Luz Eugenia Pérez Jaramillo

3rd Semester

UPB- MEDICINE STUDENT.

Patient-Specific Induced pluripotent Stem-Cell Models

for Long-QT SyndromeAlessandra Moretti, Ph.D.

Long QT Syndrom

e

Autosomal

dominant disease

Prolonged ventricular

repolarization phase

Risk of sudden cardiac death

due a ventricular

tachyarrhythmia

Characterized

T: Ventricular repolarization R: Ventricular despolarization

REPOSE

P: Auricular despolarization

MUTATION IN THE KCNQ1 GENE

Encoding

KvQTI protein (alpha subunity of the Iks Canals)

TIPE I

STEM CELLS Characterized by the ability to renew

themselves through mitotic cell division and differentiate into a diverse range of specialized cell types.

Embryonic stem cells Adult stem cells

From the inner cell mass of blastocysts

That are found in adult tissues

INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS

Type of pluripotent stem cell artificially derived from a non- pluripotent cell, typically an adult somatic cell, by inducing a "forced" expression of specific genes.

(1)Isolated and growth the donant cells.(2)Make a transfection of gene stem cells from

the donor cells by means of viral. (3)Cells were growth with strategies for

growing stem cells using mitotically inactive fibroblasts

(4)A small subset of these transfected cells become induced pluripotent stem cells

STEM CELLS IMPORTANCE Offers the opportunity to produce large

numbers of patients -pecific Stem cells. If someone has certain cells that don’t

function properly or that have been damaged, then stem cells could be used to replace those damaged cells.

In this study for example; these showed the capacity of these cells to give rise to functional cardiomyocytes that recapitulate the electrophysiological characteristics of the disorder.

OBJETIVE Observe induced stem-cell models of

patient-specific with long- QT Syndrome.

METODOS

HISTORIA CLINICA Y FENOTIPO GENETICO

HIPERACTIVO

CON DEFICIT DE ATENCION

EN ELECTROCARDIOGRA

MA

INTERVALO QT LARGO

MUTACION EN EL GEN KCNQ1 (CAMBIO DE BASE (569G→A)

Miembros de sexo Masculino

Miembros de sexo Femenino

Miembros con el SQTL

Miembros no afectados.

Los metodos geneticos mostraron que los miembros de esta familia tenia la misma mutacion heterocigotica, confirmando por esto la herencia autosomica dominante en esta familia.

•El abuelo y la tia han reportado periodos de discinecia y palpitaciones.

Abuelo: 70 años

Papá: 42 años

GENERACIÓN DE CÉLULAS MADRE PLURIPOTENCIALES DE PACIENTES ESPECÍFICOS

Se cortan y se

ubican en

Cajas de cultivo

Fibroblastos

Infectados

Con una combinación de retrovirus:OCT3/4, SOX2, KLF4, and c-MYC

DESPUÉS DE 6 DÍAS

Células infectadas

Se sembraron en

Murino embrionarias

Colonia de células madre

HASTA QUE APARECEN

(Células madre pluripotentes inducidas)

DIFERENCIACIÓN CARDIACA IN VITRO

3 día- Indujeron las células madres pluripotenciales como cuerpos embrionarios separando las células madre

4 día- El medio fue reemplazado20% suero fetal bovino

7 día- Los cuerpos embrionarios fueron recubiertos por gelatina.

20-30 días- Las áreas que mostraron excitación espontanea (indicativo de diferenciación cardiaca), fueron micro disecadas y recubiertas por Fibronectina y suero fetal bovino (2%)

EVALUACIONES DE INMUNOHISTOQUIMICA

Nanog (Abcam), TRA-1-81 (BD Pharmingen), cardiac troponin T (Lab Vision),α-actinin (Sigma–Aldrich), myosin light chain 2a and myosin light chain 2v (Synaptic Systems), KCNQ1 (Abcam),y proteina disulfido isomerasa (Abcam).

ENSAYOS DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

(PCR)

Para amplificar la región mutada del gen KCNQ1para secuenciación.

Para la evaluación de la expresión de los genes de pluripotencialidad, transgenes retrovirales, y marcadores de linaje celular.

PROPIEDADES DE LAS CÉLULAS MADRE

La trasncriptasa inversa (RT)- PCR se utilizo para marcar los fenotipos de miocardiocitos individuales.

RESULTADOSGeneración de células madre pluripotenciales

-Cambio de base 569G → ACÉLULAS CONTROL CÉLULAS DE SUJETOS CON SQTL

NO se presento SI se presento

- Presencia de genes pluripotenciales en cada una de las capas embrionarias. (clones de células madre embrionarias)

(PDX1, SOX7, y AFP)

(CD31, DESMIN, ACTA2, SCL, MYL2, y CDH5)

(KTR14, NCAM1)

VALORACION DEL TIPO DE SINDROME DE QT LARGO

Focos de contratación comenzaron a aparecer después de aprox. 12 días de diferenciación.

Adaptación en pacientes con SQTL

PAPEL DE R190Q-KCNQ1

Con el uso de RT-PCRSe

observo

KCNQ1

Fueron similares en células control y las de los sujetos con SQTL

Ubicación del KCNQ1 en la celula

CÉLULAS CONTROL CÉLULAS DE SUJETOS CON SQTL

En la membrana En el interior de la célula junto  proteína disulfuro isomerasa

ANALISIS ELECTROFISIOLOGICO DE LOS CANALES K+

CÉLULAS DE SUJETOS CON SQTL

•Disminución notable en canales de K+•Disminución en canales Iks

ACCION PROTECTORA DE LOS BETA BLOQUEADORES

OBSERVARON Arritmias

Análisis de efectos de las catecolaminas en la fase ventricular.

ISOPROTERENOL

•Simpaticomimético•Recep. B adrenérgicos

20% el potencial de repolarización (en células control Y NO EN LAS QUE TENIAN SQTL)

EFECTO CRONOTROPICO POSITIVO ( FREC.CARD)

DISCUSSION

CONCLUSIONAt present, stem cells are already

used in cell therapies for treatment of some cancer types but this use is still small in the scheme of diseases affecting humans today.

Nowadays the human genetic disorders can be studied in the physiologic and disease-causing contexts on a patient-specific level.

Their importance ranges from an understanding of the principles behind human development to the cell based therapies addressing those aspects that go awry during development and lead to disease.

The wide range of cell types and tissues that may develop from stem cells represent a biological system that mimics many of the complex interactions of the cells and tissues of the body, and as such, provides an attractive and valuable screening tool.

THANKS!!!!