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7/28/2019 Crystal Structure of Reduced and of Oxidized Peroxiredoxin-V2.0.pdf
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Crystal Structure of Reduced andof Oxidized Peroxiredoxin IVEnzyme
Reveals a Stable Oxidized Decamer and a Non-disulfide-bonded Intermediate in the Catalytic Cycle
Lus Tavares; Miguel Gonalves; Ricardo Almeida
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Peroxirredoxina IV (Prx IV)
Peroxidase 2-Cys
Proteoantioxidante
ReticuloEndoplasmtico
Ciclo Reacional H2O2
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Ciclo Reacional
I.Reao com oH2O2
II.Formao daligao dissulfureto
III. Reduo daligao por membro
das PDI
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Alteraes Conformacionais
Forma reduzida Maior atividade peroxidtica
FF
(Fully folded)
Forma oxidada Mais facilmente reduzida por tioredoxinas
LU
(Locally unfolded)
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Objetivos do estudo
Melhor compreenso dasdiferentes formas enzimticas
Influncia no ciclo reacional
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Parte Experimental
Expressas em E. coli BL21-DE3;Produo
Resina Ni-NTA; Eluio Trombina (protease);Cromatografia de Afinidade
Leitura espetrofotomtrica; 280 nm (UV);Quantificao
Estado oligomrico das protenas r.;Cromatografia de ExclusoMolecular
Tavender, T. J. and Bulleid, N. J. (2010) Peroxiredoxin IV protects cells from oxidative stress by removing H2O2 produced during disulphideformation . J. Cell Sci. 123, 2672-2679
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Ensaio de Reduo da Prx IV
Prx IV + PDIAdio de
TCA
IncubaoCentrifugao
Resuspensodos pellets Aquecimento
ElectroforeseSDS-PAGE
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Ensaio de Hiper-Oxidao
Prx IV nativa oumutante
Tioredoxina+
TioredoxinaRedutase
Diferentes[H2O2]
Desnaturaoe Reduo
WesternBlotting
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Cristalizao de Protenas
Difraco de Raio-XD*TREK C245A oxidada
XDS Restantes Protenas
Mtodo da Gota Suspensa
Prx IV nativaMutante
C15A (oxid. ered.)
MutanteC245A (oxid. e
red.)
Arrefecimentocom N2lquido
Cristalografia de Raio-X
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Resultados
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Resultados
Caracterizao estrutural da Prx IV humana:
semelhana de outras Prx A forma reduzida corresponde a umdecmero (5 dmeros);
Em forma de Donut com as extremidades N-terminal voltadas para ointerior e as extremidades C-terminal para o exterior.
Ao contrario de outras Prx, quando no estado oxidado, o decmerocontinua a ser estvel e com arranjo quase igual ao da forma reduzida
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Resultados
Folha central rodeada de -hlices;
1 e 8 interagem com o monmero vizinho; Cistena peroxidtica na hlice 2; Hlice 6 e 2sofre um rearranjo espacial na forma oxidada.
Forma OxidadaForma Reduzida
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A Estabilidade do decmero na PrxIV pode dever-se a:
Interaces que ocorrem entre os monmeros devido hidrofobicidade de alguns aminocidos das cadeias laterais;
Alterao conformacional das hlices 6 e 2.
Resultados
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Caracterizao estrutural da PrxIV mutante(C51A):
Cys245 substituda por uma Ala; O decmero continua estvel; Estrutura semelhante protena normal; Mais insensvel hiper-oxidao.
Resultados
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Resultados
Forma sulfeniladaForma Reduzida
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ResultadosA quando da remoo do agente de reciclagem ainsensibilidade da protena normal foi idntica protenamutada.
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Resultados
Consequncias da remoo da hlice do C-terminal ereciclagem:
A cistena peroxidtica torna-se mais resistente hiper-oxidao;
A desorganizao da 6
pode servir de sinalizador s PDI;
As PDI no se ligam protena.
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Resultados
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Na forma reduzida e oxidada a estrutura decamrica mantm-se; A substituio da cistena da hlice N-terminal por uma alanina a
forma decamrica mantm-se;
Discusso/Concluso
Esta substituio leva a diminuio de hiper-oxidao
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As PrxIV possuem uma extenso na extremidade N-terminal;
A alterao conformacional na passagem da forma reduzida para aforma oxidada expe aminocidos hidrofbicos;
Discusso/Concluso
Aumenta a estabilidade do decmero
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Bibliografia Cao, Z.; Tavender, T. J.; Roszak, A. W.; Cogdell, R. J. and Bulleid, N. J. (2011) Crystal
Structure of Reduced and of Oxidized Peroxiredoxin IV Enzyme Reveals a StableOxidized Decamer and a Non-disulfide-bonded Intermediate in the Catalytic Cycle. J.Biol. Chem.286, 42257-42266