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TIPIZZAZIONE TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DI MOLECOLARE DI CLOSTRIDIUM DIFFICILECLOSTRIDIUM DIFFICILE
Vincenza Romano, PhDvincenza.romano@uniparthenope.it
Denève et al., 2009
Tossine A e B
Rispettivamente citotossina ed enterotossina. Codificate a livello di uno stesso Locus genico: PaLoc Mutazioni nei geni per le tossine danno origine ai
diversi tossinotipi.
Mappa parzialedel locus di
patogenicità Rupnik et. al. 1997.
TcdA e TcdB
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•Large Clostridial toxins•Major virulence factors
•Intracellular•Glucosyltransferases
Glucosylating
enzymaticdomain
Autocatalityc
Processing domain
Translocating
domain
Bindingdomain
TcdA e TcdB
cdtA componente catalitica e cdtB componente di legame.
E’ stato dimostrato che questa tossina è presente solo nei campioni con modificazioni nei geni per le tossine A e B, fatta eccezione per il tossinotipo VIII. (Stubbs et al. 2000).
Tossina Binaria CDT
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CDT
Introduction
Tecniche molecolariTecniche molecolari
•Identificazione e profilo tossigenico
•Toxinotyping
•Ribotyping
MD PhD E. J . KuijperLieden University Medical Center, Olanda
• PCR per GluD e tossina B• PCR per tossina A (con e senza
delezione)
MD PhD Maja RupnikUniversity of Maribor, Slovenia
• Toxinotypinghttp://www.mf.uni-mb.si/tox/
Duplex PCR gene tossina A
(con e senza delezione).
tcdA
tcdB and gluD
Deletion tcdA (314 bp)
tcdA (369 bp)
tcdB (200 bp)
gluD (158 bp)
Duplex PCR per gene GluD e
gene tossina B
Identificazione e profilo tossigenico
PCR separate:
PCR per la Tossina binaria (Stubbs et al)
cdtA
cdtB
Binary toxin genes
327 bp
451 bp
This technique allows to the identification of 32 toxinotypes designated with 0 (if identical to the reference strain VPI 10463), and with I to XXXI if presenting variations in the toxin genes.
TOXINOTYPING
16sITS
RIBOTYPING
Analisi dei profili
mediante Gel
Compare
(Bionumerics)
Correlazione tra profilo tossigenico e suddivisione ottenuta tramite PCR ribotipo
METODIMETODI
Più di 220 ribotipi
001 A+B+CDT- 0
002 A+B+CDT- 0
003 A+B+CDT- I
012 A+B+CDT- 0
014/020 A+B+CDT- 0
015 A+B+CDT- 0
017 A-B+CDT- VIII
018 A+B+CDT- 0
023 A+B+CDT+ IV
027 A+B+CDT+ III
029 A+B+CDT- 0
046 A+B+CDT- 0
053 A+B+CDT- 0
056 A+B+CDT- XII
070 A+B+CDT- XIII
075 A+B+CDT+ III
078 A+B+CDT+ V
081 A+B+CDT- 0
087 A+B+CDT- 0
095
106 A+B+CDT- 0
131
126 A+B+CDT+ V
050 A+B+CDT- 0
044 A+B+CDT- 0
005 A+B+CDT- 0
066 A+B+CDT+ V
010Non
tossigenico NT
013 A+B+CDT- 0
Ribotipi più comuni
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Geographical distribution of C. difficile PCR ribotypes in European countries in November 2008 (From Bauer et al., 2011)
Most isolated ribotypes in CDI-cases
Grazie per l’attenzione