Veroniek Saegeman, 22 september 2016

Diagnose van tekenziekten: Lyme borreliosis

2

Infectieus agens:Borrelia burgdorferi sensu lato complex

Order Spirochaetales

Family

LeptospiraceaeFamily

Spirochaetaceae

Genus

TreponemaGenus

BorreliaGenus

Leptospira

Borrelia associated withLyme Borreliosis (s.l.)

Borrelia associated withRecurrent fever

B. burgdorferi ssJoints

B. afzeliiSkin

B. gariniiCNS

B. spielmanii B. bavariensis

Pathogenicity???B. valaisiana

B. lusitaniae

+/-20 species,

transmitted by soft ticks

or lice

USA:

B. burgdorferi ss.

3

• Familie Spirochaetaceae

– Gramnegatieve bacil, 20-30 µm

– Microaërofiel

– Trage groei op 33-35°C in complex medium (Kelly of BSK)

• Variabele expressie van oppervlakteproteïnen

– Outer surface proteins (Osp)

– Variable Surface antigenen (VlsE)

– …

Infectieus agens:Borrelia burgdorferi sensu lato complex

Nature Reviews Microbiology 3, 129-143 (February 2005)

4

Hovius et al. 2007

Infectieus agens:Borrelia burgdorferi sensu lato complex

5

• Spirocheten in de middelste maag van een ongevoede teek

• Expressie +++ van oppervlakteproteïne A (OspA)

• Na een bloedmaal• Wijziging in lipoproteïnes

�Expressie van OspA

�Expressie van OspC in de speekselklier

• Via OspC is invasie van de speekselklier mogelijk

• Immuun evasie– Door recombinatie in de variabel major protein-like sequentie (Vls) �

meerdere varianten van het lipoproteïne VlsE tot expressie

Infectieus agens:Borrelia burgdorferi sensu lato complex

Hovius et al. 2007

• Directe methodes: detectie van oorzakelijkagens– Cultuur van B. burgdorferi

– Microscopie

– PCR detectie van B. burgdorferi

• Indirecte methodes: detectie van de immuunrespons tegen het oorzakelijk agens– aanwezigheid van antistoffen tegen B.

burgdorferi

Diagnostiek

• Directe methodes: detectie van

oorzakelijk agens

– Cultuur van B. burgdorferi• Gouden standaard

• Matige gevoeligheid (huid> bloed/CSV)

• 2-6 weken alvorens resultaat

• Expertise

– Microscopie

• Weinig gevoelig

Diagnostiek

• Directe methodes: detectie van

oorzakelijk agens

– PCR detectie van B. burgdorferi• Geen standaard primers

– Variabele targets: flagelline, OspA

• Problemen:

– Contaminatie � vals positieven

– Inhibitie van de PCR reactie / laag aantal spirochaeten in staal � vals negatieven

Diagnostiek

9

• Zinvol voor cutane en gewrichtsmanifestaties

• Weinig zinvol bij neurologische manifestaties

• Serologische bepaling van intrathecale As synthese is

gevoeliger

• Diagnostische waarde van PCR op bloed/serum/plasma/urine:

niet bepaald � niet aanbevolen

Directe methodes : PCR

Diagnostiek

• Indirecte methodes : detectie van

immuunrespons tegen oorzakelijk agens

= aanwezigheid van antistoffen tegen B.

burgdorferi

Serologie: 1°keuze en uitgebreid beschikbaar

Diagnostiek

• European Concerted Action on Lyme Borreliosis

(www.EUCALB.com ) aanbevelingen

• Tweestapsalgoritme :

Serologische assays: voldoen aan

Borrelia ELISA

Positief/grenswaarde

IgG Borreliaimmunoblot

IgM Borreliaimmunoblot

Negatief

Alternatieve diagnose of zo symptomen < 4

weken: follow-up serumstaal

Diagnostiek

gevoelig

specifiek

• European Concerted Action on Lyme Borreliosis

(www.EUCALB.com ) aanbevelingen

• Tweestapsalgoritme :

– ELISA: a sensitive ELISA with ≥ 90% specificity

– Immunoblot confirmation with ≥ 95% specificity

– Local validation taking local epidemiology into account

Serologische assays: voldoen aan

Diagnostiek

Patiënten met lage voorafkans op Lyme borreliosis

– ELISA negatief: exclusievan Lyme borreliosis

– ELISA positief: waarschijnlijk vals positief

Diagnostiek

• Trage immuunrespons– IgM tussen 2 en 4 weken na tekenbeet

– IgG tussen 6 en 8 weken

• Labresultaten steeds interpreteren samen met de duur van

de klinische symptomen– 6-8 weken na start symptomen: geen relevantie van geïsoleerde IgM

positiviteit

• Aanwezigheid van specifieke Borrelia antistoffen ≠ actieve

ziekte

– Overblijfsel van ooit doorgemaakte (sub)klinische Borrelia-infectie

– IgM + IgG positief: geen kenmerk van activiteit, wel ↗ kans

• Seronegativiteit sluit geen Lyme borreliosis uit (ECM)

Diagnostiek

Serologie: pitfalls

Diagnostiek

Serologie: pitfalls

• Antimicrobiële therapie bij aanvang antistof respons (begin van

infectie)

� kan verdere immuunrespons inhiberen (seronegativatie of

As daling)

• Jarenlange persistentie van Borrelia specifieke IgG/IgM mogelijk

serologische follow-up van therapie is niet zinvol

• 1ste generatie sonicaat Borrelia burgdorferi bacteriën

• 2de generatie: gezuiverd B. burgdorferi antigenen van alle pathogene species � hogere specificiteit

• 3de generatie: recombinante antigenen (OspC of VlsE) van B.

burgdorferi of synthetisch peptide C6 (geconserveerd peptide VlsE)

• Mogelijk vals positieve resultaten door

– Rheumafactoren

– Kruisreagerende antistoffen: syfilis, acute EBV infectie, acute

CMV

– auto-immuunaandoeningen

Diagnostiek

Serologie: EIA

• Recombinante Borrelia specifieke Ag uit elkaar getrokken en op een

nitrocellulose membraan aangebracht

• Aantonen tegen welke Ag de patiënt As ontwikkelde

• Europa: criteria volgens bijsluiter (combinatie van antigenen van de

pathogene species)

↔ USA: CDC criteria (B.b. s.s.) :

• IgM: 2 van 3 specifieke banden

• IgG: 5 van 10 specifieke banden

• Specifieker dan EIA

• Negatieve immunoblot bij positieve ELISA: sluit vroege Lyme niet uit

Diagnostiek

Serologie: immunoblot

• Borrelia specifieke Ag verspreid op een nitrocellulosemembraan aangebracht

• Aantonen tegen welke Ag de patiënt As ontwikkelde

• Specifieker dan ELISA

• Criteria volgens bijsluiter

• Bv. Virotech Sekiseu

Diagnostiek

Serologie: immunoblot

Meest gevoelige

antigenen

IgG: VlsE

IgM: OspC

Wilske B, 2005

Diagnostiek

CMI 2011, Stanek et al

• Vroege lokale ziekte (EM, lymfocytoom)

– Sensitiviteit IgG +/- IgM: 50%

– Vnl IgM

• Vroege neuroborreliose– Sensitiviteit (IgM en IgG): 80-90%

– IgM +/- IgG

• Lyme carditis

• Hoge IgM +/- IgG titers

• Lyme artritis, late neuroborreliose, acrodermatitis

• IgG, altijd positief

� sensitiviteit ↑ met duur van de ziekte

Borrelia serologie: interpretatie

Diagnostiek

• Aantonen van intrathecale antistof (As) productie

• Serum en lumbaal vocht staal van zelfde ogenblik

• Mogelijke analyses

– Kwantitatieve EIA: Borrelia As in serum en lumbaal vocht � bepalen antistofindex

– Immunoblot op lumbaal vocht en verdund serum:

intensiteit en aantal Borrelia As banden vergelijken

• In vroege gevallen kan intrathecale antistofproductie

– afwezig zijn

– deze in serum vooraf gaan

• Na succesvolle behandeling kan intrathecale As productie

maanden/jaren persisteren

Diagnostiek neuroborreliose

• Rekening houdend met dysfunctie BBB (passieve diffusie As)

• Antistof index (AI) = proportie Borrelia specifieke IgG/IgM As van

de totale IgG/IgM in lumbaal vocht vergeleken met serum

• Zo AI > 1.5-2 = pathologisch verhoogd

.

Borrelia IgG ELISA units in CSF x total IgG in serum

CSF/serum index [AI] = ----------------------------------------------------------------

Borrelia IgG ELISA units in serum x total IgG in CSF

Diagnostiek neuroborreliose

Intrathecale As productie

24

• Immunologische merker: CXCL13

– CXCL13: wanneer As respons, WBC telling en klinische presentatieLyme neuroborreliose (LNB) niet kunnen bevestigen

– Diagnose van ‘definite’ Lyme neuroborreliosis (EFNS):

• Intrathecale antistof productie

• Pleiocytose (lymfocytose)

• Neurologische symptomen compatiebel met LNB

CBO 2013

Diagnostiek neuroborreliose

25

• Immunologische merker: CXCL13

– Diagnose van ‘definite’Lyme neuroborreliosis (LNB) (EFNS)

Definite LNB:

• intrathecale antistof productie

– Kan afwezig zijn in vroege gevallen van LNB

• Pleiocytose (lymfocyten)

• Neurologische symptomen compatiebel met LNB

– DD: intrathecale synthese of passieve diffusie van antistoffen doorheen een beschadigde bloedhersenbarrière

– Geen onderscheid tussen acute infectie, convalescentie of voorbijeinfectie

Diagnostiek neuroborreliose

Rupprecht T, 2011

Diagnostiek neuroborreliose

27

• Immunologische merker

– In vroege Lyme neuroborreliose

• 88-100% van de patiënten hadden een verhoogd CXCL13

– CXCL13 is niet specifiek voor LNB

• Verhoogd bij infecties met spirocheten, neurological diseases, inflammatie in het CZS

– CXCL13 daalt snel na start AB therapie

– Niet duidelijk of CXCL13 gebruikt kan worden bij late neuroborreliose

� niet aanbevolen

– Onvoldoende evidentie voor gebruik van andere immunologischemerkers (CD57, C3a, C4a)

Diagnostiek neuroborreliose

28

• Immunological marker: CXCL13

– In early Lyme neuroborreliosis:

• 88-100% of patients had an increased level of CXCL13

Schmidt et al, 2011

Diagnostiek neuroborreliose

• Retrospectieve studie UZ Leuven (n=82)

– Selectie gebaseerd op serum/CSV immunoblot resultaten

• Intrathecale As synthese (n=30)

• Passieve diffusie (n=24)

• Geen intrathecale Ab synthese (n=18)

• Andere CZS infectie (n=8)

• Prospectieve studie (n=47)

Diagnostiek neuroborreliose

• Resultaten retrospectieve studie UZ Leuven (n=82)

Desmet S et al, ECCMID 2016

EFNS LNB total

normal borderline increasedstrongly

increased

dLNB 0 0 1 24 25

pLNB 3 0 1 1 5

no LNB 35 2 3 2 42

other CNS infection 5 0 2 3 10

Result CXCL13 Euroimmun

dLNB: 100% patiënten: verhoogd CXCL13 (sensitiviteit)

Geen LNB / andere CZS infectie: 81% CXCL13 negatief (specificiteit)

Diagnostiek neuroborreliose

• Resultaten retrospectieve studie UZ Leuven (n=82)

Virotech CSV immunoblot result EFNS LNB total

normal borderline increasedstrongly

increased

Intrathecal synthesis (n=30) dLNB 0 0 1 24 25

pLNB 2 0 1 0 3

neg 2 0 0 0 2

Passive diffusion (n=16) pLNB 1 0 0 0 1

neg 13 0 1 1 15

Passive diffusion/intrathecal synthesis (n=8) neg 8 0 0 0 8

NEG pLNB 0 0 0 1 1

neg 12 2 2 1 17

HIV 1 0 0 2 3

HS 4 0 2 1 7

Result CXCL13 Euroimmun

Desmet S et al, ECCMID 2016

Diagnostiek neuroborreliose

• Retrospectieve study UZ Leuven (n=82)

• Resultaten prospectieve study (n=47)– Alle consecutieve stalen met aanvraag voor neuroborreliose

– Geen LNB positieven (EFNS criteria)

– 4 patiënten met verhoogd CXCL13: neurosarcoidose, B-cell lymphoma,

AML

– 3 patiënten met positieve C6 ELISA en negatieve immunoblot

• CXCL13 was negatief

normal borderline increasedstrongly

increased

43 0 2 2

Result CXCL13 Euroimmun

Diagnostiek neuroborreliose

• LTT: lymfocyten transformatie testen

• (immunologische) respons van T-lymfocyten op stimulatie met

Borrelia burgdorferi Ag nagaan (geen ziekte-activiteit)

• Geen standaardisatie

• Wisselende patiënten en controlegroepen, methodes en

antigenen

• Over algemeen minder gevoelig en minder specifiek dan

serologie

Overige Diagnostiek

Dessau et al. Clin Microbiol Infect. 2014

34

• Lyme borreliosis serologie

– Te interpreteren samen met klinische symptomen

– Pre-test probabiliteit - voorafkans

– Geen merker van ziekte-activiteit

– Positieve serologie ≠ ziekte

– Negatieve serologie ≠ afwezigheid van ziekte

– Introductie van CXCL13 om acute neuroborreliose te bevestigen

Conclusie

• Anaplasma spp.– 1-45% van 121 teken in Nederland (Schouls et al,1999 en Wielinga et al,

2006): Anaplasma phagocytophilum

– Infectie bij de mens mogelijk: (Heyman et al, 2010 en Hing et al, 2014)

• Bartonella spp. andere dan humane pathogenen B. henselae

en B quintana– 70% van de onderzochte Ixodes ricinus DNA (Schouls et al, 1999)

• Rickettsia spp.– Rickettsia helvetica (41% van 1736 teken in Nederland, Sprong et al,

2009)

– Niet humaan pathogeen?

• Babesia spp.– 1% van 1488 teken in Nederland, Wielinga et al, 2009

– Nog geen humane infecties met Babesia door teken overgedragen

beschreven

Andere door tekenoverdraagbare infecties

• Anaplasma spp.

• Militair hospitaal Koningin Astrid

• Serologie Immuunfluorescentie assay op serum: IgM en IgG

• Microscopie: morulae in neutrofielen

• PCR: DNA detectie

Andere door tekenoverdraagbare infecties

DIAGNOSTIEK

Andere door tekenoverdraagbare infecties

• Bartonella spp.

– Instituut Tropische geneeskunde - UCL

– Serologie: immuunfluorescentie assay IgG en IgM

– PCR: detectie van het rpoB-gen op biopten of puncties, bloed

• Rickettsia spp.

– Militair hospitaal Koningin Astrid

– RT-PCR

Andere door tekenoverdraagbare infecties

DIAGNOSTIEK

• Babesia spp.

– Babesia microti, Babesia divergens, Babesia EU1

– Instituut Tropische Geneeskunde

– microscopie –PCR

Andere door tekenoverdraagbare infecties

DIAGNOSTIEK