7/23/2019 Phospholipids in DNA

http://slidepdf.com/reader/full/phospholipids-in-dna 1/5

P r o c .N a t l .A c a d .S c i .USAVo l .9 2 ,p p . 7 8 3 - 78 7 , J a nu a ry 1 9 9 5B i o c h e m i s t r y

I n v i v o e v i d e n c ef o r t h e i n v o l v e m e n to f a n i o n i c p h o s p h o l i p i d si ni n i t i a t i o n o f DNA r e p l i c a t i o n i n E s c h e r i c h i ac o l i

W E I M I N GX I AAND W I L L I A MD o w H A N *D e p a r t m e n to f B i o c h e m i s t r ya n d M o l e c u l a rB i o l o g y , U n i v er s i t yo f T e x as M ed i c a lS c h o o l ,H o u s t o n ,TX 7 7 2 2 5

C o m m u n i c a t e db yE u g e n eP . K e n n e d y ,H a r v a r dM e d i c a lS c h o o l ,B o s t o n ,MA , O c t o b e r3 1 ,1 9 9 4

A B S T R A C T In v i t r o ,a n i o n i cp h o s p h o l i p i d sc a n r e a c t i v a t ei n a c t i v a t e dDnaA p r o t e i n ,w h i c hi s e s s e n t i a l f o ri n i t i a t i o no fD N Ar e p l i c a t i o na t t h eo r i C s i t eo f E s c h e r i c h i ac o l i[ S e k i m i z u ,K . K o r n b e r g ,A . ( 1 9 8 8 )J . B i o l .C h e m .2 6 3 ,7 1 3 1 - 7 1 3 5 ] .M u t a t i o n si n t h e p g s 4 g e n e e n c o d i n gp h o s p h a t i d y l g l y c e r o -p h o s p h a t es y n t h a s e )l i m i tt h es y n t h e s i so f t h em a j o ra n i o n i cp h o s p h o l i p i d sa n d l e a dt o a r r e s to f c e l lg r o w t h .W e r e p o r th e r e i n t h a ta m u t a t i o ni n t h e r n h Ag e n e e n c o d i n gR N a s eH )t h a tb y p a s s e st h e n e e df o rt h e DnaAp r o t e i nt h r o u g hi n d u c t i o no f c o n s t i t u t i v es t a b l eD N Ar e p l i c a t i o n[ K o g o m a ,T . v o nM e y e n b u r g ,K . ( 1 9 8 3 )E M B OJ . 2 , 4 6 3 - 4 6 8 ]a l s os u p p r e s s e dt h e g r o w t ha r r e s tp h e n o t y p eo f a p g s Am u t a n t .T h e m a i n t e -n a n c eo f p l a s m i d sd e p e n d e n to n a no r i C s i t ef o rr e p l i c a t i o n ,a n d t h e r e f o r eDnaA p r o t e i n ,w a s a l s oc o m p r o m i s e du n d e rc o nd i t i o ns o fl i m i t i n ga n i o n i c p h o s p h o l i p i ds y n t h e s i s .T h e s er e s u l t sp r o v i d es u p p o r tf o rt h ei n v o l v e m e n to f a n io n i cp h o s -p h o l i p i d si n n o r m a li n i t i a t i o no fD N Ar e p l i c a t i o na t o r i C i nv i v ob y t h e DnaA p r o t e i n .

S u b s t a n t i a le v i d e n c ei n d i c a t e st h a tDNA r e p l i c a t i o ni nE s c h -e r i c h i ac o l ii s a s s o c i a t e dw i t h t h ec e l lm e m b r a n ea n d m ayr e q u i r ea n i o n i c p h o s p h o l i p i d s( 1 - 3 ) .From e l e c t r o nm i c r o s -c o p ya n d c e l lf r a c t i o n a t i o ns t u d i e s ,t h e r ea p p e a rt o b e n o n -c o v a l e n t i n t e r a c t i o n sa m o n gt h e m e m b r a n e ,t h e o r i g i no fr e p l i c a t i o n ,t h er e p l i c a t i o nf o r k ,a n d t h et e r m i n a t i o ns i t eo f t h ec h r o m o s o m e( 4 ) .D n a A ,t h ep r o t e i nn e c e s s a r yf o ri n i t i a t i o no fDNA r e p l i c a t i o na t t h eo r i C s i t e ,i s p e r i p h e r a l l yb o u n dt om e m b r a n e si n v i t r o ,c o p u r i f i e sw i t h p h o s p h o l i p i d s ,a n d s p e -c i f i c a l l yb i n d s a n i o n i cp h o s p h o l i p i d s( 5 , 6 ) . F u r t h e r m o r e ,a n i o n i cp h o s p h o l i p i d sf a c i l i t a t et h ec o n v e r s i o no f t h ei n a c t i v eA D P - b o u n df o r m o f t h eD n a A p r o t e i nt o t h ea c t i v eATP-b o u n df o r mi nv i t r o ,r e s u l t i n gi nr e g e n e r a t i o no ft h ei n i t i a t i o na c t i v i t yo f p r e v i o u s l yi n e r tD n a Ap r o t e i n( 2 ,3 ,7 ) .O n l ya n i o n i cp h o s p h o l i p i d s c o n t a i n i n gu n s a t u r a t e d f a t t ya c i d s a r ef u n c -t i o n a li ns t i m u l a t i n gD n a Af u n c t i o ni nv i t r o( 7 ) ,a n o b s e r v a t i o nt h a ti s a l s oc o n s i s t e n tw i t h t h eo b s e r v a t i o nt h a ti n i t i a t i o no fc h r o m o s o m er e p l i c a t i o ni nv i v oa p p e a r st o b e d e p e n d e n to n al i p i db i n d i n gs i t ei n t h em e m b r a n ec o n t a i n i n gu n s a t u r a t e df a t t ya c i d s( 8 ) .H o w e v e r ,w h e t h e ra n i o n i c p h o s p h o l i p i d sa r ei n v o l v e di n i n i t i a t i n gDNA s y n t h e s i si n v i v oh a s n o t b e e ne s t a b l i s h e d .

I n i t i a t i o no fDNA r e p l i c a t i o nr e q u i r e sf o r m a t i o no fa n RNA

p r i m e r - D N Ah y b r i dd u p l e xa t t h ei n i t i a t i o ns i t e .R N a s eH , t h er n h A g e n e p r o d u c t ,r e s t r i c t sDNA r e p l i c a t i o ni n v i v o t ot h eo r i C s i t eb y p r e f e r e n t i a l l yd e g r a d i n gt h e s eRNA p r i m e r sa ts i t e so t h e r t h a n t h eD n a A p r o t e i n - d e p e n d e n to r i C i n i t i a t i o ns i t e( 9 ) .When t h er n h Ag e n e ( 1 0 )i s i n a c t i v a t e d ,c o n s t i t u t i v es t a b l eDNA r e p l i c a t i o n c S D R )c a n b e i n i t i a t e da t s e v e r a lD n a A p r o t e i n - i n d e p e n d e n to r i K s i t e sb y u t i l i z i n gt h eu n d e -g r a d e dRNA p r i m e r s( 1 1 , 1 2) .I n t r o d u c t i o no f a n r n h Am u -t a t i o ni n t o s t r a i n sl a c k i n gt h ed n a Ag e n e o r t h eo r i C s i t eb y p a s s e st h en e e d f o rt h e s eg e n e t i cl o c if o rc e l lv i a b i l i t y( 1 3 ,1 4 ) .RecA p r o t e i n e n c o d e db y t h er e c Ag e n e )i sr e q u i r e df o r

cSDR a t t h eo r i Ks i t e s( 1 5 ) ,b u t t h i sr e q u i r e m e n ti ss u p p r e s s ei n a l e x A D e f )m u t a n t( 1 6 ) .

I f a ni o ni c p h o s ph o li p i d sa r ee s s e n t i a lf o r D n a A p r o t e i nf u n c t i o ni n v i v o ,t h e n m u ta t i o n st h a ts u p p r e s st h en e e d f oD n a Ap r o t e i n - d e p e n d e n ti n i t i a t i o no f DNA r e p l i c a t i o na t t h eo r i C s i t emay a l s os u p p r e s st h eg r o w t ha r r e s tp h e n o t y p eo fm u t a n t sw i t h a l i m i t i n gl e v e lo f a n i o n i c p h o s p h o l i p i d sT h ep h o s p h o l i p i dc o m p o s i t i o no f t h eE . c o l ic e l lm e m b r a n ei s7 0 - 8 0 p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e( z w i t t e r i o n i c ) ,1 5 - 2 0p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l P G , a n i o n i c ) ,a n d 2 - 5 c a r d i o l i( C L ,a n i o n i c )( 1 7 ) .P h o s p h a t i d y l g l y c e r o p h o s p h a t es y n t h a e n c o d e db y t h e p g s A g en e)c a t a l y z e st h ec o m m i t t e ds t e pi nt h eb i o s y n t h e s i so f P G a n d CL ( 1 8 )a n d i se s s e n t i a lf o rc e l lg r o w t h( 1 9 ) .To s y s t e m a t i c a l l ys t u d y t h e s p e c i f i cr o l e so f a n i o n i cp h o s p h o l i p i d si n c e l lf u n c t i o n s ,a s t r a i nb e a r i n ga D [ l a cp g s A + ]g e n e f u s i o ni n a p g s A : : k a nn u l la l l e l eb a c k g r o u n dw a sc o n s t r u c t e d( 2 0 ) .I n t h i ss t r a i n ,a n i o n i cp h o s p h o l i p i dc o n t e ng e n e e x p r e s s i o n ,a n d c e l lg r o w t h r a t ec a n b e e x o g e n o u sc o n t r o l l e db y t h ei n d u c e r o f t h el a co p e r o n i s o p r o p y lP - Dt h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e I P T G ) . I n t h ea b s e n c eo f I P T G , t h eb a s a ll e v e lo f t h ep g s Ag e n e p r o d u c ti s i n s u f f i c i e n tt o s u p p o rc e l lg r o w t h ,a l t h o u g hc e l l sr e m a i nv i a b l e ,a s i n d i c a t e db yr e s u m p t i o no f g r o w t hu p o na d d i t i o no f I P T G .F a i l u r et o l o sv i a b i l i t yi n d i c a t es t h a ta n i o n i cp h o s p h o l i p i d sa r e e s s e n t i a lf oc e r t a i nc e l lf u n c t i o n si n d e p e n d e n to f a m e m b r a n es t r u c t ur e q u i r e m e n t( 2 1 ) .

B a s e d o ns t u d i e so f t h e s u p p r e s s i o no f t h eg r o w t ha r r e sp h e n o t y p eo f t h e a b o v ep g s A m u t a n t u n d e r c o n d i t i o n s o fc S D R ,we r e p o r tr e s u l t st h a ts u p p o r t t h e i n v o l v e m e n to fa n i o n i cp h o s p h o l i p i d si n t h ei n i t i a t i o no fDNA r e p l i c a t i ob yt h eD n a A p r o t e i na t t h eo r i C s i t ei n v i v o .

M AT E R I A L SA N DMETHODS

S t r a i n s ,P l a s m i d s ,a n d C e l lG r o w t h .Ta b l e1 s u m m a r i z e st h es t r a i n sa n d p l a s m i d su s e d i nt h i sw o r ka n d o u t l i n e st h es c h e mu s e dt oc o n s t r u c ts t r a i n sb y P 1 t r a n s d u c t i o n( 2 3 ) .To c o n s t r u c ts t r a i nMRLA12, t h em a l G : : T n l Ol o c u sw a s f i r s t- i n t r o d ui n t os t r a i nM R 1 2a n du s e dt om o n i t o ri t sr e p l a c e m e n tw i t ht h em a l G +l o c u sa l o n gw i t h t h ec l o s e l yl i n k e d( 0 . 2m i n )l e x A ( Da l l e l e( 24 , 2 5 ) .S t r a i nM D L 1 2w a sc o n s t r u c t e db ys u c c e s s i vP 1

t r a n s d u c t i o n so f s t r a i nMG1655 ( n ok n o w nm u t a t i o n sb yu s i n gs t r a i nHDL1001a sd o n o r .P l a s m i d sw e r e i n tr o du c edi n tc e l l sb y e l e c t r o p o r a t i o n ( E l e c t r oC e l lM a n i p u l a t o r6 0 0 ) .C e l lw e r e g r o w na t 3 7 ° C( u n l e s so t h e r w i s ei n d i c a t e d )i n l i q uc u l t u r e so r o n a g a r p l a t e si n LB medium s u p p l e m e n t e dw i t h1 0 0 ,M IPTG w h e r ei n d i c a t e d ) .A n t i b i o t i c s( 2 6 )w e r ep r e s e nd u r i n gt h eg r o w t ho fp l a s m i d - c o n t a i n i n gs t r a i n su n l e s s o t hw i s e i n d i c a t e da n d w e r e u s e d o n l yf o rt h ei n i t i a ls e l e c t i o no fs t r a i n sc a r r y i n gc h r o m o s o m a l l yl o c a t e da n t i b i o t i c - r e s im a r k e r s .

A b b r e v i a t i o n s :P G ,p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ;C L ,c a r d i o l i p i n ;c S D R ,c o n -s t i t u t i v es t a b l eDNA r e p l i c a t i o n ;I P T G ,i s o p r o p y lf - D - t h i o g a l ar a n o s i d e .* T owhom r e p r i n tr e q u e s t s s h o u l db e a d d r e s s e d .

7 8 3

T h e p u b l i c a t i o nc o s t so f t h i sa r t i c l ew e r ed e f r a y e di np a r tb y p a g e c ha rg ep a y m e n t .T h i s a r t i c l em u s tt h e r e f o r eb e h e r e b ym a r k e d a d v e r t i s e m en ti na c c o r d a n c ew i th 1 8U . S . C .§ 1 7 3 4s o l e l yt o i n d i c a t et h i sf a c t .

7/23/2019 Phospholipids in DNA

http://slidepdf.com/reader/full/phospholipids-in-dna 2/5

7 8 4 B i o c h e m i s t r y :X i a a n d Dowhan

Ta b l e 1 . S t r a i n sa n d p l a s m i d s

S t r a i n so rp l a s m i d R e l e v a n tc h a r a c t e r i s t i c ( s ) S o u r c eo r r e f .

S t r a i nM G 1 6 5 5 W i l d t y p e G . W e i n s t o c kKA2 186 A r e c As r l : : T n l O G . We i n s t o c kGE4 50 m a l G : : T n l O G . We i n s t o c kGE1 52 l e x A D e f ) 5 1 G . We i n s t o c k

K H G 7 1 2 r n h A l : : T n 3 T . H o r i u c h iHDL1001* p g s A 3 0 : : k a nt 4 l a c O P - p g s A + ] Il a c Z 2 0l a c Y:: T n 9r e c As r l : : T n l O

HDL11 p g s A 3 0 : : k a n4 D l a c O P - p g s A + ] 1l a c Z 2 1l a c Y : : T n 9l p p 2z d g : : T n l O

H D 3 0 t p g s A 3 0 : : k a n 1 9H L 3 0 t H D 3 0 ,I p p 2 z d g : : T n l O ;P 1 :HD30 x HDL11 T h i s w o r kH R 3 0 t H D 3 0 ,r n h A l : : T n 3 ;P 1 :HD30 x K H G 7 1 2 T h i s w o r kH L R 3 0 t H L 3 0 ,r n h A l : : T n 3 ;P 1 :HL30 x K H G 7 1 2 T h i s w o r kMDL12* p g s A 3 0 : : k a nD [ l a c O P - p g s A + ] 1l a c Z T h i s w o r k

l a c Y : : Tn 9 ; P 1 :MG1655x HDL1001M R 1 2 MDL12, r n h A l : : T n 3 ;P 1 :M D L 1 2x K H G 7 1 2 T h i s w o r kM R A 1 2 * M R 1 2 ,A r e c As r l : : T n l O ;P 1 :M R 1 2 x KA2186 T h i s w o r kMRM12 MR12, m a l G : : T n l O ;P 1 :M R 1 2 x GE450 T h i s w o r kM R L 1 2 M R 1 2 ,l e x A ( D e f ) 5 1 ;P 1 :M R M 1 2x GE152 T h i sw o r kM R L A 1 2 MRL12, A r e c As r l : : T n l O ;P 1 :M R L 1 2x KA2186 T h i s w o r k

P l a s m i dpHD102 p g s A +c a m ro r i f s 1 9

p M M 5 p B R 3 2 2 ,r n h A +a m p rt e t r 2 2pAC11 o r i C m i o C +s p e c r p r J . Z y s k i n dpAC12 o r i C m i o C -s p e c rs t r e p r J . Z y s k i n d

R e l e v a n tc h a r a c t e r i s t i c sa r e a p a r t i a ll i s to f g e n e t i cm a r k e r s .G . We i n s t o c ki s a t U n i v e r s i t yo f T e x a sM e d i c a lS c h o o l ,H o u s t o n ;T .H o r i u c h ii sa t K y u s h uU n i v e r s i t y ,F u k u o k a ,J a p a n ;J . Z y s k i n di sa t S a nD i e g oS t a t eU n i v e r s i t y ,S a n D i e g o .* R e q u i r e sIPTG f o rv i a b i l i t y .t R e q u i r e sp l a s m i dp H D 1 0 2f o rv i a b i l i t y .

M e a s u r e m e n to f D e p e n d e n c eo n a F u n c t i o n a lp g s AG e n e .IPTG w a s w a s h e do u t o f c u l t u r e so f s t r a i nM D L 1 2a n d i t sd e r i v a t i v e sa f t e rg r o w t ho v e r n i g h ti n t h ep r e s e n c eo f IPTG( 2 0 ) .C e l l sw e r e d i l u t e da n d p l a t e di n e q u a l p o r t i o n so n LBa g a r p l a t e s ,e i t h e rw i t h o r w i t h o u t I P T G . C o l o n yn u m b e r s 1 0 - 5 0 0c o l o n i e sp e r p l a t e )w e r e s c o re da f t e ri n c ub a t i o n o ft h ep l a t e sf o r 2 4 - 3 6 h r , a n d t h e p e r c e n t a g eo f c e l l sf o r m i n gc o l o n i e si n t h ea b s e n c eo fIPTG I P T Gi n d e p e n d e n c ei n d e x ,a v e r a g eo f t h r e ee x p e r i m e n t s )w a sc a l c u l a t e db yc o m p a r i n gt h ec o l o n yn u m b e ri nt h ea b s e n c eo f IPTG t o t h a ti nt h ep r e s e n c eo fI P T G .A s i m i l a ra p p r o a c hw a s u s e d t o t e s tt h es u p p r e s s i o no f t h e t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v eg r o w t h p h e n o t y p eo f s t r a i n sHR30 a n d HLR30 ( b o t hc a r r y i n gp l a s m i dp H D 1 0 2 ) ,e x c e p tw i t h t h e s es t r a i n st h e p e r m i s s i v ec o n d i t i o n sw e r e g r o w t ha t3 0 ° C a n d t h e r e s t r i c t i v ec o n d i t i o n sw e r e g r o w t h a t 4 2 ° C .G r o w t ho f a l lt h e a b o v es t r a i n su n d e rr e s t r i c t i v ec o n d i t i o n sf o rp e r i o d s l o n g e rt h a n 3 6 h r r e s u l t e di n f o r m a t i o no f a d d i t i o n a lc o l o n i e sd u e t oc o n s t i t u t i v em u t a t i o n si nt h el a cp r o m o t e r( 2 0 )o r t e m p e r a t u r e - r e s i s t a n tm u t a n t so fp l a s m i dpHD102 ( 1 9 )a s

r e p o r t e d .A s s a yf o rP l a s m i dS t a b i l i t y .A n o v e r n i g h tc u l t u r eg r o w ni nt h ep r e s e n c eo f IPTG a n d t h e a p p r o p r i a t ea n t i b i o t i c[ s p e c t i -n o m y c i n( 5 0g g / m l )a n ds t r e p t o m y c i n( 5 0, t g / m l )f o rp l a s m i d spAC11 a n d pAC12 o r t e t r a c y c l i n e( 1 0j i g / m l )f o r p l a s m i dp B R 3 2 2 ]w a s d i l u t e di n t oa n t i b i o t i c - f r e eLB medium e i t h e rw i t h o r w i t h o u tI P T G .T h ec u l t u r e sw e r e k e p t i n e x p o n e n t i a lg r o w t hf o r6 - 1 4g e n e r a t i o n sb yd i l u t i o nw i t hf r e s hm e d i u m .A tt h e i n d i c a t e dt i m e p o i n t s ,d i l u t i o n so ft h ec u l t u r ew e r e s p r e a do n LB a g a r p l a t e si n t h ep r e s e n c e o f IPTG e i t h e rw i t h o rw i t h o u t t h ea p p r o p r i a t ea n t i b i o t i c ( s )t o d e t e r m i n et h ep e r -c e n t a g eo f c e l l sr e t a i n i n gt h ec o r r e s p o n d i n gp l a s m i d ( s ) .

O t h e rP r o c e d u r e s .P h o s p h o l i p i dc o m p o s i t i o no f c e l l su n i -f o r m l yl a b e l e d w i t h 3 2 p O 4wa s d e t e r m i n e da s d e s c r i b e d( 2 0 ) ,e x c e p t t h e r a d i o l a b e lw a s d e t e ct eda n d q u a n t i f i e du s i n ga

B e t a s c o p e B e t a g e n e ,W a l t h a m ,M A ) .P h o s p h a t i d y l g lp h o s p h a t es y n t h a s ea c t i v i t yw a sd e t e r m i n e da sd e s c r i b e d( 1 8 )

R E S U LT SS u p p r e s s i o no fp g s AM u t a n t sb y I n d u c t i o no f c S D R .C o l o n y

f o r m a t i o nb y s t r a i nM D L 1 2 o n LB a g a r p l a t e si s I P T G -d e p e n d e n td u e t o a l a c ko f s u f f i c i e n ta n i o n i cp h o s p h o l is y n t h e s i st o s u s t a i nc e l lg r o w t hu n d e rr e p r e s s e dc o n d i t i o n sf o rt h e t 4 l a c O P - p g s A + ]g e n e ( 2 0 ) .A n i o n i cp h o s p h o l i p i d si n t h ep r e s e n c eo fA TPw e r ed e m o n s t r a t e dt o r e a c t i v a t et h ei n a c t i vADP f o r mo f D n a Ap r o t e i nf o rc o n t i n u i n gr o u n d so f i n i t i a t i oo fDNA r e p l i c a t i o na t t h eo r i C s i t ei n v i t r o( 2 ) .S i n c ea n r n h Am u t a t i o ns u p p r e s s e st h er e q u i r e m e n tf o ra f u n c t i o n a lD n a Ap r o t e i n ,s u c h a m u t a t i o nm ay a l s os u p p r e s st h eg r o w t ha r r e s tp h e n o t y p eo f t h er e p r e s s e d( I [ l a c O P - p g s A + ]m u t a n tt h e r e bl i n k i n ga n a n i o n i cp h o s p h o l i p i dr e q u i r e m e n tt o D n a Ap r o t e if u n c t i o ni n v i v o .

W i t hs t r a i nM D L 1 2( r n h A + )a s c o n t r o l ,t h eIPTG i n d e p ed e n c ei n d e xo ft h es t r a i nM R 1 2( r n h A )w a s d e t e r m i n e d( F i g1 ) ;8 5 o f t h eM R 1 2c e l l sw e r e I P T G - i n d e p e n d e n ta n d o n l y2 o f t h eM D L 1 2c e l l sw e r e I P T G - i n d e p e n d e n t .T h e IPTGi n d e p e n d e n c ei n d e x o f s t r a i nM R 1 2w a s v e r y s i m i l a rt o t h ep l a t i n ge f f i c i e n c y 8 0 ) o f d n a A 4 6 f s - c o n t a i n i n gc e l l sa t t h er e s t r i c t i v et e m p e r a t u r e( 4 2 ° C )v s .t h ep e r m i s s i v et e m p e r a t u r e( 3 0 ° C )a f t e ri n t r o d u c t i o no f a n r n h Am u t a t i o n( 9 ) .T h e2 o fM D L 1 2c e l l st h a tf o r m e dc o l o n i e si n t h ea b s e n c eo f IPTGs h o w e da l a c ko fr e p r e s s i o no f t h el a c O Pp r o m o t e r ,w h i c hi st h em o s t c o m m o n s p o n t a n e o u sm u t a t i o nl e a d i n gt o IPTG i n d ep e n d e n c e( 2 0 ) .T h u s ,t h eg r o w t h - a r r e s tp h e n o t y p ed u e t o am u t a t i o ni nt h ea b i l i t yt o m a i n t a i na n o r m a ll e v e lo f t h em a j o ra n i o n i cp h o s p h o l i p i d sc a n b e s u p p r e s s e db y a m u t a t i o nr e n -d e r i n gc e l l si n d e p e n d e n to f D n a A p r o t e i na n d t h e o r i C s i t ei . e . ,b yu t i l i z i n gc S D R .I n t r o d u c t i o no f p l a s m i dp M M 5 r n h A + )

P r o c .N a t l .Acad S c i .U S A9 2 ( 1 9 9 5 )

7/23/2019 Phospholipids in DNA

http://slidepdf.com/reader/full/phospholipids-in-dna 3/5

P r o c .N a t l .Acad S c i .US A9 2 1 9 9 5 ) 7 8 5

85 8 67 - ~ ~

M D L1 2 M R1 2 r n h A ) M R 1 2 1 p M M 5 M R A 1 2 MRLA12

r n h A / r n h A + ) r n h A. r e c A ) n h A . r e c A . l e x A )

Ta b l e 3 . P h os p h o li p i d c o m p o s it i o n so f s t r a i n sd e r i v e df r o mM D L 1 2

C o m p o s i t i o n , C o l o n y + IPTG - I P T G

f o r m a t i o nS t r a i n - I P T G ) P E P G CL P E P G CL

M D L 1 2 - 6 9 . 3 1 6 . 6 2 . 8 8 4 . 4 5 . 8 0 . 8M R 1 2 + 6 9 . 9 1 7 . 7 2 . 1 8 5 . 2 4 . 5 0 . 6M R 1 2 / p M M 5 - 6 9 . 1 1 9 . 1 2 . 5 8 3 . 4 5 . 0 0 . 7M R A 1 2 - 7 0 . 7 1 8 . 72 . 0 8 5 . 8 2 . 7 0 . 4M R L A 1 2 + 6 9 . 2 1 8 . 7 2 . 5 8 6 . 1 3 . 7( D e v i a t i o n ) ( ± 2 . 8 )( ± 1 . 9 ) ( ± 0 . 2 )( ± 1 . 7 )( ± 0 . 4 ) ( ± 0

P E , p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e .

F I G .1 . IPTG d e p e n d e n c eo f s t r a i nM D L 1 2a n d i t sd e r i v a t i v e s .A l ls t r a i n sw e r e f i r s tg r o w ni n t h ep r e s e n c e o f I P T G , a n d t h e IPTGi n d e p e n d e n c ei n d e xw a sd e t e r m in e d . E r ro rb a r ss h o w i n gt h eS E Ma r ei n d i c a t e d .

i n t o s t r a i nM R 1 2r e t u r n e d t h eIPTG i n d e p e n d e n c ei n d e xt o4 ( F i g .1 ) ,t h e r e b yv e r i f y i n gt h a ts u p p r e s s i o ni n s t r a i nM R 1 2w a s d i r e c t l yr e l a t e dt o t h er n h Am u t a t i o n .

I n i t i a t i o no f DNA r e p l i c a t i o na t t h eo r i K s i t e si n a s t r a i nc a r r y i n ga n r n h Aa l l e l ei sR e c A - p r o t e i n - d e p e n d e n t( 1 5 ) .RecAp r o t e i ni se s s e n t i a lf o rr e c o m b i n a t i o na n d t h eS OS DNA r e p a i rs y s t e m( 2 7 ,2 8 )t h r o u g h i t s i n t e r a c t i o nw i t h s i n g l e - s t r a n d e dD N A .T h eRecA p r o t e i nr e q u i r e m e n tf o rcSDRm ay s i m i l a r l yi n v o l v et h e b i n d i n ga n d s t a b i l i z a t i o no f s i n g l e - s t r a n d e dDNAa t t h eo r i Ks i t e sf o ra s s e m b l yo f t h er e p l i c a t i o nc o m p l e xi nt h ea b s e n c eo f f u n c t i o n a lD n a Ap r o t e i n( 2 9 ) .I nt r o du c t io n o ft h eA r e c Aa l l e l ei n t os t r a i nM R 1 2 r e d u c e d t h eIPTG i n d e p e n -d e n c ei n d e xt o 0 . 4 ( F i g .1 ) ,f u r t h e rs u p p o r t i n gt h e i n d u c t i o no f cSDR a s t h e m e c h a n i s mf o r s u p p r e s s i o no f t h ep g s Am u t a t i o n .

B e s i d e s R e c A - p r o t e i n - d e p e n d e n tc S D R , T o r r e y a n dKogoma ( 1 6 )h a v e r e p o r t e d t w o R e c A - p r o t e i n - i n d e p e n d e n tcSDR m o d e s ,o n e o fw h i c ho c c u r s i nc e l l sw i t h t h ef o l l o w i n gg e n o t y p e :r n h Ar e c A l e x A ( D e f ) .T h e LexA p r o t e i n ,w h i c hi s

i n a c t i v a t e db y t h eRecA p r o t e i ni n r e s p o n s et o DNA d a m a g e ,n o r m a l l ya c t st o s u p p r e s sg e n e si n d u c e di n t h eS OS r e s p o n s eo f c e l l st o DNA d a m a g e ;i n a l e x A D e f )s t r a i nt h e s eg e n e sa r ec o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s e d( 2 8 ) .A l t h o u g ht h ee x a c t m e c h a n i s mo f r e c A + - i n d e p e n d e n tcSDR i s n o t k n o w n ,i t i s p o s s i b l et h a tamong t h e d e r e p r e s s e dSOS g e n e s , o n e g e n e p r o d u c t i se x p r e s s e dt h a tc r e a t e s a RecA p r o t e i ns u b s t i t u t et ob y p a s st h er e q u i r e m e n tf o rRecA p r o t e i ni ncSDR ( 1 6 ) .S t r a i nM R L A 1 2[ r n h Ar e c Al e x A ( D e f ) ]s h o w e da n IPTG i n d e p e n d e n c ei n d e xo f8 6 ( F i g . 1 )c o n s i s t e n tw i t h a p r e d i c t e dr e c A + - i n d e p e n d e n tcSDR s u p p r e s s i o no f t h er e q u i r e m e n tf o rD n a A p r o t e i n .

A n i o n i cp h o s p h o l i p i dm e t a b o l i s mi n a l lt h eM D L 1 2d e r i v -a t i v e sw a si n v e s t i g a t e dt o a s s u r e t h a ti n d u c t i o no f cSDRh a dn oe f f e c to n p h o s p h a t i d y l g l y c e r o p h o s p h a t es y n t h a s ea c t i v i t yl e v -e l s( T a b l e2 )o r p h o s p h o l i p i dc o m p o s i t i o n( T a b l e3 )f o ra l lt h es t r a i n s .C e l l sg r o w ni n t h e a b s e n c eo f IPTG f o r5 h r s h o w e d

Ta b l e 2 . P h o s p h a t i d y l g l y c e r o s p h o s p h a t es y n t h a s ea c t i v i t i e so fs t r a i n sd e r i v e df r o mM D L 1 2

C o l o n y S p e c i f i ca c t i v i t y ,u n i t s / m gf o r m a t i o n

S t r a i n - I P T G ) + IPTG - IPTG

M D L 1 2 - 1 . 0 8± 0 . 1 1 0 . 2 5± 0 . 0 4M R 1 2 + 1 . 1 1± 0 . 1 3 0 . 2 2± 0 . 0 5MR12/pMM5 - 1 . 3 1± 0 . 0 3 0 . 2 1± 0 . 0 5M R A 1 2 - 1 . 5 1± 0 . 2 9 0 . 2 1± 0 . 0 4M R L A 1 2 + 1 . 0 3± 0 . 1 8 0 . 1 8± 0 . 0 4

S p e c i f i ca c t i v i t y :1 u n i to f e n z y m ea c t i v i t yi s d e f i n e da s t h eamounto f e n z y m et h a tc o n v e r t s 1 n m o l o f g l y c e r o l3 - p h o s p h a t ei n t oac h l o r o f o r m - s o l u b l ep r o d u c ti n 1 m i n .

t h e e x p e c t e dr e d u c t i o ni n enzyme a c t i v i t ya n d a n i o n i cp h o s -p h o l i p i dc o n t e n t .

To t e s tw h e t h e rt h e i n i t i a t i o no f DNA r e p l i c a t i o ni s t h e o n l ye s s e n t i a lc e l lp r o c e s s d e p e n d e n ton a n i o n i cp h o s p h o l i p i d s ,a nr n h A m u t a t i o nwas i n t r o d u c e di n t ot wo p g s A : : k a nn u l la l l e ls t r a i n sl ac k i ng t h e4 F [ l a c O P - p g s A + ]a l l e l e( 1 9 , 2 1 ) ,r e s u l t i n gi ns t r a i n sHR30 a n d HLR30. Th e p a r e n t s t r a i n sa r e d e p e n d e nf o rg r o w t hon p l a s m i dpHD 10 2 p g s A + ) ,w h i c hi s i t s e l ft e m -p e r a t u r e - s e n s i t i v ef o rr e p l i c a t i o n .The I pp m u t a t i o n[ n o r m a l l ye n c o d e st h e m a j o ro u t e r membrane l i p o p r o t e i n( 3 0 ) ]i ns t r a iHLR30 i s a s u p p r e s s o r o f t h e I P T G d e p e n d e n c eo f t h eD [ l a c O P - p g s A + ]a l l e l eb u t n o t o f a n u l la l l e l eo f t h e p g s Ag e n e( 2 1 ) .E x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a ts t r a i n sHR30 a n dHLR30r e m a i n e dt e m p e r a t u r e - s e n s i t i v ef o rg r o w t ha n d , t h e r ef o r e ,d e p e n d e n ton a f u n c t i o n a l p g s A g e n e t h a tc a n n o t b eb y p a s s e db y i n d u c t i o no f c S D R d a t a n o t s h o w n ) .T h e r e f o r et h e r e m u s t b e e s s e n t i a lr e q u i r e m e n t sf o ra n i o n i cp h o s p h o l i p i do t h e r t h a n D n a A p r o t e i n f u n c t i o n even i n t h e p re sence o fa n o t h e rknown p a r t i a ls u p p r e s s o r ( I p p )o f t h e pgsA g e n e ( 3 1 )

D e p e n d e n c eo f o r i CP l a s m i dM a i n t e n a n c eon A n i o n i cP h o s -p h o l i p i d s .A s a n i n d e p e n d e n tm e a s u r e o f t he r e q u i r e m e n tf o ra n i o n i cp h o s p h o l i p i d sf o rD n a A - p r o t e i n - d e p e n d e n ti n i t i a t ia t t h e o r i C s i t e ,t h e s t a b i l i t yo f p l a s m i d s p A C 1 1a n d pAC12)d e p e n d e n ton o r i C f o r r e p l i c a t i o nwas e x a m i n e du n d e r c o n -

d i t i o n so f l i m i t i n ga n i o n i c p h o s p h o l i p i ds y n t h e s i s .P l a s m i dpBR322 w a s u s e das a c o n t r o ls i n c ei t sr e p l i c a t i o ni nv i v oi sn o td e p e n d e n to n t h e D n a A p r o t e i n ( 3 2 ) .B o t ho r i C p l a s m i d sa n dpBR322 ar e p a r t i t i o n e d r a n d o m l ya t c e l ld i v i s i o n ,a n d t h e is t a b i l i t yo f i n h e r i t a n c ei s p r o p o r t i o n a lt o t h e c o p y number i nt h e c e l l( 3 3 ) .P l a s m i dpAC11 h a s a h i g h e r c o p y number t h a np l a s m i dp A C 1 2 3 0 v s . 6 c o p i e s ;A . C h i a r a m e l l oa n d J . W .Z ys k i nd , p e r so n a lc o m m u n i c a t i o n )d u e t o t h e mioC+ l o c u s( 3 4 ,3 5 ) a n d , t h e r e f o r e ,s h o u l d p a r t i t i o ns i m i l a r t o p l a s m i dpBR322 a t d i v i s i o n .

N e i t h e r p l a s m i d pAC11 n o r p A C 1 2 y i e l d e d s i g n i f i cn u m b e r so f t r a n s f o r m a n t s( 2 ± 2 or f e w e rt r a n s f o r m a n t sper1 0 n g o f p l a s m i dD N A )o f s t r a i nM R 1 2( IPTG i n d e p e n d e n twhen c e l l sw e r e p l a t e d i n t h e a b s e n c eo f IPTG. B o t hp l a s m i d sr e s u l t e d i ns i m i l a r l yh i g h n u m b e r so f t r a n s f o r m a n t s 1 7 0 ± 2 0

t r a n s f o r m a n t sp er 1 0 n g o f p l a s m i dD N A ) when c e l l swerep l a t e d i n t h e presence o f I P T G . I n c o n t r a s t , t h e t r a n s f o r m at i o ne f f i c i e n c yo f s t r a i nM R 1 2b y p l a s m i dpBR322 was s i m i lu n d e rb o t h p l a t i n gc o n d i t i o n s( p l u sI P T G ,8 8 1 6 t r a n s f o r -m a n t s p er 1 0 p g o f p l a s m i dD N A ; m i n u s I P T G , 7 5 ± 1 5t r a n s f o r m a n t sper 1 0 p g o f p l a s m i dDNA).

Th e s t a b i l i t yo f p l a s m i d spAC11 a n d p A C 1 2 v s . p l a s m i dpBR322 w a s f u r t h e r e x a m i n e di n s t r a i n sM D L 1 2a n d M R 1 2grown i nl i q u i dm e d i u m i n t h e p re sence a n d a b s e n c eo f IPTG.S t r a i n M D L 1 2w i l lc o n t i n u e t o g r o w s l o w l yi n l i q u i dm e d i u meven a f t e ri t r e a c h e s i t s m i n i m u ma n i o n i c p h o s p h o l i p i dc o n -

t e n t ,w h i c hr e q u i r e sa b o u tseven g e n e r a t i o n so f g r o w t hi n t h ea b s e n c eo f I P T G ( 2 0 ) .Du e t o t h e r n h Am u t a t i o nt h e g r o w t ho f s t r a i nM R 1 2i s I P T G - i n d e p e n d e n ti n l i q u i dm e d i u m .W i t h -o u t d r u g s e l e c t i o n ,p l a s m i dpBR322 i s l e s ss t a b l e i n r n h Amutants t h a n i nw i l d - t y p ec e l l s ,b u t t h i so n l yb e c o m e sa p p a r e n t

1 0 0

x

O 8 0

a 6 0 -

Pt

4 4 0 ,laS

0 2 0 -

B i o c h e m i s t r y :X i a a n dDowhan

7/23/2019 Phospholipids in DNA

http://slidepdf.com/reader/full/phospholipids-in-dna 4/5

7 8 6 B i o c h e m i s t r y :X i a a n dDowhan

a f t e rg r o w t hf o rmany m o r eg e n e r a t i o n st h a n e m p l o y e dh e r e( 9 ) . A l t h o u g ht h e p e r c e n t a g eo f c e l l sr e t a i n i n gt h e o r i Cp l a s m i d s i n t h e a b s e n c e o f d r u g s e l e c t i o nd e c r e a s e da s af u n c t i o no fg e n e r a t i o nn u m b e re v e ni n t h e p r e s e n c eo f I P T G ,c e l l so f b o t hs t r a i n sM D L 1 2a n d M R 1 2g r o w i n gw i t h o u tI P T Gl o s tt h eo r i Cp l a s m i d sa ta s i g n i f i c a n t l y f a s t e rr a t e( F i g .2 )w h i l ep l a s m i d pBR322 w a s s t a b l eu n d e r a l l g r o w t h c o n d i t i o n s .T h e r e f o r e , t h e r e i s a c l e a rd e p e n d e n c eo f o r i C p la s mi d sf o r

s t a b l em a i n t e n a n c e o ne i t h e rt h el e v e lo r r a t eo f s y n t h e s i so fa n i o ni c p h o s ph o li p i d s.

DISCUSSIONT h ed e p e n d e n c yo f c e l li n t e g r i t yo n membrane p h o s p h o l i p i d sa n d t h er e q u i r e m e n tf o rs p e c i f i cp h o s p h o l i p i d sf o rm a n y c e l lp r o c e s s e sa r e t w o s e p a r a t eb u t r e l a t e df u n c t i o n so f p h o s p h o -l i p i d s .Du e t o t h ed i f f i c u l t yi n s y s t e m a t i c a l l ya l t e r i n gm e m -b r a n e p h o s p h o l i p i dc o m p o s i t i o nw i t h o u t c a u s i n gc e l ld e a t h ,t h em a j o r i t yo f e v i d e n c ef o rs p e c i f i cr o l e sf o rp h o s p h o l i p i d si nm o s tc e l l u l a rp r o c e s s e sh a s come f r o mr e s u l t so b t a i n e db y i nv i t r os t u d i e sw i t h l i t t l ei n v i v od a t a a v a i l a b l et o s u p p o r tt h e s ei n v i t r or e s u l t s .I n E . c o l i ,a m u t a n ti nw h i c ht h eP G - p l u s - C Lc o n t e n to fc e l l sc a n b e s y s t e m a t i c a l l yr e g u l a t e da sa f u n c t i o no f

IPTG ( 2 0 )h a s b e e nu s e d t o e s t a b l i s ht h ei n v i v or e q u i r e m e n tf o r a n i o n i cp h o s p h o l i p i d si n t h e S e c A - p r o t e i n - d e p e n d e n tt r a n s l o c a t i o no fp r o t e i n sa c r o s s t h e i n n e r m e m b r a n e( 3 6 ,3 7 ) .S e c Ap r o t e i nh a s l a t e n tA T P a s ea c t i v i t yt h a ti s a c t i v a t e di nv i t r ou p o na s s o c i a t i o no f t h i sc y t o p la s m i c p r o te i nw i t h a n i o n i cp h o s p h o l i p i d - c o n t a i n i n gm e m b r a n e s( 3 6 , 3 7 ) .T h eD n a A p r o -t e i ni s a l s oa c y t o p l a s m i cATPase t h a ti s d r a m a t i c a l l ya l t e r e di n i t si n t e r a c t i o nw i t h A TP b y a s s o c i a t i o nw i t h a n i o n i cp h o s -p h o l i p i d si n v i t r o( 2 ,3 ) .B a s e d o nt h e s es i m i l a r i t i e s ,t h ea b o v em u t a t i o ni n a n i o n i c p h o s p h o l i p i ds y n t h e s i s( s t r a i nMDL12)w a s u t i l i z e dt o o b t a i n i n v i v oe v i d e n c et o s u p p o r tt h ei n v i t r oe v i d e n c ef o r t h ed e p e n d e n c eo f D n a A p r o t e i nf u n c t i o n o na n i o n i cp h o s p h o l i p i d s .

S i n c ea m u t a t i o ni nt h er n h Ag e n e a l l o w si n i t i a t i o no f DNAr e p l i c a t i o ni n d e p e n d e n to f t h e D n a Ap r o t e i na n d t h eo r i Cs i t e( 1 4 ) ,a s t r a i nc a r r y i n ga n r n h Aa l l e l es h o u l d b y p as st h en e e df o ra l lc e l l u l a rc o m p o n e n t ss p e c i f i c a l l yr e q u i r e df o ri n i t i a t i o na tt h eo r i C s i t e .Ou r r e s u l t sc l e a r l yd e m o n s t r a t et h a ta n r n h Am u t a t i o nc a n s u p p r e s st h eg r o w t ha r r e s tp h e n o t y p eo f m u t a n t sd e f e c t i v ei n a n i o n i cp h o s p h o l i p i ds y n t h e s i sa n d t h u ss t r o n g l y

Z

B1 0 0 1

5 03 0

1 05

_- .zx

0 2 4 6 8 1 0 1 2

Cl a 10 0* R 5 0S 3 0

I 1 05

s - 0-0

* 0

D1005 0 :

3 0

1 05

2 4 6 8 1 0 1 2 1 4G e n e r a t i o n s

s u p p o r tt h e h y p o t h e s i st h a ta n i o n i cp h o s p h o l i p i d sa r e r e q u i r e df o rt h ei n i t i a t i o no f DNA r e p l i c a t i o na t t h eo r i C s i t ei n a nr n h A +s t r a i n .T h e s u p p r e s s i o nb y t h e r n h A 4m u t a t i o nh a d t h ep r o p e r t i e se x p e c t e df r o m t h e c S D R - d e p e n d e n tb yp a s s o ft h eD n a Ap r o t e i na n d t h e o r i Cs i t e .T h es u p p r e s s i o nw a sr e v e r s e db y a p l a s m i dc a r r y i n g t h er n h 4+ g e n e ,w a sd e p e n d e n to n RecAp r o t e i n i n a l e x A+ b a c k g r o u n d ,a n d w a s R e c A - p r o t e i ni n d e p e n d e n ti n a l e x A D e f )b a c k g r o u n d .In a n i n d e p e n d e n

m e a s u r eo f i n v i v oD n a A p r o t e i n f u n c t i o n ,i t w a s s h o w nt h a tp l a s m i d sd e p e n d e n to n a n o r i C s i t ef o rr e p l i c a t i o n ,a n d t h e r ef o r eD n a Ap r o t e i n ,w e r eh i g h l yd e p e n d e n to n n o r m a la n i o n i cp h o s p h o l i p i ds y n t h e s i s f o rs t a b l em a i n t e n a n c ei n t h e a b s e n c eo f o t h e r s e l e c t i v ef o r c e s .F i n a l l y ,s u p p r e s s i o no fIPTG d e p e n -d e n c eb y a n r n h Am u t a t i o nw a s n o t t h er e s u l to f a r e t u r n t on o r m a la n i o n i c p h o s p h o l i p i dm e t a b o l i s m .

T h em o d e li nF i g .3 s u m m a r i z e st h e i nv i v oa n d i nv i t r od a t ao n t h e i n v o l v e m e n to f a n i o ni cp h o s p h o l i p i d si nD n a Ap r o t e if u n c t i o na n d t h e p r o p o s e dm e c h a n i s mo f s u p p r e s s i o no f t h ep g s Am u t a t i o nb y a n r n m h Am u t a t i o n .B a s e do n t h i sm o d e l ,i ts h o u l db e p o s s i b l et oi s o l a t em u t a n t si nt h eD n a Ap r o t e i ni t s e lt h a ta l s os u p p r e s st h eIPTG r e q u i r e m e n tf o rs t r a i nMDL12.Inv i t r o ,s u c h m u t a t e dD n a A p r o t e i n ss h o u l de i t h e rb e i n d e p e n -d e n t o f a n i o n i c p h o s p h o l i p i d sf o ra c t i v a t i o no r b e a l t e r e di nt h e i ri n t e r a c t i o np r o p e r t i e sw i t h a n i o n i c p h o sp h o l i p i dI n i t i am u t a n ts c r e e n i n g sh a v eg e n e r a t e da c o l l e c t i o no f m u t a t i o n si na p l a s m i d b o r n e c o p y o f t h e d n a A g e n e t h a ta p p e a r s t os u p p r e s st h eI PTG r e q u i r e m e n tf o rs t r a i nM D L 1 2( d a t an o ts h o w n ) .

T h e i n a b i l i t yt o s u p p r e s sa n u l la l l e l eo f t h ep g s Ag e n ev i ai n d u c t i o no f cSDR i s s i m i l a rt o t h e r e s u l t sw i t h a m u t a t i o ni nt h eI p pg e n et h a tc a n o n l ys u p p r e s s p g s Aa l l e l e sc a p a b l eo f somer e s i d u a ll e v e lo fa n i o n i cp h o s p h o l i p i ds y n t h e s i s( 21 , 3 1 ) .T h el i m i t i n gl e v e lo f a n i o n i c p h o s p h o l i p i da t t h ep o i n to f c e l lg r o w t ha r r e s ti n a p g s An u l l s t r a i n( 1 9 )i s v e r y s i m i l a rt o t h eb a s a ll e v e lo f a n i o n i c p h o s p h o l i p i di n t h e r e g u l a t e ds t r a i ng r o w ni n t h e a b s e n c eo f I P T G ,w h i c hd o e s n o t r e s u l ti n c e l ld e a t hb u t s i m p l ya r e d u c t i o ni nt h eg r o w t hr a t eo f t h e c e l l( 2 0 )T h e r e f o r e ,t h e r ea p p e a rt ob e m u l t i p l ee s s e n t i a lr e q u i r e m e n tf o ra n i o n i cp h o s p h o l i p i d sw i t h d i f f e r e n tm i n imumt h r e s h o lf o re a c h e s s e n t i a lf u n c t i o n .

T h e e f f e c to f r e d u c e d a n i o n i c p h o s p h o l i p i do n p r o t e it r a n s l o c a t i o ni s n o t a b s o l u t eb u t i s r e f l e c t e di n a g r e a t lr e d u c e dr a t eo f t r a n s l o c a t i o ni n p r o p o r t i o nt o t h er e m a i n i n ga n i o n i cp h o s p h o l i p i d s( 3 8 ,3 9 ) . S i m i l a r l y ,t h ed i r ec t r e l a t is h i pb e t w e e nt h e r a t e o f s y n t h e s i so f a n i o n i cp h o s p h o l i( i . e . ,t h el e v e lo f t h ep g s Ag e n e p r o d u c t )a n d t h eg r o w t hr a t ef o rI P T G - d e p e n d e n tc e l l s( 2 0 )m i g h tb e a r e s u l to ft h e r e d u c e dr a t eo f i n i t i a t i o nb y t h eD n a A p r o t e i n ,w h i c hw o u l da f f e c tt h e

( a c t i v e ) ( i n a c t i v e )PAT P * RNase H GR N a s e H

AT P ~ j TP iP

ADP PA D Po n( i n a c t i v e ) G r K C ( i n a c t i v e ) r i

G ADNA r e p l i c a t i o na t o r i Ci np g s A + ,r n h A +s t r a i n

o0

0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4G e n e r a t i o n s

F I G . 2 . S t a b i l i t yo f o r i C p l a s m i d si n t h e s t r a i n sl a c k i n g a n i o n i cp h o s p h o l i p i d s .S t r a i n s M D L 1 2 A a n d B ) a n d M R 1 2 C a n d D)c a r r y i n gp l a s m i dpBR322 ( - , p l u s I P T G ;L o ,m i n u sI P T G ) ,pAC11 ( 0 ,p l u s I P T G ;0, m i n u sI P T G ) ,or pAC12( - , p l u s I P T G ; A m i n u sIPTG)w e r e g r o w n i nLB m e d i u mw i t h o u ta n t i b i o t i c s .Th e p e r c e n t a g eo f c e l l ss t i l lc a r r y i n g a p l a s m i dwas d e t e r m i n e da f t e rt h e i n d ic a t ednumber o fg e n e r a t i o n s .

DNA r e p l i c a t i o na t o r i Ki np g s A ,r n h As t r a i n

F I G .3 . M o d e lf o r t h e i n i t i a t i o no f DNA r e p l i c a t i o ni n E . c o l iU n d e rn o r m a lc o n d i t i o n si n i t i a t i o no f DNA r e p l i c a t i o ni sr e s t r i c t e dt ot h eo r i Cs i t ea n d d e p e n d e n to n t h eDnaAp r o t e i nd u e t o t h ed i g e s t io f RNA p r i m e r sa t t h eo r i Ks i t e sb y RNase H . A n i o n i cp h o s p h o l i( s y n t h e s i z e db y t h ep g s Ag e n ep r o d u c t )f a c i l i t a t et h eg e n e r a t i o no f t h ea c t i v eA TP f o r mo f t h e D n a Ap r o t e i n .T h ep r o p o s e dr e q u i r e m e n tf o ra n i o n i cp h o s p h o l i p i d si nm a i n t a i n i n gf u n c t i o n a lD n a Ap r o t e i nc a n b es u p p r e s s e dt h r o u g hi n d u c t i o no f cSDR i n a n r n h / Am u t a n tb y p e r m it i n gi n i t i a t i o na t t h eo r i Ks i t e sw h e r eRecA p r o t e i nm a y s u bs t i t u t eD n a A p r o t e i n .

P r o c . N a t l .Acad S c i .US A9 2 ( 1 9 9 5 )

A

; 2 1

7/23/2019 Phospholipids in DNA

http://slidepdf.com/reader/full/phospholipids-in-dna 5/5

P r o c .N a t l .A c a d .S c i .US A9 2 ( 1 9 9 5 ) 7 8 7

g r o w t hr a t eo f t h e c e l l( 4 0 ) .B y p a s s i n gt h en e e d f o rD n a Ap r o t e i nm ay r e m o v et h eg r o w t hr a t ed e p e n d e n c eo f t h e c e l lo nD n a A p r o t e i nf u n c t i o na n d p r e v e n tc e l lg r o w t ha r r e s te v e na ta r e d u c e dl e v e lo f a n io n i c p h o s p h ol ip i d .T h e m e c h a n i s mo fs u p p r e s s i o no f t h e g r o w t h a r r e s tp h e n o t y p eo f some p g s Am u t a n t sb y t h el p pm u t a t i o nm i g h tb e t h r o u g hi n c r e a s i n gt h er a t ea t w h i c hb u l k a n i o n i cp h o s p h o l i p i di s made a v a i l a b l ef o rm e m b r a n ef o r m a t i o na n d t os u s t a i nt h e g r o w t hr a t eo f t h ec e l ld e p e n d e n to n D n a A - p r o t e i n - d i r e c t e di n i t i a t i o n .M a t u r a t i o n

o f t h e l p pg e n e p r od u c tc o n s u m e s7 x 1 0 5m o l e c u l e so f P G p e rg e n e r a t i o ni na p o s t t r a n s l a t i o nm o d i f i c a t i o ne v e n t ( 4 1 ) .A t t h er e l a t i v e l yd e f i c i e n tl e v e lo f 5 P G , t h e r e a r e a b o u t 1 0 6P Gm o l e c u l e sd i s t r i b u t e dm a i n l yb e t w e e nt h et w o l e a f l e t so f t h ei n n e rm e m b r a n eo fE . c o l i( 4 2 ) .T h e r e f o r e ,a n y p r o c e s s ,s u c ha s i n i t i a t i o no f DNA r e p l i c a t i o n ,d e p e n d e n to n t h e m a i n t e -n a n c eo f a t h r e s h o l dl e v e lo f f r e ea n i o n i cp h o s p h o l i p i do n t h ei nn e r s ur fa ce o f t h e membrane m i g h t b e a f f e c t e db y t h ed i v e r s i o no f n e w l ys y n t h e s i z e dP G t o t h i sp o s t t r a n s l a t i o n a le v e n t .Any f u r t h e r d e c l i n ei na n i o n i cp h o s p h o l i p i d s ,s u c ha si na p g s A n u l l s t r a i ne v e n when c a r r y i n gt h e l p p a n d r n h As u p p r e s s o rm u t a t i o n s ,m i gh t b e g int o c o m p r o m i s ea f u n c t i o nw i t h a l o w e r t h r e s h o l dr e q u i r e m e n tf o ra n i o n i cp h o s p h o l i p i d sa n d ,t h e r e f o r e ,s t i l lr e s u l ti n a r r e s to f c e l lg r o w t h .

D e f i n i t i v ec o n c l u s i o n sa b o u t t h er o l eo f p h o s p h o l i p i d si n

c e l l u l a rp r o c e s s e sc a n n o tb e m a d e f r o me i t h e ri n v i t r oo r i nv i v os t u d i e sa lo ne b u tc a n b e m a d e b y c o m b i n i n gs u p p o r t i n gd a t af r o m b o t h t y p e so f s t u d i e s .I t i s now c l e a rt h a tp r o t e i nt r a n s l o c a t i o n a c r o s st he i nn erm e m b r a n ei nE . c o l ii s d e p e n -d e n t o n a n i o n i c p h o s p h o l i p i d s .T h e r e s u l t sr e p o r t e d h e r es t r o n g l ys u p p o r ta s i m i l a ri n v o l v e m e n to fa n i o n i cp h o s p h o l i p -i d si n i n i t i a t i o no f DNA r e p l i c a t i o n .O t h e re x a m p l e se x i s to ft h ea s s o c i a t i o no f c y t o p l a s m i cp r o t e i n s 4 3 - 4 5 )w i t h p h o s p h o -l i p i d s ,i n c l u d i n g p r o t e i n st h a ta l s oi n t e r a c tw i t h n u c l e i ca c i d s( 4 6 , 4 7 ) ,r e s u l t i n gi n b i o l o g i c a l l y s i g ni f i c a n tc h a n g e s .T h e r e -f o r e ,a s p e c i f i cr e q u i r e m e n tf o rp h o s p h o l i p i d si n t h e o r g a n i -z a t i o no f p r o t e i n sa t t h e m e m b r a n es u r f a c e i n f u n c t i o n a lc o m p l e x e sa p p e a r st o b e w i d e s p r e a d .

We t h a n kD r . J u d i t hZ y s k i n df o rp r o v i d i n gu s w i t h p l a s m i d sp A C 1 1a n d pAC12b e f o r e t h e i rp r o p e r t i e sw e r e r e p o r t e d .We a l s ot h a n kD r .

E l l i o t tC r o o k ef o rh e l p f u ld i s c u s s i o n sd u r i n gt h e s es t u d i e s .T h i s w o r kw a s s u p p o r t e db y N a t i o n a lI n s t i t u t e so f H e al th G r a n tG M - 2 0 4 8 7 .

1 . F i r s h e i n ,W. ( 1 9 8 9 )A n n u .R e v .M i c r o b i o l .4 3 ,8 9 - 1 2 0 .2 . S e k i m i z u ,K . K o r n b e r g ,A . ( 1 9 8 8 )J . B i o l .C h e m .2 6 3 ,7 1 3 1 -

7 1 3 5 .3 . C r o o k e ,E . ,C a s t u m a ,C .E . K o r n b e r g ,A . ( 1 9 9 2 )J . B i o l .C h e m .

2 6 7 ,1 6 7 7 9 - 1 6 7 8 2 .4 . Ry t e r , A . ( 1 9 6 8 )B a c t e r i o l .R e v .3 2 ,3 9 - 5 2 .5 . S e k i m i z u ,K . ,Yu n g ,B .Y . K o r n b e r g ,A . ( 1 9 8 8 )J . B i o l .C h e m .

2 6 3 ,7 1 3 6 - 7 1 4 0 .6 . H w a n g ,D . S . ,C r o o k e ,E . K o r n b e r g ,A . ( 1 9 9 0 )J . B i o l .C h e m .

2 6 5 ,1 9 2 4 4 - 1 9 2 4 8 .7 . Yu n g ,B .Y . K o r n b e r g ,A . ( 1 9 8 8 )P r o c .N a t l .A c a d .S c i .USA8 5 ,

7 2 0 2 - 7 2 0 5 .8 . F r a l i c k ,J . A . L a r k ,K . G . ( 1 9 7 3 )J . M o l . B i o l .8 0 ,4 5 9 - 4 7 5 .9 . H o r i u c h i ,T . ,M a k i ,H . S e k i g u c h i ,M . ( 1 9 8 4 )M o l . G e n . G e n e t .

1 9 5 ,1 7 - 2 2 .1 0 . K a n a y a ,S . C r o u c h ,R . ( 1 9 8 3 )J . B i o l .C h e m .2 5 8 ,1 2 7 6 - 1 2 8 1 .1 1 . M a s s y , B . , F a y e t ,0 . K o g o m a ,T . ( 1 9 8 4 )J . M o l .B i o l .1 7 8 ,

2 2 7 - 2 3 6 .

1 2 . To r r e y ,T . ,A t l u n g ,T . K o g o m a ,T .( 1 9 8 4 )M o l . G e n .G e n e t .1 9 63 5 0 - 3 5 5 .

1 3 . F r e y ,J . ,C h a n d l e r ,M . C a r o , L . ( 1 9 8 1 )M o l. G e n.G e n e t .1 8 23 6 4 - 3 6 6 .

1 4 . K o g o m a ,T . v o n M e y e n b u r g ,K . ( 1 9 8 3 )EMBO J . 2 , 4 6 3 - 4 6 81 5 . K o g o m a ,T . ,S k a r s t a d ,K . ,B o y e ,E . ,v o n M e y e n b u r g ,K . S t e e n

H . B . ( 1 9 8 5 )J . B a c t e r i o l .1 6 3 ,4 3 9 - 4 4 4 .1 6 . To r r e y , T . K o g o m a ,T . ( 1 9 8 7 )M o l. G e n.G e n e t .2 0 8 ,4 2 0 - 4 2 71 7 . R a e t z ,C .R . D o w h a n ,W. ( 1 9 9 0 ) J .B i o l .C h e m .2 6 5 , 1 2 3 5 - 1 2 31 8 . G o p a l a k r i s h n a n ,A . S . ,C h e n ,Y . ,T e m k i n ,M . D o w h a n ,W .

( 1 9 8 6 )J . B i o .C h e m .2 6 1 ,1 3 2 9 - 1 3 3 8 .1 9 . H e a c o c k ,P .N . D o w h a n ,W. ( 1 9 8 7 )J . B i o l .C h e m .2 6 21 3 0 4 4 - 1 3 0 4 9 .

2 0 . H e a c o c k ,P .N . D o w h a n ,W. ( 1 9 8 9 )J . B i o l .C h e m . 2 6 41 4 9 7 2 - 1 4 9 7 7 .

2 1 . D o w h a n ,W. 1 9 9 2N AT OASI S e r .H 6 3 ,1 1 - 3 2 .2 2 . H o r i u c h i ,T . , M a k i ,H . ,M a r u y a m a ,M . S e k i g u c h i ,M . ( 1 9 8

P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U S A7 8 ,3 7 7 0 - 3 7 7 4 .2 3 . S i l h a v y ,T . , B e r m a n ,M . E n q u i s t ,L . ( 1 9 8 4 )E x p e r i m e n t sw i t

G e n eF u s i o n C o l d S p r i n gH a r b o rL a b .P r e s s ,P l a i n v i e w ,N Y ) ,p p .1 0 7 - 1 1 2 .

2 4 . B a c h m a n n ,B . L o w , K . B . ( 1 9 8 0 )M i c r o b i o l .R e v .4 4 ,1 - 5 6 .2 5 . M i k i ,T . , E b i n a , Y . ,K i s h i ,F . N a k a z a w a ,A . ( 1 9 8 1 )N u c l e i c

A c i d sR e s .9 , 5 2 9 - 5 4 3 .2 6 . M a n i a t i s ,T . , F r i t s c h ,E .F . S a m b r o o k ,J . ( 1 9 8 2 )M o l e c u l a

C l o n i n g :A L a b o r a t o r yM a n u a l C o ld S p ri ngH a r b o rL a b . P r e s sP l a i n v i e w ,N Y ) ,p p .4 4 0 - 4 4 4 .

2 7 . W i t k i n ,E. ( 1 9 9 1 )B i o c h i m i e7 3 ,1 3 3 - 1 4 1 .2 8 . C o x ,M . L e h m a n ,I . ( 1 9 8 7 )A n n u .R e v .B i o c h e m .5 6 ,2 2 9 - 2 6 22 9 . S k a r s t a d ,K . B o y e ,E . ( 1 9 8 8 )J . B a c t e r i o l . 1 7 0 ,2 5 4 9 - 2 5 5 4 .3 0 . W u , H . C . ,T o k u n a g a ,M. , T o k u n a g a ,H . ,H a y a s h i ,S . G i a m

C . - Z .( 1 9 8 3 )J . C e l l .B i o c h e m .2 2 ,1 6 1 - 1 7 1 .3 1 . A s a i ,Y . ,K a t a y o s e ,Y . ,H i k i t a ,C . ,O h t a ,A . S h i b u y a ,I . ( 1 9 8

J . B a c t e r i o l .1 7 1 ,6 8 6 7 - 6 8 6 9 .3 2 . A b e , M . ( 1 9 8 0 )J . B a c t e r i o l .1 4 1 ,1 0 2 4 - 1 0 3 0 .3 3 . K o r n b e r g ,A . B a k e r , T . ( 1 9 9 2 )D N AR e p l i c a t i o n F r e e m a n

N ew Y o r k ) ,p p .6 4 7 , 7 5 9 .3 4 . S t u i t j e ,A . R . M e i j e r ,M . ( 1 9 8 3 )N u c l e i cA c i d sR e s .1 1 ,5 7 7 5 -

5 7 9 1 .3 5 . L o b n e r - O l e s e n ,A . ,A t l u n g ,T . R a s m u s s e n ,K . ( 1 9 8 7 )J . B a c -

t e r i o l .1 6 9 ,2 8 3 5 - 2 8 4 2 .3 6 . L i l l ,R . ,D o w h a n ,W. W i c k n e r ,W . ( 1 9 9 0 )C e l l6 0 ,2 7 1 - 2 8 0 .3 7 . H e n d r i c k ,J . P . W i c k n e r , W. ( 1 9 9 1 )J . B i o l .C h e m . 2 6 6

2 4 5 9 6 - 2 4 6 0 0 .3 8 . d e Vr i j e ,T . ,d e S w a r t ,R . L . ,D o w h a n ,W . , T o m m a s s e n ,J . d e

K r u i j f f ,B . ( 1 9 8 8 )N a t u r e L o n d o n )3 3 4 ,1 7 3 - 1 7 5 .3 9 . K u s t e r s ,R . ,D o w h a n ,W . d e ,K . B . ( 1 9 9 1 )J . B i o l .C h e m .2 6 6

8 6 5 9 - 8 6 6 2 .4 0 . H e l m s t e t t e r ,C .( 1 9 8 7 )i nE s c h e r i c h i ac o l ia n d S a l m o n e l l aT y p h

m u r i u m :C e l l u l a ra n dM o l e c u l a rB i o l o g y ,e d s .I n g r a h a m ,J . ,L o w ,K . B . ,M a g a s a n i k ,B . ,S c h a e c h t e r ,M. U m b a r g e r ,H . E . A m .S o c .M i c r o b i o l . ,Wa s h i n g t o n ,D C ) ,Vo l .2 , p p .1 5 9 4 - 1 6 0 5 .

4 1 . S a n k a r a n ,K . W u , H . C . ( 1 9 9 4 )J . B i o l .C h e m .2 6 9 ,1 9 7 0 11 9 7 0 6 .

4 2 . N e i d h a r d t ,F . C . ( 1 9 8 7 )i n E s c h e r i c h i ac o l ia n d S a l m o n e l l aT yp h i m u r i u m :C e l l u l a ra n d M o l e c u l a rB i o l o g y ,e d s .I n g r a h a m ,J . ,L o w , K . B . ,M a g a s a n i k ,B . ,S c h a e c h t e r ,M . U m b a r g e r ,H . E. A m .S o c .M i c r o b i o l . ,Wa s h i n g t o n ,D C ) ,Vo l . 1 , p . 4 .

4 3 . R a n d o ,R . R . ( 1 9 8 8 )FA S E BJ . 2 , 2 3 4 8 - 2 3 5 5 .4 4 . B e l l ,R . M . B u r n s ,D . J . ( 1 9 9 1 )J . B i o l .C h e m .2 6 6 ,4 6 6 1 - 4 6 6 44 5 . Yu l i ,W . , M a c D o n a l d ,J . I S . K e n t , C . ( 1 9 9 3 )J . B i o l .C h e m

2 6 8 ,5 5 1 2 - 5 5 1 8 .4 6 . Yo s h i d a ,S . ,Ta m i y a ,K . K . K o j i m a ,K . ( 1 9 8 9 )B i o c h i m .B i o p h

A c t a 1 0 0 7 ,6 1 - 6 6 .4 7 . P a r k s ,W. A . ,C o u p e r ,C .L . L o w , R . L . ( 1 9 9 0 )J . B i o l .C h e m

2 6 5 ,3 4 3 6 - 3 4 3 9 .

B i o c h e m i s t r y :X i a a n dDowhan