Post on 12-Oct-2019
光合色素的色層分析
www.sciences.fundp.ac.be/. ../photosynthese.htm
http://www.sciences.fundp.ac.be/websciences/biologie/Fichesderevision/revision2 fonctionnement/photosynthese.htm
色層分析法(chromatography)
用來分離並確認化合物的技術
主要組成:
固定相 (stationary phase) 流動相 (mobile phase)
原理:
利用混合物中物質對固定相及流動相
親和力的不同,造成分離效果
與固定相親和力大者,易滯留原地
與流動相親和力大者,易隨流動相移動
種類
氣相色層分析
(GC , gas chromagraphy)薄層色層分析
(TLC , thin layer chromagraphy)濾紙色層分析
(PC , paper chromagraphy)
濾紙色層分析
最簡單的色層分析法
固定相-吸附在濾紙中的水(極性)移動相-一種或數種混合的有機溶劑
(非極性)石油醚:90%丙酮
9 : 1
Rf值(retention factor value)
計算色素b的Rf值
Rf value =色素移動距離
展開液移動距離
Rf值= XcmYcm
鑑定未知物
單一化合物以同樣的層析法分離時,必有其特定的Rf值,所以鑑定一些未知化合物時,將測得的Rf值和標準物質的Rf值對照比較,即可初步確定此未知化合物的所屬類別和名稱。
Rf值的應用
光合色素
faculty.clintoncc.suny.edu/.../ photosyn.htm
http://faculty.clintoncc.suny.edu/faculty/Michael.Gregory/files/Bio 101/Bio 101 Lectures/Photosynthesis/photosyn.htm
葉綠素a主要光合色素
呈深綠色
分子式C55H72O5N4Mg
葉綠素b
主要光合色素
呈淡綠色
分子式C55H70O6N4Mg
胡蘿蔔素
厭水性
呈鉻黃色
分子式 C40H56
葉黃素
親水性
呈淡黃色
分子式C40H56O2
實驗步驟
配置展開液
展開液:
4.5ml石油醚+0.5ml 90%丙酮(石油醚:90%丙酮=9:1)
(★務必精準配置)置於100ml量筒中,量筒口以鋁箔密封
*極性大小依序為:水 > 丙酮 > 石油醚
萃取光合色素
取適量烘乾菠菜葉
⇒ 捏碎後放入研缽中,研磨成粉末⇒ 加10 ml 90%丙酮充分研磨⇒ 以雙層紗布過濾,取濾液
層析取一長條濾紙,將前端剪成尖形,
並以鉛筆在離尖端3cm處畫一橫線⇒ 以毛細管吸取濾液(葉汁),
點一滴在橫線上,重複數次
(★點的面積愈小愈好)⇒ 將濾紙放入含有展開液的量筒中⇒ 將濾紙固定好,以鋁箔封口
(★層析過程切勿晃動展開液)
結果與計算Rf值
展開液上升到濾紙全長的90%時,取出濾紙觀察
(★展開液上升高度切勿超過濾紙)
分別計算各種色素的Rf值
PC結果--石油醚:丙酮= 9:1胡蘿蔔素
葉黃素
葉綠素a
葉綠素b
脫鎂葉綠素a(氧化葉綠素)
脫鎂葉綠素a
www.aw-bc.com/mathews/ ch17/pheophyt.htm
http://www.aw-bc.com/mathews/ch17/pheophyt.htm
第1張展開液晃動致歪斜
第2張展開液晃動
色素呈雙峰
PC 結果(不佳)--石油醚:丙酮= 9:1
以不同比例配置展開液
探討改變展開液成分比例對濾紙色層分析(PC)結果的影響實驗設計:將展開液中90%丙酮和石油醚以不同的比例(體積比)調配,觀察色層分析的結果。
建中59th張育唐、莊淯全、郭英樹、陳建彰
PC結果討論1
光合色素的色層分析以丙酮、石油醚為展開溶劑(皆具揮發性,產生牽引力)這些溶劑均為非極性,因此愈是脂溶性的色素便會跑得愈前面
PC結果討論2
分辨葉綠素a和b,除了看顏色外,葉綠素a總是跑在葉綠素b前面分辨胡蘿蔔素和葉黃素,除了看顏色外,胡蘿蔔素總是跑在葉黃素前面
薄層色層分析法TLC(thin-layer chromatography)固定相附在金屬板上的一層矽膠薄膜探討不同比例的展開液在TLC片中對薄層色層分析(TLC)結果的影響。實驗設計:將90%丙酮與石油醚以不同的比例配成展開液,觀察在TLC片中色層分析的結果。
建中59th張育唐、莊淯全、郭英樹、陳建彰
TLC結果討論展開液為90%丙酮:石油醚=5:5時的分層效果最好,可以看到十幾種色帶。
依Rf值由大至小排列應為:
胡蘿蔔素
葉綠素a
葉綠素b
葉黃素
色層分析法(chromatography)種類濾紙色層分析Rf值(retention factor value)光合色素葉綠素a葉綠素b胡蘿蔔素葉黃素實驗步驟配置展開液萃取光合色素層析結果與計算Rf值PC結果--石油醚:丙酮= 9:1PC 結果(不佳)--石油醚:丙酮= 9:1以不同比例配置展開液PC結果討論1PC結果討論2