CLASSIFICAÇÃO FILOGENÉTICA DE ESCHERICHIA COLI  PATOGÊNICA

PARA AVES (APEC) E CORRELAÇÃO COM A PRESENÇA DE FATORES DE VIRULÊNCIA

Ana Lívia da Silva FerreiraDepartamento de Microbiologia

Universidade Estadual de Londrina

Orientadora: Renata K. T. Kobayashi

Objetivos

•O objetivo deste trabalho é Classificar as amostras de Escherichia coli isoladas de aves com colibacilose e de frangos comercializados nos grupos filogenéticos A, B1, B2 e D;

•Comparar esses resultados com a presença/ ausência de fatores de virulência das APEC previamente analisados, observando se há uma relação dos grupos com fatores específicos.

INTRODUÇÃO

Escherichia coli

•um bacilo gram-negativo;

•Microbiota intestinal de humanos, outros mamíferos e aves;

•Comensais, patogênicas intestinais e patogênicas extra-intestinais;

•Em humanos causa infecções como meningites, septicemias,, pneumonias, infecções urinárias e intestinais;

•em alimentos, como carnes congeladas, é permitida uma quantidade de 104 UFC/g alimento.

INTRODUÇÃO

Fator de virulência Função

tsh hemaglutinina temperatura sensível

papC, papG fímbria P

felA fímbria F11

fimH fímbria tipo 1

fac

afa/draBC adesina afimbrial

sfaDE

sfaS fímbria S

csgA curli

cvaC colicina V

iutA aerobactina

iss resistência sérica

kps cápsula

cnf1, cnf2 fator necrozante citotóxico

RELACIONADOS A ADESÃO

NÃO RELACIONADOS A ADESÃO

INTRODUÇÃO

MATERIAIS E MÉTODOS

•Foram utilizadas 200 amostras de frangos com colibacilose: estoque da profa. Dra. Marilda c. vidotto;

•103 Amostras isoladas de frangos comercializados: estoque da profa. Dra. Renata kobayashi.

•As amostras utilizadas como controle positivo foram gentilmente cedidas pela profa. Dra. Halha Ostrensky Saridakis.

Essas amostras foram crescidas em lb caldo durante 24h.

O dna de cada uma delas foi extraído para que pudéssemos realizar pcr.

MATERIAIS E MÉTODOS

A pcr realizada foi descrita por clermont et al., 2000.

Ciclo curto:-desnaturação por 4 min a 94ºC, -30 ciclos de 5 s a 94ºC e 10 s a 59ºC -uma extensão final de 5 min a 72ºC. Ao final da reação,

as amostras foram mantidas a 4ºC, até sua corrida em gel de agarose 2%.

Os primers utilizados foram:-chuA-yja-tspe4.c2

Gene Seqüencia de oligonucleotideo pb

ChuA (CGG ACG AAC CAA CGG TCA GGA T)(TGC CGC CAG TAC CAA AGA CAC G)

279

Yja (CGT GAA GTG TCA GGA GAC GCT GC)(TGC GTT CCT CAA CCT GTG ACA AAC C)

211

Tsp (GGG AGT AAT GTC GGG GCA TTC AG)(CAT CGC GCC AAC AAA GTA TTA CGC AG)

152

MATERIAIS E MÉTODOS

KOTLOWSKI et al., 2007; Clermont et al., 2000

Análise estatística:-ANOVA não paramétrico (Kruskal-Wallis), através do programa de estatística Epi Info, versão 3.4.3.

MATERIAIS E MÉTODOS

Clermont et al., 2000

Resultados e discussão

chuA (279pb)yja (211pb)TSPE4.C2 (152pb)

1 2 3 4 5 6 7 C+ C-

B1 A A B2 D B1 B1 B2

Resultados e discussão

Frangos comercializados Aves com colibacilose (APEC)

B2 B2/ D

JOHNSON et al., 2000 apud MOULIN-SCHOULEUR et al., 2007, PICARD et al., 1999

Resultados esperados:

Resultados e discussão

frango comercializado apec

33; 32%

18; 17%17; 17%

35; 34%56; 28%

66; 32%

45; 23%

33; 17%

Resultados e discussão

0,00%

20,00%

40,00%

60,00%

80,00%

100,00%

120,00%

Fator de virulência

Po

rcen

tag

em d

e p

osi

tivo

s

Grupo A

Grupo B1

Grupo B2

Grupo D

APEC:

Resultados e discussão

A (56) B1 (66) B2 (45) D (33) TOTAL DE AMOSTRAS POSITIVAS

P(0,05)

tsh 13 (16,5%)C: 23,2%

31 (39,2%)C: 47,0%

26 (32,9%)C: 57,8%

9 (11,4%)C: 27,3%

79 p<0,05

papC 4 (10,8%)C: 7,1%

6 (16,2%)C: 9,1%

18 (48,6%)C: 40,0%

9 (24,3%)C: 27,3%

37 p<0,05

papG 2 (6,3%)C: 3,6%

5 (15,6%)C: 7,6%

17 (53,1%)C: 37,8%

8 (25%)C: 24,2%

32 p<0,05

felA 1 (4,2%)C: 1,8%

5 (20,8%)C: 7,6%

17 (70,8%)C: 37,8%

1 (4,2%)C: 3,0%

24 p<0,05

fimH 54 (28,0%)C: 96,4%

61 (31,6%)C: 92,4%

45 (23,3%)C: 100,0%

33 (17,1%)C: 100,0%

193 p>0,05

afa/draBC

0 1 (100%)C: 1,5%

0 0 1 p>0,05

csgA 56 (28,0%)C: 100,0%

66 (33,0%)C: 100,0%

45 (22,5%)C: 100,0%

33 (16,5%)C: 100,0%

200 p>0,05

APEC:

Resultados e discussão

A (56)* B1 (66) B2 (45) D (33) TOTAL DE AMOSTRA

S POSITIVAS

P(0,05)

cvaC 11 (15,7%)C: 19,6%

18 (25,7%)C: 27,3%

34 (48,6%)C: 75,6%

7 (10,0%)C: 21,2%

70 p<0,05

iutA 22 (17,5%)C: 39,3%

42 (33,3%)C: 63,6%

39 (31,0%)C: 86,7%

23 (18,3%)C: 69,7%

126 p<0,05

iss 12 (15,6%)C: 21,4%

25 (32,5%)C: 37,9%

22 (28,6%)C: 48,9%

18 (23,4%)C: 54,5%

77 p<0,05

kpsII 6 (14,6%)C: 10,7%

7 (17,1%)C: 10,6%

22 (53,7%)C: 48,9%

6 (14,6%)C: 18,2%

41 p<0,05

APEC:

Fatores Número de amostras

iutA + tsh + iss 40

iutA + tsh + iss + cvaC 28

iutA + tsh + iss + cvaC + kps 17

tsh + papC + papG + felA 14

Resultados e discussão

UPEC

NMEC

APEC

APEC:

Resultados e discussão

DELICATO et al., 2003

APEC:

A; 55%

B1; 35%

B2; 22,50%

D; 42,50%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

Grupos FilogenéticosPo

rcen

tag

em d

os

fran

go

s q

ue

apre

sen

tara

m

os

gru

po

s fil

og

enét

ico

s

A

B1

B2

D

Resultados e discussão

Frangos comercializados::

22

14

9

17

CONCLUSÃO

este trabalho visou à correlação entre virulência e classificação filogenética de amostras patogênicas, necessitando de estudos mais profundos para se chegar às amostras com potencial patogênico.

Quando estas relações forem elucidadas, o tratamento e a prevenção de infecções serão mais específicos, tanto em animais quanto em humanos, podendo levar à economia de tempo e de verbas destinadas à saúde pública ou ao controle de qualidade dos produtos do agronegócio.

CONCLUSÃO