The use of antineutrophil antibodies in the diagnosis and

monitoring of small vessel vasculitis

Critically Appraised Topic

Steven Vervaeke

19 - 04 - 2005

ANCA

Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibodies

ANCA

hυhυ’

c-ANCA:

CCytoplasmatisch

Diffuus, granulair, cytoplasmatisch patroon.

p-ANCA:

PPerinucleair

Perinucleaire tot nucleaireaankleuring.

De termen De termen p-ANCAp-ANCA en en c-ANCAc-ANCA

slaan op hetslaan op hetimmuunfluorescentiepatroon!immuunfluorescentiepatroon!

Ethanol- en Formaline-fixatie van testgranulocyten.

ETHANOL:ETHANOL: invloed op spreiding van Ag, sommige migreren richting kern en zijn verantwoordelijk voor het p-ANCA patroon

GEVOLGGEVOLG:: kans op verwarring met ANA-patroon.

FORMALINE:FORMALINE: geen Ag-migratie.

Target-antigenen

• C-ANCAC-ANCA

– Proteinase 3 (PR3)

– BPI (CAP-57)

– andere onbekende Ag

• P-ANCAP-ANCA

– Myeloperoxidase (MPO)– Lactoferrine– Elastase– BPI (CAP-57)– Cathepsin G– β-glucuronidase– Lysozyme– α-enolase– ...

Ziekte-associatie

• C-ANCAC-ANCA

– M. Wegener (80-90%)

– MPA (10-35%)

– CSS (10-20%)

– PAN (< 5%)

• P-ANCAP-ANCA

– Primaire vasculitis:• MPA (42-70%)• CSS (18-60%)• WG (10%)

– Andere:• SLE• RA• IBD• Chronische leverziekten• ...

VAN ALLE ANTIGENEN ZIJN VAN ALLE ANTIGENEN ZIJN ENKEL ENKEL MPOMPO EN EN PR3PR3 GEASSOCIEERD GEASSOCIEERD

MET MET PRIMAIRE VASCULITISPRIMAIRE VASCULITIS..

GEEN ENKEL ANDER ANTIGEN HEEFT GEEN ENKEL ANDER ANTIGEN HEEFT EEN DIAGNOSTISCHE BETEKENIS EEN DIAGNOSTISCHE BETEKENIS

BIJ GEEN ENKELE ANDERE AANDOENING!BIJ GEEN ENKELE ANDERE AANDOENING!

ELISA

MPO of PR3

ELISA

Serum patientmet ANCA

ELISA

MPO of PR3-ANCA

De termen De termen MPO-ANCAMPO-ANCA en en PR3-ANCAPR3-ANCA

slaan op ANCA slaan op ANCA specifiek gericht tegenspecifiek gericht tegen

MPO of PR3MPO of PR3 ((ELISAELISA))

IIF:

Primaire vasculitis of niet?

Problemen:Problemen: - Echte p-ANCA of ANA of beide?- Indien p-ANCA: welk antigen?

TEST GUIDELINES:

Een positieve IIF test Een positieve IIF test moet steeds bevestigd worden door moet steeds bevestigd worden door een MPO of PR3 positieve ELISA.een MPO of PR3 positieve ELISA.

Ziekte-associatie van de gecombineerde IIF en ELISA test

IIF patroon Antigen Ziekte

C-ANCAC-ANCA PR3PR3 WGWG (80-90%)MPA (20-40%)CSS (35%)

P-ANCAP-ANCA MPOMPO MPAMPA (50%)CSS (35%)WG (10%)

ANCA-geassocieerde vasculitiden

• Morbus WegenerMorbus Wegener:– Prevalentie: 3 per 100.000

• Microscopische polyangiitisMicroscopische polyangiitis:– Incidentie: 1 per 100.000 per jaar

• Churg-Strauss syndroom:Churg-Strauss syndroom:– Incidentie: 1 tot 3 per 1.000.000 per jaar

Diagnostische waarde vd testen (Hagen et al. 1998)

Wegener MPASensitiviteit:c-ANCA 64% 23%p-ANCA 21% 58%PR3 66% 26%MPO 24% 58%

Specificiteit tov zieke controles:c-ANCA 95% PR3 87%p-ANCA 81% MPO 91%

Diagnostische waarde vd testen (Hagen et al. 1998)

Wegener MPASensitiviteit:c-ANCA + PR3 57%p-ANCA + MPO 49%beide 73% 67%

Specificiteit tov zieke controles: 99%. Gezonde controles: 100%

Diagnostische waarde vd testen (Hagen et al. 1998)

CONCLUSIE:

De waarde van de IIF test voor ANCA kan De waarde van de IIF test voor ANCA kan gevoelig verhoogd worden door ze gevoelig verhoogd worden door ze te combineren met ELISA.te combineren met ELISA.

Diagnostische waarde vd testen (Hagen et al. 1998)

CONCLUSIE:

C-ANCA + PR3C-ANCA + PR3 is kenmerkend voor is kenmerkend voor WGWGp-ANCA + MPOp-ANCA + MPO is kenmerkend voor is kenmerkend voor MPAMPA

Niet alle IIF ANCA positieven zijn AAV pat.Niet alle IIF ANCA positieven zijn AAV pat.Niet alle AAV patienten testen positiefNiet alle AAV patienten testen positief

Indicaties voor gebruik van ANCA in diagnostiek:

• Edgar et al., 1995:– Slechts 27% van alle ANCA-aanvragen gebeuren in

kader van een AAV.

• AAV zijn zeldzame aandoeningen• Hoge vals-positiviteit:

– ANCA komen in tal van ziektes voor.– ANA

• ANCA zijn niet essentieel in de diagnose van AAV (classificatiecriteria)

Indicaties voor gebruik van ANCA in diagnostiek:

• International consensus statement on testing and reporting of ANCA (1999):

• Glomerulonefritis

• Longbloeding

• Cutane vasculitis met systemische weerslag

• Meerdere longnoduli

• Chronische destructieve BLW pathologie

• Chronisch actieve sinusitis of otitis

• Subglottische trachea stenose

• Mononeuritis multiplex of andere perifere neuropathie

• Retro-orbitale massa

– indien er geen andere duidelijke oorzaak voor is !

Indicaties voor gebruik van ANCA in diagnostiek:

• CSS? – Asthma, eosinofilie en vasculitis.

• Koorts, arthralgie, myalgie, vermoeidheid?– GEEN INDICATIES!

• ANCA is geen screeningstest!ANCA is geen screeningstest!

• Maar:– AAV vaak moeilijke diagnose

– elke ernstige, acute pathologie (vooral wanneer longen en/of nieren betrokken) heeft recht op een ANCA-test.

Aanvraaggedrag ANCA in UZ Leuven:

• April 2003 - Oktober 2004: 7781 aanvragen– 6391 (82,1%) negatief op IIF– 911 (11,7%) positief op IIF– 479 (6,2%) dubieus op IIF

• 597 aanvragers:– aanvraagfrequentie: 1 per 1,5 jaar tot 21

aanvragen per maand.

Aanvraaggedrag ANCA in UZ Leuven:

% IIF positief % ELISA positiefaantal Pos. Pos.+Dub IIF Pos. IIF Dub.

IAL 1245 14,5 21,9 49 (56) 15 (22)NEU 638 3,1 7,1 15 (16) 0 (12)NEF 585 13,9 18,8 42 (56) 10 (28)HEP 450 10,7 16,5 6 (19) 12 (15)REU 374 24,6 32,9 16 (28) 3 (6)PNE 345 9,6 16,3 27 (36) 4 (8)GE 212 17 22,7 NB NBALL 203 2,9 5,8 NB NBNKO 107 4,7 7,4 NB NBGER 63 6,3 14,2 NB NBPED 52 11,5 13,5 NB NBHEM 34 5,8 14,7 NB NB

Filter op de aanvragen?

• Werkt het systeem?– Sinclair et al. 2004:

• Criteria opgesteld (~ ICG)

• 72,5% vd aanvragen werd toegelaten tot de test

• Resultaat van de aanvaarde aanvragen– 73% negatief

– 27% positief waarvan 74% inderdaad AAV patienten.

• Slechts 1 patient vd geweigerde patienten ontwikkelde een AAV in de follow-up (delay 2 dagen)

• CONCLUSIE:CONCLUSIE: het selecteren van aanvragen heeft een positieve impact op de test: klinische relevantie van een positieve test stijgt en de procedure werkt kostensparend.

Filter op de aanvragen?

• Werkt het systeem?– Mandl et al. 2004:

Filter op de aanvragen?

• Werkt het systeem?– Mandl et al. 2004:

• Retrospectieve studie• Het aantal ANCA-testen zou met 23% zakken• Het aandeel van de vals positieve IIF zou zakken

met 27%• Geen enkele AAV werd gemist.• Noot: neurologie PPV: 0%!• CONCLUSIE:CONCLUSIE: het toepassen van selectiecriteria op

ANCA-aanvragen zorgt voor een efficiënter gebruik van de test en voor een gevoelige kostenbesparing in het labo.

Filter op de aanvragen?

• Werkt het systeem?– UZ Gasthuisberg:

• Retrospectieve studie over 18 maand op IAL.

• 286 aanvragen:– Negatieve IIF: 199 (69,5%)

» 78 aanvragen zouden aanvaard worden (39%)

– Positieve IIF: 56 (19,5%)

» 32 aanvragen zouden aanvaard worden (57%)

– Dubieuze IIF: 31 (11%)

» 16 aanvragen zouden aanvaard worden (52%)

– GEEN ENKELE AAV WERD GEMIST!GEEN ENKELE AAV WERD GEMIST!

Filter op de aanvragen?

• Werkt het systeem?– UZ Gasthuisberg:

• Op totaal van 286 aanvragen werd 44% toegelaten.

• Per jaar:– Ongeveer 5500 aanvragenOngeveer 5500 aanvragen

– 21 500 euro minstens uitgespaard per jaar voor IIF21 500 euro minstens uitgespaard per jaar voor IIF

» Kosten voor een positieve IIF niet ingecalculeerd.Kosten voor een positieve IIF niet ingecalculeerd.

» ANCA voor IBD en AIH als ‘niet geaccepteerd’.ANCA voor IBD en AIH als ‘niet geaccepteerd’.

Filter op de aanvragen?

• Werkt het systeem?1. Slecht of onvolledig ingevulde ‘klinische

inlichtingen’

2. Wie doet het werk?

3. Electronische aanvraag en ‘vasculitis screening’

4. Wat met een gemiste diagnose tgv niet aanvaarden van de aanvraag.

ANCA in de follow-up van AAV

• Therapie niet zonder risico• Herval niet zonder risico• Een merker die een AAV-herval kan

aangeven?– ANCA rol in pathogenese van AAV– Patienten in remissie: ANCA vaak niet meer

detecteerbaar.– Actieve Wegener: hogere titers dan andere

patienten

ANCA in de follow-up van AAV

• Literatuur: controversieel.

• Stegeman, 2002:– Meeste studies ‘minderwaardig’– Correct opgezette studies:

• 4-voudige toename van c-ANCA titer op IIF4-voudige toename van c-ANCA titer op IIF

OFOF

• > 75% toename in PR3-ANCA op ELISA> 75% toename in PR3-ANCA op ELISA

is in meer dan 50% van de gevallen geassocieerd met een herval binnen de 6 tot 12 maand. (Wegener)

ANCA in de follow-up van AAV

• Girard et al. 2001:– Herverschijnen van ANCA bij AAV patienten

slechts in 37% geassocieerd met herval.– Persisterende positiviteit was in 31% van de

gevallen geassocieerd met herval.– De delay tussen ANCA stijging en herval kan

heel lang zijn (maanden).– CONCLUSIE:CONCLUSIE: er is een verband, doch zwak.

Niet voldoende om behandeling te wijzigen. ANCA stijging is een waarschuwingssignaal.

Verder doel van de CAT:

• Wat met onze flow-chart?• Mogelijke problemen:

– ‘Dubieus’ op titer 1/40

– Dubbele stalen op ELISA

– Cut-off MPO-ELISA:• Onze cut-off: 5 U (firma: 20 U)

• Geteste populatie: 50 stalen met ‘IIF pos.’ en ‘MPO’

• 18 op 50 hadden MPO tussen 5 U en 20 U:– Slechts 3 waren geassocieerd met AAV

• 32 op 50 hadden MPO boven 20 U:– 16 AAV en 13 andere vasculitiden (29 op 32)

Verder doel van de CAT:

– Cut-off MPO-ELISA:• Cut-off > 20 U: 16 AAV op 32 stalen (50%)

• Cut-off > 5 U: 19 AAV op 32 stalen (38%)• Cut-off > 20 U: Sensitiviteit: 53% - specificiteit 99%

• Cut-off > 5 U: Cut-off > 5 U: sensitiviteit: 100% - specificiteit 0%sensitiviteit: 100% - specificiteit 0%

ANCA praktisch

• Preanalytisch: – serum, 2-8°C.– Geen gehemolyseerde, besmette, onvolledig

gedefibrineerde,… stalen: achtergrond kleuring

• Reproduceerbaarheid:– IIF: interassay en interobserver variation– ELISA: te bekijken

ANCA praktisch

• Diagnostische performantie:– IIF IAL: sensitiviteit 68%, specificiteit 80% (zieken)

ANCA praktisch

• TAT:– < 10 dagen.– IIF: vier maal per week (niet op woensdag)

– ELISA: twee maal per week (dinsdag en vrijdag)

ANCA praktisch

• Kosten:– IIF:

• Consumable cost: 4,34 euro• TU and Log: 1,73 euro• Support: 1,79 euro• Invest: 0 euro• TOTAAL: 7,86 euro7,86 euro.• Extra: elke titratiestep herhaalt deze kost.

– ELISA:• Consumable cost: 15,65 euro• TU and Log: 2,84 euro• Support: 2,80 euro• Invest: 0,12 euro• TOTAAL: 2 x 21,47 = 42,94 euro42,94 euro

ANCA praktisch

• Terugbetaling:– IIF:

• ANCA-detectie: B300 = 8,4 euro• ANCA-titratie: B400 = 11,20 euro• Totale terugbetaling voor positieve IIF: B700 = 19,60 euroNoot: kosten kunnen oplopen tot 47,16 euro47,16 euro !

– ELISA:• PR3 detectie: B350 = 9,80 euro• MPO detectie: B350 = 9,80 euro• Totale terugbetaling voor ELISA: B700 = 19,60 euro.Noot: kostprijs ELISA bedraagt 42,94 euro42,94 euro!

– Dus: om de kosten van één vals positief IIF resultaat te compenseren zijn 36 tot 94 negatieve stalen nodig!

To Do’s:

• Overleg met clinici mbt de selectiecriteria voor ANCA-testen.

• Afwerken statistische analyse op onze ANCA-aanpak.– Bijstellen cut-off waarden ELISA– Aanpassen flow-chart

• Zin of onzin van het in duplo lopen van stalen op de ELISA.

• ANCA-testen voor ander doeleinden dan AAV?

Om te onthouden:

“The problemsThe problems of antineutrophil cytoplasmic antibody testing include the diversitydiversity of antineutrophil cytoplasmic antibody target antigenstarget antigens, assay standardisationtandardisation and performanceperformance, the application of antineutrophil cytoplasmic antibody testing in a clinical setting with a low pretest probabilitya low pretest probability, and, finally, the widespread assumptionassumption that antineutrophil cytoplasmic antibody titerstiters alone may closely reflect disease activityclosely reflect disease activity and therefore may be used to guide therapy. Recent findings demonstrate that the combined combined useuse of indirect immunofluorescence tests and solid phase assays to detect antineutrophil cytoplasmic antibody directed against myeloperoxidase and proteinase 3 can minimize the occurrence of false-positive antineutrophil cytoplasmic antibody results. Furthermore, the yield of antineutrophil cytoplasmic antibody testing can be improved by the use of a well standardised test, adherence to published guidelines, and restricting the restricting the useuse of the test to clinical situations with a rather high pretest probability for antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitides. However, treatment treatment decisionsdecisions should be based on the clinical presentation of the patient and histological findings and not on the results of antineutrophil cytoplasmic antibody testing alone.”

Schmitt and van der Woude, 2004.