Secuenciar ????

Establecer el orden exacto de las 4 bases(A,C,G,T) a lo largo de un fragmento de ADN.

Métodos básicos de secuenciación

Método químico de Maxam y GilbertMaxam, A.M. and Gilbert,W.(1977) A new method for sequencing DNA.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560-564.

Método enzimático de SangerSanger, F., Micklen, S.,and Coulson, A.R.(1977) DNA sequencing and chain terminating inhibitors.Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 74, 5463-5467

Frederick Sanger y WalterGilbert compartieron, en1980, el premio Nobel dequímica por haberdesarrolladoindependientemente métodosde secuenciación del ADN .Sanger ganó anteriormenteel premio Nobel de 1959 porla secuenciación de laproteína insulina.

F. Sanger W. Gilbert

Método químico de Maxam y Gilbert

El fragmento de ADN se marca en sus extremoscon Ɣ32P ó Ɣ32S dATP por acción de laPolinucleótido Quinasa.

Las moléculas marcadas se rompen conreacciones químicas específicas para cada unade las cuatro bases.

Los productos luego se resuelven enfunción de su tamaño en geles depoliacrilamida.

Extremo marcado radioactivamente 5' o 3‘.

El tratamiento químico rompe la uniónglicosídica entre la ribosa y el nucleótido.

Reacciones químicas específicas–G : DMS, piperidina–A + G: DMS, ácido fórmico,piperidina– C+T: Hidracina, piperidina–C : Hidracina en 1.5M NaCl, piperidina(rompe la uniónfosfodiester)

Electroforesis en gel + Autoradiografía

USOS

Secuenciar oligonucleótidos sintéticos

Analizar modificaciones en laestructura del adn (ejemplo: metilaciónde bases)

Estudiar la estructura secundaria delADN o su interacción con proteínas(ejemplo: experimentos de protecciónquímica).

Método de secuenciación de Sanger

Desarrollado en 1977 por Frederick Sanger.

Método Bioquímico (usa una polimerasa).

Basado en la incorporación deDideoxinucleótidos (ddNTPs) que detienen elcrecimiento de la cadena de ADN.

Los dideoxinucleótidos no tienen OHen carbono 2' ni en 3' de ladesoxirribosa, por lo que no puedenformar enlaces fosfodiéster.

Durante la secuenciación se llevan a cabo cuatro reacciones de síntesis separadas incluyendo encada una de ellas pequeñas cantidades de losdideoxinucleótidos (ddNTP: ddGTP; ddATP, ddCTP, ddTTP)

se requiere:+ Primer Marcado+ ADN polimerasa+ 4 dNTPs+ ddATPAl incorporarse un dideoxinucleótido finaliza la copia deltemplado y se generan fragmentos de distintos tamaños.

Los ddNTP compiten con los dNTPpara ser incorporados. produciendouna mezcla de cadenas de distintaslongitudes.

La sustitución de uno delos dNTPs por el mismonucleótido marcadoradiactivamente permitela visualización de lasbandas de distintalongitud porautoradiografía.

En el gel la separación de lasdistintas bandas se produce en funciónde su tamaño y la secuencia puededeterminarse leyendo las bandas de loscuatro carriles.

Los protocolos de secuenciaciónautomática:

Son una alternativa al método de Sanger.

Se utilizan compuestos fluorescentes para “marcar” al “primer” ó a los terminadores.

Los productos de la reacción se detectan directamente durante la electroforesis.

Los fluoróforos son excitados por la luz de un láser y luego el equipo detecta la fluorescencia emitida.

La reacción se realiza en un ciclador

Las reacciones de secuenciaciónautomática pueden emplear:

Terminadores fluorescentes

Primers fluorescentes

Secuenciación empleandoterminadores fluorescentes

Se realiza una única reacción de secuenciaen presencia de los cuatro ddNTPs, cadauno de ellos marcados con una sondafluorescente distinta.

Las sondas empleadas son: A ---> JOE.Emisión: verde. Derivado de fluoresceínaC ---> FAM.Emisión: azul. Derivado de fluoresceínaG --> TAMRA.Emisión: amarillo. Derivado de rodaminaT --> ROX.Emisión: rojo. Derivado de rodamina

Secuenciación empleandoprimers fluorescentes

Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las cuales se añade el “primer” marcado en 5´ con una sonda fluorescente distinta, junto con la polimerasa, los dNTPs y el ddNTP correspondiente.

En la secuenciación cíclica solo se utiliza UNO de losdos primers a la vez.Si utilizáramos al mismo tiempo ambos “primers”, como en un PCR común, resultarían dos secuencias solapadas ( la del templado y la de su cadena complementaria).

Aplicaciones de la secuenciación de ADNSecuenciación genómica

Evaluación del clonado en vectoresDiagnóstico de enfermedades :bacterianasviralesprotozooshongoscáncergenéticas

Detección de polimorfismos (single nucleotide polymorphism)ForenseADNs fósiles