Ethylmethansulfonat (EMS)

+

CH2CH3

CH3

recessive mutants by ethyl methane sulfonate (EMS) mutagenesis

Punktmutation

G C

wildtype

EMS

Et-G C

replication

Et-G T

replication

Et-G T

G C

wildtype

A T

mutation

Fixed mutation can be isolated by

gene mapping

1. Chemische Mutagenese

Zur chemischen Mutagenesewerden oft Samen mit EMSbehandelt.

Das Ti-Plasmid und die Integrationin die chromosomale DNA

Das Ti-Plasmid und die Integrationin die chromosomale DNA

Schnelle Zellteilung Opinsynthese

Auxin

Cytokinin

Phytohormone

Ungewöhnliche Aminosäuren

1. Bindung an Verwundungsstelle

2. Verwendung der Phenole zur Erkennung durch Sensorproteine

VIR A und VIR G

3. Aktivierung der Gene der VIR-Region: VIR B, C, D und E

4. Diese VIR-Proteine stellen eine freie Kopie der T-DNA her und

5. Verpacken die T-DNA zu einem T-Transportkomplex und leiten In Zelle

6. Signalsequenzen in VIR E2 und VIR D2 dirigieren durch nukleären

Porenkomplex (NPC) in den Zellkern

7. T-DNA wird in Chromosom integriert und der Komplementärstrang

wird durch ein Reparatursystem synthetisiert.

4. Mutation durch Transposons

4. Mutation durch Transposons

Nachweis der MutationSiehe PCR

1. Chemische Punktmutation

4. Insertion von Transposons

3. Das Agrobakterium-System

2. Energiereiche Strahlung

A

B

Die Erzeugung und Analyse von Mutanten ist einwichtiges Werkzeug der Entwicklungsphysiologie

Identifizierung mutierter Gene:Was kann man über die Wahrscheinlichkeit von crossing over sagen?

Mit einer Hybridisierungssonde kann man Mutationen nachweisen

Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus

2. Ansatz: Molekulare MarkerRespriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)

Erfolgreicher Gentransfer durch Agarobacterium tumefaciens

Nutzpflanzen

Magnolisopsida Rosopsida („Eudicots“)Liliospsida

(„Monocots“

? TabakTomateKartoffelRapsBlumenkohlSalatSonnenblumeApfelRübe

AsparagusYamwurzel

Da gibt es noch ein Problem ! WT ca. 200 kb!

Zwei-Vektor-Verfahren

Da gibt es noch ein Problem !

Cointegration

Agrobakterium

Selektion von der transformierten Zellen

Transformation

Transgene Pflanze

Komplikationen beim Einsatz des Agrobacterium-Systems

1. Insertion von T-DNA in wesentliche Gene oder in Kontrollelemente

2. Insertion der T-DNA an verschiedenen Loci des Genoms

3. Insertion von Concatameren in einen Locus

4. Insertion eines Teiles der T-DNA

5. Insertion des Plasmidgerüstes des einfachen oder binären Vektors

6. Nicht erfolgreiche Insertion von T-DNA

7. Insertion zufälliger DNA-Fragmente von E. coli oder Agrobacterium

8. Aktivierung von Transposons

1. Insertion von T-DNA in wesentliche Gene oder in Kontrollelemente

- T-DNA von Agrobacterium insertiert bevorzugt an Stellen transkriptional

hoher Aktivität. Gilt auch für „nackte“ DNA.

- Ursache: solche Stellen sind partiell denaturiert (Strangaufspaltung) für

Transkription. Offensichtlich lassen solche Stellen Rekombination leichter

zu.

- Solche Stellen sind meist Gene (oder sehr nahe daran), so dass mit hoher

Wahrscheinlichkeit Insertion in Gene erfolgt – das damit „knocked out“ ist.

- Nahezu alle transformierten Pflanzen enthalten auch ein oder sogar mehrere

ausgeschaltete Gene. Wegen Redundanz muss das nicht unbedingt einen

Einfluss auf den Phänotyp habe.

- Mit Agrobacterium werden gezielt T-DNA-Mutanten erzeugt.

2. Insertion der T-DNA an verschiedenen Loci des Genoms

- Mehrfache Insertion ist nicht selten, aber nicht vorhersehbar.

Die Häufigkeit hängt vom Protokoll ab, sogar von Agrobacterium-

Stamm und stark von der Pflanze.

- Wenn einmal der Widerstand gegen eine Insertion in das Pflanzengenom

überwunden ist, dann gibt es meist auch multiple Insertionen. Eine

Einzelinsertion ist möglich, muss aber nachgewiesen werden.

- Concatamere T-DNA-Insertion nennt man, wenn Kopf-Schwanz-Insertionen

an derselben Stelle erfolgen. (3. Insertion von Concatameren in einen Locus)

- Dass „nackte“ DNA leichter mehrfach insertiert werden als mittels Agrobacterium

ist ein widerlegtes Gerücht. Beide Komplikationen sind häufig.

- Die Anzahl der Insertionen sollte ermittelt werden.

4. Insertion eines Teiles der T-DNA

- Der Nachweis von T-DNA-Stücken kann schwieriger sein als die Insertion

der vollständigen Sequenz. Die Wirkung beim „knock out“ kann aber dieselbe sein.

- RNAi (Gene silencing) tritt oft auf, wenn multiple identische Gene zur selben

Zeit transkribiert werden. Dazu sind nicht vollständige Sequenzen erforderlich,

Teilsequenzen können sogar effektiver sein – ein ernstes Problem.

Der Mechanismus ist nicht genau bekannt: Insertion kleiner Teilstücke oder

Ablesefehler bei der Transkription.

- Das historisch erste Agrobacterium-Plasmid pBIN19 hatte den Selektionsmarker

(gegen Kanamycin) an der rechten T-DNA-Grenze. Da in Agrobacterium der

Transfer von der rechten zur linken Grenze erfolgt (der Einbau allerdings von

links nach rechts) konnte der Selektionsmarker ohne Gen von

Interesse transferiert werden. Viele moderne Vektoren sind von pBIN19 abgeleitet.

5. Insertion des Plasmidgerüstes des einfachen oder binären Vektors

- Linke und rechte Grenzen sind nahezu Palindrome, d.h. Spiegelbilder.

- Die linke Grenze wird daher mitunter als rechte Grenze missverstanden.

Folglich wird ein Teil oder das ganze Plasmidskelett transferiert. Das geschieht

auch mit binären Vektoren.

- Nach Initiation des Gentransfers kopieren die VIR-Proteine die

T-DNA von der linken zur rechten Grenze.

- Nur wenn danach speziell gesucht wird kann ein solcher Fehler auch

gefunden werden. Effekte auf den Phänotyp können auf „knock out“ beruhen

und als Einführung eines speziellen Gens fehlinterpretiert werden.

6. Nicht erfolgreiche Insertion von T-DNA

- VIRD2-Proteine von Agrobacterium schützen die Enden der T-DNA (Verhinderung

der Degradation in Wirtszelle) und unterstützen die Integration durch (1.) Initiation der

DNA-Öffnung und (2.) der Rekombination.

- Die kovalente Bindung erfolgt jedoch nicht immer an der Stelle der Öffnung.

Der überhängende Teil der Wirts-DNA wird eliminiert. Das kann auf beiden Seiten

der Insertion erfolgen.

- Da die DNA-Integration initiiert werden kann ohne erfolgreich sein zu müssen

kommt es so zu einer DNA-Deletion, die nicht durch eingefügte DNA markiert ist.

- Das Ausmaß dieses Effektes lässt sich nur schwer abschätzen,

ist aber an Beispielen nachgewiesen worden.

- E. coli-DNA ist in transformierten Genomen nachgewiesen worden, die mit reiner

DNA transformiert wurden – wahrscheinlich einfach von verunreinigenden

Plasmidextrakten. (7. Insertion zufälliger DNA-Fragmente von E. coli oder Agrobacterium)

8. Aktivierung von Transposons

- Genome höherer Organismen sind von Transposon-ähnlichen Sequenzen

dominiert und kann mehr als 10 % der Gesamtsequenz ausmachen. Unterschiede

im Ausmaß können für unterschiedliche Genomgrößen mitverantwortlich sein.

- Es gibt Mechanismen, die diese Transposons inaktiv halten.

- Insbesondere unter Stress (dazu gehört Transformation oder Selektionsdruck,

manchmal auch in vitro-Kultivierung) sind diese Inaktivierungsmechanismen

durchbrochen.

- In Tabak ist gezeigt worden, dass Tto1 bei einem Transformationsexperiment

30 – 100 Bewegungen vornehmen kann. In einigen Fällen nimmt man durchaus

1000 Bewegungen von Transposons bei einem Transformationsereignis an.

1. PEG-vermittelte Aufnahme von DNA

1. PEG-vermittelte Aufnahme von DNA

Effektivität der Transformation liegt bei 1 : 100.000

1. PEG-vermittelte Aufnahme von DNA (Protoplastenfusion)

2. Electroporation (Aufnahme von DNA oder Protoplastenfusion)

4. Biolistic

Vermutlich zweitwichtigste Methode nach Agrobakterium.

Rupture disk

Flying disk

DNA-coated gold particles

Stopping screen

Sterile leafPlant regeneration medium

HELIUM HELIUM

Evacuated chamber

Biolistic chloroplast transformation

Segregation of chloroplast genomes (Plastom)accelerated gold particle coated with transforming DNA

~50-100 plastids / cell ~10-20 nucleoids / plastid ~5-10 pt genomes / nucleoid

~10,000 pt genomes /cell

4. Biolistic

Integration of foreign genes into the chloroplast genome

intergenicspacergene A gene B gene C gene D

pt DNA

aadAgene B gene C

transformation vector

A

gene X

gene Xgene A gene B gene C gene D

pt DNA

aadA

gene B gene C

transformation vector

B