MLPA(Multiplex ligation – dependent probe amplification)

Peter Böhm Nielsen

S eqscape

A na ly se ring 3730

S ekven s p roduk t op rensn ing

S ekvensreak tion

P C R p roduk t op rensn ing

G eldokum en ta tion

S m elteku rve va lide ring

L igh tscanner an a ly se

P C R o psæ tn ing

D N A op rensn ing

Generelt analyseflow

MLPA

Anvendte metoder

Allel 1

Allel 2

Allel 1

Allel 2

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

HRM & Sanger sekventering

Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA)

• MLPA er en teknik til kopitalsbestemmelse af specifikke sekvenser. Dette sker ved simultan binding af op til 45 prober, hvorefter det relative antal af bundne prober bestemmes.

• Til udførelsen benyttes PCR amplifikation.

MLPA Probe hybridisering

Promoter Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3

Promoter Exon 1 Intron 1 Intron 2 Exon 3

1

2

MLPA (1) Multiplex Ligation depending Probe Amplification

1. Denaturering2. Hybridisering3. Ligering4. Amplifikation5. Fragment-

analyse

SALSA MLPA prober

Hybridisering

1. MLPA probemix blandes med denatureret genomisk DNA.

2. De to sammenhørende prober hybridiseres til tilstødende target sekvenser

Ligering

3. Prober ligeres sammen af en thermostabil ligase.

Amplifikation

4. Et universelt primer par benyttes til amplifikation af alle ligerede prober.Hvert amplifikat fra hver probe har en unik længde (130 - 480 bp).

Separation og kvantitering ved kapillær elektroforese

Hver top er et amplifikat fra en specifik probe .

Prøverne sammanlignes med en kontrolprøve.

En forskel i relativ tophøjde/areal indikerer en ændring i kopital af den gældende probes target sekvens.

MLPA

MLPA

MLPA

MLPA

MLPA

Normal MLPA

MLPA Deletion af exon 5-7

MLPA Deletion af exon 3-16

MLPA Duplikation af exon 13

Hvad kan dette være ?

Kan dette være rigtigt ?

Det er ikke sandsynligt at ovenstående er deletioner, da proberne mellem de 2 exons har korrekt amplifikationsstatus.

MLPAProbe hybridisering (2)

AGTTGGAACTAAACCTGTGCATGCGTGGATTTCCCTTGATTTGGACACGTACGCACCT

OHP

Stuffer sekvens

Gen specifikke prober

Kontroller

Prober forsøges designet udenfor SNP’s

MLPA prober - eksempler

5´-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACTGCCGTGCTCACCTGGGCTCTGGCTCTTC-3´

5´-P-TTTCAGGTGGGTCTCCGACCCTGACTTCAACGTGGGGGTGTTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC-3´

5´-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACATCAGCAGAAGATGGCTCGCGAGCCCGCGTGAGT-3´

5´-P- GCCCAGGGGAAGGGGTGTAGGCGAAGGGAGGAGACAGCTGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC-3´

Anvendte metoder

Allel 1

Allel 2

Allel 1

Allel 2

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

HRM & Sanger sekventering

Materialer og metoder CISH og FISH for HER-2 amplifikation (1)

Materialer og metoder CISH og FISH for HER-2 amplifikation (2)

Farshid.

Materialer og metoder (Prøvemateriale (1))

Materialer og metoder (Prøvemateriale (2))

Hematoxylin og eosin-farvning (HE)

Cancerceller kan ”fortyndes” i normale celler

Hvad har det af betydning ?

ResultaterNormal

Resultater Amplificeret

ResultaterMLPA vs. ISH

Kvalitetssikring af resultatet Quantity-peaks

Q-peaks: 64, 72, 76 & 82 – indikerer DNA mængde

Uafhængig af ligering

Kvalitetssikring af resultatet Denaturing-peaks

D-peaks: 88, 92 & 96 – indikerer DNA kvalitet og ligerings-reaktion

Afhængig af DNA &ligering

D-prober er placeret tæt på CpG-island – kræver meget energi ved denatureringen

TE TE+50mM NaCl TE+75mM NaCl

Raw-data vurdering (sloping)

God amplifikation Uensartet amplifikation

Resultater med samme signal-niveau er bedst at sammenligne.

Sloping er OK til et vist punkt, hvis normalisering kan udføres.

Kan skyldes fordampning – test med 8µl vand.

Rawdata vurdering

”Skuldre”

Degradering af ligerede prober: Kør MLPA-analysen direkte efter fortynding i formamid