造元の使用説明書に記載の方法に若干の変更を加え、自動化抽出を行いました。自動化抽出プロトコールのデッキレイアウトを図 1に示します。種々のピペッティングおよび吸引ステップの概要を表 1および表 2に示します。

手作業での抽出は NucleoSpin RNA Virus キットを用い、製造元の使用説明書に従って行いました。

RT-qPCR解析 – RNA サンプルの解析は、Vandenbussche らの手法（2008）に従い、7900HT Fast リアルタイム PCR システム（Applied Biosystems 社）で BTV に特異的な RT-qPCR を行いました。

サンプル自動化抽出プロトコールの感度を求めるため、ウシ血液サンプルに BTV-8（Bel2006/01株）を 0.05～7.05 log10 TCID50 mL-1の範囲で 8点、異なる濃度で添加しました。2007年の BTV 流行時に採取された純粋な現地試料 42検体も含めて試験を行い、手作業および自動化による抽出プロトコールを比較しました。強陽性サンプル 48検体および陰性サンプル 48検体を格子縞状に配置して抽出を行い、クロスコンタミネーションのリスクを評価しました。

Procedure Note

Add RAV1 FT

Add Proteinase FT

Mixing DT

Move samples for 90°C incubation Gripper

Add Ethanol FT

Transfer Lysates 1 DT

Vacuum for binding See Table 2

Transfer Lysates 2 DT

Vacuum for binding See Table 2

Change waste plate in manifold Gripper

Wash 1 with buffer RAW FT

Vacuum for Wash 1 See Table 2

Wash 2 with buffer RAW FT

Vacuum for Wash 2 See Table 2

Change waste plate in manifold Gripper

Wash 3 with buffer RAV3 FT

Vacuum for Wash 3 See Table 2

Wash 4 with buffer RAV3 FT

Vacuum for Wash 4 See Table 2

Vacuum for drying See Table 2

Place elution plate in manifold Gripper

Add elution buffer FT

Vacuum for elution 1 See Table 2

Vacuum for elution 2 See Table 2

表 1. VersaTip、グリッパーおよびバキュームのリモートコントロールにより、JANUSを用いた RNA抽出の完全自動化が可能になります。DT：ディスポーザブルチップ FT：固定チップ

図 1. RNA 抽出の自動化のための WinPREP 上のグラフィックデッキレイアウト

表 2. ウイルス RNA抽出用のWinPREPテンプレートで指定する吸引の設定。

Vacuum Procedure Pressure (mbar) Time (secs)

for binding 600 300

for wash 1 – buffer RAW 600 180

for wash 2 – buffer RAW 600 180

for wash 3 – buffer RAV3 600 60

for wash 4 – buffer RAV3 600 60

for drying 400 360

for elution 1 – elution buffer 600 120

for elution 2 – elution buffer 600 60

統計解析統計解析は全て MedCalc 9.0ソフトウェアを用いて行いました。統計解析を行うため、陰性サンプルの Ct値（すなわち時間を乗じた DNA 分子の濃度）は全て45.1としました。解析を行う前に、コルモゴロフ・スミノフ検定によって正規性の検定を行いました。さらに t検定を行い、手作業および自動化による抽出プロトコール間に統計学的に有意な差があるかどうか調べました。Bland-Altman プロット（Bland and Altman、1995）、Passing-Bablok の回帰分析（Passing and Bablok、1983）およびピアソンの相関係数により、両抽出プロトコールの一致度および相関を評価しました。P値が 0.05未満だった場合、統計学的に有意であると判断しました。

結果および考察

感度10倍希釈系列において、手作業および自動化による抽出プロトコール間の Ct値を比較し、感度を求めました。図 2に示すように、手作業による抽出法では自動化抽出法よりもわずかに良好な結果 が 得られました（平均 差：0.88、95% CI：0.65 ～ 1.12、P<0.0001）。この差は、統計学的に有意であるものの、検出限界に影響するものではないため、診断には影響しません。

反復性および再現性反復性（ラン内のばらつき）および再現性（ラン間のばらつき）に関して、0.05～7.05 log10 TCID50 mL-1の範囲で、8点のウイルス希釈系列を抽出して評価しました。全ての希釈系列は独立した 3ランで、6回ずつ試験を行いました。各希釈濃度について、結果の平均値およびばらつきを表 3にまとめました。変動係数（CV）は 1.47%から 8.96%で、反復間およびラン間のばらつきが低いことを示しています。想定された通り、検出限界に近づくにつれてCVは大きくなりました（1.05および 0.05 log10 TCID50 mL-1）。

比較解析2007年の BTV 流行時の現地試料計 42検体を、手作業および自動化により抽出し、RT-qPCR による分析を行いました。その結果に基づいて、両抽出プロトコール間の比較を行いました。ピアソンの相関係数から、両プロトコール間に有意な相関があることが示されました（r=0.9884；95% CI：0.9784 ～ 0.9938；P<0.0001）。Bland-Altman 解析（図 3A）は、2手法の結果の

差および平均値の間に系統的なバイアスがないことを示しています。抽出プロトコール間の差は、Ct値の全範囲で均一に分布しており、そのうち 92.8%は 95%信頼区間内に含まれています （±1.96 標準偏差）。抽出プロトコール間の平均差は -0.3702 （95% CI： 0.6374～ -0.1031）でした。Passing-Bablok の回帰分析（図3B）は、傾き1.0000（95% CI：0.9549 ～1.0477）、切片0.4200（95% CI：0.8377～1.7520）で、抽出プロトコール間の優れた一致率を示しています。

クロスコンタミネーションウイルス量が多いサンプルとウイルス量が少ないサンプルの両方を扱う診断検査機関において、クロスコンタミネーションリスクの低減は非常に重要です。クロスコンタミネーションがないことを検証するため、強陽性サンプル 48検体および陰性サンプル48検体を格子縞状に配置しました。自動化による抽出の後、陰性サンプル 48検体全てにおいてウイルス RNAは検出されませんでした。

スループット手作業で精製できる血液サンプルの数は、微量遠心機の最大処理数によって 24 検体に制限されてしまいます。手作業による処理では遠心を行うステップが数回あり、1バッチ 24サンプルの精製に 2時間かかります。92検体の血液サンプルからの核酸の自動化精製にかかる時間は約 2時間です。JANUS自動ワークステーションのセットアップにかかる時間は、受け入れ血液サンプルのフォーマット（個別のチューブか、マイクロプレートか）によりますが 15分から 30分です。

Ct-v

alue

図 2. 異なる濃度のウイルスを添加した血液サンプルから手作業（赤色）および自動化（青色）で抽出した RNAより得た Ct値。手作業および自動化で処理したサンプルのCt値はそれぞれ 3回および 6回の反復試験の平均です。

B

auto

mat

ed e

xtra

ctio

n (C

t-val

ue)

A

man

ual –

aut

omat

ed (C

t-val

ue)

図 3. （A）現地試料 42検体から、手作業および自動化抽出プロトコールで処理して得られた Ct値の Bland-Altman解析。各検体について、手作業および自動化プロトコールによる Ct値の平均に対し、Ct値の差をプロットしています。（B）手作業および自動化抽出プロトコールで得られた Ct値の Passing-Bablock回帰解析。実線は回帰直線、破線は信頼区間を表します。点線は一致性を示す 45度の線です（x=y）。

JANUS自動ワークステーションは、BTV診断の全血サンプルからの核酸精製を自動化することができます。本アプリケーションノートでご紹介した自動化抽出プロトコールは、手作業での抽出プロトコールとほぼ同じ感度を示し、約 2時間で 92サンプルを処理できます。自動化プロトコールは反復性／再現性に優れ、クロスコンタミネーションを起こす傾向は認められませんでした。最後に、手作業および自動化による抽出プロトコールの比較解析を行った結果、両プロトコールは本質的に同じ結果をもたらし、互換性があることが示されました。

参考資料1. Bland J.M., and Altman, D.G., 1995. Comparing methods

of measurement: why plotting difference against standard method is misleading. Lancet, 1085-1087.

2. MacLachlan, N.J., 1994. The pathogenesis and immunology of bluetongue virus infection of ruminants. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 17: 197-206.

3. Mertens, P.P., Diprose, J., Maan, S., Singh, K.P., Attoui, H., Samuel, A.R., 2004. Bluetongue virus replication, molecular and structural biology. Vet. Ital., 40: 426-437.

4. Passing, H., and Bablok, W., 1983. A new biometrical pro-cedure for testing the equality of measurements from two different analytical methods. Application of linear regres-sion procedures for method comparison studies in Clinical Chemistry, Part I. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 21: 709-720.

Samples (log10 TCID50 ml-1) Mean Intrarun SDResults (Ct-value)

interrun SD Total SD Total C V (%)

7.05 17.89 0.53 0.73 0.80 4.47

6.05 21.66 0.53 0.62 0.76 3.50

5.05 24.96 0.40 0.74 0.73 2.94

4.05 28.18 0.46 0.42 0.56 1.99

3.05 31.47 0.40 0.33 0.46 1.47

2.05 34.97 0.50 0.77 0.81 2.31

1.05 39.82 3.53 1.36 3.57 8.96

0.05 43.46 2.06 1.93 3.17 7.29

表 3. 自動化抽出プロトコールにおけるラン内およびラン間のばらつき

5. Toussaint, J.F., Vandenbussche, F., Mast, J., De Meester, L., Goris, N., Van Dessel, W., Vanopdenbosche, E., Kerkhofs, P., Zientara, S., Sailleau, C., Czaplicki, G., Depoorter, G., Dochy, J. M., De Clercq, K., 2006. Bluetongue in northern Europe. Vet. Rec., 159: 327.

6. Vandenbussche, F., Vanbinst T., Verheyden B., Van Dessel W., Demeestere L., Houdart P., Bertels G., Praet N., Berkvens D., Mintiens K., Goris N., De Clercq K., 2008. Evaluation of antibody-ELISA and real-time RT-PCR for the diagnosis and profiling of bluetongue virus serotype 8 dur-ing the epidemic in Belgium in 2006. Vet. Microbiol., 129: 15-27.

7. Verwoerd, D.E., 2004. Bluetongue. Infectious diseases of livestock. T.R.C. Coetzer J.A. Cape Town, Oxford University Press: 1201-1220.

8. Wilson A, Carpenter S, Gloster J, Mellor P., 2007. Re-emer-gence of bluetongue in northern Europe in 2007. Vet. Rec., 161: 487-489.

本レポートは以下を日本語訳したものです。“Automated extraction of viral RNA from blood samples for veterinary diagnos-tics using the JANUS Automated Workstation”, Application Note, 008752_01（2009）.

008752_JPN_01 © 2014　PerkinElmer Japan Co., Ltd. June 2014

＊記載されている製品の名称、仕様や外観については予告なしに変更される場合がありますので、あらかじめご了承ください。＊記載の会社名および商品名は、各社の商標または商標登録です。＊本カタログに記載されているすべての製品は、試験研究目的でのみご使用いただけます。

株式会社パーキンエルマージャパンwww.perkinelmer.co.jp

ライフサイエンス事業部本　　社 〒240-0005 横浜市保土ケ谷区神戸町 134

横浜ビジネスパーク テクニカルセンター 4F TEL.（045）339-5862 FAX.（045）339-5872

大阪支社 〒564-0051 大阪府吹田市豊津町 5-3 TEL.（06）6386-1771 FAX.（06）6386-6401

東京営業所 〒101-0024 東京都千代田区神田和泉町 1-7-17 CTK ビル 5F TEL.（03）3866-2647 FAX.（03）3866-2652

九州営業所 〒812-0013 福岡市博多区博多駅東 1-12-6 花村ビル 2F TEL.（092）474-2311 FAX.（092）473-8353