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Table des matières i

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

UNIVERSITE DE TOLIARA

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FACULTE DES SCIENCES D’ANTANANARIVO

(DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE)

INSTITUT HALIEUTIQUE ET DES SCIENCES MARINES

THESE DE DOCTORAT

EN

BIOCHIMIE

Présentée par

RAHERINIAINA Christian Edmond

Maître ès Sciences

Soutenu le 23 mars 2004 devant la Commission d’examen composée de :

Président : Professeur RANAIVOSON Eulalie

Rapporteur : Professeur JEANNODA Victor

Examinateurs :

Professeur RANDRIANASOLO Olivier J. B.

Professeur RALISON Charlotte

Docteur RABENEVANANA MAN WAI

ETUDES CHIMIQUE ET TOXICOLOGIQUE DU PRINCIPE

ICHTYOTOXIQUE DE EUPHORBIA LARO (EUPHORBIACEAE).

IMPACTS DE LA PECHE AU LARO

Table des matières ii

REMERCIEMENTS Le présent travail est le fruit d’une étroite collaboration entre l’Institut Halieutique et des Sciences Marines (IH.SM) de l’Université de Toliara et le Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée, Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo. Il s’agit d’un mini-projet de recherche qui a bénéficié d’un financement de la Direction de Recherches Universitaires de l’ex-MINESUP sous forme de Contrat Programme de recherche (vague 2000).

Les diverses enquêtes (ethnobotaniques et socio-économiques) et la collecte des échantillons ont été réalisées dans les régions littorales de la Commune rurale de Manombo Sud, Toliara, avec la contribution des autorités locales (la Sous-préfecture de Toliara II, la Mairie, la Gendarmerie). Les travaux de recherche ont été effectués essentiellement dans :

• le Laboratoire de Toxicologie du Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée, Faculté des Sciences, Université d’Antananarivo ;

• le Laboratoire d’Algologie et Aqualab de l’IH.SM, Université de Toliara.

Des expériences plus spécifiques ont été réalisées dans des laboratoires partenaires dont : • le Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement du CNRE ; • le Laboratoire de Cancérologie de l’IMRA ; • le Laboratoire Central d’Anatomie Pathologie du CHU Joseph Ravoahangy

Andrianavalona.

Je voudrais exprimer ma profonde reconnaissance à Monsieur le Professeur JEANNODA Victor, Chef du Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée, Faculté des Sciences, Université d’Antananarivo, encadreur de mon stage et rapporteur de cette thèse, pour m’avoir accueilli dans le laboratoire de Toxicologie. Malgré ses responsabilités, il m’a toujours soutenu et dirigé en partageant son expérience en matière de Biochimie et de Toxicologie durant la réalisation de mes travaux de recherche.

J’adresse mes plus vifs et sincères remerciements à Monsieur le Docteur RABENEVANANA MAN WAI, Directeur de l’IH.SM, Université de Toliara, qui m’a proposé ce thème de recherche. Malgré ses nombreuses occupations, il a pu me consacrer du temps pour me faire bénéficier de ses compétences en matière de Pêche et de Sciences Marines et il a pu se rendre disponible pour faire partie du jury.

Que Madame le Docteur RAKOTO-RANOROMALALA Danielle A. Doll, Maître de Conférences à la Faculté des Sciences, Université d’Antananarivo, trouve ici l’expression de mes remerciements les plus sincères pour son aide, ses encouragements, les conseils et le soutien qu’elle m’a prodigués tout au long de mes travaux aussi bien sur terrain qu’au Laboratoire.

Table des matières iii

Je tiens à adresser ma profonde reconnaissance à Madame le Professeur

RANAIVOSON Eulalie, qui, malgré ses lourdes tâches, me fait le grand honneur de présider le jury de cette thèse. Que Madame le Professeur RALISON Charlotte et Monsieur le Professeur

RANDRIANASOLO Olivier J. B. trouvent ici l’expression de ma reconnaissance pour avoir bien voulu accepter de siéger parmi les membres du jury, malgré leurs multiples obligations.

Mes plus vifs remerciements s’adressent à :

• Messieurs le Docteur RALIJAONA Christian et le Docteur MARA Edouard

REMANEVY, Maîtres de Conférences à l’IH.SM, Université de Toliara, pour leurs précieux encouragements, conseils et soutien;

• Madame le Docteur RAVELO VOLOLONAVALONA, Maître de Conférences à

l’IH.SM, Université de Toliara, qui m’a épaulé durant l’étude de toxicité sur les animaux marins ;

• Madame le Professeur RATSIMAMANGA, qui m’a autorisé avec bienveillance à

réaliser une partie de mes travaux dans son établissement (IMRA) ;

• Monsieur le Docteur RAJAONARISON J. F., Responsable du Laboratoire de Cancérologie de l’IMRA, qui m’a guidé et soutenu lors des tests de cytotoxicité sur les cellules cancéreuses ;

• Monsieur le Docteur RAMAROSON A. L., qui m’a autorisé à réaliser la partie

microbiologique de ce travail dans le Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement du CNRE ;

• Monsieur LOPE J. C. pour l’aide qu’il m’a apporté durant l’étude sur les planctons ;

• La COUT (Cellule des Océanographes de l’Université de Toliara), qui m’a beaucoup

aidé à mener à bien les travaux sur Pêche et Sciences Marines de nos travaux ;

• Monsieur NOMERY H., Maire de la Commune Rurale de Manombo Sud Toliara, qui m’a autorisé à franchir les circonscriptions de la dite Commune et m’a soutenu et encouragé durant mes travaux sur terrain ;

• Les Présidents de 6 Fokontany : Andrevo, Tsihake, Fitsitike, Manombo I, Manombo II

et Fiherenamasay, qui m’ont facilité la tâche.

Je tiens à remercier les équipes des Laboratoires dans lesquels mes travaux ont été effectués ainsi que tous ceux qui ont contribué, de près ou de loin, à la réalisation de cette thèse.

Table des matières iv

A mon épouse Farah,

Ton amour, ta patience et ta compréhension m’ont beaucoup soutenu

durant l’élaboration de ce travail.

A mes fils Dimby et Telly,

Papa vous donne une belle image dans la voie des études.

A ma grand-mère de Vangaindrano.

A mes parents.

A toute la famille.

A tous ceux qui me sont chers.

Table des matières v

TABLE

DES MATIERES

Table des matières vi

TABLE DES MATIERES REMERCIEMENTS LISTE DES ABREVIATIONS.................................................................................... GLOSSAIRE ................................................................................................................ LISTE DES FIGURES................................................................................................. LISTE DES TABLEAUX ............................................................................................ RESUME ................................................................................................................ ABSTRACT ................................................................................................................ INTRODUCTION GENERALE................................................................................. GENERALITES SUR LES PLANTES ICHTYOTOXIQUES................................ 1. Les plantes ichtyotoxiques ...................................................................................... 2. Les principes ichtyotoxiques................................................................................... 3. Les propriétés toxicologiques et pharmacologiques des diterpènes toxiques des euphorbes ................................................................................................................

PREMIERE PARTIE : ISOLEMENT ET CARACTERISATION CHIMIQUE

DU PRINCIPE ICHTYOTOXIQUE DU LATEX DE EUPHORBIA LARO 1. Introduction ........................................................................................................... 2. Matériels ................................................................................................................ 2.1. Matériel végétal................................................................................................. 2.1.1. Description botanique ................................................................................. 2.1.2. Répartition géographique ............................................................................ 2.1.3. Récolte du latex........................................................................................... 2.2. Produits chimiques ............................................................................................ 3. Méthodes ................................................................................................................ 3.1. Méthode d’extraction ........................................................................................ 3.1.1. Préparation du latex..................................................................................... 3.1.2. Extraction proprement dite.......................................................................... 3.2. Méthodes de purification................................................................................... 3.2.1. Fractionnement liquide-liquide ................................................................... 3.2.2. Précipitation par l’acétate neutre de plomb................................................. 3.2.3. Filtration sur charbon actif .......................................................................... 3.2.4. Chromatographie sur gel de silice...............................................................

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3.2.5. Chromatographie sur gel Sephadex G 25.................................................... 3.2.6. Ultrafiltration sur membrane à perméabilité sélective ................................ 3.3. Méthode de concentration et d’évaporation...................................................... 3.4. Méthodes analytiques........................................................................................ 3.4.1. Chromatographie sur couche mince............................................................ 3.4.2. Réactions de détection des familles chimiques ........................................... 3.4.2.1. Les alcaloïdes ........................................................................................ 3.4.2.1.1. Test préliminaire ............................................................................. 3.4.2.1.2. Test de confirmation........................................................................ 3.4.2.2. Les flavonoïdes et les leucoanthocyanes............................................... 3.4.2.2.1. Test de WILSTATER...................................................................... 3.4.2.2.2. Test de BATH-SMITH.................................................................... 3.4.2.3. Les tanins et les polyphénols................................................................. 3.4.2.3.1. Test à la gélatine.............................................................................. 3.4.2.3.2. Test à la gélatine salée..................................................................... 3.4.2.3.3. Test au chlorure ferrique ................................................................. 3.4.2.4. Les anthraquinones................................................................................ 3.4.2.5. Les saponines ........................................................................................ 3.4.2.6. Les stérols et les triterpènes .................................................................. 3.4.2.6.1. Test de LIEBERMANN-BURCHARD........................................... 3.4.2.6.2. Test de SALKOWSKI..................................................................... 3.4.2.7. Les lactones insaturés : test de KEDDE................................................ 3.4.2.8. Les desoxyoses : test de KELLER-KILIANI........................................ 4. Résultats ................................................................................................................ 4.1. Isolement du principe ichtyotoxique ................................................................. 4.1.1 Extraction ..................................................................................................... 4.1.1.1.Extraction aqueuse ................................................................................. 4.1.1.2. Extraction hydroalcoolique ................................................................... 4.1.2. Purification .................................................................................................. 4.1.2.1. Fractionnement par l’acétate d’éthyle ................................................... 4.1.2.2. Chromatographie sur gel de silice......................................................... 4.1.2.3. Chromatographie sur gel Sephadex G 25.............................................. 4.2. Contrôle de pureté de l’extrait E3...................................................................... 4.3. Rendement de purification ................................................................................ 4.4. Caractérisation chimique de la toxine ............................................................... 4.4.1. Propriétés physico-chimiques ..................................................................... 4.4.2. Nature chimique .......................................................................................... 5. Discussion et conclusion........................................................................................

DEUXIEME PARTIE : ETUDE DES PROPRIETES TOXICOLOGIQUES

1. Introduction ........................................................................................................... 2. Matériels ................................................................................................................ 2.1. Les organismes d’expérimentation.................................................................... 2.1.1. Les animaux ................................................................................................

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2.1.2. Les végétaux................................................................................................ 2.1.3. Le plancton.................................................................................................. 2.1.4. Les cellules et les microorganismes ............................................................ 2.2. Milieux de culture ............................................................................................. 2.2.1. Milieux utilisés pour la culture de cellules P388N ..................................... 2.2.2. Milieux utilisés pour la culture de microorganismes .................................. 3. Méthodes ................................................................................................................ 3.1. Méthode de stérilisation .................................................................................... 3.2. Méthodes d’étude des effets de la toxine sur les poissons ................................ 3.2.1. Test de toxicité ............................................................................................ 3.2.2. Détermination de la CL 50 .......................................................................... 3.3. Méthodes d’étude des effets de la toxine sur divers organismes marins .......... 3.3.1. Chez les animaux nageurs ........................................................................... 3.3.2. Chez Artemia............................................................................................... 3.3.2.1. Préparation des larves ........................................................................... 3.3.2.2. Test de toxicité ...................................................................................... 3.3.3. Chez les végétaux........................................................................................ 3.3.4. Chez le plancton .......................................................................................... 3.4. Méthodes d’étude des effets de la toxine sur la souris...................................... 3.4.1. Estimation de la toxicité.............................................................................. 3.4.2. Détermination de la DL 50 (24 h) ............................................................... 3.4.3. Examens anatomopathologiques ................................................................. 3.4.3.1. Prélèvement et fixation.......................................................................... 3.4.3.2. Inclusion ................................................................................................ 3.4.3.3. Microtomie et étalement de coupe ........................................................ 3.4.3.4. Coloration des coupes et montages des lames ...................................... 3.5. Méthodes d’étude des effets de la toxine sur les cellules cancéreuses ............. 3.5.1. Culture cellulaire ......................................................................................... 3.5.1.1. A partir des cellules cryocongelées....................................................... 3.5.1.2. A partir des cellules en culture.............................................................. 3.5.2. Test de cytotoxicité ..................................................................................... 3.5.3. Recherche du pourcentage d’inhibition et évaluation de la CI 50 .............. 3.6. Méthodes d’étude des propriétés hémolytiques de la toxine ............................ 3.6.1. Préparation de la suspension des hématies de mouton................................ 3.6.2. Test hémolytique ......................................................................................... 3.6.3. Dosage de l’activité hémolytique................................................................ 3.7. Méthodes d’étude des effets de la toxine sur les microorganismes .................. 3.7.1. Méthode par diffusion : méthode des disques............................................. 3.7.2. Méthode d’étude en milieu liquide ............................................................. 3.7.2.1. Détermination de la CMI....................................................................... 3.7.2.2. Détermination de la CMB ..................................................................... 4. Résultats ................................................................................................................ 4.1. Effets de l’eupholarine sur les poissons ............................................................ 4.1.1. Symptômes d’intoxication........................................................................... 4.1.2. Détermination de la CL 50 .......................................................................... 4.1.2.1. Chez les poissons d’eau douce : Cyprinus carpio.................................

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4.1.2.2. Chez les poissons d’eau de mer : Terapon jarbua ................................ 4.2. Effets de l’eupholarine sur divers organismes marins ...................................... 4.2.1. Effets sur les animaux ................................................................................. 4.2.1.1. Chez les holothuries .............................................................................. 4.2.1.1.1. Symptômes d’intoxication............................................................... 4.2.1.1.2. Détermination de la CL 50 .............................................................. 4.2.1.2. Chez les coquillages .............................................................................. 4.2.1.3. Chez les oursins et les ophiures ............................................................ 4.2.1.4. Chez les crabes et les crevettes ............................................................. 4.2.1.5. Effets sur les larves d’Artemia .............................................................. 4.2.2. Effets sur les végétaux................................................................................. 4.2.3. Effets sur le plancton................................................................................... 4.3. Effets de l’eupholarine sur la souris.................................................................. 4.3.1. Symptômes d’intoxication........................................................................... 4.3.2. Détermination de la DL 50 (24 h) ............................................................... 4.3.3. Lésions anatomopathologiques ................................................................... 4.4. Effets de l’eupholarine sur les cellules cancéreuses ......................................... 4.5. Effets de l’eupholarine sur les hématies de mouton.......................................... 4.5.1. Test hémolytique ......................................................................................... 4.5.2. Dosage de l’activité hémolytique................................................................ 4.6. Effets de l’eupholarine sur les microorganismes .............................................. 4.6.1. Spectre d’activité de l’eupholarine.............................................................. 4.6.2. Détermination de la CMI et de la CMB ...................................................... 5. Discussion et conclusion...........................................................................................

TROISIEME PARTIE : ETUDE DES IMPACTS DE LA PECHE AU LARO 1. Introduction ........................................................................................................... 2. Méthodologie.......................................................................................................... 2.1. Zones d’étude .................................................................................................... 2.2. Types d’information recherchées ...................................................................... 2.3. Techniques de collecte et sources d’information .............................................. 3. Résultats ................................................................................................................ 3.1. Importance d la pêche au laro ........................................................................... 3.1.1. Lieu de pêche .............................................................................................. 3.1.2. Technique de la pêche au laro..................................................................... 3.1.3. Commercialisation ...................................................................................... 3.2. Impacts de la pêche au laro sur la santé............................................................ 3.2.1. Sur la santé des pêcheurs............................................................................. 3.2.2. Sur la santé des consommateurs de poissons pêchés au laro ...................... 3.2.2.1. Fréquence de la consommation ............................................................. 3.2.2.2. Symptômes d’intoxication..................................................................... 3.2.3. Maladies courantes dans la zones d’étude .................................................. 3.3. Impacts de la pêche au laro sur l’activité de pêche .......................................... 3.3.1. Sur les ressources halieutiques exploitables ...............................................

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3.3.2. Sur les opérateurs œuvrant dans la pêche ................................................... 3.4. Impacts de la pêche au laro sur l’environnement marin ................................... 3.4.1. Effets du poison sur les organismes marins ................................................ 3.4.2. Effets sur les récifs coralliens ..................................................................... 3.5. Mesures prises dans les zones d’étude face à la pêche au laro ......................... 3.5.1. Au niveau de l’Etat...................................................................................... 3.5.1.1. Politique générale en matière de pêche ................................................. 3.5.1.2. Mode de gestion des activités de pêche sur le récif .............................. 3.5.2. Au niveau des autorités locales ................................................................... 3.5.2.1. Mairie .................................................................................................... 3.5.2.2. Brigade de la Gendarmerie Nationale ................................................... 3.5.3. Au niveau des ONGs................................................................................... 3.5.4. Situation actuelle de la pêche au laro ......................................................... 4. Discussion et conclusion........................................................................................... CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ................................................ ANNEXES ................................................................................................................ BIBLIOGRAPHIE .......................................................................................................

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ABREVIATIONS

ANP : Acétate Neutre de Plomb BAE : Butanol / Acide acétique / Eau distillée BFE : Butanol / acide Formique / Eau distillée C : Concentration CCM : Chromatographie sur couche mince CH 50 : Concentration hémolytique à 50% CI 50 : Concentration inhibitrice à 50% CL 50 : Concentration létale à 50% CMB : Concentration minimale bactéricide CME : Chloroforme / Méthanol / Eau distillée CMI : Concentration minimale inhibitrice C.N.R.E. : Centre National pour la Recherche sur l’Environnement CSB : Centre de santé de base Da : Dalton DL 50 : Dose létale à 50% D.O : Densité Optique EB : Extrait Brut EMC : Environnement marin et côtier ICAM : Intoxication par consommation des animaux marins IH.SM : Institut Halieutique et des Sciences Marines IMRA : Institut Malgache de Recherche Appliquée i.p : intra-péritonéale IPM : Institut Pasteur de Madagascar LME : Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement ONG : organisme non gouvernemental PAE : plan d’action environnemental PM : poids moléculaire PNE : programme national pour l’environnement p/p : poids par poids p/v : poids par volume q.s.p.: quantité suffisante pour Rf : référence frontale RPMI : Roswell Park Medium Institut SVF : sérum de veau fœtal tr/min : tour par minute UV : ultraviolet v/v: volume à volume

xii

GLOSSAIRE Antibiotique : substance capable d’empêcher le développement des microorganismes

Asthénie : fatigue, manque de force

Ataxie : incoordination des mouvements volontaires d’origine neurologique

Bactéricide : qui tue les bactéries

Bactériostatique : qui arrête la prolifération des bactéries sans les tuer

Benthique : vivant en liaison avec le fond de l’eau (opp. Pélagique)

Crises convulsives : mouvements incontrôlés du corps dus à des contractions involontaires et

saccadées des muscles

Dina : pactes sociaux ayant une forme juridique

Dyspnée : difficulté à respirer

Exophtalmie : saillie anormale des globes oculaires

Fidobohana : engin (en bois) avec lequel les pêcheurs tapent sur la surface des eaux pour

pousser les poissons vers le filet

Fongicide : qui tue les champignons

Fongiostatique : qui arrête la prolifération des champignons sans les tuer

Hyperpnée : augmentation de la fréquence respiratoire

Ichtyotoxique : toxique pour les poissons

Paresthésie buccale ou péribuccale : fourmillements de la bouche et son pourtour

Piloérection : érection des poils

Phytotoxine : toxine d’origine végétale

Prurit : démangeaisons

Tandeo : appellation locale (dans la Commune de Manombo Sud) des dépressions de taille

variée sur le récif corallien

Tehake (ou rano maike) : saison de vives eaux

Généralités sur les plantes ichtyotoxiques 5

LISTE DES FIGURES

Figues Pages

Figure 1 : Euphorbia laro (rameaux et plante).

Figure 2 : technique de collecte du latex de Euphorbia laro.

Figure 3 : Dispositif pour la filtration sur charbon actif.

Figure 4 : Chromatogrammes des différentes fractions obtenues lors de la

chromatographie sur gel de silice de l’extrait E1.

Figure 5 : Chromatogrammes des différentes fractions obtenues lors de la

chromatographie sur gel Sephadex G25 de l’extrait E2.

Figure 6 : Chromatogrammes des divers extraits obtenus lors des différentes étapes

de purification.

Figure 7 : Schéma recaputilatif des différentes étapes d’extraction et de

purification du principe ichtyotoxique du latex de Euphorbia laro.

Figure 8 : Chromatogrammes de l’extrait E3 :migration dans différents systèmes de

solvants.

Figure 9 : Les animaux marins testés Figure 10 : Détermination de la DL 50 (24 h) par la méthode des totaux cumulatifs de REED et MUENCH (1938).

Figure 11 : Lésions histopathologiques au niveau du cœur.

Figure 12 : Lésions histopathologiques au niveau du foie.

Figure 13 : Lésions histopathologiques au niveau des reins.

Figure 14 : Lésions histopathologiques au niveau des intestins.

Figure 15 : Lésions histopathologiques au niveau des poumons.

Figure 16 : Village de pêcheurs.

Figure 17 : Enquêtes auprès des villageois.

Figure 18 : Le tandeo (à marée haute et à marée basse de vives eaux).

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LISTE DES TABLEAUX

Tableaux Pages

Tableau 1 : Des exemples de plantes ichtyotoxiques. Tableau 2 : Groupes de fractions obtenus après chromatographie sur gel de silice de l’extrait E1. Tableau 3 : Groupes de fractions obtenus après chromatographie sur gel Sephadex G 25 de l’extrait E2.

Tableau 4 : Evolution de l’homogénéité de divers extraits obtenus lors des

différentes étapes de purification du principe ichtyotoxique de Euphorbia laro. Tableau 5 : Effets des extraits obtenus après ultrafiltration sur les alevins de carpe. Tableau 6 : Résultats du criblage phytochimique de l’extrait E3. Tableau 7 : Liste des poissons de récif testés. Tableau 8 : Liste des coquillages testés. Tableau 9 : Liste des oursins et des ophiures testés. Tableau 10 : Liste des algues marines testées. Tableau 11 : Liste des planctons testés. Tableau 12 : Liste des microorganismes utilisés comme germes tests. Tableau 13 : Préparation des milieux utilisés pour le test de toxicité sur Artemia. Tableau 14 : Préparation des tubes à essai servant le test de toxicité sur le plancton. Tableau 15 : Répartition des réactifs et des hématies au cours du test hémolytique. Tableau 16 : Effet de l’eupholarine sur les alevins de Cyprinus carpio (Poissons d’eau douce). Tableau 17 : Effet de l’eupholarine sur Terapon jarbua (Poissons d’eau de mer). Tableau 18 : Effet de l’eupholarine sur les juvéniles de Holothuria scabra. Tableau 19 : Résultats expérimentaux dans la détermination de la DL 50 (24 h). Tableau 20 : Détermination de la DL 50 (24 h) par la méthode de régression linéaire.

Tableau 21 : Totaux cumulatifs des survivants et des morts en fonction de la dose. Tableau 22 : Lésions histopathologiques observés chez la souris ayant reçu une dose de 60 mg/kg en EB. Tableau 23 : Lésions histopathologiques observés chez la souris ayant reçu une dose de 48 mg/kg en eupholarine. Tableau 24 : Effet de l’EB et de l’eupholarine sur les cellules cancéreuses P388N.

Tableau 25 : Effet de l’EB et de l’eupholarine sur les hématies de mouton. Tableau 26 : Résultats de la lecture des DO pour les témoins. Tableau 27 : Effets de l’eupholarine sur les hématies de mouton. Tableau 28 : Effets de l’eupholarine (30 µg/disque) sur les cultures de bactéries et de champignon en milieu solide. Tableau 29 : Valeurs des CMI et CMB de l’eupholarine sur les germes sensibles. Tableau 30 : Informations sur les zones d’étude.

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RESUME

Les plantes à propriétés ichtyotoxiques, plus connues sous le nom vernaculaire malgache « famamo », sont abondantes à Madagascar. Euphorbia laro, une Euphorbiacée

endémique, est largement utilisée sur le littoral sud-ouest de la Province de Toliara pour pêcher les poissons sur les récifs.

Après vérification du pouvoir ichtyotoxique du latex de la plante, le principe actif en a été extrait à froid par une solution hydroalcoolique (80%) et obtenu à l’état pur par un procédé

de purification comprenant un fractionnement liquide-liquide par l’acétate d’éthyle et deux chromatographies dont l’une sur gel de silice et l’autre sur gel Sephadex G25. Ce principe

actif, appelé Eupholarine, de faible poids moléculaire, soluble dans l’eau et les solvants organiques et absorbant dans l’ultra-violet, possède des caractéristiques des terpènes.

Eupholarine est très toxique non seulement pour les poissons - sa CL50 chez Terapon jarbua (poissons de récif) est de 1,15 µg/ml – mais aussi pour divers organismes marins dont les holothuries, les coquillages, les échinodermes et les planctons. Administrée par voie intra-péritonéale à la souris, elle provoque des symptômes qui suggèrent une atteinte des systèmes neveux et cardio-vasculaire et des lésions histopathologiques au niveau de plusieurs organes. Par ailleurs, elle possède une activité hémolytique et des propriétés anti-microbiennes . Ses effets à long terme sur l’homme, les autres organismes vivants et leur environnement sont

encore mal connus. La pêche par empoisonnement utilisant le latex de Euphorbia laro est interdite par les

pactes sociaux (Dina) et les textes réglementaires en vigueur. La manipulation du latex pour la confection des appâts et la consommation des poissons pêchés au laro nuisent à la santé des

pêcheurs et celle de leurs ménages. Par ailleurs, à terme, la pratique fréquente de cette technique de pêche non sélective risque de devenir un facteur important dans la dégradation

des écosystèmes récifaux et dans la perte de la biodiversité et pourrait compromettre le développement du secteur pêche dans la région.

Mots-clés : Euphorbia laro, Euphorbiacées, latex, principe toxique, Eupholarine, terpènes, ichtyotoxique, CL50, DL50, propriétés anti-microbiennes, intoxication, famamo, pêche au laro, pêche par empoisonnement, tandeo, environnement marin, récif corallien, impacts,

Toliara-Madagascar. Directeur de thèse: Professeur Jeannoda Victor


ABSTRACT Ichtyotoxic plants, usually known by their vernacular name of « famamo », are

abundant in Madagascar. Euphorbia laro, an endemic Euphorb to Madagascar is one of those

plants. Its latex called laro and widely used in the south-western coast of the Toliara Province

for fishing on coral reef.

After checking the ichtyotoxic properties of the plant latex, the active principle was

extracted with hydroalcoolic solution (80%) and purified by three steps procedure including

an ethyl-acetate fractionation, a chromatography on silicagel and a gel filtration on Sephadex

G25. The active principle, named Eupholarine, has low molecular weight. It is soluble in

water and organic solvents, absorbs UV lights and exhibits some terpens characteristics.

Eupholarine is highly toxic, not only to fishes – its LC50 on Terapon jarbua (coral

reef fish) is 1,15 µg/ml – but also to various sea organisms including Holothuria, Shellfishes,

Echinoderms and planktons. When intra-peritoneally administrated in mouse, it provokes

symptoms that suggest an affection of the nervous and cardio-vascular systems and it causes

histopathological lesions in several organs of this animal. In addition, it has haemolytic and

antimicrobial activities. Its long term effects on humans and other living organisms and their

environment are not well known yet.

Fishing technique using Euphorbia laro as poison is prohibited by social contract

(Dina) and by laws. Handling latex when making up the baits and consumption of fishes

caught with laro are harmful to fishers and their households health. The frequent use of this

non selective fishing technique may become an important factor of coral reef ecosystem

degradation and biodiversity loss. Moreover, it compromises the local fishery sector

development.

Key-words : Euphorbia laro, Euphorbiaceae, latex, toxic principle, Eupholarine, terpens,

ichtyotoxic, fish poisoning, LC50, LD450, anti-microbial properties, intoxication, famamo,

marine environment, coral reef, impacts, Toliara-Madagascar

Advisor : Professor Victor Jeannoda


INTRODUCTION

GENERALE


La connaissance et les premières utilisations empiriques des propriétés des

plantes et animaux toxiques remontent à des temps immémoriaux. L’homme,

conscient des dangers auxquels il s’expose en manipulant les extraits de ces

organismes, a toujours su en tirer profit. Les exemples sont nombreux, mais nous n’en

citerons que quelques uns des plus connus :

• les plantes à curare comme Chondrodenron tomentosum et Chondrodendron

candicans (Menispermacées) sont utilisées par les Indiens d’Amérique pour

confectionner des flèches empoisonnées pour la chasse ;

• les plantes à roténone dont différentes espèces de Derris, de Lococarpus et de

Tephrosia sont employées comme poisons de pêche ;

• les plantes utilisées comme poisons d’épreuve (pour décider de la culpabilité ou de

l’innocence d’un suspect) sont nombreuses surtout à Madagascar dont les plus

connues sont Cerbera venenifera (Apocynacées) et Cryptostegia madagascariensis

(Asclepiadacées) ;

• les venins de certaines espèces animales sont employés pour soigner différentes

maladies. On peut mentionner comme exemples l’utilisation des venins de crapaud

dans le traitement des maladies de cœur, de crotale dans celui de l’épilepsie et

d’abeille pour soigner les rhumatismes, les douleurs musculaires et articulaires ;

• l’usage à des fins homicides n’est pas rare.

Malgré l’ancienneté de la connaissance des substances toxiques, la Toxicologie, c’est-

à-dire la science des poisons, n’a que lentement évolué jusqu’au XIX siècle. Grâce aux progrès de diverses disciplines scientifiques notamment la Chimie, la Physique, la Biochimie, la Médecine, la Pharmacologie…, les connaissances sur les toxines naturelles se sont améliorées. Ainsi, de nombreuses toxines de diverses sources ont été obtenues à l’état pur et caractérisées chimiquement.

La multiplicité, la diversité ainsi que la spécificité de leurs actions pharmacologiques et de leurs modes d’action ont diversifié leurs utilisations. Certaines, par exemple, constituent des outils dans l’exploration et la compréhension de divers phénomènes biologiques complexes. Ainsi :

• La toxine diphtérique (COLLIER, 1977), diverses toxines bactériennes comme la


puromycine, le chloramphénicol, la streptomycine (LENHINGER, 1985) et des

toxines de plante telles l’abrine et la ricine ont joué des rôles très importants dans

l’élucidation de la voie de biosynthèse des protéines et de son mécanisme de

régulation ;

• La toxine cholérique (BENETT et CUATRECASAS, 1977) a permis d’élucider les

divers effets biologiques de l’AMP cyclique et le mécanisme de régulation de

l’adénylate cyclase ;

• La toxine tétanique (BIZZINI, 1977) a été utilisée dans l’exploration du

fonctionnement du système nerveux central ;

• La tétrodotoxine (MAILMAN, 1980), une toxine bactérienne, est la substance la plus

largement utilisée pour le blocage des canaux sodiques ;

• Diverses toxines dont la colicine E3 (HOLLAND, 1977 ; STEPHEN et PETROWSKI,

1983), la toxine diphtérique et les toxines cytolytiques (ALOUF, 1977) ont beaucoup

aidé dans l’étude de la structure et du fonctionnement de la membrane cellulaire ;

• La roténone et l’antimycine A (MORELAND, 1980) ont contribué à la compréhension

de la structure et du fonctionnement de la chaîne respiratoire ;

• Le curare et la nicotine (MAIN, 1980), des poisons végétaux puissants, ont conduit à

la découverte de récepteurs synaptiques à la jonction neuromusculaire des nerfs

somatiques ;

• Les esters de phorbol développent un grand nombre d’effets cellulaires et

biochimiques. Ainsi, le TPA (12-O-tétradécanoyl phorbol-13-acétate) active la

protéine kinase C en se substituant au diacylglycérol endogène (ALCARAZ et RIOS,

1991).

D’autres sont utilisées à des fins thérapeutiques. Ainsi, par exemple :

• La morphine est employée pour calmer les douleurs atroces des cancers en phase


terminale grâce à ses propriétés analgésiques puissantes ;

• L’atropine, douée de propriétés vagolytiques, est surtout utilisée comme

antispasmodique, dilatateur de la pupille (GOLDSTEIN et coll., 1974) ;

• La digitaline est employée comme tonique cardiaque ;

• Les antibiotiques sont utilisés pour traiter différentes maladies infectieuses.

Devant l’intérêt croissant des toxines, la recherche et la caractérisation des nouvelles

toxines sur les plans chimique et pharmacologique constituent une des principales orientations de la Toxicologie moderne. Le Laboratoire de Toxicologie du Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée, Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo, a étudié plusieurs toxines naturelles provenant de plantes endémiques de Madagascar. On peut citer entre autres les plantes du genre Albizia, Fabacées (ANDRIANTSOA, 1983 ; RAHARISOA, 1999 ; RAHERINIAINA, 1999 ; RAJEMIARIMOELISOA, 1996, 2000 ; RAMAMONJISOA, 1998 ; RANDRIANARIVO, 1996, 2003), Tachiadenus longiflorus, Gentianacées (RAKOTO-RANOROMALALA,1989), Boletus affinis, Boletacées (RAZANAMPARANY, 1987), Croton mongue, Euphorbiacées (RALISON, 1987), diverses espèces de Connaracées (JEANNODA, 1986 ; JEANNODA et coll., 1983, 1984, 1985 ; RAKOTO-RANOROMALALA, 1984).

Parmi les nombreux usages des toxines, nous nous sommes intéressés particulièrement à leurs utilisations dans la pêche. Cette activité est connue sous l’appellation de « pêche par empoisonnement ». C’est une technique de pêche très pratiquée depuis des temps anciens dans de nombreuses régions du monde dont Madagascar pour faciliter la capture des poissons. Par rapport aux autres techniques de pêche existantes, elle est facile à mettre en œuvre et est rentable. Il suffit aux pêcheurs de préparer les appâts ichtyotoxiques, généralement à partir d’extraits de plantes largement disponibles, et ensuite de les épandre dans l’eau. De nombreuses espèces aquacoles et marines peuvent ainsi être capturées en un temps relativement plus court.

Euphorbia laro, une Euphorbiacée malgache réputée pour ses propriétés ichtyotoxiques (LE BERBIER, 1908) constitue notre matériel d’étude. Plusieurs raisons ont justifié le choix de cette plante :

• La plante est crainte par les populations et son utilisation comme poison de pêche est

interdite par les « dina » (pactes sociaux) et par des textes réglementaires, mais à

cause de son efficacité, elle continue, malgré tout, à être utilisée dans le Sud de

Madagascar aussi bien pour la capture des poissons d’eau de mer que celle d’eau

douce;


• Il est bien connu que la famille des Euphorbiacées contient de nombreuses substances

dangereuses pour divers organismes ;

• Bien que les propriétés ichtyotoxiques de Euphorbia laro soient bien connues et que

les documents s’y rapportant soient nombreux, la chimie et les propriétés

toxicologiques des principes actifs sont encore inconnues.

Les travaux, objet de cette thèse, ont pour principaux objectifs :

• de vérifier expérimentalement les propriétés ichtyotoxiques du latex de Euphorbia

laro ;

• d’isoler le principe ichtyotoxique et de le caractériser sur le plan chimique ;

• d’étudier ses propriétés toxicologiques ;

• d’évaluer les différents impacts ainsi que les risques associés à l’utilisation du latex de

Euphorbia laro comme poison de pêche.

Ainsi, après l’introduction générale et des généralités sur les plantes ichtyotoxiques, nous décrirons dans la première partie du mémoire l’étude chimique du principe ichtyotoxique de Euphorbia laro et dans la deuxième partie l’étude des propriétés toxicologiques de la toxine. L’étude des impacts de la pêche au laro précède la conclusion générale et les perspectives.

La pêche est pratiquée en tant qu’activité de subsistance pour diverses communautés. Plusieurs techniques sont utilisées pour la réaliser. Parmi elles figure la pêche par empoisonnement utilisant des plantes à propriétés ichtyotoxiques. Bien qu’officiellement prohibée et pratiquée clandestinement, elle constitue un mode de pêche très répandu dans plusieurs pays dont Madagascar.

Dans cette partie, nous allons voir quelques données bibliographiques sur les plantes ichtyotoxiques.


GENERALITES SUR LES

PLANTES ICHTYOTOXIQUES


1. LES PLANTES ICHTYOTOXIQUES

Plusieurs familles, genres et espèces de plante sont réputés pour leurs propriétés

ichtyotoxiques. Le terme d’enivrées, dont la forme la plus ancienne est « bois à enyvrer »

(BIET, 1664 ; BARRERE, 1743), est utilisé pour couvrir l’ensemble des plantes

ichtyotoxiques. Les plantes ichtyotoxiques appartiennent à diverses familles comme les

Composées, les Loganiacées, les Lécythidacées et les Sapindacées (MORETTI et

GRENAND, 1982). Quelques exemples sont cités dans le tableau 1. A Madagascar, elles sont

essentiellement des familles des Cæsalpiniées, Euphorbiacées et Papilionacées

(RASOANAIVO et coll., 1991).

2. LES PRINCIPES ICHTYOTOXIQUES

Parmi les nombreuses espèces de plantes ichtyotoxiques connues, certaines ont

déjà fait l’objet d’études chimiques et biologiques. Ainsi, de nombreux principes

ichtyotoxiques ont été obtenus à l’état pur et caractérisés chimiquement. A titre

d’illustration, nous allons citer quelques exemples.

• Lonchocarpus renferme des roténoides voisins notamment de la roténone et la

déhydroroténone (BRAZ FILHO, 1973). La teneur en roténoides dans ce genre est

relativement faible, de 1 à 4%.

• Derris renferme de la roténone et des dérivés du type pterocarpanes (BRAZ FILHO,

1973).

• Tephrosia contient des dérivés de la roténone (BARNES et FREYRE, 1966 ;

LEFOURNIER et coll., 1980 et ELOUARD et coll., 1982) dont les plus actifs sont la

téphrosine et la dégueline (ELOUARD et coll., 1982).

Tableau 1 : Des exemples de plantes ichtyotoxiques


Famille des Cæsalpiniées

Cadia ellisiana

Cadia pedisellata Cadia rubra

Famille des Composées

Clibadium asperum Clibadium surinamensis

Clibadium sylvestris

Famille des Euphorbiacées

Cleistanthus perrieri Euphorbia enterophora

Euphorbia helioscopa Euphorbia laro Euphorbia mainty Euphorbia oncoclada Euphorbia stenoclada

Euphorbia tirucalli Phyllantus subglomeratus Savia laureola

Famille des Loganiacées

Strychnos vacacoua

Famille des Lecythidacées

Barringtonia speciosa

Famille des Papilionacées

Chadsia grevei Crotalaria coursii

Crotalaria ibityensis Derris amazonica Derris elliptica Derris pterocarpus Derris ulginosa Lonchocarpus sp. Lonchocarpus hedyosmus Lonchocarpus chrysophyllus Lonchocarpus floribindus

Lonchocarpus latifolius Lonchocarpus nicou Mundulea barclayi Mundulea monantha Mundulea panciflora Mundulea pungens Mundulea sericea Mundulea striata Mundulea suberosa Mundulea telfairii Tephrosia densiflora Tephrosia macropoda Tephrosia periculosa Tephrosia toxicana Tephrosia vogelii

Famille des Sapindacées

Paulinia

Serjania

• Paulinia et Serjania sont riches en tanins en plus des saponines. Leur activité

ichtyotoxique est due à l'association tanins-saponosides (MORETTI et GRENAND,

1982).

• Barringtonia speciosa renferme 15% de saponines (MORETTI et GRENAND, 1982).

• Clibadium renferme des principes actifs caractéristiques des Composées. Ce sont des

dérivés polyacétyléniques du type ichtyothereol (CZERSON et coll., 1979).


• Les euphorbes toxiques à feuilles parfois réduites ou nulles, sécrétant du latex

renferment des principes actifs caractéristiques. Ce sont les esters diterpéniques

toxiques du type ester de phorbol (BRUNETON, 1993).

3. LES PROPRIETES TOXICOLOGIQUES ET PHARMACOLOGIQUES

DES DITERPENES TOXIQUES DES EUPHORBES

Ces euphorbes toxiques sont connues pour leurs propriétés purgatives

violentes, leur ichtyotoxicité, leur agressivité au niveau de la peau, leur capacité à

induire des conjonctivites. Les symptômes d’intoxication causés par l’ingestion de ces

molécules toxiques apparaissent sous forme d’inflammation de la bouche, de

vomissements, de diarrhées sanguinolentes, de gastro-entérite, de troubles circulatoires

et de délire dans les cas extrêmes (KINGHORN et coll., 1989, 1991 ; BRUNETON,

1993). Le pouvoir cancérigène de ces molécules a été signalé par de nombreux auteurs

(BLUMBERG, 1980 ; BRUNETON, 1993 ; HECKER, 1981 ; EVANS et coll., 1983 ;

KINGHORN et coll., 1979, 1983, 1985, 1989, 1991 ; OPFERCKUCH et coll., 1982 ;

ROE et coll., 1961).

Parmi les esters diterpéniques toxiques, les plus étudiés sont les esters du

phorbol, en particulier le TPA (12-O-tétradécanoyl phorbol-13-acétate). En effet, de

nombreuses recherches ont été effectuées sur le phorbol. A titre d’illustration, citons

quelques résultats :

• Le TPA, un puissant promoteur de tumeurs, altère de nombreuses fonctions

membranaires (CASTAGNA, 1982).

• La stimulation de lymphocytes humains par l'acétate de phorbol (TPA) et un

ionophore calcique, A23187, induit une expression précoce de l’oncogène c-fos

suivie de l’oncogène c-myc (POMPIDOU et coll., 1986).

• NGUYEN-BA (1992), en travaillant sur l'induction de l’ornithine décarboxylase

(ODC) par le cancérigène non génotoxique TPA, rapporte que :

o L’application du TPA stimule rapidement l’ODC dans les cellules

épidermiques, l’enzyme clef de contrôle de la biosynthèse des polyamines.


Son activité est élevée dans des pathologies hyperprolifératives et

tumorales.

o Le TPA peut stimuler aussi la phospholipase A2 (PLA2), mobiliser l’acide

arachidonique membranaire et déclencher toute une cascade de réactions

enzymatiques conduisant à la synthèse des acides gras médiateurs de

l’inflammation. Ce processus se traduit par une réaction inflammatoire dans

le compartiment dermique.

o Le traitement répété par le TPA entraîne une hyperplasie de l’épiderme. A

ce stade, les cellules épidermiques deviennent très sensibles à l’action du

cancérogène. Ainsi, à 48 h d’intervalle, une seconde application du TPA

provoque une surinduction de l’ODC, toujours accompagnée d’une intense

réaction inflammatoire.

Etude chimique .... 8

PREMIERE PARTIE

ISOLEMENT ET

CARACTERISATION CHIMIQUE

DU PRINCIPE ICHTYOTOXIQUE

DE EUPHORBIA LARO


Les principes toxiques trouvés chez les Euphorbiacées sont très variés. D’après

BRUNETON (1993), plusieurs euphorbes toxiques doivent leur toxicité à des esters

diterpéniques de type tigliane, ingenane ou daphnane. En ce qui concerne Euphorbia laro,

comme nous l’avons déjà signalé plus haut (Cf. p.4), la plante n’a pas encore fait l’objet d’une

étude chimique.

Dans cette partie chimique, après avoir vérifié la toxicité des extraits bruts du latex de

la plante sur des alevins de carpe (Cyprinus carpio), nous avons :

• mis au point un procédé d’extraction et de purification du principe ichtyotoxique du

latex ;

• déterminé certaines de ses propriétés physico-chimiques ;

• entrepris l’élucidation de sa nature chimique ;

2.1. MATERIEL VEGETAL

Le latex d’Euphorbia laro constitue notre matériel d’étude.

2.1.1. Description botanique de Euphorbia laro

Euphorbia laro (figure 1) est une Euphorbiacée endémique de Madagascar (DRAKE,

1899) appartenant au groupe Intisy (annexe I). C’est un arbre de 3 à 6 m de hauteur, à

rameaux nombreux, charnus, cylindriques et striés. Les fruits sont constitués par une capsule

arrondie, à trois loges sur laquelle les lignes de suture des carpelles sont marquées par une

faible dépression. Le pédoncule des fruits est toujours recourbé à angle droit vers sa base. Les

branches stériles, ramifiées à courts intervalles portent des branches secondaires courtes,

pourvues des feuilles alternes, sessiles, ligulées, charnues atteignant 12 mm de longueur sur 4

mm de large. Ces feuilles sont parfois isolées le long des tiges ou à la base des rameaux mais

le plus souvent groupées à leur extrémité par trois ou quatre.

1. INTRODUCTION

2. MATERIELS


a) Rameaux b) Plante entière

Figure 1 : Euphorbia laro :

a) Rameaux ; b) Plante entière

2.1.2. Répartition géographique

De nombreux auteurs dont DENIS (1921) rapportent la présence de Euphorbia laro

dans différentes régions de Madagascar :

Dans la région du centre Sur les rocailles à une altitude de 1000 m, aux environs de

Tsaratanana.

Dans la région de l’Ouest Tout au long des dunes aux environs de Mahajanga.

Dans la région du Sud-Ouest

• Près du Menarandra, de la Sakamasina et de l’Androtina

• Sur les plateaux calcaires entre le Fiherenana et l’Onilahy

• Sur les collines du bas Fiherenana

• Sur les collines calcaires du Fiherenana


Selon COSTATIN et GALLAUD (1905) et DENIS (1921), Euphorbia laro pousse

avec les autres euphorbes du groupe intisy dans la région Sud-Ouest de Madagascar, en

formant un paysage d’euphorbes xérophytiques. Ainsi, HUMERT et COURDANE (1965)

avaient décrit le domaine du Sud-Ouest comme étant un fourré à Euphorbiacées. En 1974,

KOECHLIN avait délimité ce fourré en une bande étroite le long de la côte.

Laro, tel est le nom vernaculaire de Euphorbia laro DRAKE.

2.1.3. Récolte du latex

Le latex a été récolté à Manombo Sud, Toliara, en Septembre 2000.

La récolte est effectuée en pratiquant des entailles sur le tronc de l’arbre (figures 2). Le

latex, visqueux et de couleur jaunâtre, coule le long du tronc et tombe dans un trou

préalablement préparé au pied de l’arbre. Il est ensuite recueilli, puis versé dans des

bouteilles. Au laboratoire, il est congelé.

2.2. PRODUITS CHIMIQUES

La plupart des produits chimiques utilisés, essentiellement de marque MERCK,

PROLABO, RIEDEL DE HAEN, sont de qualité pure ou pour analyse.

Les supports chromatographiques employés sont :

- le gel Sephadex G 25

- le gel de silice de marque MERCK

- et les plaques de gel de silice KIESELGEL 60 F254 (MERCK) prêtes à l’emploi, de

dimensions 20 cm x 20 cm et d’épaisseur 0,2 mm pour la CCM.


Figures 2 : Technique de collecte de latex de Euphorbia laro

1) Confection au pied de la plante

d’un trou destiné à recueillir le latex

2) Entailles faites sur le tronc de l’arbre avec une bêche

3) Cicatrices au niveau des entailles

2

3

1


3.1. METHODE D’EXTRACTION

3.1.1. Préparation du latex

Le latex durci est pesé, puis concassé à l’aide d’une spatule. La poudre

grossière ainsi obtenue constitue notre matériel végétal de départ.

3.1.2. Extraction proprement dite

La poudre de latex est mise en suspension dans le solvant d’extraction dans un

rapport 1/5 (p/v). La suspension est mélangée sous agitation magnétique pendant 3 h à

la température ambiante. Le mélange ainsi obtenu est macéré à 4°C pendant une nuit.

Le macérat est filtré grossièrement sur quatre épaisseurs de gaze pour éliminer les

tourteaux. Le filtrat est ensuite centrifugé à 27200 x g pendant 30 min à 5°C à l’aide

d’une centrifugeuse BECKMAN J2-21 (Rotor JA20). Le solvant d’extraction est

évaporé, puis l’extrait est concentré et ramené à un volume voulu (cf. § 3.3., p.17).

3.2. METHODES DE PURIFICATION

La purification est guidée par des tests d’ichtyotoxicité sur des alevins de carpe et des

tests d’homogénéité par chromatographie sur couche mince (CCM) en utilisant le système

butanol/ acide formique/ eau (B/F/E), dans un rapport 6-2-2 (v/v), comme système de solvants

de migration. A chaque étape de purification, la solution toxique est évaporée à sec afin

d’évaluer le rendement.

3.2.1. Extraction liquide-liquide

Principe

Le principe repose sur le partage des substances entre deux solvants non miscibles de

polarités différentes (MAHUZIER et HAMON, 1990).

Mode opératoire

L’extrait à traiter est mélangé volume à volume dans une ampoule à décanter avec un

3. METHODES


solvant organique non miscible à l’eau. Le mélange est secoué vigoureusement, puis laissé au

repos jusqu’à la séparation nette des deux phases : une phase supérieure organique et une

phase inférieure aqueuse. La phase organique est recueillie, tandis que la phase aqueuse est

traitée de nouveau avec un égal volume de solvants. La même opération est répétée trois fois.

Chaque phase, additionnée d’eau distillée est soumise à une évaporation sous vide afin

d’éliminer le solvant organique et de réduire le volume à la valeur souhaitée.

3.2.2. Précipitation par l’acétate neutre de plomb (ANP)

Principe

L’acétate neutre de plomb (ANP), tout comme d’autres métaux lourds, permet la

défécation d’extraits biologiques en précipitant les grosses molécules comme les protéines, les

acides nucléiques et d’autres molécules comme les acides organiques.

Mode opératoire

La solution d’ANP (20%, v/v) est versée goutte à goutte dans l’extrait, placé sous

agitation magnétique, jusqu’à ce qu’il n’y ait plus formation de précipité. Le précipité obtenu

est éliminé par centrifugation à 27200 x g pendant 15 min. L’excès d’ANP dans le surnageant

est ensuite précipité par addition d’une solution de phosphate dissodique (10%, p/v). Le

précipité est écarté par centrifugation.

3.2.3. Filtration sur charbon actif

Principe

Le charbon actif a un pouvoir adsorbant élevé et une grande affinité pour les

substances aromatiques. Il est utilisé en chromatographie pour la déprotéinisation ou la

décoloration des extraits liquides ainsi que pour la séparation des acides aminés aromatiques.

Mode opératoire

La technique mise au point par JEANNODA en 1986 est utilisée. Une couche de

charbon actif (MERCK) est déposée dans un entonnoir au dessus d’un bouchon de fibre de

verre. L’entonnoir est adapté à une fiole à vide (figure 3). L’extrait à traiter est filtré sous

pression réduite sur la couche de charbon actif préalablement humidifiée à l’eau distillée. La

filtration est assurée par une légère aspiration à l’aide d’une pompe à vide. Le filtrat obtenu

est ensuite passé sur papier filtre pour éliminer les éventuels particules de charbon.


Figure 3 : Dispositif pour la filtration sur charbon actif

3.2.4. Chromatographie sur gel de silice

Principe

Les substances à séparer migrent dans un milieu solide poreux doué de propriétés

adsorbantes. Cette migration résulte de l’équilibre de deux systèmes de forces opposées :

d’une part, l’action d’un courant de liquide à travers la colonne et d’autre part, les affinités

d’adsorption pour les supports solides. Ces dernières forces agissent de façon sélective

(MAHUZIER et HAMON, 1990 ; LEDERER, 1959).

Mode opératoire

* Préparation du gel de silice

Le gel est mis à gonfler pendant 3 h à la température ambiante dans le solvant de

chromatographie puis dégazé sous pression réduite. La suspension est ensuite coulée dans une


colonne de verre de dimensions connues. Lorsque le gel est complètement sédimenté, sa

surface supérieure est stabilisée avec un disque de papier filtre.

* Dépôt de l’échantillon et élution

L’échantillon à analyser est déposé à la surface du gel. L’élution par gravité est

effectuée par percolation du système de solvants. L’effluent de la colonne est recueilli par

fractions de volume constant dans des tubes à essai à l’aide d’un collecteur de fractions.

3.2.5. Chromatographie sur gel Sephadex G25

Principe

C’est un procédé basé sur la séparation des substances suivant leur taille et leur forme

moléculaire.

Le Sephadex est un gel préparé par réticulation d’un polymère anhydroglucosé : le

dextrane. Il joue un rôle de tamis moléculaire. Les grosses molécules ayant un poids

moléculaire élevé n’entrent pas dans les pores du gel. Elles restent dans le liquide extra-

granulaire et sortent les premières dans le volume mort de la colonne : elles sont dites exclues.

Par contre, les petites molécules pénètrent facilement dans les pores du gel et leur élution se

fait lentement le long de la colonne. Les molécules sont alors éluées par ordre des poids

moléculaires décroissants.

Il existe plusieurs types de gel Sephadex selon leur degré de réticulation, c’est à dire

selon leur pouvoir de gonflement et leur domaine de fractionnement. Le gel utilisé dans le

cadre de ce travail est du type Sephadex G25 possédant un domaine de fractionnement

compris entre 100 et 5000 Da (MAHUZIER et HAMON, 1990).

Mode opératoire

* Préparation du gel

Le gel est mis à gonfler pendant 3 h à la température ambiante dans de l’eau distillée,

puis dégazé sous pression réduite au moyen d’une pompe à vide. La suspension est ensuite

coulée dans une colonne de verre de dimensions connues. La surface supérieure du gel est

stabilisée avec un disque de papier filtre. La colonne est ensuite équilibrée par percolation de

trois fois de son volume de solvants.


* Dépôt de l’échantillon

L’échantillon à analyser est déposé à la surface du gel. Le dépôt est suivi d’une élution

par gravité. L’effluent de la colonne est recueilli à volume constant dans des tubes à essai à

l’aide d’un collecteur de fractions.

* Régénération du gel

Il n’y a pas de régénération spéciale du gel. En effet, lorsque toutes les substances sont

éluées, la colonne est prête pour une nouvelle chromatographie.

3.2.6. Ultrafiltration sur membrane à perméabilité sélective

Principe

L’ultrafiltration est une technique de séparation de substances selon leur poids

moléculaire par passage à travers des pores calibrés d’une membrane à perméabilité sélective.

Une faible pression exercée par l’intermédiaire de l’air comprimé permet l’ultrafiltration.

Ce sont les membranes DIAFLO (AMICON) qui sont les plus utilisées. Trois

membranes UM 10, UM 2 et UM 05 (25 mm de diamètre) dont les seuils de filtration sont

respectivement 10000, 1000 et 500 Da sont utilisées. La cellule d’ultrafiltration

correspondante est la cellule AMICON 8MC.

Mode opératoire

Avant la première utilisation, la couche de glycérine protectrice à la surface de la membrane doit être éliminée par bains successifs de celle-ci dans de l’eau distillée. La pression de l’air comprimé appliquée est inférieure ou égale à 6 atmosphères pour les trois types de membrane.

Après chaque ultrafiltration, deux extraits sont obtenus :

• L’ultrafiltrat ou la solution de substances qui passent à travers la membrane

ultrafiltrante,

• Le retentat qui contient les composés qui ne peuvent pas traverser la

membrane.

La membrane est réutilisable. Après chaque utilisation, des rinçages successifs au

NaCl 1 M sont nécessaires pour débarrasser des dépôts éventuels à sa surface, puis la

membrane est conservée humide dans l’éthanol 10% à 4ºC.


3.3. METHODE DE CONCENTRATION ET D’EVAPORATION

Les opérations de concentration et d’évaporation des solvants à partir des

différents extraits sont réalisées au moyen d’un évaporateur rotatif HEIDOLPH, à

50°C. La pression est réduite à l’aide d’une pompe à vide.

3.4. METHODES ANALYTIQUES

3.4.1.Chromatographie sur couche mince (CCM)

Principe

La CCM est un procédé de micro-analyse faisant intervenir le phénomène de partage

et d’adsorption. Les substances à séparer sont soumises d’une part à des échanges entre deux

phases dont l’une fixe aqueuse et l’autre mobile organique et d’autre part aux forces

d’adsorption dues au support (MAHUZIER et HAMON, 1990).

Mode opératoire

Le support utilisé est le gel de silice 60F254 (20 cm x 20 cm ; 0,2 mm d’épaisseur) étalé

sur feuilles plastiques. Les extraits à analyser sont déposés en traits fins de 7 mm, espacés de

6 mm, au moyen d’un capillaire de verre, à 15 mm du bord inférieur de la plaque et à 13 mm

des bords latéraux. Chaque dépôt est séché à l’aide d’un séchoir à main. La plaque est ensuite

développée dans une cuve chromatographique DESAGA préalablement saturée par les

vapeurs du système de solvants de migration grâce à l’application de papier Joseph contre les

parois internes de la cuve.

Il s’agit d’une chromatographie ascendante. Lorsque le front du solvant arrive à 5 mm du

bord supérieur de la plaque, le développement est arrêté en retirant la plaque de la cuve.

Elle est ensuite séchée à l’aide d’un séchoir à main.

Systèmes de solvants

Pour le suivi de l’homogénéité des différentes fractions obtenues à chaque étape de

purification, le solvant de chromatographie est le système butanol/ acide formique/ eau

(B/F/E) dans un rapport 6-2-2 (v/v), phase supérieure.


Pour contrôler la pureté de la toxine, plusieurs systèmes de solvants ont été utilisés.

Révélation des chromatogrammes

La révélation est réalisée en deux étapes :

1) Visualisation des différentes substances sous lumières ultraviolettes à 254 nm et à

366 nm ;

2) Pulvérisation d’un réactif sur la plaque : le réactif vanilline/acide sulfurique

(0,5/100 p/v) : après chauffage à l’étuve à 120°C pendant 5 min, ce réactif, considéré

comme universel, donne des taches noires,

3.4.2. Réactions de détection des familles chimiques

3.4.2.1. Les alcaloïdes ( DALTON, 1979 ; CORDELL, 1981)

Les tests des alcaloïdes sont réalisés avec les réactifs de MAYER, de WAGNER et de

DRAGGENDORFF dont les formules sont données en annexe II.

3.4.2.1.1. Test préliminaire

L’extrait à analyser est acidifié par ajout de HCl 2 N. Le mélange est réparti dans quatre

tubes à essai dont un sert de témoin. 0,5 ml de chacun des trois réactifs est ajouté

respectivement dans les tubes tests. Après une légère agitation, l’apparition d’une

floculation ou d’un précipité est une présomption de la présence d’alcaloïdes dans l’extrait.

3.4.2.1.2. Test de confirmation

L’extrait étudié est alcalinisé avec de l’ammoniaque, puis la solution est extraite trois

fois avec du chloroforme. Les solutions chloroformiques sont rassemblées puis évaporées à

sec.

Le résidu d’évaporation à sec est repris dans de l’eau distillée. Cette solution est

acidifiée par ajout de HCl 2 N puis filtrée. La solution limpide est répartie dans quatre tubes à

essai dont un sert de témoin. Le test est réalisé comme précédemment avec les trois tubes.


L’apparition d’un précipité, d’une floculation ou d’un trouble confirme la présence des

alcaloïdes dans l’extrait.

Le test de confirmation est effectué seulement lorsque le test préliminaire est positif.

3.4.2.2. Les flavonoïdes et les leucoantocyanes (FONG et coll., 1977)

Deux tests, le test de WILSTATER pour les flavonoïdes et celui de BATE-

SMITH pour les leucoantocyanes, sont réalisés.

3.4.2.2.1. Test de WILSTATER

L’extrait à tester est évaporé à sec, puis le résidu est repris dans l’éthanol 80%

(v/v). La solution alcoolique obtenue est répartie dans quatre tubes à essai dont un sert

de témoin.

Dans le deuxième tube sont ajoutés 0,5 ml de HCl concentré (12,07 N) puis

deux tournures de magnésium.

Dans le troisième tube, en plus de ce qu’on a mis dans le deuxième tube, 1 ml

d’alcool isoamylique a été ajouté.

La présence des flavonoïdes est caractérisée par un virage de la coloration :

• au rouge pour les flavones (deuxième tube)

• au pourpre pour les flavonols (troisième tube)

3.4.2.2.2. Test de BATE SMITH

Dans le quatrième tube préparé précédemment, 0,5 ml de HCl concentré (12,07

N) est ajouté. Le mélange est porté au bain-marie bouillant pendant 30 min. Après

refroidissement, l’apparition d’une coloration rouge indique la présence de

leucoanthocyanes.

3.4.2.3. Les tanins et les polyphénols (HEMINGWAY et KARCHESY, 1989)

Le résidu d’évaporation à sec de l’extrait étudié est repris dans de l’eau

distillée chaude. La solution obtenue est répartie dans quatre tubes à essai dont un sert

de témoin.


3.4.2.3.1. Test à la gélatine

L’addition de 4 gouttes de gélatine aqueuse 1% dans le deuxième tube peut

entraîner l’apparition d’un précipité blanc. Ceci indique la présence des tanins

hydrosolubles de type catéchique dans l’extrait.

3.4.2.3.2.Test à la gélatine salée

Un ajout de la gélatine salée (gélatine 1% + NaCl 10%) est effectué dans le

troisième tube. L’apparition d’un précipité indique la présence des tanins de type

pyrogallique dans l’extrait.

3.4.2.3.3. Test au chlorure ferrique

Dans le quatrième tube sont ajoutés 4 gouttes de chlorure ferrique à 10% dans

du méthanol. La présence de tanins se traduit par l’apparition d’un précipité.

Si le test à la gélatine salée est négatif, alors qu’en présence du chlorure

ferrique, une coloration vert-noir est observée, d’autres types de composés

polyphénoliques seraient présents dans l’extrait.

3.4.2.4. Les anthraquinones : Test de BORNTRÄGER

L’extrait étudié est mélangé volume à volume avec du benzène dans une

ampoule à décanter. L’ensemble est secoué vigoureusement puis laissé au repos

jusqu’à la séparation des deux phases. La phase benzénique ou organique est

recueillie, puis additionnée de 0,5 ml d’ammoniaque 25%. L’apparition d’une

coloration rouge après agitation démontre la présence d’anthraquinones.

3.4.2.5. Les saponines : indice de mousse (FONG et coll., 1977)

La présence de saponines est appréciée par la détermination de l’indice de

mousse. L’extrait étudié est mis dans un tube à essai de 1 cm de diamètre. La solution

est agitée vigoureusement pendant 30 s. Une mousse alvéolée de 3 cm de hauteur qui

persiste pendant 30 min indique la présence de saponines.

3.4.2.6. Les stérols et les triterpènes (FONG et coll., 1977 ; NOHARA, 1989)


Le résidu d’évaporation à sec de l’extrait est repris dans du chloroforme. La

solution obtenue est répartie dans trois tubes à essai dont un sert de témoin. Deux tests

sont alors effectués.

3.4.2.6.1. Test de LIEBERMANN-BURCHARD

Dans le deuxième tube, 0,5 ml d’anhydride acétique est ajouté. Après une

légère agitation, 0,5 ml d’acide sulfurique concentré y est versé. L’apparition d’un

anneau rouge, violet ou mauve à l’interface, indique la présence de triterpènes, tandis

que la coloration verdâtre de la phase supérieure (aqueuse) montre la présence de

stéroïdes. Les deux phénomènes peuvent être observés simultanément.

3.4.2.6.2. Test de SALKOWSKI

Le troisième tube est incliné, puis 2 ml d’acide sulfurique concentré y sont

versés. L’apparition d’une coloration rouge démontre la présence de stérols.

3.4.2.7. Les lactones insaturés : test de KEDDE (FONG et coll., 1977)

Le résidu d’évaporation à sec de l’extrait est dissous dans de l’éthanol. Après

ajout de 1 ml de KOH 1 N et 4 gouttes d’acide 3,5-dinitrobenzoïque, la solution est

placée dans un bain marie à 100°C pendant 10 min. L’apparition d’une coloration

violette traduit la présence de lactone insaturé.

3.4.2.8. Les désoxyoses : test de KELLER-KILIANI (FONG et coll., 1977)

Le résidu d’évaporation à sec de l’extrait étudié est repris dans une solution de

chlorure ferrique à 10%. La solution obtenue est ensuite additionnée de 1ml d’acide

acétique glacial. Après une légère agitation, le tube est incliné de 45°, puis 4 gouttes

d’acide sulfurique concentré y sont versées. Un anneau pourpre se formant à la surface

de contact des deux phases indique la présence de désoxyoses.


4.1. ISOLEMENT DU PRINCIPE ICHTYOTOXIQUE

4.1.1. Extraction

Deux solvants d’extraction ont été testés : l’eau distillée et l’alcool éthylique

80%. Le choix de l’eau comme solvant est dicté par le raisonnement selon lequel si les

appâts sont efficaces c’est que les principes ichtyotoxiques qu’ils contiennent sont

solubles dans l’eau douce et dans l’eau de mer. La solution hydrolalcoolique est plutôt

un solvant classique.

Dans les deux cas, 20 g de poudre de latex sont suspendus dans 100 ml de

solvants d’extraction. La suspension est mélangée sous agitation magnétique et la suite

de l’opération est réalisée comme décrite au § 3.1.2., p. 12.

4.1.1.1. Extraction aqueuse

Après concentration du surnageant et élimination des substances insolubles par

centrifugation à 27200 x g pendant 30 min, on obtient un extrait brut de couleur jaune

orangé. Son volume est ramené à 20 ml. Il est toxique sur les alevins de Cyprinus

carpio. Cependant, un précipité est observé après chaque opération de congélation-

décongélation.

4.1.1.2. Extraction hydroalcoolique

Le surnageant limpide devient trouble après évaporation de l’alcool. Ce trouble

est éliminé par centrifugation à 27200 x g pendant 30 min. Un extrait brut limpide (20

ml), de couleur jaune verdâtre, toxique sur les alevins de Cyprinus carpio est obtenu.

Le phénomène de précipitation constaté avec l’extrait brut obtenu par extraction

aqueuse n’est plus observé.

Ainsi, l’extraction hydroalcoolique a été adoptée pour la préparation de

4. RESULTATS


l’extrait brut.

A partir de 200 g de poudre de latex de Euphorbia laro, 200 ml d’extrait brut

ont été préparés. Ce dernier donne après évaporation 4 g de résidu sec.

4.1.2 Purification

Plusieurs méthodes de fractionnement, basées sur les différences soit de

solubilité soit de taille et de forme moléculaires ont été testées pour essayer de purifier

la toxine à partir de l’extrait brut.

4.1.2.1. Fractionnement par l’acétate d’éthyle

Dans le procédé de purification, nous sommes partis de 10 g de résidu

d’évaporation d’extrait brut (obtenus à partir de 500 g de poudre de latex).

Ce résidu sec est repris dans de l’eau distillée jusqu’à l’obtention d’une

solution à la concentration de 10 mg/ml.

200 ml de cette solution sont mélangés volume à volume avec de l’acétate

d’éthyle et le fractionnement se poursuit comme indiqué au § 3.2.1., p. 12.

Après évaporation de l’acétate d’éthyle, la phase aqueuse est ramenée à 200

ml. Elle n’est pas toxique sur les alevins de carpe.

Le résidu d’évaporation à sec de la phase organique pèse 735 mg. Il est

insoluble dans l’eau distillée. Repris dans l’acétate d’éthyle, il donne une solution

limpide. Une grande quantité d’eau distillée est additionnée à cette solution puis

l’acétate d’éthyle est évaporé. A la fin de l’opération, deux parties bien distinctes sont

obtenues : une partie insoluble dans l’eau tapissant la surface intérieure du ballon et

une solution aqueuse limpide.

La fraction insoluble pèse 480 mg soit 65,30% de la phase organique. La

solution aqueuse est toxique sur les alevins de carpe. Elle constitue l’extrait E1 et son

résidu d’évaporation à sec pèse 255 mg, soit 34,70% du résidu d’évaporation à sec de

la phase organique.


Le résidu d’évaporation à sec de l’extrait E1 ainsi obtenu pèse 1,3 g, soit 13%

de celui de l’extrait brut.

4.1.2.2. Chromatographie sur gel de silice

Le résidu de E1 (1,3 g) est repris dans 5 ml du système de solvants B/F/E

(butanol/ acide formique/ eau distillée) dans un rapport 6-2-2 (v/v). La solution

obtenue est déposée sur la colonne de gel de silice (1,6 cm x 94 cm). Le débit de la

colonne est de 28 ml/h/cm². L’effluent de la colonne est recueilli par fractions de 7,5

ml.

Les différentes fractions obtenues sont soumises à une chromatographie sur

couche mince et rassemblées ensuite suivant la similitude des bandes observées sous la

lumière ultraviolette à 254 et à 366 nm. Deux groupes de fractions sont ainsi

constitués (tableau 2) : le groupe FI à une seule bande et le groupe FII à deux bandes.

Tableau 2: Groupes de fractions obtenus après chromatographie sur gel de silice de l’extrait E1.

Groupe de fractions

Numéro des tubes Volume total

F I N°10 – N°30 157,5 ml F II N°60 – N°85 195 ml

Les chromatogrammes sont ensuite révélés à l’aide du réactif à la vanilline

acide sulfurique (figure 4).

Les tests de toxicité réalisés sur alevins de carpe ont montré que, seul FII est

actif. Cette solution limpide, de couleur jaune verdâtre, constitue l’extrait E2 : son

résidu d’évaporation à sec pèse 500 mg.

4.1.2.3. Chromatographie sur gel Sephadex G 25

Le résidu d’évaporation à sec de l’extrait E2 est repris dans 5 ml d’eau distillée

qui est le solvant de chromatographie. La solution obtenue est déposée à la surface

supérieure du gel (1,6 cm x 74 cm). Le débit de la colonne est de 19 ml/h/cm².

L’effluent de la colonne est recueilli par fractions de 4,5 ml. Les différentes


fractions sont chromatographiées sur couche mince et rassemblées suivant la

similitude des bandes observées sous la lumière ultraviolette à 254 et à 366 nm. Deux

groupes de fractions, présentant chacun une bande sont obtenus (tableau 3).

Tableau 3: Groupes de fractions obtenus après chromatographie sur gel Sephadex G25 de l’extrait E2.

Groupe de

fractions

Numéro des

tubes Volume total

F I N°5 – N°20 72 ml

F II N°39 – N°55 76,5 ml

Les chromatogrammes sont ensuite pulvérisés avec le réactif à la vanilline

acide sulfurique (figure 5). Les bandes observées sous la lumière ultraviolette sont

révélées et se présentent comme des tâches noires indiquant ainsi l’homogénéité des

deux groupes de fractions. Cependant, après test de toxicité, seul le groupe de fractions

FI de couleur jaune verdâtre, limpide est toxique sur les alevins de carpe et il constitue

l’extrait E3. Il contient donc la molécule ichtyotoxique du latex de Euphorbia laro.

Son résidu d’évaporation à sec pèse 215 mg.

Le tableau 4 et le chromatogramme (figure 6) montrent l’évolution de

l’homogénéité des divers extraits obtenus lors des différentes étapes de purification du

principe ichtyotoxique du latex de Euphorbia laro (figure 7).

Tableau 4 : Evolution de l’homogénéité des divers extraits obtenus lors de la purification du principe ichtyotoxique de Euphorbia laro.

Etapes de purification Extraits Homogénéité Propriété

Extraction éthanolique Extrait brut 9 bandes Toxique

Fractionnement par l’acétate d’éthyle

Phase organique Phase aqueuse

4 bandes 5 bandes

Toxique Non toxique


Chromatographie sur gel de silice

Fraction FI Fraction FII

1 bande 2 bandes

Non toxique Toxique

Chromatographie sur gel Sephadex G25

Fraction FI Fraction FII

1 bande 1 bande

Toxique Non toxique


Figure 4 : Chromatogrammes des différentes fractions obtenues lors de la chromatographie sur gel de silice de l’extrait E1 : migration dans le système butanol/ acide formique/ eau (6/2/2, v/v) ; révélation à la vanilline acide sulfurique.

72 76 80 84 88 92 96 100 104 108 112 116 120 124

20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68

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