Diagnostic des mycoses profondesDiagnostic des mycoses profondes

Boualem SENDIDBoualem SENDIDBoualem SENDIDBoualem SENDID

ParasitologieParasitologie--Mycologie,Mycologie, Inserm U995Inserm U995--22

InstitutInstitut de Microbiologie, CHRU de Lillede Microbiologie, CHRU de Lille

Colloque National des Biologistes des HôpitauxColloque National des Biologistes des HôpitauxLille, 4Lille, 4--8 octobre 20108 octobre 2010

Agents fongiques responsables d’infections invasives chez lepatient hospitalisé (USA)*

Type d’infection Proportion %

Candidose 59

Aspergillose 14

Cryptococcose 9

Histoplasmose 4Histoplasmose 4

Coccidioidomycose 3

Blastomycose 3

Fusariose 1

Scedosporiose 1

Zygomycose 1

Autres 5

*Fothergill AW, Focus on Fungal infections 18, 2008

49%

10%

5%3% 2% 0%

1%

C. albicans

C. glabrata

C. parapsilosis

C. tropicalis

Distribution des espèces de levures isoléesd’hémoculture (AP-HP, 2002-2007, 1824)*

17%

13%

C. tropicalis

Cr. neoformans

C. krusei

C. kefyr

C. guilliermondii

Autres

Données de l’Observatoire des levures,CNRMA

50%

60%

70%

80%

90%

100%

other species

C. krusei

C. parapsilosis

C. tropicalis

C. glabrata

C. albicans

Distribution des espèces Candida isolées d’hémocultureau CHRU Lille (430 isolats, 1993-2003)

0%

10%

20%

30%

40%

ICU

Surgery

Solidtum

ors

Gastroenterology

Onco-haem

atology

Pediatrics

Other w

ards

Sendid B et al. BMC Infect Dis. 2006

Aspergillose invasive, pathologies sous-jacentes(Surveillance nationale 2005-2006, 331 cas)*

Hémopathies malignes 81%Pathologies resp. chron. 11%Cancer 5%Transplantation d’organes 3%

45% Hémopathies malignes

Réseau SAIF, CNRMA

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

LAM LAL Lymphomes LLC Autres

Hémopathies malignes

28%

Aspergillose invasive et transplantation

Allogeneic – Unrelated 10.3%

Allogeneic – Related 6.7%

Lung Transplant 8.4%

Heart Transplant 6.2%

Autologous BMT 2.6%

Liver Transplant 1.7%

Pancreas Transplant 1.3%

Kidney Transplant 0.7%

Infections fongiques invasives,un problème de santé publique persistant

Morbidité1

Durée de séjour à l’hôpital étendue : 3 -30 days.Surcoût par patient : 6.214- 92.266 $

Mortalité1,3

Associée à la candidémie : 10-40 %;Traitement retardé (>12 h): 23-46%.Traitement retardé (>12 h): 23-46%.Associée à l’aspergillose : 50-90%

Traitement antifongique2 : 10.5% des charges totalesExemple (2005)4: 2.8 M€ par an pour un hôpital de 3000 lits (France)

Origine : difficultés du diagnostic clinique et biologiqueEx. Hémoculture, sensibilité < 50%; LBA <30%Diagnostic précoce (pronostic favorable)?

1Pfaller M. CMR, 2007: 2Rentz AM. CID, 19983Morgan JM, Infect. Control. Hosp Epidemiol. 20054 Sendid B, BMC Infect Dis 2006

Stratégies diagnostiques desinfections fongiques invasivesinfections fongiques invasives

(IFI)

HISTOLOGIE

Diagnostic de certitude, mais biopsies rarement réalisées (gestesinvasifs)

• Candidose profonde : diagnostic tardif, en particuliersuspicion de candidose hépato-splénique (images de micro-abcès), atteinte médullaire…

IMAGERIE

Valeur majeure nonspécifique

retardé

Halo Condensation CroissantJ0 - J5 J5 - J10 J10 - J20

IMAGERIE : Aspergillose invasive

IMAGERIE

Aspergillose Invasive

Caillot D, 2001

Neutropénie PNN >> 500

spécifique

C. albicans

C. glabrata.

C. krusei

C.tropicalis

Milieu chromogène identification présomptive :

Mycologie: méthodes conventionnelles

Levur

Galerie d’identification

Résultats disponibles en 24-72h

Tests d’agglutination :

res

Milieux d’isolement :

Sabouraud + antibiotiquesGélose au sang

Milieu d’identificationmilieu CzapecExtrait de Malt

FILAM

Mycologie: méthodes conventionnelles

Incubation :25-30°CAtmosphère aérobieDurée 48h- plusieurs jours

MENTEUX

Amplification et séquençage des régions ITS (gène 18RNAr)« Internal Transcribed Spacer »

18S ADNr 5,8 S 26S ADNr

ITS1 ITS2pITS1

Intérêts :Diagnostic de mycoses invasives (examen direct positif, culture négative)Diagnostic d’espèce pour les mycoses rares

Levures émergentes (ex. C. haemulonii, candidémies)Champignons filamenteux rares (Fusarium sp.)

pITS2

Taille: 400-600 pb

Identification des champignons par MALDI-TOF

Spores de AspergillusSpectre

MatrixDHB

MALDI-TOF-MS

ME. Bougnoux/A. Alanio, ICAAC 2009

MALDI-TOF MS: Une révolution en microbiologie cliniquePlus de 500 références dans PubMed..

Aspergillus sp. Pics de référence des 28 espèces

FumigatiFumigati FlaviFlavi TerreiTerrei NigriNigri NidulantesNidulantes UstiUsti

Aspergilli : Taxonomie

GenreSection

Complexe d’espèces

Fumigati

FlaviN. pseudofischeri

35 espèces

Hong et al., 2008

Aspergillus

Flavi

Nigri

Terrei

NidulantesA. lentulus

N. udagawae

A. viridinutans

A. fumigatiaffinis

A. fumigatus

Identification des levures en routine hospitalière(700 souches, 17 espèces différentes, 50 souches de référence*

C dubliniensis

P cactophila

No

mb

red

eso

uch

es

Résultats d’identification par SM

Résultats d’identification par méthodes conventionnelles

Première identificationDeuxième identificationDiscordance

No

mb

red

eso

uch

es

99% de corrélation avec la galerie API32C

* Sendid B. 2010, J Mycol Med, sous presse

Examen mycologique

• Sites normalement stériles (LCR, liquide pleural, liquide articulaire, bile…): valeur diagnostique très élevée, mais prélèvements peu réalisés

Stratégies diagnostiques des mycosesprofondes

Hémocultures : 50 % pour Candida ; inutilisables pour Aspergillus

• Sites "ouverts", susceptibles d’être colonisés ou contaminés (trachée,LBA) : interprétation difficile

- Importance de la densité fongique et la fréquence d’isolement (LBA,Urines…)

La colonisation fongique

• La colonisation est un préalable à toute invasion- Facteur de risque majeur d’infection

• Colonisation de plusieurs sites périphériques:Facteur de risque indépendant de candidose invasive

Eggimann, 2004

Le % de patients colonisés augmente au cours deL’hospitalisation

Eggiman P. Lancet Infect Dis. 2003

La colonisation fongique, en pratique…

650 patients suivis en USI; 29 patientscolonisés :11 ont développé des CI

Index de colonisation (IC, ICC)*:

mieux cibler les patients justifiantd’un traitement antifongique

*Pittet D, Annals of Surgery 1994Pittet D, Am J Med 1991

Seuil 0.5 atteint 5-6 jours avant l’infection

• Valeur prédictive, pas testée en prospectif,• Stratégie non validée en réanimation médicale• Difficultés de mise en œuvre ++

(Hamidfar R et al, SRLF 2004)

Se Sp VPP VPN

>ou= 2 sites colonisés100 22 44 100

Index de colonisation (>0,5)100 69 66 100

Index de colonisation corrigé100 100 100 100

‘‘Candida Score’’ pour identifier les patients justifiantd’un traitement antifongique

A "Candida score » >2.5 accurately selectedpatients who would benefit from

early antifungal treatment.

Leon C. Crit Care Med 2006; 34: 730-737

Justification des tests alternatifs à la culture

• Faible sensibilité des méthodes conventionnelles (hémoculture: 50%,LBA < 30%)

• Patients à haut risque d’IFI, souvent traités de manière empirique, faiblerendement des cultures, nécessité de documenter l’épisode infectieux*

• Amélioration de la précocité du diagnostic biologique

• Suivi l’efficacité thérapeutique

Probabiliste

Prophylactique

72%

Répartition de la consommation antifongique enhématologie adulte et pédiatrique en 2005

Documenté

24,7%

3,3%

Thèse, Bérénice Bro , 2007

Total : 1 731 300 €

Tests sérologiques : détection du mannane et desanticorps anti-mannane

PlateliaPlatelia®® CandidaCandidaantigèneantigène

100100°°CC

PlateliaPlatelia®® CandidaCandidaanticorpsanticorps

Sendid et al. J Clin Microbiol 1999Yera et al. EJCMID 2001Sendid et al. J Med Microbiol 2002Sendid et al. J Clin Microbiol 2004

Nouvelle génération de Tests PlateliaTM Candida

Nom* Platelia™Candida Ag PlusInterprétation des résultats C<62.5pg/ml : Négative pour la présence d’antigène mannane

62.5pg/ml=<C<125pg/ml : Intermédiaire pour la présence d’antigène mannaneC>=125pg/ml : Positif pour la présence d’antigène mannane

Nom** Platelia™Candida Ab PlusInterprétation des résultats C<5AU/ml : Négatif pour la présence d’anticorps anti-mannane

5=<C<10AU/ml : Intermédiaire pour la présence d’anticorps anti-mannaneC>=10AU/ml : Positif pour la présence d’anticorps anti-mannane

* Test plus sensible; ** Faible dilution de sérum (1:400)

En pratique : Détection conjointe Mnn/Ac Mnn

60

80

100

Sen

sib

ilit

é(%

)

Exemple : Valeurs cinétiques des tests Platelia Ag et Acau cours d’une candidose systémique chez un patientde réanimation

60

80

100

6

8

10

Tit

res

d’a

nti

co

rps

an

ti-m

an

nan

e(A

.U)

Ma

nn

an

ém

ie(n

g/m

l)

Ac

0

20

40

n samples/patient(n patients/category)

Sen

sib

ilit

é(%

)

1(19)

2(17)

3(13)

4(9)

5(5)

6(3)

Herent et al. JCM 1992

Jours

-20 -10 0 10 20 30

0

20

40

60

0

2

4

6

Isolement de Candidad’une hémoculture (J0)

Tit

res

d’a

nti

co

rps

an

ti

Ma

nn

an

ém

ie(n

g/m

l)

Un prélèvement dès l’admission et un suivibi-hebdomadaire pour les patients à haut risque

Early diagnosis of invasive candidiasis with mannanantigenemia and antimannan antibodies

Prella M, Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2004

Contribution des tests Platelia® au diagnostic descandidoses systémiques

EN RÉSUMÉ…

• Diagnostic de 80 % des candidoses déterminées par lesespèces les plus pathogènes du genre, C. albicans, C.glabrata et C. tropicalis

• Sensibilité plus faible (40-50%) pour les autres espèces

• Précocité : 4 jours en moyenne avant positivité del’hémoculture

•Tests automatisés, adaptés à la surveillance d’un grandnombre de patients à risque.

PATAGPATAG

GOLDGOLD

Galactomannane

Présent sur de nombreuses

2M1 2M1 2M1 6M1a a a

Galf

Galf

1

5b

6

n>4

PLATELIA ASPERGILLUS

GOLDTEMGOLDTEM

GOLDSEMGOLDSEM

Présent sur de nombreusesGlycoprotéines avecMMr > 40 kDa

JP Latgé, IP Paris.

Détection du galactomannane sérique (ELISA)Patients avec cancers

Etude prospective de 797 patients3294 échantillons sériques

153 épisodes d’AI; 31 confirmés, 67 probables, 55 possibles

Sp 94.8 98.2 98,2 adultes 47.6 (enfants)

Se 29.4 65 confirmés16 probables26 possibles

VPP 58 92% chez non-allogréffé43% chez allogreffé

VPN 85

Herbrecht, R, J Clin Oncol, 2002Valeur diagnostique, 2 sérums consécutifs + > un résultat isolé

Dépistage de patients à haut risqued’aspergillose invasive (AI)

La détection d’antigène GM est plus sensible et plus spécifique que la TDM etla culture

La positivité de l’antigène GM précède les signes radiologiques (TDM) et laculture d’une semaine (moyenne)culture d’une semaine (moyenne)

L’antigène GM était positif 6 à 10 jours avant l’apparition des symptomescliniques

L’antiggène GM était plus sensible (comparé à la RT-PCR aux b-glucanes)pour la prédiction d’un diagnostic positif d’AI chez le patient d’onco-hématologie.

Faux positifs

• Réactivité croisée avec d’autres champignons (Cryptococcus,Histoplasma) ou bactéries (bifidobacterium)

• Apport exogène de galactomannane, alimentaire, antibiotiques(Pipéraciline/Tazobactam, interférence variable selon les lots)(Pipéraciline/Tazobactam, interférence variable selon les lots)

• Solutés de nutrition parentérale (Ribaud, ICAAC 2007)

Détection d’anticorps anti-Aspergillus par ELISA

ELISA indirect 2h30

Utilisation d’un antigène recombinant

Détection d’anticorps anti-Aspergillus par ELISA

Groupes :1A : chronic pulmonary aspergillosis1b : ABPA

2 : Mutiple colonization (culture ++)

Thorez S, Sendid B, Hennequin C, ICAAC 2010

2 : Mutiple colonization (culture ++)3: 1 seul prélèvement BP +4: Culture - et IPD négative5: Témoins sains

Limulus assay

Fungitell ® assay: Associates of Cape Cod, Agrément FDA 2004

Le fungitell est préparé à partir d’un lysat d’amebocytes (GR du crap)traités (dépourvus de facteur C, activable par le LPS).

Test enzymatique (durée 40 min)

- Miyazaki T et al. J Clin Microbiol 1995

Spécificité large:

Candida,

1,3-glucanes, un marqueur panfongique

- Miyazaki T et al. J Clin Microbiol 1995- Obayashi T et al. J Med Vet Mycol 1992- Obayashi T et al. Lancet 1995

- Mitsutake KT et al. J Clin Microbiol 1996

- Pazos C et al. J Clin Microbiol 2005

Candida,Aspergillus,Pneumocystis,Fusarium,Scedosporium

Exception:Cryptococcus (très faible quantité)Zygomycoses

170 Healthy subjects

B-D-Glucanes et infections déterminées par Candida sp.

+Valeurs de référence :

80

120

-

Détection d’ADN fongique par PCR

Beaucoup de questions : certaines sont résolues d’autres pas…

• Echantillon biologique : Sang total, Plasma, Sérum ?

• Cible amplification ? ADNr, autres ?• Cible amplification ? ADNr, autres ?

• Type de PCR, conventionnelle, temps réel

• Extraction: Manuelle, automatique

• Volume d’échantillon: 5 ml, 1ml, 200 L…?

SeptiFast permet l’identification de

25 agents pathogènes couvrants 90% des infections, en moins de 6 heures.

MRSA (mecA)

Sang total EDTA(3 ml)

SeptiFastTechnique RT-PCR sur LightCycler 2.0 CE/IVDdirectement sur sang prélevé sur EDTA

Prélèvement Lyse Extraction SeptiFast Rendu

approx. 5 heures

MagNA LyserInstrument LightCycler 2.0

Instrument

Coût : 150 € /analyse

Etude prospective interventionnelle temps-réel SeptiFast enréanimation médicale, CHRU de Lille (Evaluation en cours en hématologie)

SF pos SF neg

HCpos

5SF=S. aureus/HC=C. glabrataSF=S.marcescens/HC =S. marcescens SF

= C. tropicalis/HC= C. albicans

SF= S.aureus/HC = S.aureus

2Inhib*/ HC = E. coli

SF Neg/ HC = Leuconostoc

(pas dans le panel SeptiFast)

* Leucocytose > 30.000/mm3

SF= S.aureus/HC = S.aureusSF=S.marcescens/HC =S. marcescens

HCneg

72 E. coli/ HC neg

2 S. aureus / HC neg

2 Klebsiella/HC neg1 P. aeruginosa

74 dont 2 SF = INH*

Wallet F, Clin Microbiol Infecttion, soumis

Patientsà risque

Admissions

RéanimationChirurgieLeucémiesTumeurs solidesTransplantationGreffésPrématurésBrûlés….

Facteurs de risque associésChimiothérapie (mucite)AntibiotiquesCorticothérapieCathéter veineux central

QUELS PATIENTS ?

Cathéter veineux centralScore de gravité élevéColonisation fongique

Mycose profonde

Syndrome infectieux résistantaux antibiotiques

SurveillanceMycologiqueSérologique

A quel moment ?Aide à la décision thérapeutique

Patientsà risque

Admissions

LeucémiesTumeurs solidesTransplantationGreffésPrématurésBrûlés….

Facteurs de risque associésChimiothérapie (mucite)NeutropénieAntibiotiquesCorticothérapieCathéter veineux centralScore de gravité élevéColonisation fongique

Mycose profonde

Stratégie diagnostique des mycoses profondes en hématologie

A l’admission : Début de chimiothérapie :

Décisionthérapeutique

T. empirique

Bilan mycologiqueBouche, nez, urines, selle, crachatsAspiration bronchiqueBilan sérologique- Mnn; GM; BDG (VPN:- Anticorps Candida, Aspergillus

Surveillance bi- hebdomadaireGM, BDG, Mnn

Recherche active des foyers infectieux si :*2x GM+ avec ou sans BDG (Aspergillose)**2x Mnn+ avec ou seul BDG (candidose)***2x BDG (autres mycoses)

*Foyers aspergillairesImagerie (TDM, Echographie)Aspirations bronchiques (X)LBA, Biopsies, LCRPCR sérum ++

**Foyers candidosiquesHémoculturesImagerie (Echographie)Lésions cutanéesBiopsies

***Autres mycoses profondesImagerie (TDM, IRM)Biopsies

Stratégie de prise en charge diagnostique de l’aspergillose invasive

Clin Infect Dis 2005;41:1242-50

Evaluation des facteurs de

Stratégie diagnostique des candidoses profondes en réanimation

Admission

Bilan mycologique « de référence »Bouche, nez, urines, selle, crachatsAspiration bronchiqueBilan sérologique « de référence »BDG, Mnn/Ac Mnn

Recherche de foyers infectieux:- Hémocultures- Imagerie (Echographie)- Biopsies

Décision thérapeutique

DialogueBio-clinique

- +Surveillance

+-

Evaluation des facteurs derisque associés

AntibiotiquesCathéter veineux centralScore de gravité élevéChirurgie

Bilan mycologiqueBouche, nez, urines, selle, crachatsAspiration bronchique

Surveillance 2x /semaine

Bilan sérologiqueBDG, Mnn, Ac

+

- Surveillance

Diagnostic mycologique conventionnel est :

- Perfectible (répéter les prélèvements)- Indispensable

identification du genre, d’espèceTests de sensibilité aux antifongiques

- Biomarqueurs alternatifs à la culture:

Conclusions

- Biomarqueurs alternatifs à la culture:

- Outils de screening, identification des patients justifiantd’une recherche active du foyer infectieux (Hémocultures, TDM)- Contributifs si réalisés de manière régulière (2X/semaine)